JP5222138B2 - 脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（ａ−ｆａｂｐ、ｆａｂｐ４、ｐ２）の濃度を測定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、インスリン非依存型糖尿病（II型糖尿病）、インスリン抵抗性、肥満症（Obesitas/Adipositas/Fettsucht）および種々の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの診断および研究のために、脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（A-FABP、FABP4、P2）の濃度を測定する方法に関する。本発明はさらに、この方法を実施するための試験キットに関する。

応用分野としては医薬が挙げられ、ここでは特に医学的診断である。

症候群X、インスリン抵抗性症候群またはマルチプルメタボリックシンドロームとしても呼ばれるメタボリックシンドロームは、生体の脂質、炭水化物、タンパク質、鉱物性物質等の代謝の障害を表し、これは遺伝子および／または生活習慣によって生じ得るものである。以下のものがメタボリックシンドロームに属する：インスリン抵抗性、脂質異常症、動脈高血圧症および肥満症。

インスリン抵抗性は、生体自身のインスリンに対する非感受性として定義される。II型糖尿病の患者のみでなく、実質上健康であり、太り過ぎでないヒトの約20%がインスリン抵抗性に罹患している。インスリン抵抗性の原因は、今日でもまだ明確には解明されていない。インスリン抵抗性の特徴には、高インスリン血症ならびにブドウ糖毒性および脂肪毒性によって生じるβ細胞の疲憊、脱感作およびアポトーシスが含まれる。

脂質異常症は、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂質血症（上位概念としては血中脂肪値の上昇）という形態の脂質代謝障害である。これは、高いトリグリセリド値および低いHDL-コレステロール値、小さくて密なLDL粒子、ならびに遊離脂肪酸の高含有量を特徴とする。障害の範囲は、「日常的な」（多遺伝子性）高コレステロール血症（人口の約10%）から、遺伝的な原因によるまれな脂質代謝障害までにわたっている。脂質異常症は、アテローム性動脈硬化症、特に冠状動脈性心臓病の危険因子である。さらに、遊離脂肪酸はインスリン抵抗性状態の維持の一因となるものである。

心臓血管疾患および特に冠状動脈性心臓病（KHK）は、メタボリックシンドロームの予後判定的に重要な合併症であり、このような患者群の主要な死因でもある。

本発明の目的は、II型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症および／または関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの早期発見および／または観察である。本発明は、I型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症および／または関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの診断および治療におけるリスク評価および経過観察のために、適当なパラメーターを測定することが可能な方法および試験キットを開発する、という課題に基づくものである。

本発明は請求項1〜請求項11により具現化され、従属請求項は好ましい変形を表すものである。本発明は、血清、血漿、尿もしくはその他の細胞外体液における、または脂肪組織におけるA-FABPの濃度を測定し、そしてこの濃度を脂肪酸代謝の障害に関連するメタボリックシンドローム、その付随疾患、初期形態および二次疾患の診断または研究に使用するという、中心的着想に基づくものである。

脂肪細胞および脂肪代謝が、メタボリックシンドロームおよびII型糖尿病の発生、進行および経過において非常に中心的な役割を果たす。脂肪細胞の細胞質性タンパク質は脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（A-FABP、FABP4またはP2と略す）であり、脂肪細胞の細胞質中の長い脂肪酸、プロスタノイド、レチノイン酸および類似の水不溶性分子を輸送する。A-FABPの濃度を健常者およびII型糖尿病の血清中において比較し、その際、検査されるヒトの体重における脂肪組織の割合に関する指標としてボディー・マス・インデックスを考慮した。A-FABPは脂肪細胞の細胞内タンパク質であり、血液循環中にほとんど存在しないはずであるにもかかわらず、通常の健康なヒトにおいてはナノグラム範囲（ng/ml）のA-FABPレベルが見られる。

血清中のA-FABPレベルは脂肪細胞ホルモンであるレプチンのレベルの約2倍であり（レプチン濃度 ± 8 ng/ml；A-FABPは± 16〜20 ng/mlである）、A-FABPが血液循環中に能動的に分泌されることが明らかである。さらに、A-FABPが細胞内の機能に依存しない別の（シグナル）効果に起因し得るということを排除することはできない。しかしながら、体液中のA-FABP濃度の測定がメタボリックシンドロームの確認および観察に適しているということは、全く予期しなかったことである。

