JP7139317B2 - 抗レプチン中和抗体を検出する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年9月12日に出願された米国仮出願第62/393632号の利益を主張する。
試料中のレプチンに対する中和抗体を検出する方法が、本明細書に記載される。例示的な方法は、(a)試料中に存在するレプチンを不活性化する工程;(b)既知量の標識レプチンを試料に添加する工程;(c)(b)の標識レプチンを含有する試料を、標識レプチンを結合することができる基板と接触させる工程;(d)未結合の標識レプチンを除去するために基板を洗浄する工程;及び(e)基板結合した標識レプチンによって生成された標識シグナルを測定する工程を含む。
る特定の実施形態では、カットポイントは、対象が治療を継続するべきかどうか、又は対象が治療に応答性であるかどうかを決定するために使用され得る。例えば、差の割合がカットポイントに等しい又はそれ未満である場合、対象は治療を中断すべきである、又は対象は治療に応答しないと決定され得る。
本発明の他の態様は、本発明の方法を実行するための構成要素を含むキットである。このようなキットは、標識レプチン、及び本発明の方法で使用するための上記される標識レプチンに結合することができる基板を含み得る。例えば、一部の実施形態では、レプチンは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルテニウムトリス-ビピリジンで標識され得る。ある特定の実施形態では、レプチンはメトレレプチンである。
対象試料は、それらが含有する中和抗体のレベルを決定するために、以下のように試験され得る(図4も参照されたい)。
1.ストレプトアビジン被覆されたプレートをSuperblockを用いて1時間遮断する。
2.対象試料を熱不活性化する。
3.ルテニウム(Ru)スルホタグ付けされたレプチン又はメトレレプチンを各試料に添加する。陽性対照試料は、Ruスルホタグ付けされたレプチン又はメトレレプチン及び抗レプチン陽性対照抗体muLEP13-11.03を添加することによって調製される。試料を室温で2時間インキュベートする。
4.ストレプトアビジンプレートをリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄する。PBSで希釈したビオチン標識された抗ヘキサヒスチジン抗体をプレートに添加し、室温で1時間インキュベートする。
5.プレートをPBSで洗浄し、希釈したヘプタヒスチジンタグ付けされたレプチン受容体タンパク質をプレートに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートする。
6.プレートをPBSで洗浄し、試験試料及び対照試料(上記の工程2から)をプレートに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートする。
7.プレートをPBSで洗浄し、MSD ESLリーダーで読み取る。
実施例1に記載される手順を以下のように変更することにより、任意選択の酸解離工程を実行することができる(図5も参照されたい)。
1.熱不活化後、試料を0.8%酢酸溶液中、室温で1時間インキュベートして、試料中のいずれの結合抗体も解離させる。
2.スルホタグ付けされたレプチン又はメトレレプチンを0.124MのTham緩衝液中で希釈する。これは添加時に酢酸試料を中和し、抗体結合を可能にする。
カットポイントは、以前にメトレレプチン治療を受けたことがある疾患対象、及び正常な非疾患治療におけるレプチン及びメトレレプチンシグナルの阻害パーセントに基づいて計算された。正常及び以前に治療された疾患対象におけるレプチン結合阻害のカットポイントは、10.18%阻害であった。以前に疾患対象を治療したことがある対象におけるメトレレプチン結合阻害のカットポイントは9.66%の阻害であり、正常な対象においては7.89%の阻害であった。すべてのカットポイントは1%の偽陽性率を生じるように設定された。カットポイントデータは図6に示されている。
17人の患者由来の試料を上記の方法に従ってレプチン及びメトレレプチンシグナル阻害について試験した。データは、図6及びTable 2(表2)~Table 4(表4)に示されている。
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文書への言及及び引用は、本開示を通じてなされている。このような文書はすべて、本明細書によって、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更及びそれらの多数の更なる実施形態は、本明細書に引用された科学文献及び特許文献への言及を含む、この文書の全内容から当業者に明らかとなる。本明細書における主題は、その様々な実施形態及びそれらの同等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示及び手引きを含有する。
Claims (13)
- 試料中のレプチンに対する中和抗体を検出する方法であって、
(a)試料中に存在するレプチンを不活性化する工程;
(b)既知量の標識レプチンを試料に添加する工程;
(c)(b)の標識レプチンを含有する試料を、標識レプチンを結合することができる基板と接触させる工程;
(d)未結合の標識レプチンを除去するために基板を洗浄する工程;及び
(e)基板に結合した標識レプチンによって生成された標識シグナルを測定する工程
を含み、
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(i)被覆マトリックス;及び
(ii)(i)のマトリックスに結合したタグ付けされたレプチン受容体、
を含み、又は
