JP2002504102A - 糖尿病治療のためのレプチン拮抗物質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 インスリン分泌不足に起因する疾患、高血糖症およびインスリン耐性の治療用の医薬品を製造するためのレプチン拮抗物質の使用。

Description

【発明の詳細な説明】 糖尿病治療のためのレプチン拮抗物質の使用 本発明は、新規使用、特に糖尿病およびその合併症の治療における新規使用に 関する。 インスリン非依存型糖尿病(ＮＩＤＤＭ)は、（特に骨格筋、脂肪組織および肝 臓における）インスリン耐性および膵臓のランゲルハンス島のベータ細胞からの 不十分なインスリン分泌に起因することが知られている。かくして、高インスリ ン血症であるにもかかわらず、インスリン耐性を補い血中グルコースを望ましい 範囲内に保つにはインスリンが不足している。 Pelleymounterら（Science，1995，269，540-543）は、オー・ビー（ｏｂ）ポ リペプチドまたは「レプチン(leptin)」が、遺伝的に肥満したｏｂ／ｏｂマウス において血漿インスリンおよびグルコース濃度を共に低下させることを報告して いる。 英国特許出願、公開番号２２９２３８２は、とりわけポリペプチド、ＯＢポリ ペプチド、およびそれらの拮抗物質、ならびに体重調節のためのそれらの使用に 関する。ＧＢ２２９２３８２の開示を引用して本明細書の一部とする。 本発明者らは、今回、組換えレプチンがｏｂ／ｏｂマウスの単離された小島お よび灌流下の膵臓からのインスリン放出を共に直接抑制することを示した。従っ て、レプチン拮抗物質はインスリン分泌を増強し、それによって血中グルコース 濃度の調節を助ける上で有用であることが示される。本発明者らは、さらに、レ プチンがｏｂ／ｏｂマウスの単離されたヒラメ筋中の基礎的およびインスリン刺 激下のグリコーゲン合成を抑制することを示した。従ってレプチン拮抗物質は、 グルコース利用およびインスリンのグルコース利用増加作用を増強する上でも有 用であることが示される。拮抗物質は、ゆえに、インスリン非依存型糖尿病のご とき、インスリンの分泌不足および作用不足に起因する疾患ならびに高血糖症の 治療に直接使用できることが示される。さらに、高血糖症が糖尿病の長期合併症 の多くを引き起こすと考えられるため、インスリン分泌を増強し、血中グルコー スの調節を助ける拮抗物質は、網膜症、神経障害および脈管障害のごとき糖尿病 合併症の治療に有用であり得る。 従って、本発明は、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のごとき、イン スリン分泌不足に起因する疾患および高血糖症の治療のためのレプチン拮抗物質 の使用を提供する。 別の態様においては、本発明は、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の ごとき、インスリン分泌不足に起因する疾患および高血糖症の治療用の医薬品を 製造するためのレプチン拮抗物質の使用を提供するものである。 レプチンの適当な拮抗物質は、ＧＢ２２９２３８２に開示された通りであり、 そこに開示された方法に従って調製し得る。 特別の拮抗物質には蛋白質拮抗物質が含まれる。 特別の拮抗物質には、非蛋白質拮抗物質、特に小さな有機分子拮抗物質が含ま れる。 本発明はまた、ヒトまたはヒト以外の哺乳類における、インスリン非依存型糖 尿病（ＮＩＤＤＭ）のごとき、インスリン分泌不足に起因する疾患および高血糖 症の治療方法であって、かかる治療を必要とするヒトまたはヒト以外の哺乳類に 、有効な、医薬上許容される、無毒な量のレプチン拮抗物質を投与することより なる治療方法にも拡大される。 本発明は、また、レプチン拮抗物質、またはその医薬上許容される誘導体、お よび医薬上許容される担体を含む医薬組成物にも拡大される。 本発明の特別な組成物は、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）のごとき 、インスリン分泌不足に起因する疾患および高血糖症の治療に使用される組成物 である。 適当な医薬上許容される担体は、ＧＢ２２９２３８２または国際特許出願、公 開番号ＷＯ９４／０１４２０に開示されたごとき、通常の手法において指示され るものである。 本発明の組成物は、上記特許出願に記載されたごとき、通常の方法に従って調 製される。 拮抗物質の投与量は、上記特許出願に記載されたごとき、通常の手法に従って 決定され得る。 