従って、本発明は、細胞外体液におけるF-ABPの含有量の有意な増加が、インスリン非依存型糖尿病（II型糖尿病）、インスリン抵抗性、肥満症（Obesitas/Adipositas/Fettsucht）および関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドローム、その初期形態、付随疾患および二次疾患と結び付いているという、全く予期せずに得られた知見に基づくものである。

従って本発明は、メタボリックシンドロームおよび関連の物質代謝疾患の診断および／または研究に、体液における、特に血清からのF-ABP濃度（脂肪酸輸送能）を使用する方法に関する。さらに、体液、特に血清中のA-FABPの濃度が、II型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症および関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの別のパラメーターの濃度と有意に相関することは、全く予期されないことであった。メタボリックシンドロームおよび上述の物質代謝障害の診断および観察のために、本発明では、体液および／またはその希釈溶液中のF-ABP濃度が測定される。

本発明の実施には、体液中のまたは体液からのA-FABPの濃度の測定が容易であるため、特に光学的評価および／またはバイオセンサーによる評価と組み合わせたイムノメトリック系が特に好適である。その際に、特に、固相／キャリアー材料に結合し、A-FABPまたはそれに由来する構造に対してアフィニティーを有する種々の特定濃度のキャプチャー分子を滴定または使用することにより、特定のまたは既知の濃度のA-FABPを用いて標準化／キャリブレーションを行う場合には、例えば、測定される体液の種々の濃度について同時にまたは順次に測定することによってA-FABPの濃度が測定可能である種々の系を使用することができる。

これに関連して、体液中のまたは体液からのA-FABPの濃度の測定に適した物質がその表面において固定化されたキャリアー材料を含む方法もまた有利である。これは特に、F-ABPに対してアフィニティーを有する分子または該分子から構成される物質、好ましくはタンパク質、例えば抗F-ABP抗体であることができる。A-FABPの部分的断片、特にペプチド鎖、または部分的断片から構成されるペプチドに対してアフィニティーを有する物質を固定化することも可能である。

キャリアー材料としては、分子をその表面上に固定化できる材料またはコーティングされた材料は全て適しており、特に、ニトロセルロースもしくはPVDF、または例えばELISAプレートのウェルにおける生物物理学的な固定化用の他の材料が好適である。しかし、静電相互作用を介する固定化または化学結合による固定化、例えば、いわゆる（クロス−）リンカーの使用もまた可能である。特に、例えば、表面プラズモン共鳴または電気化学的量を含むバイオセンサーによる測定のための固定化には、例えば金またはコーティングされた金表面もまた好適である。本発明の方法の実施には、特に、少なくとも部分的に平らに形成された表面を有するキャリアー材料、例えば、ガラスチップもしくはプラスチックチップまたはELISAプレートが有利であり、これは例えばスキャナーまたはELISAリーダーを用いることにより、本発明の方法の実施が特に容易になるからである。固定化されたキャプチャー分子、特に抗A-FABP抗体によって部分的に設けられる領域（例えば、スポット）が形成される平らな表面、例えばセルロースまたはチップの表面上に加えて、特に、ELISAプレートのウェルの底面もまた、体液からのA-FABP濃度の測定に好適である。

イムノメトリック系としては特に、いわゆる酵素結合イムノソルベント検定法（ELISA）または色素で標識された分子を用いる同等の系が好適であり、これによって、特に感度が高いA-FABP濃度測定系が得られる。この場合には、A-FABPもしくはそれに由来する分子に対してアフィニティーを有する1種またはそれ以上の物質、例えば抗体が固定化されているキャリアー材料を、体液または体液を含有する溶液と接触させることにより、体液を含む溶液に場合により存在するA-FABPまたはそれに由来する形態／配列が、キャリアー材料の表面付近の物質と結合することができる。これに関して、体液はインキュベーション溶液、例えばブロッキングバッファーに溶解することができ、これによって、例えば、非特異的相互作用の減少により、シグナル／ノイズ比が改善する。表面上に結合したA-FABPまたはそれに由来する分子の検出のために、多くの場合は洗浄段階後に、溶解させた物質、好ましくは抗A-FABP抗体がキャリアー材料上に加えられ、この場合に、溶解させた検出物質が同様にA-FABPに対するアフィニティーを有するので、キャリアー材料付近において、キャリアー材料の付近で結合しているA-FABP上に結合する。A-FABPまたはそれに由来する分子に結合した検出物質／抗体の検出は、種々の方法で行うことができる。検出物質または抗A-FABP抗体には、例えば、色素、特に蛍光色素を、または例えば検出溶液からの基質を光学的に検出可能に変換できる酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼを用いることにより、標識を既に備えさせておくことも可能である。しかしながら、検出物質、特に抗体はまた、別の標識物質、例えばストレプトアビジンに対してアフィニティーを有する分子、例えばビオチンを備えていてもよい。検出物質／抗A-FABP抗体自体が標識されていない場合には、標識された二次抗体が特に好適であり、これを主に洗浄段階の後に添加することにより、キャリアー材料の表面上の検出物質／抗A-FABP抗体を可視化することができ、または後続の光学的評価が可能になる。

