KR102273107B1

KR102273107B1 - 세포 투과성 접착 단백질 나노입자 기반 약물과 유전자 동시전달 시스템

Info

Publication number: KR102273107B1
Application number: KR1020190108873A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 정연수; 조윤기
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2021-07-05
Also published as: KR20200026757A

Abstract

본 발명은 홍합 접착 단백질기반의 세포 투과성 접착 단백질 및 이를 이용한 나노입자를 통한 약물과 유전자 동시전달 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 세포 투과성 접착 단백질을 이용하면, 홍합 접착 단백질의 세포 내 투과도가 상승하여 세포 내 전달 효율이 증가될 수 있고, 본 발명의 나노입자는 약물 및 유전자를 동시에 적재할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 내 투과도가 증가하여 목적하는 약물 또는 유전자를 세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 통해, 원하는 효과를 극대화할 수 있다.

Description

세포 투과성 접착 단백질 나노입자 기반 약물과 유전자 동시전달 시스템 {Drug and gene co-delivery system based on cell-penetrating adhesive protein nanoparticles}

본 발명은 홍합 접착 단백질기반의 세포 투과성 접착 단백질 및 이를 이용한 나노입자를 통한 약물과 유전자 동시전달 시스템에 관한 것이다.

나노입자를 기반으로 한 약물전달시스템은 약물의 분해를 방지하고 특정 세포에서 자극에 의한 제어방출을 할 수 있어 효과적인 치료를 얻음과 동시에 부작용을 줄일 수 있어 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나, 임상 분야에서도 어느정도 치료효과를 보였음에도 불구하고, 대부분 단일 약물을 전달하는 시스템으로 다중약물내성(multi-drug resistance) 세포에 취약하고, 병인의 다양성으로 인해 일차원적인 치료 메커니즘으로는 효과적인 치료에 한계점이 있다.

이러한 한계점을 극복하기 위하여, 다중약물내성에 영향을 받지 않으며, 약물과 다른 경로의 치료 메커니즘을 이용할 수 있는 유전자를 이용하여 약물과 동시 전달할 수 있는 시스템이 개발되고 있다. 하지만 유전자 전달을 위한 바이러스성 벡터는 안전성의 문제가 제기되고 있어, 비교적 큰 분자량을 지닌 유전자와 작은 분자량을 지닌 약물을 동시에 담지할 수 있는 비바이러스성 벡터의 개발이 많이 이루어지고 있다.

세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)는 자연에 존재하는 생명체가 지니는 막-이동 시퀀스(Membrane-Translocating Sequence, MTS)나 단백질-투과 도메인(Protein-Transduction Domain, PTD)로부터 유도된 아미노산 사슬이며, 일반적으로 약 10-30개 정도의 짧은 아미노산 서열로 이루어져 있다. 세포 투과성 펩타이드를 단백질과 연결시켜 융합단백질을 생성할 경우, 세포막을 파괴하지 않고 세포 내로 효율적으로 수송할 수 있어, 약물 및 유전자 전달체의 전달 효율을 높이기 위한 방안으로 많이 활용되고 있다.

한편, 자연에서 유래한 홍합 접착 단백질(mussel adhesive protein)은 바다와 같은 수중환경에서 표면에 효과적으로 부착할 수 있으며, 뛰어난 생체적합성과 생분해성을 가지고 있어 생체소재로서 많은 각광을 받고 있다. 홍합 접착 단백질은 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA)잔기를 통하여 바다에 존재하는 철 이온과 결합하여 가교를 할 수 있으며, 주변의 pH에 따라 달라지는 도파-철 가교형태를 통해 나노입자를 형성할 경우, 약물의 제어방출이 가능하다고 보고된 바 있다. 또한, 홍합 접착 단백질은 양전하를 가진 리신(lysine) 잔기가 20%정도 포함하고 있어서 음전하를 가진 유전자와 전기적 상호결합을 할 수 있다.

하지만 현재까지 홍합 접착 단백질에 세포 투과성 펩타이드가 연결된 세포 투과성 접착 단백질에 대해서는 보고된 바가 없으며, 상기 세포 투과성 접착 단백질 나노입자에 유전자와 약물을 함께 탑재하여 동시전달하는 시스템으로 응용하려는 시도는 없었다.

따라서, 유전자와 약물을 함께 탑재하여 동시전달이 가능하며, 홍합 접착 단백질의 전달효과를 극대화하는 기술의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 홍합 접착 단백질의 전달 효과를 극대화하기 위한 연구를 진행한 결과, 홍합 접착 단백질을 이용하여 제작한 나노입자에 유전자와 약물을 동시에 탑재하는 것이 가능하며, 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드를 연결한 세포 투과성 접착 단백질이 약물과 유전자의 전달 효율을 극대화 시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 본 발명자는 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)가 융합된 세포 투과성 접착 단백질, 이를 이용한 약물 또는 유전자 전달용 나노입자 및 이의 제조방법을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)가 융합된 세포 투과성 접착 단백질, 이를 이용한 약물 또는 유전자 전달용 나노입자 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)가 융합된 세포 투과성 접착 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 투과성 접착 단백질의 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 세포 투과성 접착 단백질; 상기 도파와 배위결합 가능한 철 이온; 및 나노입자 내에 적재되는 약물 또는 유전자;로 구성된, 약물 또는 유전자 전달용 나노입자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 항암제를 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 홍합 접착 단백질에 세포 투과 펩타이드를 연결하여 세포 투과성 접착 단백질을 제조하는 단계; (2) 상기 세포 투과성 접착 단백질의 티로신 잔기를 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환하는 단계; (3) 상기 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 세포 투과성 접착 단백질 및 배위결합 가능한 철 이온을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 (4) 상기 혼합물에 약물 또는 유전자를 혼합하여 전기방사하는 단계를 포함하는, 약물 또는 유전자 전달용 나노입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 세포 투과성 접착 단백질을 이용하면, 홍합 접착 단백질의 세포 내 투과도가 상승하여 세포 내 전달 효율이 증가될 수 있고, 본 발명의 나노입자는 약물 및 유전자를 동시에 적재할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 내 투과도가 증가하여 목적하는 약물 또는 유전자를 세포 내로 효율적으로 전달하는 것을 통해, 원하는 효과를 극대화 할 수 있다.