以下に、本発明の図面（図１−５および表１）の簡単な説明を記載する： 図１および表１は、ｏｂマウスの灌流下膵臓からのインスリンの基礎的分泌に 対するレプチン（１００ｎＭ）の効果を示す。 図２は、ｏｂ／ｏｂ小島からのグルコース刺激（１６．７ｍｍｏｌ／ｌ）下の インスリン分泌に対するレプチン（１００ｎｍｏｌ／ｌ）の効果を示す。 図３は、ｏｂ／ｏｂマウスの単離膵島からのグルコース刺激（１６．７ｍｍｏ ｌ／ｌ）下のインスリン分泌に対する組換えレプチンの抑制効果の用量依存性を 示す。 図４は、ｏｂ／ｏｂマウスの単離ヒラメ筋中のグリコーゲン合成に対するレプ チンの効果を示す。 図５は、ｏｂ／ｏｂマウスの単離ヒラメ筋中のグリコーゲン合成に対するレプ チンの効果を示す。 Leeら（Nature，1995，379，632-635）は、レプチン受容体には多数の形態が あることを示した。もし小島の受容体が、性質または割合において他の組織の受 容体と異なる場合、特に有用な拮抗物質とは、小島および／または骨格筋の受容 体ではレプチンの作用に拮抗するが、他の（例えば視床下部の）レプチン受容体 に拮抗せず、これによりインスリン耐性を悪化させない拮抗物質であろう。 マウスのｏｂ遺伝子（J．Hered，41，317-318(1950)）およびディー・ビー（ ｄｂ）遺伝子（Science 153，1127-1128(1966)）の突然変異は、肥満およびイン スリン非依存型糖尿病を引き起こす。ｏｂ遺伝子産物であるレプチンは、専ら脂 肪組織で発現され（Nature(Lond.)，372，425-432(1994)）、組換えレプチンを 毎日注射することによりｏｂ／ｏｂマウスの食物摂取が抑制され、体重および脂 肪量が減少することが証明されている（Science 269，543-546(1995)；Science 269，540-543(1995)；Science 269，546-549(1995)）。また、かかる処置の結果 、高インスリン血漿が低下する（Science 269，540-543(1995)）。最近、ｏｂ− 遺伝子の受容体をコードする遺伝子が同定された（Cell 83，1263-1271(1995)） 。レプチン受容体には、幾つかの異なるスプライシングを受けた異型がある。こ れらのスプライシングされた異型の一つが視床下部に高濃度で発 現され、エネルギーバランスの調節における機能的受容体であると考えられてい る。それは、Ｃ５７Ｂ１／ＫＳＪ ｄｂ／ｄｂマウスにおいて異常なスプライシ ングを受けており（Nature（Lond.）379，622-635(1996)；Cell 84，491-495(19 96)；Science 271，994-996(1996)）、従って、細胞質領域が欠落しており、こ れはシグナル変換の欠陥に導く。本発明者らは、今回、視床下部に加え、推定機 能的レプチン受容体であるｏｂ−Ｒｂが、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて膵島を含め た幾つかの組織で発現されることを報告する。さらに、組換えレプチンは、ｏｂ ／ｏｂマウスの単離された小島および灌流下の膵臓からのインスリン放出を共に 直接抑制し、かつｏｂ／ｏｂマウスの単離されたヒラメ筋における基礎的および インスリン刺激下のグリコーゲン合成を抑制し、これは、レプチンが中枢および 末梢の両作用を有することを証明する。 マウスにおける糖尿病（ｄｂ）遺伝子産物はレプチン受容体であると確認され ている。少なくとも６個の異なるスプライシングを受けたレプチンメッセージの 形態が同定されている（Nature（Lond.）379，622-635(1996)）。これらのうち の一つであるＯｂ−Ｒｂは、ＪＡＫプロテインキナーゼの結合に必要であり、機 能的受容体をコードすると考えられる、ボックス（Ｂｏｘ）２配列モティーフを 含む広範な細胞内領域を有する。短いアンチセンス(antisense)オリゴデオキシ ヌクレオチドプローブ（Trayhurn et al，Biochem．Soc．Trans．Vol 23 page 4 945，1995）３０−３４量体が、マウスレプチン受容体ｍＲＮＡ配列の異なるド メインとハイブリダイズするように設計され、これは、レプチン受容体の全ての 転写産物の発現を検出するか、あるいは、レプチン受容体の長い形態であるＯｂ −Ｒｂだけを検出するために使用される。各オリゴヌクレオチドプローブ配列は レプチン受容体に固有のものであり、他のいかなる公知の配列とも有意な相同性 を有していなかった。 