メタボリックシンドローム、その初期形態、付随疾患および二次疾患、II型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症または関連の物質代謝障害の診断および研究にとっては、本発明によって測定したA-FABP濃度を、別の特徴、例えば、年齢あるいは性別、ボディー・マス・インデックスと、またはメタボリックシンドロームに特徴的な代謝の成分、特にインスリン（例えばQuicki値）、グルコース、トリグリセリド、アディポネクチン、レプチン、全コレステロール、HDL-コレステロールおよび／またはLDL-コレステロールと関連付けて認識することも好適かつ有利である。A-FABPと少なくとも1種の他のパラメーターとの組み合わせにより、有利には、メタボリックシンドロームの他のパラメーターの予測もまた行うことが可能である。

本発明を実施することにより、簡単な方法でメタボリックシンドロームの特性を推測することができ、特にII型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症（Obesitas/Adipositas/Fettsucht）および関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの簡単かつ価格的に有利な診断または観察も可能になる。例えば、組織中または細胞中の病的な経過から直接推測することが可能なので、組織サンプルの採取も不要である。本発明の有利な点は、特に、メタボリックシンドロームのまだ早期の段階を検出可能なことである。これによって初めて、メタボリックシンドロームに関連した病状が発現する前の早期に既に、例えば、食餌療法または運動を指示することにより、または適当な薬剤を投与することにより、患者のための対応策を取ることが可能になる
本発明によって、脂肪、糖およびエネルギー代謝に影響を及ぼすために、ホルモンに類似した物質としてA-FABPを使用することもまた可能となる（図20参照）。A-FABPに正の効果が存在する場合には、A-FABPまたはその断片またはその模倣剤は医薬品として使用することができる。効果が負の場合には、A-FABPブロッカーが薬効を有する。

図20は脂肪細胞培養の細胞培養上清の二次元電気泳動を示すものであり、A-FABPの非常に大きく、明瞭なスポットが見られる（タンパク質の同定は、マススペクトルメーターを用いるN末端の配列決定によって行われる。）。ウエスタンブロットを用いた場合に上清にベータ-チューブリン（細胞内構造タンパク質）が確認されないという事実は、A-FABPが脂肪細胞の崩壊によってではなく、実際に分泌によって培地に入るということを示すものである。

従って、本発明は、メタボリックシンドロームおよびII型糖尿病の診断および治療におけるリスク評価および経過観察に関して全く新しい可能性を提供するものである。

本発明を本願実施例を用いて以下に詳細に説明する。

実施例1：
486人の被験者において、血清中のA-FABPを測定した。100人が標準的な体重を有する健常者、100人が脂質異常症を有するが肥満ではなく、メタボリックシンドロームの別の特徴を持たない患者、86人がII型糖尿病、100人が肥満、そして100人がメタボリックシンドロームの患者であった。A-FABPの他に、以下のパラメーターの測定も行った：ボディ・マス・インデックス（BMI）、グルコース、インスリン、量的インスリン感受性検査指数（QUICKI）、アディポネクチンおよびE-FABP（表皮型脂肪酸結合タンパク質）。