도 1은 세포 투과성 접착 단백질을 이용하여 유전자와 약물을 동시 탑재한 나노입자를 나타낸 모식도이다.
도 2은 홍합 접착 단백질 기반의 세포 투과성 융합단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 MAP-TAT, MAP-iRGD 융합 단백질과 대조군 MAP 단백질의 용액상의 전하를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 홍합 접착 단백질과 GFP-p53 플라스미드(plasmid) 유전자의 복합체를 질소와 인의 상대적 비율(N/P ratio)에 따라 전기영동으로 나타낸 사진이다.
도 5은 GFP-p53 플라스미드 유전자를 내재한 홍합 접착 단백질 기반의 나노입자의 SEM 관찰결과이다.
도 6는 N/P ratio에 따른 GFP-p53 플라스미드 유전자를 내재한 홍합 접착 단백질 나노입자(MAP@GFP-p53 NPs)의 입자 크기 분포와 용액 내 전하를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 N/P ratio에 따라 제조한 MAP@GFP-p53 NPs의 항암효과를 분석하기 위한 세포 생존율을 도식화한 그래프이다.
도 8은 MAP@GFP-p53 NPs의 유전자 전달 효율을 분석하기 위한 mRNA 발현량을 도식화한 그래프이다.
도 9은 항암약물인 DOX와 GFP-p53 플라스미드 유전자를 동시에 내재한 홍합접착단백질 나노입자(MAP@DOX/GFP-p53 NPs)의 세포내 전달 및 발현을 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 붉은색은 DOX, 초록색은 GFP, 노란색은 붉은색과 초록색이 합쳐진 것으로 DOX와 GFP가 동시에 존재하는 것을 나타낸 형광 이미지이다.
도 10은 MAP@DOX/GFP-p53 NPs의 항암효과를 분석하기 위한 세포 생존율을 도식화한 그래프이다. 대조군으로 단일 유전자와 단일 약물을 각각 내재한 홍합접착단백질 나노입자(MAP@GFP-p53 NPs; MAP@DOX NPs)를 사용하였다.
도 11은 생체내에서 MAP@DOX/GFP-p53 NPs의 항암효과를 분석하기 위한 종양의 성장을 도식화한 그래프이다. 대조군으로 단일 약물, 단일 유전자, 그리고 MAP@GFP-p53 NPs 를 사용하였다.
도 12은 DOX와 p53 플라스미드 유전자를 동시에 내재한 MAP-TAT, MAP-iRGD 융합 단백질기반 나노입자(MAP-TAT@DOX/p53 NPs; MAP-iRGD@DOX/p53 NPs)의 SEM 관찰결과이다.
도 13은 MAP NPs과 MAP-iRGD NPs의 생체적합성을 분석하기 위한 세포 생존율을 도식한 그래프이다.
도 14는 약물과 유전자 동시전달에 있어서 융합단백질의 효과를 보기 위하여 MAP-iRGD@DOX/p53 NPs의 세포생존율을 도식화한 그래프이다. 대조군으로 DOX/p53와 MAP@DOX/p53 NPs를 사용하였다.

본 발명은 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)가 융합된 세포 투과성 접착 단백질을 제공한다.