痩せた＋／＋マウスにおける全レプチン受容体ｍＲＮＡの発現は、視床下部、 腎臓、肺、肝臓、全膵臓、脳、ヒラメ筋および脾臓に検出されたが、白色脂肪組 織、下垂体および心臓には検出されなかった。ポリ（Ａ）ｍＲＮＡレベルに標準 化された全レプチン受容体ｍＲＮＡは、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、痩せた同腹 子に比べて過剰発現された。しかしながら、過剰発現には組織特異的な違いが あった。かくして、痩せたマウスでは最高の発現レベルを示す視床下部では、ｏ ｂ／ｏｂマウスにおいて２倍しか過剰発現されなかった。腎臓では、全レプチン ｍＲＮAは４倍過剰発現されたが、痩せたマウスで全レプチンｍＲＮＡの発現の 低かった他の幾つかの組織では、全レプチンｍＲＮＡはｏｂ／ｏｂマウスにおい て１０倍まで過剰発現された。 このレプチン受容体の長い形態、Ｏｂ−Ｒｂにのみ存在する細胞内ループの一 部である、塩基３３２９−３３６３に対応する３４量体でプローブされた視床下 部のノーザンブロット分析では、単一の鋭いバンドが得られた。これは、レプチ ン受容体の全ての公知のスプライシングされた異型に共通の配列である塩基１８ ７７−１９１０に対応する３３量体でブロットがプローブされた場合の複数のバ ンドと対照的である。分子量マーカーは、３４量体が、推定機能的レプチン受容 体に一致する約３４００ｂ．ｐ．のｍＲＮＡフラグメントにハイブリダイズした ことを示した。Leeら（Nature（Lond.）379，622-635(1996)）の最近の研究と一 致して、これは、視床下部において高濃度に発現されることが判明した。さらに 、ｏｂ／ｏｂマウスからの視床下部は、＋／＋マウスに比べ２倍の過剰発現を示 した。Ｏｂ−Ｒｂレプチン受容体は肝臓、腎臓および肺にも存在する（そして痩 せた＋／＋マウスに比べて過剰発現される）が、全脳、心臓、ヒラメ筋または下 垂体には存在しない。Ｏｂ−Ｒｂレプチン受容体が、痩せた＋／＋マウスに比べ てｏｂ／ｏｂマウスにおいて相対的に過剰発現されるという知見は、組換えレプ チンがｏｂ／ｏｂマウスにおいて食物摂取および体重を減少させるのにより有効 であるという、数人の研究者の知見（Science 269，540-543(1995)；Proc．Natl ．Acad．Sci.，USA 93，1726-1730(1996)）と一致している。それはまた、レプ チンがその受容体の発現を調節しているという可能性を生起する。このことが、 レプチン耐性を引き起こすのかもしれず、食事に誘発された肥満において組換え レプチンの活性が比較的低い（Science 269，540-543(1995)）ことを説明し得る 。 スロット−ブロット法を用いて、痩せた＋／＋またはｏｂ／ｏｂマウスからの 全膵臓において長い形態のレプチン受容体の発現は検出されなかった。しかしな がら、ｏｂ／ｏｂマウスの膵島からのｍＲＮＡを用いて強いシグナルが得られた 。 以前の研究により、組換えレプチンを毎日２８日間腹腔内注射すると、血漿イ ンスリンおよび血中グルコースはｏｂ／ｏｂマウスでは用量依存的に有意に減少 するが、痩せたマウスでは減少しないことが証明されている（Science 269，540 -543(1995)）。推定機能的受容体である長い形態のレプチン受容体が、ｏｂ／ｏ ｂマウスからの膵島中で高率に発現することをふまえ、本発明者らは、ｏｂ／ｏ ｂマウスの漕流下の膵臓を用いてインスリン分泌に対する機能的反応を調べるこ とにした（図１、表１）。 レプチン（１００ｎＭ）は単離された膵臓からのインスリン放出を直ちに減少 させた。 灌流下の膵臓標本におけるレプチンの作用は、小島に対する直接作用であるか 、または脈管構造からのさらなるメディエーターの放出を介したものである。こ の点を明らかにするため、ｏｂ／ｏｂマウスの単離された膵島からのインスリン 放出に対するレブチンの効果を測定した。レプチン（１００ｎＭ）は、一晩絶食 させたマウスから単離した小島におけるインスリン放出に対する１６．７ｍＭグ ルコースの刺激効果を完全に抑制した（図２）。レプチンの抑制効果は、１−１ ００ｎＭの範囲において用量相関的であった（図３）。レプチン（１０ｎｍ）は また野生型マウスからの小島によるグルコース刺激下のインスリン分泌も抑制し たが、レプチン（１００ｎＭ）はｏｂ／ｏｂマウスからの小島によるインスリン 分泌には効果を示さなかった。 