各被験者群において、A-FABP濃度範囲は図1に示されるような結果が得られた。

ボディ・マス・インデックスで修正すると（A-FABPをBMIで割る）、図2のような分布となった。

A-FABP値をQUICKI指数で割ると、図3に示される分布が得られた。

測定されたデータからは、A-FABPレベルが標準的な健常者とメタボリックシンドローム患者とを非常に有効に区別し、しかもこれがボディ・マス・インデックスに依存しないということが見出され、これは非常に驚くべきことであり、そして明確なことであった。

さらに、グルコースの濃度、インスリン、量的インスリン感受性検査指数（QUICKI）およびトリグリセリドを測定し、A-FABPの測定値との相関を調べた（図4〜7）。

グルコース、インスリン、QUICKIおよびトリグリセリドの測定値、すなわちメタボリックシンドロームに特徴的なパラメーターが、測定したA-FABPの濃度と正相関を示すことが明らかに認められた。
図1および図2からの値をさらに用いれば、体液からのA-FABPの測定値がメタボリックシンドロームおよび関連の物質代謝疾患と直接関連付けられることは明らかである。

実施例2：
48人の女性（血清サンプルが利用でき、そしてこの中にはメタボリックシンドロームである女性が含まれ得る）において、A-FABP、E-FABP、全コレステロール、HDL-コレステロールおよびLDL-コレステロールの濃度を測定した。A-FABPまたはE-FABP値を全コレステロール（図8）、HDL-コレステロール（図9）およびLDL-コレステロール（図10）の値に対してそれぞれ適用することにより、A-FABPがII型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症（Obesitas/Adipositas/Fettsucht）および関連の物質代謝障害を含むメタボリックシンドロームの最も重要なパラメーターと密接に相関することが明確に認められた。

実施例3：
組換えヒトA-FABPの製造：
cDNA配列：
ATGTGCGATGCGTTTGTGGGCACCTGGAAACTGGTTAGCAGCGAAAACTTCGATGATTACATGAAAGAAGTGGGCGTTGGTTTTGCGACCCGCAAAGTTGCGGGTATGGCGAAACCGAACATGATTATCAGCGTGAACGGCGATGTGATTACCATCAAAAGCGAAAGCACCTTCAAAAACACCGAAATCAGCTTTATCCTGGGCCAGGAATTTGATGAAGTGACCGCGGATGATCGTAAAGTGAAAAGCACCATCACCCTGGATGGTGGTGTTCTGGTGCATGTGCAGAAATGGGATGGCAAAAGCACCACCATCAAACGCAAACGCGAAGATGATAAACTGGTGGTGGAATGCGTGATGAAAGGTGTTACCAGCACCCGTGTTTATGAACGTGCG
アミノ酸配列：
MCDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMIISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDGGVLVHVQKWDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYERA
発現したタンパク質は、追加的なアミノ酸またはタグを含有していない。
タンパク質サイズ：132アミノ酸；分子量：約14720 Da
発現株：
E.coli： BL21DE3(pRSET-FABP4)-1
発現方法：
・ SOB培地（4.5 L）にE.coli BL21DE3(pRSET-FABP4)-1の一晩培養物を播種した。
・ 振とう器において37℃で培養を行った。
・ 培養の3.5時間後に誘導剤IPTGをOD = 0.69で添加した。
・ 発現を4時間後に終了させた。光学密度はOD = 1.52に達した。
・ 細菌を遠心分離し、68.4 mlのPBSバッファーにおいて理論上OD = 100まで濃縮した。
・ 細菌の超音波処理により、可溶性A-FABPを得た。

A-FABPの発現解析（図11）：
タンパク質の分離の結果、レーン2〜5ではA-FABPが明確なタンパク質バンドとして検出でき、これに対してコントロールレーン1では対応するバンドが示されなかった。

＜抗体取得および処理＞
A-FABPに対してポリクローナル抗体を製造し、アフィニティー精製を行った。

1. 動物の免疫処置
1.1. ヤギ
ヤギ（No.589）に以下のスキームで免疫処置を行った：

CFA −コンプリートフロイントアジュバント
IFCA −インコンプリートフロイントアジュバント
1.2. ウサギ
ウサギ（No.68および69）に以下のスキームで免疫処置を行った：

CFA −コンプリートフロイントアジュバント
IFCA−インコンプリートフロイントアジュバント
2. 血清取得
血液（ヤギ由来もウサギ由来も）を4℃、2400 Gで20分間遠心分離し、得られた血清を-20℃で保存した。