본 발명의 상기 홍합 접착 단백질은 홍합에서 유래한 접착 단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합 접착 단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 홍합 접착 단백질은 상기 홍합 종에서 각각 유래한 Mefp(Mytilus edulis foot protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foot protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foot protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 및 Mgfp-5 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 fp(foot protein)-1 (서열번호 1), fp-2 (서열번호 5), fp-3 (서열번호 6), fp-4 (서열번호 7), fp-5 (서열번호 8), 및 fp-6 (서열번호 9)로 이루어진 군에서 선택된 단백질, 또는 상기 단백질 중 선택된 2종 이상의 단백질이 연결되어 있는 융합 단백질, 또는 상기 단백질의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 홍합 접착 단백질은 국제공개번호 제WO2006/107183호 또는 제WO2005/092920호에 기재된 모든 홍합 접착 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 홍합 접착 단백질은 fp-151(서열번호 10), fp-131(서열번호 12), fp-353(서열번호 13), fp-153(서열번호 14), fp-351(서열번호 15) 등의 융합 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 홍합 접착 단백질은 fp-1 에서 80번 정도 반복되는 데카펩타이드(서열번호 2)가 1 내지 12회 또는 그 이상으로 연속하여 연결된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 서열번호 2의 데카펩타이드가 12회 연속하여 연결된 fp-1 변이체 폴리펩타이드(서열번호 3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 홍합 접착 단백질은 홍합 접착 단백질의 접착력을 유지하는 전제 하에 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단이나 아미노 말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 홍합 접착 단백질의 카르복실 말단 또는 아미노 말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합 접착 단백질의 변이체의 예로는, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 fp-1 변이체-RGD 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 fp-151-RGD 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 전체 티로신 잔기가 카테콜 유도체로 변환된 것 일 수 있으며, 바람직하게는 티로신 잔기의 10 ~ 100%가 카테콜 유도체로 변환된 것일 수 있으며, 상기 카테콜 유도체는 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 홍합 접착 단백질은 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 티로신 잔기의 10 ~ 100%가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 것일 수 있다. 대부분의 홍합 접착 단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 20-30 %이다. 천연 홍합 접착 단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 카테콜 유도체인 도파(DOPA)로 변환된다. 그러나 대장균에서 생산된 홍합 접착 단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합 접착 단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 예시로, 티로시나제를 사용하여 티로신 잔기를 도파 잔기로 수정할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 버섯 티로시나제를 이용한 시험관내(in vitro) 효소 반응을 통해서 상기의 도파 전환율을 만족시키는 홍합 접착 단백질을 생산할 수 있다.

상기 카테콜 유도체는 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 금속과 배위결합이 가능하다. 구체적으로는, 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrin), 에피갈로카테킨(epigallocatechin gallate) 및 이들의 유도체 등일 수 있으며, 도파인 것이 바람직하다.

상기 배위결합 가능한 금속은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)와 배위결합을 할 수 있는 임의의 금속으로, 전형 금속 또는 전이 금속일 수 있다. 예로, 상기 금속은 배위결합이 가능한 티타늄(titanium), 바나듐(vanadium), 크롬(chrome), 망간(manganese), 철, 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 지르코늄(zirconium), 니오브(niobium), 몰리브덴(molybdenum), 테크네튬(technetium), 루테늄(ruthenium), 로듐, 팔라듐(palladium), 은, 하프늄(hafnium), 탄탈(tantalum), 텅스텐(tungsten), 레늄(rhenium), 오스뮴(osmium), 이리듐(iridium), 백금 및 금 등일 수 있으며, 철(Ⅲ)인 것이 바람직하다.

상기 카테콜 유도체 및 금속은 배위결합하여 금속-카테콜 유도체의 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 상기 금속-카테콜 유도체의 복합체는 Fe(Ⅲ)-도파 복합체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 홍합 접착 단백질에 존재하는 도파 및 Fe(Ⅲ)은 배위 결합을 통해 가교를 형성하는데, 도파와 Fe(Ⅲ)은 우리 몸 속에 이미 존재하는 물질이기 때문에 생체적합성이 우수한 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드(Cell-penetrating peptide, CPP)는 인 비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 이동 대상(cargo)을 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩티드를 의미하며, 바람직하게는 TAT 펩타이드 또는 iRGD 펩타이드일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 16의 TAT 펩타이드 또는 서열번호 17의 iRGD 펩타이드일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 접착 단백질은 홍합 접착 단백질과 세포 투과성 펩타이드(CPP)가 융합된 것일 수 있으며, 상기 융합에 의해 홍합 접착 단백질의 세포 내 투과도가 증가된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 18의 MAP-TAT 펩타이드 또는 서열번호 19의 MAP-iRGD 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 상기 나노 입자는 약물 또는 유전자를 적재하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 약물 및 유전자를 동시 적재하는 것 일 수 있다.

본 발명의 상기 약물은 저분자량 약물, 단백질 약물, 항체 약물, 합성화합물 약물 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 저분자량 약물은 독소루비신, 닥디토마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 시타라바인, 아자세르진, 메클로레타민, 시클로포스파마이드, 트라이에틸렌멜라민, 트레오설판, 레티노익산, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 피록시캄, 나프로센, 페노프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 메소트렉세이트, 메클로에타민, 덱사메타손, 프레드니솔론, 셀레콕시브, 발데콕시브, 니메슐리드, 코르티손, 및 코르티코스테로이드 등일 수 있다. 또한, 상기 단백질(protein) 약물은 단일클론 항체(monoclonal antibody)계의 트라스트주맵(trastuzumab), 리투시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 세투시맵(cetuximab), 보테조밉(bortezomib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 수니티닙(sunitinib); 효소(enzyme)계의 L-아스파라지나제(L-asparaginase); 호르몬(hormone)계의 트리톨레린 아세테이트(triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 고세레린(goserelin); 시토크롬 씨(cytochrome c), p53 단백질 등일 수 있다. 특히 상기 약물은 항암 효과가 있는 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 및 캄토테신 등의 항암제일 수 있다.

본 발명의 상기 유전자는 DNA, RNA, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA), 작은 RNA(Small RNA, smRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 파이RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA), 소핵소체RNA(small nucleolar RNA, snoRNA), t-RNA-유래 작은 RNA(tRNA-derived small RNA, tsRNA), 작은 rDNA-유래 RNA(small rDNA-derived RNA, srRNA), 소핵 RNA(small nuclear RNA, U-RNA) 및 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA, lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 핵산일 수 있으며, 종양 억제 유전자일 수 있다. 상기 종양 억제 유전자는 바람직하게 WT1, p53, p16, Rb, BRCA1 및 LK8 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 더 바람직하게는 p53일 수 있다.