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(iii)被覆マトリックス;
(iv)(iii)のマトリックスに結合した抗体;及び
(v)(iv)の抗体に結合したタグ付けされたレプチン受容体
を含む、方法。 - 血液、血清、又は血漿中のレプチンに対する中和抗体を有する対象を同定する方法であって、
(a)対象の血液、血清、又は血漿に由来する試料中に存在するレプチンを不活性化する工程;
(b)既知量の標識レプチンを試料に添加する工程;
(c)(b)の標識レプチンを含有する試料を、標識レプチンを結合することができる基板と接触させる工程;
(d)未結合の標識レプチンを除去するために基板を洗浄する工程;
(e)結合した標識レプチンによって生成された標識シグナルを測定する工程;
(f)工程(a)~(e)に加えて、工程(b)で既知量の抗レプチン抗体を添加することを更に含む工程を完了することによって生成された陽性対照シグナルを測定する工程;及び
(g)(e)からのシグナルを(f)からのシグナルと比較する工程であって、工程(e)で測定されたシグナルのレベルが、工程(f)で測定されたシグナルのレベル以下であることが、対象が抗レプチン中和抗体について陽性であることを示す、工程
を含み、
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(i)被覆マトリックス;及び
(ii)(i)のマトリックスに結合したタグ付けされたレプチン受容体、
を含み、又は
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(iii)被覆マトリックス;
(iv)(iii)のマトリックスに結合した抗体;及び
(v)(iv)の抗体に結合したタグ付けされたレプチン受容体
を含む、方法。 - 血液、血清、又は血漿中のレプチンに対する中和抗体を有する対象を同定する方法であって、
(a)対象由来の血液、血清又は血漿の試料、又は、抗レプチン中和抗体を含まない血液、血清、もしくは血漿の試料中に存在するレプチンを不活性化する工程;
(b)既知量の標識レプチンを試料に添加する工程;
(c)(b)の標識レプチンを含有する試料を、標識レプチンを結合することができる基板と接触させる工程;
(d)未結合の標識レプチンを除去するために基板を洗浄する工程;
(e)結合した標識レプチンによって生成された標識シグナルを測定する工程;
(f)工程(a)~(e)を完了することによって生成された陰性対照シグナルを測定する工程であって、抗レプチン中和抗体を含まない血液、血清、又は血漿の試料を用いて行われる、工程;及び
(g)(e)からのシグナルと(f)からの最大シグナルとの差を最大シグナルで割ることによって計算される値をカットポイントと比較する工程であって、前記値がカットポイントより大きいことが、対象が抗レプチン中和抗体について陽性であることを示す、比較する工程
を含み、
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(i)被覆マトリックス;及び
(ii)(i)のマトリックスに結合したタグ付けされたレプチン受容体、
を含み、又は
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(iii)被覆マトリックス;
(iv)(iii)のマトリックスに結合した抗体;及び
(v)(iv)の抗体に結合したタグ付けされたレプチン受容体
を含む、方法。 - カットポイントが、約5%~約40%の間である、請求項3に記載の方法。
- 標識レプチンが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、又はルテニウムトリス-ビピリジンで標識されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 不活性化工程(a)が、試料を加熱することによって達成される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- レプチン受容体が、ビオチンでタグ付けされている、請求項1に記載の方法。
- 被覆マトリックスがストレプトアビジン被覆されたマトリックスである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- レプチン受容体が、ヘキサヒスチジンタグでタグ付けされている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体が、抗ヘキサヒスチジン抗体である、請求項9に記載の方法。
- 抗体が、被覆マトリックスに結合するのに適したタグで標識されている、請求項1から7、9又は10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)で添加される標識レプチンが、標識メトレレプチンである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中のレプチンに対する中和抗体を検出するために使用するキットであって、(a)標識レプチン、及び(b)標識レプチンを結合することができる基板を含む、
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(i)被覆マトリックス;及び
(ii)(i)のマトリックスに結合したタグ付けされたレプチン受容体、
を含み、又は
標識レプチンを結合することができる前記基板が、
(iii)被覆マトリックス;
(iv)(iii)のマトリックスに結合した抗体;及び
(v)(iv)の抗体に結合したタグ付けされたレプチン受容体
を含む、キット。
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