3. アフィニティー精製
3.1. アフィニティーカラムの製造
供給元のマニュアルに従って1mgのA-FABPをPoros AL（Applied Biosystems製）0.45gに固定した。

3.2. 抗体精製
抗体を0.1M PBS（pH 7.4）においてカラムに結合させ、0.1 PBS、13 mM HCl、0.15mM NaClで溶出した。

アフィニティークロマトグラフィーの結果を図12（ウサギ由来抗体の精製）および図13（ヤギ由来抗体の精製）に示す。

3.3. 純度および力価測定に関する抗体の試験
3.3.1. 精製した抗体を12%のSDS-PAGEで分離し、クマシーブルーで染色した（図14）。

3.3.2. 間接ELISAによる力価測定
マイクロタイタープレート（Nunc製）を25 ng／ウェルのA-FABPでコーティングした。アフィニティー精製した抗体を最初に1mg／mlの濃度でピペットに取り、1：3で系列的に希釈した。

力価は、1.5未満の吸光度を有する抗体希釈として定義した：
ヤギ：
力価：270000、量：4.4 mg。

ウサギ：
力価：90000より大きい、量：4.8 mg。

＜ELISAの説明＞
ELISAプレート：
マイクロタイタープレートのコーティングには、アフィニティー精製されたヤギ抗体（4μg／ml）を炭酸水素塩バッファー（0.1M）において使用した。4.0℃で一晩コーティングを施した後に、プレートをPBSで洗浄し、TPSにおける0.5% BSA、4％ショ糖を用いて室温で30分間ブロッキングを行った。

標識：
アフィニティー精製したウサギ抗体をビオチン-LC-LC-NHS-スルホ（Pierce製、カタログ番号21338）で製造元のマニュアルに従って標識し、33μg／mlの濃度で使用した。

ストレプトアビジン-HRP標識体は、Roche者から購入した（カタログ番号1089153）。

キャリブレーター：
組換えヒトA-FABPを凍結乾燥し、最初に濃度500 ng／mlをマスターキャリブレーターとして使用した。

実際のElisa試験は図15に示すように行った。

最後に、以下の試験特性を確認した：
a）ヒトA-FABPに対する典型的な検量線：ELISAを行ったところ、A-FABP の濃度測定の感度は100 pg／ml未満であった（図16）。
b）回収率（Wiederfindung）／希釈（表1参照）

c）回収率（Wiederfindung）／添加（表2参照）

d）精度−試験間（表3参照）

e）精度−試験間（表4）

f）健康な大人におけるA-FABPに関する値分布は図17に示すとおりであった。
g）A-FABP値における年齢の影響は図18によって確認した。
h）A-FABP値における性別の影響を調べた（表5参照）。

i）66人の女性の群において、標準範囲を確認または設定した（図18も参照）：
最小値：7.7 ng／ml
最大値：45.1 ng／ml
平均：19.58 ng／ml
標準偏差：8.16
正常範囲（x±2s）：19.8±16.32 ng／ml。

図1は、486人の被験者における血清中A-FABPの測定結果を示す。 図2は、図1からの値をボディ・マス・インデックスで修正した結果を示す。 図3は、QUICKI指数の値によって割ったA-FABP値を示す。 図4は、被験者のA-FABP測定濃度とインスリン測定濃度との間の相関を示す。 図5は、被験者のA-FABP測定濃度とグルコース測定濃度との間の相関を示す。 図6は、A-FABP測定濃度とQUICKI指数との間の相関を示す。 図7は、A-FABP測定濃度とトリグリセリド測定濃度との間の相関を示す。 図8は、A-FABPまたはE-FABPの濃度と血清からの全コレステロールとの相関を示す。 図9は、A-FABPまたはE-FABPの濃度と血清からのHDL-コレステロールとの相関を示す。 図10は、A-FABPまたはE-FABPの濃度と血清からのLDL-コレステロールとの相関を示す。 図11は、細胞溶解液のSDS PAGEによる電気泳動での分離および得られたタンパク質バンドのクマシー染色による可視化の結果を示す。 図12は、A-FABPを結合したカラムによる、ウサギ由来の抗A-FABP抗体のアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。 図13は、A-FABPを結合したカラムによる、ヤギ由来の抗A-FABP抗体のアフィニティークロマトグラフィーの結果を示す。 図14は、精製抗体を12% SDS-PAGEで分離し、クマシーブルーで染色した結果を示す。 図15は、体液からのF-ABP濃度測定のためのELISAの実施の概要を示す。 図16は、典型的な検量線を示す。 図17は、血清中A-FABP値の分布を示す。 図18は、A-FABP値における年齢の影響を示す。 図19は、66人の女性の群におけるA-FABP値の標準範囲の確認を示す。 図20は、脂肪細胞の馴化培地の二次元電気泳動による分離結果を示す。 図21は、非肥満（BMI<25）および肥満（BMI>25）個体におけるA-FABPの血液循環レベルを示す。 図22は、肥満の種々の指数と正相関するA-FABPの血清中レベルを示す。 図23は、血清A-FABPのインスリン感受性 (HOMA)、空腹時インスリン、空腹時および2h FPグルコースとの相関を示す。 図24は、A-FABPのLDL、TGおよびFFAとの正相関を示す。 図25は、アバンディア（ロジグリタゾン）処置により増加するT2DM患者におけるA-FABPを示す。