본 발명의 상기 나노입자는 인체에 투입될 때에는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달될 수 있다. 적재된 약물은 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달될 수 있지만, 특히, 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 비경구란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 복합체 나노입자는 대표적으로 주사 제형으로 제제될 수 있다. 본 발명의 주사가능한 복합체 나노입자는 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.

본 발명의 상기 나노입자는 암, 알츠하이머, 심혈관 질환, 류마티스 및 골다공증 등의 질병에 사용될 수 있으며, 암 질병에 사용되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 포유류 동물, 특히 인간에게 발생되는 모든 암일 수 있으며, 바람직하게 상기 암은 피부암, 흑색종, 위암, 식도암, 결장암, 직장결장암, 췌장암, 대장암, 직장암, 담관암, 간암, 뇌종양, 백혈병, 육종, 골암, 유방암, 갑상선암, 폐선암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 내분비선암, 요도암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 전립선암, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 유방암 일 수 있다.

상기 나노입자는 개체에 투입될 때에는 주사, 경구, 피부 등 다양한 방법을 통해 전달될 수 있다. 적재된 약물은 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달될 수 있지만, 특히, 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 비경구란 근육내, 복막내, 복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로, 본 발명의 복합체 나노입자는 대표적으로 주사 제형으로 제제될 수 있다. 본 발명의 주사가능한 복합체 나노입자는 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유 동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체내 임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.

본 발명의 상기 나노입자를 이용하면, 표적 세포에 대한 유효물질을 효과적으로 전달할 수 있으며, 바람직하게는 표적 세포에 대해 약물 및 유전자를 동시에 전달하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 암 세포에 대해 항암제 및 종양 억제 유전자를 동시에 전달하여 암을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 나노입자는 세포독성이 없어 생체적합성이 우수한 것일 수 있다.

상기 항암제는 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 상기 항암제의 일일 투여량은 약 0.0001~100㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001~10㎎/㎏이며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 항암제는 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 (1) 단계는 단백질에 펩타이드를 연결하는 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중합효소연쇄반응을 이용하여 연결하는 것 일 수 있다.

본 발명의 상기 (2) 단계의 티로신 잔기를 도파로 변환하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 티로시나제를 사용하여 티로신 잔기를 도파 잔기로 변환하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 (3) 단계의 혼합은 철이온과 도파의 비율을 다양하게 하여 혼합하는 것 일 수 있으며, 바람직하게는 철이온과 도파의 비율이 1:1 내지 1:5의 몰(molar)비가 되도록 혼합하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 철이온과 도파의 비율이 1:3의 몰(molar)비가 되도록 혼합하는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 (4) 단계는 (3)단계의 혼합물을 약물 및/또는 유전자와 혼합한 후, 이를 전기방사하여 복합체 나노입자를 제조하는 단계일 수 있다. 전기방사공정은 고분자 용액이나 용융된 고분자를 소정 전압으로 하전시킬 때 발생하는 전기적 인력 및 척력을 이용하여 나노입자를 형성시키는 기술일 수 있다. 전기방사공정은 수 nm ~ 수천 nm 크기의 다양한 직경을 갖는 나노입자를 제조할 수 있으며, 장비 구조가 간단하고, 광범위한 재료에 적용이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 전기방사공정을 수행하기 위하여, 세포 투과성 접착 단백질, Fe(Ⅲ) 및 약물을 물 기반의 용매에 용해시킬 수 있다. 유기 용매 대신에 물 기반의 용매를 사용함으로써 전기방사동안 남아있는 용매의 독성 효과를 배제할 수 있다. 상기 물 기반의 용매는 증발성을 향상시키기 위하여, 유기 용매를 더 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 증류수에 대해 60~80% (v/v)의 에탄올을 더 혼합할 수 있다.

본 발명의 상기 (4) 단계의 혼합은 (1) 단계의 홍합 접착 단백질에 존재하는 질소 원자와 (4) 단계의 유전자에 존재하는 인 원자의 비율(N/P ratio)이 4 이상 1000 이하인 것일 수 있으며, 바람직하게는 4 이상 100 이하인 것일 수 있다. 상기 N/P ratio가 4 이상인 경우, 완전한 유전자 적재 단백질 복합체가 제조되는 것 일 수 있으며, N/P ratio가 작아질수록 제조되는 유전자 적재 단백질 복합체의 크기가 커지는 것일 수 있으며, 용액 내 전하(zeta potential)이 낮아지는 것 일 수 있다.

본 발명에 따른 독소루비신(DOX) 및/또는 P53 유전자 전달용 나노입자는 생체적합성이 우수할 뿐 아니라, 효과적인 세포 내 주입을 통해 암 세포에 대해 우수한 세포독성 효과를 나타내는 것 일 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 투과성 접착 단백질(MAP-CPP) MAP-TAT, MAP-iRGD 제조

12회 반복 연결된 데카펩타이드(AKPSYPPTYK)로 구성된 홍합 접착 단백질 fp-1(Mytilus mussel foot protein type 1) 변이체(서열번호 3)를 공지된 절차에 따라 제조하였다(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2010, 107, 12850-3). 상기와 같이 제조된 홍합접착단백질 fp-1에 세포 투과 펩타이드인 TAT(Giulia Guidotti, Liliana Brambilla, Daniela Rossi, 2017. Trends in Pharmacological Sciences 38: 406-424)와 iRGD(Ke Wang, Xiaofeng Zhang, Yang Liu, Chang Liu, Baohong Jiang, Yanyan Jiang, 2014. Biomaterials 35: 8735-8747)에 대한 서열의 프라이머(표 1)를 제작하여 중합효소연쇄반응을 이용하여 연결하였으며, 홍합접착단백질 fp-1, TAT 및 iRGD에 대한 프라이머 염기서열을 표 1에 나타내었다.