Claims (17)

1. メタボリックシンドローム、その前段階、初期形態、付随疾患もしくは二次疾患、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、肥満症、または関連の物質代謝障害を診断するために脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（Ａ−ＦＡＢＰ）の濃度を測定する方法であって、体液中における脂肪酸結合タンパク質の脂肪細胞型（Ａ−ＦＡＢＰ）の濃度を脂肪酸輸送能に関する指標として使用することを特徴とする方法。
2. Ａ−ＦＡＢＰ濃度の測定にイムノメトリック系を使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. Ａ−ＦＡＢＰまたはその一部分に対してアフィニティーを有する物質が固定化されたキャリアー材料を使用することを特徴とする、請求項２記載の方法。
4. Ａ−ＦＡＢＰまたはその一部分に対してアフィニティーを有する固定化物質が抗体として形成されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
5. キャリアー材料が少なくとも部分的に平らに形成されていることを特徴とする、請求項３記載の方法。
6. キャリアー材料がＥＬＩＳＡプレートに包含されていることを特徴とする、請求項３または４のいずれか１つに記載の方法。
7. イムノメトリック系がＥＬＩＳＡまたは同等の色素アッセイであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１つに記載の方法。
8. ＥＬＩＳＡまたは同等の色素アッセイが抗Ａ−ＦＡＢＰ抗体、二次検出抗体、キャリアー材料、洗浄溶液、インキュベーション溶液および検出溶液を含むことを特徴とする、請求項７記載の方法。
9. 評価にスキャナーまたはＥＬＩＳＡリーダーを使用することを特徴とする、請求項２〜８のいずれか１つに記載の方法。
10. Ａ−ＦＡＢＰ濃度を、以下：
    性別、ボディー・マス・インデックス、あるいはインスリン、グルコース、ＱＵＩＣＫＩ、アディポネクチンおよびＥ−ＦＡＢＰからなる群から選択される代謝の成分、
    から選択される少なくとも１つの別の特徴と関連付けて認識することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
11. 請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法のための試験キットを使用し、当該キットがＡ−ＦＡＢＰまたはその一部分に対してアフィニティーを有する物質が固定化されている適当なキャリアー材料を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
12. Ａ−ＦＡＢＰまたはその一部分に対してアフィニティーを有する固定化物質が抗体として形成されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
13. キャリアー材料が少なくとも部分的に平らに形成されていることを特徴とする、請求項１１または１２のいずれか１つに記載の方法。
14. キャリアー材料がＥＬＩＳＡプレートに包含されていることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
15. 前記試験キットがＥＬＩＳＡまたは同等の色素アッセイの実施に適したキャリアー材料、物質および溶液を含むことを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
16. 前記試験キットが抗Ａ−ＦＡＢＰ抗体、二次検出抗体、キャリアー材料、洗浄溶液、インキュベーション溶液および検出溶液を含むことを特徴とする、請求項１５記載の方法。
17. 前記試験キットが、組換えＡ−ＦＡＢＰを含有する少なくとも１種のキャリブレーション溶液を含むことを特徴とする、請求項１５または１６のいずれか１つに記載の方法。

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