Primer	Nucleotide sequence (5' → 3')
Forward for fp-1	CATATGGCGAAACCGAGC
Reverse for TAT	CTCGAGTTACTGCGGCGGGCGGCGGCGCTGGCGGCGTTTTTTGCGGCCCTTGTACGTTGGAGGATAAGAAG
Reverse for iRGD	CTCGAGTTAGCAATCCGGGCCTTTATCGCCGCGGCACTTGTACGTTGGAGGATAAGAAG

T7 프로모터를 포함하는 pET-22b(+) 벡터를 플라스미드 운반체로 사용하였으며, 대장균 TOP10 균주에 형질전환하였다. 또한, 융합 단백질의 발현을 위하여, 클로닝된 재조합 벡터를 대장균 BL21 (DE3) 균주에 다시 형질전환하였다.MAP-TAT(Mussel adhesive protein-TAT) 혹은 MAP-iRGD(Mussel adhesive protein-iRGD) 유전자로 형질전환된 대장균 균주를 50μg/ml의 암피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 액체배지에서 37 ℃, 300 rpm의 조건으로 배양하였으며, 600 nm에 대한 광학 밀도(optical density; OD₆₀₀)가 0.4 내지 0.6 수준에 이르렀을 때, 1 mM의 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 동일 조건에서 8시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 4 ℃, 18,000 × g의 조건에서 10분 동안 원심분리하였으며, 용출 버퍼(10 mM Tris-HCl, 및 100 mM sodium phosphate, pH 8)에 재부유하여 200 Kpsi의 조건에서 세포 파쇄를 진행하였다. 이를 통해 얻은 세포 용해물(cell lysate)로부터 세포 파괴물(cell debris)를 얻어내기 위하여 4 ℃, 18,000 × g의 조건에서 20분 동안 원심분리하였으며, 25%(v/v) 아세트산을 이용하여 목적 융합 단백질인 세포 투과성 접착 단백질을 추출하고, 최종적으로 정제된 세포 투과성 접착 단백질은 동결건조를 거친 후 -80 ℃에서 보관하였다. 단백질에 대한 생산 및 정제는 12%(w/v) SDS-PAGE를 통해 분석하여 분석 결과를 도 2에 나타내었으며, 단백질의 농도는 Bradford assay(Bio-Rad)를 통해 측정하여 도 3에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 투과성 접착 단백질이 성공적으로 발현됨을 확인하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이 생산된 세포 투과성 접착 단백질 MAP-TAT(서열번호 18)와 MAP-iRGD(서열번호 19)는 대조군 단백질인 MAP에 비해 pH 7.4 용액에서 높은 양전하를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 세포 투과성 펩타이드가 주로 양이온을 띠는 아미노산으로 구성되어 있기 때문으로 확인하였다.

실시예 2. 유전자를 내재한 홍합접착단백질 나노입자 제조

2.1. DOPA-변환된 홍합 접착 단백질 MAP(Mussel adhesive protein) 준비

홍합 접착 단백질은 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌, DOPA)잔기를 통하여 철 이온과 결합하여 가교를 할 수 있으며, 주변의 pH에 따라 달라지는 도파-철 가교형태를 통해 나노입자를 형성할 경우, 약물의 제어방출이 가능하다. 한편, 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신 잔기를 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 필요하다. 이를 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 홍합 접착 단백질(MAP)과 세포 투과성 접착 단백질(MAP-CPP)를 티로시나제(mushiroom tyrosinase) 효소를 이용한 시험관내(in vitro) 효소 반응을 수행하여, 상기 MAP의 티로신 잔기를 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환하였다. 구체적으로는 1.50 mg/ml의 MAP 용액 및 100 μg/mL의 티로시나제를 버퍼용액 (100 mM 인산나트륨, 20 mM 붕산, 25 mM 아스코르브산, pH 6.8)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석하였다.

2.2. 유전자 적재 단백질 복합체 제조

상기 실시예 2.1.에서 제조한 도파 변환된 MAP를 이용하여 GFP-p53 플라스미드 유전자와 복합체를 제조하였다. 구체적으로, MAP 용액에 GFP-p53 플라스미드 유전자를 MAP 단백질에 존재하는 질소 원자와 GFP-p53 플라스미드 유전자에 존재하는 인 원자의 비율(N/P ratio)을 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64로 달리하여 가한 후, 30분간 상온에서 반응시켰다. 이렇게 제조한 복합체를 1%(w/v) 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 20분간 실시한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, N/P ratio가 4 이상일 경우에 완전한 유전자 적재 단백질 복합체가 제조되는 것을 확인하였다. 대조군으로 GFP-p53 플라스미드 유전자를 사용하였다.

2.3. 유전자 적재 단백질 나노입자 제조

상기 실시예 2.2.에서 제조한 유전자 적재 단백질 복합체를 이용하여 유전자가 탑재된 나노입자(MAP@GFP-p53 NPs)를 제조하기 위하여 전기방사 기술을 이용하였다. 구체적으로, 증류수:에탄올(30:70) 용매에 1.5~3 wt%의 MAP를 용해하고, FeCl₃ 용액을 가하여 Fe³⁺:DOPA가 1:3의 몰(molar) 비가 되도록 만든 후, 상기 혼합 용액을 전기방사하였다. 전기방사는 상기 용액을 실린지 펌프를 이용해 1 ml/h의 속도로 내보내면서 0.4 mm의 지름을 가진 바늘을 통과할 때 6~14 kV의 고전압을 걸어주면서 나노입자를 생성시키는 방식으로 진행하였고, 생성된 나노입자를 인산완충식염수(PBS; pH 7.4)를 포함하는 교반 수조 또는 알루미늄 호일 위에 수거하였다. 유전자 적재 나노입자의 형성을 확인을 위해 SEM 분석을 실시하여 그 결과를 도 5에 나타내었고, 질소와 인의 상대적 비율 (N/P ratio)에 따른 입자의 크기와 용액 내 전하(zeta potential)를 분석하여 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, SEM 분석에 의해 유전자 적재 나노입자의 형성을 확인하였으며, 도 6에 나타낸 바와 같이 DLS 분석 결과, 나노 입자 제조시, 질소와 인의 상대적 비율 (N/P ratio)이 작아질수록 입자의 크기가 커지는 것으로 나타났으며, 용액 내 전하(zeta potential)는 낮아지는 것으로 나타났다.

실시예 3. 유전자를 내재한 홍합접착단백질 나노입자의 유전자 전달 확인

상기 실시예 2.2.에서 제조된 MAP@GFP-p53 NPs의 유전자전달체로서의 효능을 확인하기 위하여 유방암세포 MDA-MB-231을 이용하여 in vitro 세포실험을 진행하였다. 구체적으로 37℃에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 분위기에서 MDA-MB-231 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)와 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양하고, 유지하였다. 세포를 0.25% 티로신-EDTA를 이용하여 분리한 후, 트립판 블루 분석법에 의해 계수된 생존 세포를 추가적인 분석을 위해 이용하였다. 독성 평가를 위해서, 세포를 초기에 웰 당 5 X 10⁴ 세포로 24-웰 배양 플레이트에 시딩하였고, 1일 동안 배양하였다. 각 웰마다 500ng의 유전자를 유리(free) GFP-p53 plasmid 유전자와 각 N/P ratio를 가진 MAP@GFP-p53 NPs을 배지에 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 배양 배지내로 CCK-8 시약을 처리하고 3시간 동안 배양한 후, 각 배지의 분취량으로부터 450nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 유리(free) GFP-p53 plasmid 유전자 처리군보다 MAP@GFP-p53 NPs가 처리된 실험군에서 유방암세포 MDA-MB-231의 사멸이 잘 유도되며, N/P ratio가 높은 MAP@GFP-p53 NPs가 처리된 실험군일수록 유방암세포 MDA-MB-231의 사멸이 잘 유도되는 것을 확인하였다.

유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) 분석을 실시하였다. 세포를 초기에 웰 당 5 X 10⁴ 세포로 24-웰 배양 플레이트에 시딩하였고, 1일 동안 배양하였다. 각 웰마다 500ng의 유전자를 유리(free) GFP-p53 plasmid 유전자와 N/P ratio가 60인 MAP@GFP-p53 NPs을 배지에 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 트리졸 시약(TRizol reagent)을 이용하여 세포로부터 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA를 cDNA로 합성한 후, 합성된 cDNA와 P53, BAX, p21의 mRNA를 프라이머와 혼합하여 thermal cycler를 수행하였다. 각각의 mRNA 발현량은 GAPDH mRNA 발현량에 표준화하여 도 8에 나타내었으며, 상기 프라이머의 염기서열을 표 2에 나타내었다.

		Sequence (5'→3')	Tm(℃)	Accession No.
P53	forward	CCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTC	68.25	NM_001126118.1
P53	reverse	GCAGCGCCTCACAACCTCCGTCAT	69.48	NM_001126118.1
BAX	forward	GGACGAACTGGACAGTAACATGG	61.17	NM_138764.4
BAX	reverse	GCAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC	60.85	NM_138764.4
P21	forward	GAGGCCGGGATGAGTTGGGAGGAG	68.21	NM_001798
P21	reverse	CAGCCGGCGTTTGGAGTGGTAGAA	67.18	NM_001798
GAPDH	forward	GAAGGTGAAGGTCGGAGTC	57.18	X01677
GAPDH	reverse	GAAGATGGTGATGGGATTTC	53.72	X01677

도 8에 나타낸 바와 같이, P53유전자의 mRNA 발현량은 MAP@GFP-p53 NPs의 경우 GFP-p53 plasmid 유전자보다 4배 이상 높은 것을 확인하였으며, p53 유전자의 하위 단계 유전자인 BAX와 p21의 mRNA 발현량 또한 증가하였음을 확인하였다. 이로부터, 유전자를 내재한 홍합접착단백질 나노입자에 의해 유전자가 효과적으로 전달되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자의 동시전달 확인

4.1. 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자 제조

상기 실시예 2.1에서 제조한 MAP를 이용하여 약물인 Doxorubidin(DOX)와 GFP-p53 플라스미드 유전자를 동시 적재한 단백질 나노입자(MAP@DOX/GFP-p53 NPs)을 제조하기 위하여, 실시예 2.1과 같이 MAP 용액 및 티로시나제를 버퍼용액에 반응시키고, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석한 용액에 GFP-p53 플라스미드 용액을 가하고 30분간 반응시킨 후, DOX 용액을 가하고 PBS에 직접 전기방사 하였다.

4.2. 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자의 동시전달 확인

상기 실시예 4.1.에서 제조한 MAP@DOX/GFP-p53 NPs을 이용하여 유방암세포 MDA-MB-231을 이용하여 in vitro 세포 실험을 진행하였다. 24-웰 배양플레이트에 웰마다 500ng의 유전자만큼 MAP@DOX/GFP-p53 NPs을 배지에 처리하고 24시간 동안 배양한 후, 세포 내 전달 평가를 세포 이미징을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 형광현미경을 통해 GFP-p53 유전자의 GFP가 발현된 것을 확인할 수 있으며, DOX의 형광도 세포에 확산되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자에 의해 약물 및 유전자가 모두 세포 내로 전달되는 것을 확인하였다.

유전자와 약물에 따른 항암효과를 알아보기 위하여, 실험군으로 24-웰 배양플레이트에 웰마다 500ng의 유전자만큼 MAP@DOX/GFP-p53 NPs을 배지에 처리하고 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양 배지내로 CCK-8 시약을 처리하고 3시간 동안 배양한 후, 각 배지의 분취량으로부터 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였다. 대조군으로 MAP@GFP-p53 NPs과 MAP@DOX NPs을 사용하여 동일하게 실시하였으며, 세포 생존율 측정 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, MAP@DOX/GFP-p53 NPs을 처리한 실험군에서 가장 낮은 세포 생존율이 확인되었다. 따라서, 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자에 의해 약물 및 유전자가 모두 세포 내로 전달되는 것을 다시 한번 확인하였다.

또한, 상기 실시예 4.1.에서 제조한 MAP@DOX/GFP-p53 NPs의 생체내에서의 항암효과를 확인하기 위하여 면역 결핍 누드 마우스 (BALB/c nude mouse)의 피하에 유방암세포 MDA-MB-231 세포를 1 X 10⁷ 세포로 주입하여 종양 모델을 만들었다. 종양의 크기가 ~200 mm³ 가 되었을 때, 수술을 통해 종양을 제거한 후, 그 위에 MAP@DOX/GFP-p53 NPs을 도포하였다. 40일 동안 종양의 부피를 아래와 같은 식으로 측정하였다.

종양 부피 = 길이 Х 너비²/2

대조군으로 DOX, GFP-p53, MAP@GFP-p53 NPs을 사용하였으며, 측정 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, GFP-p53 그룹에 비해 MAP@GFP-p53 NPs 그룹의 종양성장이 효과적으로 저해되었으며, MAP@DOX/GFP-p53 NPs의 경우 타 그룹보다 가장 큰 종양성장 저해 효과를 보임을 확인하였다. 따라서, 약물 및 유전자 동시 적재 단백질 나노입자에 의해 약물 및 유전자가 모두 세포 내로 전달되는 것을 in vivo 실험을 통해 확인하였다.

실시예 5. 세포 투과성 융합단백질 나노입자의 약물/유전자 동시전달 확인

5.1. 세포 투과성 융합단백질 나노입자의 제조

상기 실시예 2.1에서 제조한 도파 변환한 MAP-TAT와 MAP-iRGD를 이용하여 약물인 Doxorubidin(DOX)과 p53 플라스미드 유전자를 동시 적재한 단백질 나노입자(MAP-TAT@DOX/p53 NPs; MAP-iRGD@DOX/p53 NPs)를 제조하기 위하여 실시예 2.1 내지 2.3에 개시된 방법과 같이, 1.50 mg/ml의 MAP-CPP(MAP-TAT 또는 MAP-iRGD) 용액 및 100 μg/mL의 티로시나제를 버퍼용액 (100 mM 인산나트륨, 20 mM 붕산, 25 mM 아스코르브산, pH 6.8)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석한 용액(도파 변환된 MAP-TAT와 MAP-iRGD 용액)에, p53 플라스미드 용액을 가하고 30분간 반응시킨 후, DOX 용액을 가하고, FeCl₃ 용액을 가하여 Fe³⁺:DOPA가 1:3의 몰(molar) 비가 되도록 만든 후, 상기 혼합 용액을 PBS에 직접 전기방사하였다. 세포투과성 융합단백질 기반의 약물/유전자 동시 적재 나노입자의 형성을 확인을 위해 SEM 분석을 실시하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, SEM 분석에 의해 세포 투과성 융합단백질 기반의 약물/유전자 동시 적재 나노입자의 형성을 확인하였다.

5.2. 세포 투과성 융합단백질 나노입자의 생체적합성 확인

세포 투과성 융합단백질 나노입자의 생체적합성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2.1에서 제조한 도파 변환한 MAP-iRGD와 대조군으로 MAP를 이용하여 PBS에 전기방사하여 MAP-iRGD NPs와 MAP NPs를 제조하였다. 유방암세포 MDA-MB-231을 배양한 24-웰 배양플레이트에 0, 10, 20, 60, 120, 180, 200, 240μg/ml의 농도로 각 나노입자를 배지에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 생존율은 배양 배지내로 CCK-8 시약을 처리하고 3시간 동안 배양한 후, 각 배지의 분취량으로부터 450nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, MAP-iRGD NPs는 MAP NPs와 비슷한 생존력을 보였으며, 세포 독성을 가지지 않는 것을 확인하였다.

5.3. 세포 투과성 융합단백질의 항암효과 확인

세포 투과성 융합단백질의 항암효과를 확인하기 위한 in vitro 세포 실험을 진행하였다. 실험군으로 상기 실시예 5.1.에서 제조한 세포투과성 융합단백질 기반의 약물/유전자 동시 적재 나노입자인 MAP-iRGD@DOX/p53 NPs을 사용하였고, 대조군으로 DOX/p53과 MAP@DOX/p53 NPs을 사용하였다. 유방암세포 MDA-MB-231을 배양한 24-웰 배양플레이트에 웰마다 500ng의 유전자와 0.5μg의 약물만큼 각 NPs을 배지에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 생존율은 배양 배지내로 CCK-8 시약을 처리하고 3시간 동안 배양한 후, 각 배지의 분취량으로부터 450nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, MAP-iRGD@DOX/p53 NPs은 MAP@DOX/p53 NPs과 비교하여 더 뛰어난 항암효과를 나타내었다. 따라서, 세포 투과성 융합 단백질 기반의 약물/유전자 동시 적재 나노입자는 비-세포 투과성 융합단백질 기반 약물/유전자 동시 적재 단백질 나노입자보다 약물 및 유전자를 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는 것을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Drug and gene co-delivery system based on cell-penetrating adhesive protein nanoparticles <130> Postech1-64P-1 <150> KR 10-2018-0104699 <151> 2018-09-03 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 800 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fp-1 <400> 1 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 50 55 60 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 85 90 95 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 100 105 110 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 130 135 140 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 145 150 155 160 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 165 170 175 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 180 185 190 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 195 200 205 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 245 250 255 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 260 265 270 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 275 280 285 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser 290 295 300 Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 305 310 315 320 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 325 330 335 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 340 345 350 Pro Ser Tyr Pro Pro 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Claims

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티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 세포 투과성 접착 단백질; 상기 도파와 배위결합 가능한 철 이온; 및 나노입자 내에 동시 적재되는 약물 및 유전자;로 구성된, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자로서,
상기 세포 투과성 접착 단백질은, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 MAP-TAT 단백질; 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 MAP-iRGD 단백질인 것을 특징으로 하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
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제8항에 있어서, 상기 세포 투과성 접착 단백질의 티로신 잔기의 10 내지 100%가 도파로 변환된 것을 특징으로 하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 약물은 저분자량 약물, 단백질 약물, 항체 약물, 합성화합물 약물 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 약물은 독소루비신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플레틴, 카보플래틴, 5-FU, 에토포시드, 및 캄토테신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 항암제인 것을 특징으로 하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, RNA, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA), 작은 RNA(Small RNA, smRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 파이RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA), 소핵소체RNA(small nucleolar RNA, snoRNA), t-RNA-유래 작은 RNA(tRNA-derived small RNA, tsRNA), 작은 rDNA-유래 RNA(small rDNA-derived RNA, srRNA), 소핵 RNA(small nuclear RNA, U-RNA) 및 긴 비암호화 RNA(long noncoding RNA, lncRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 핵산인 것을 특징으로 하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 유전자는 종양 억제 유전자인 것을 특징으로 하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제14항에 있어서, 상기 종양 억제 유전자는 WT1, p53, p16, Rb, BRCA1 및 LK8 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 나노입자는 피부암, 흑색종, 위암, 식도암, 결장암, 직장결장암, 췌장암, 대장암, 직장암, 담관암, 간암, 뇌종양, 백혈병, 육종, 골암, 유방암, 갑상선암, 폐선암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 두경부암, 방광암, 내분비선암, 요도암, 난소암, 고환암, 신장암, 방광암, 전립선암, 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 암 예방 또는 치료용인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항에 있어서, 상기 나노입자는 생체적합성을 가지는 것을 특징으로 하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자.
제8항의 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자를 포함하는, 항암제.
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다음 단계를 포함하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자의 제조방법:
(1) 홍합 접착 단백질에 세포 투과 펩타이드를 연결하여 세포 투과성 접착 단백질을 제조하는 단계;
(2) 상기 세포 투과성 접착 단백질의 티로신 잔기를 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환하는 단계;
(3) 상기 티로신 잔기가 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)로 변환된 세포 투과성 접착 단백질 및 배위결합 가능한 철 이온을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 혼합물에 약물 및 유전자를 혼합하여 전기방사하는 단계;
상기 (1) 단계의 세포 투과성 접착 단백질은, 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성된 MAP-TAT 단백질; 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성된 MAP-iRGD 단백질인 것을 특징으로 하는, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자의 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 (3) 단계의 혼합은 철이온과 도파의 비율이 1:1 내지 1:5의 몰(molar)비가 되도록 혼합하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자의 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 (1) 단계의 홍합 접착 단백질에 존재하는 질소 원자와 상기 유전자에 존재하는 인 원자의 비율(N/P ratio)이 4 이상 1000 이하인 것을 특징으로 하는 것인, 약물 및 유전자 동시 전달용 나노입자의 제조방법.