レプチンがグルコース摂取およびインスリンの作用を直接抑制し得る可能性を 評価ずるため、Challissらの方法（Biochemical Pharmacology，1988，37,947-9 50）を用いて、体重４−６ｍｇのｏｂ／ｏｂマウスから単離された無傷のヒラメ 筋において、［¹⁴Ｃ］−グルコースのグリコーゲンへの組込みを測定した。組換 えネズミ・レプチンは１００ｎＭにおいてヒラメ筋内のグリコーゲン合成を抑制 し（図４）、基礎的合成は３５％（Ｐ＜０．０１）、低濃度インスリン（１０、 ５０および１００ｕＵ／ｍｌ）下の合成はそれぞれ２８％、３０％および４５％ （Ｐ＜０．０５）抑制した。インスリン（１０，０００ｕＵ／ｍｌ）に対する最 大反応はレプチンによって有意な影響を受けなかった。より低濃度のレプチン（ １および１０ｎＭ）の効果をインスリンの不在下および１００ｕＵ／ｍ ｌのインスリン存在下で調べた。１０ｎＭレプチンは基礎的およびインスリン刺 激下のグリコーゲン合成を共に有意に抑制した（それぞれ３２％および３５％、 Ｐ＜０．０５）が、１ｎＭレプチンは有意な効果を示さなかった（図５）。 肥満は、西洋社会および多くの開発途上国において最も一般的な栄養関連疾患 である。それは、インスリン非依存型糖尿病と強く関連している。この関連の根 本は、脂肪過多症の発病に伴って起きるインスリン耐性の増加と関係があると広 く推定されてきた。インスリン耐性はグルコース不耐性を引き起こすと予想され 得るが、一般的にインスリン非依存型糖尿病の発病には、さらなる独立した膵臓 障害の発病が必要であると考えられている。 ｏｂ／ｏｂマウスおよび痩せた同腹子への組換えレプチンの注入を用いた初期 研究では、レプチンの主作用が、おそらく中枢のエヌ・ピー・ワイ（ＮＰＹ）の 放出の抑制を介して食欲を制御することであると示唆された（Nature（Lond.）3 37，530-532(1995)）。しかしながら、レプチンを注入したマウスと同量の食物 を摂取したｏｂ／ｏｂマウス群を用いたより最近の研究では、レプチンに有意な 代謝作用があることが証明された（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 93，1726-173 0(1996)）。ｏｂ／ｏｂマウスにレプチンを注入した結果、同量の食物を与えた マウスに比べ、体重および脂肪パッド量が有意に低下した。しかしながら、レプ チンを注入したマウスと同量の食物を与えたマウスとの最も劇的な相違点は、血 漿インスリン濃度であった。同量の食物を与えた場合、インスリン濃度は３０． ６±６．２ｍｇ／ｍｌから１４．２±４．２ｍｇ／ｍｌに減少した。レプチンを 注入したマウスにおいて、インスリン濃度０．０９±０．０８ｍｇ／ｍｌは、痩 せたマウスと有意差がなかった（Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 93，1726-1730( 1996)）。本研究は、機能的受容体をコードするレプチン受容体のスプライシン グされた異型がｏｂ／ｏｂマウスの膵島に存在し、レプチンが灌流下の膵臓中の インスリンの基礎的分泌およびｏｂ／ｏｂマウスから単離された小島によるグル コース刺激下のインスリン放出を直接抑制することを証明する。これらのデータ は、過度の脂肪過多症に続くレプチンの過剰生産がインスリン分泌を直接修飾し 、糖尿病症候群の発症に関わる可能性のあることを初めて示唆するものである。 これらのデータは、さらに、肥満に伴うレプチンの過剰生産が、肥満にお いてインスリン耐性を誘発する多数の要因の一つであり得ることを示唆する。 従って、さらなる特別の態様において、本発明は、インスリン耐性、特に肥満 に伴うインスリン耐性の治療におけるレプチン拮抗物質の使用を提供する。 さらに、本発明は、インスリン耐性、特に肥満に伴うインスリン耐性の治療の ための医薬品を製造するためのレプチン拮抗物質の使用を提供する。 また、ヒトまたはヒト以外の哺乳類におけるインスリン耐性、特に肥満に伴う インスリン耐性を治療する方法であって、かかる治療を必要とするヒトまたはヒ ト以外の哺乳類に、有効で、医薬上許容される、無毒な量のレプチン拮抗物質を 投与することよりなる治療方法も提供される。 従って、本発明のさらなる特別の医薬組成物は、インスリン耐性、特に肥満に 伴うインスリン耐性の治療に有用な医薬組成物である。 膵島に加え、本発明者らは、肝臓、腎臓および肺において長い形態のレプチン 受容体を検出した。これらの組織におけるレプチンの機能的効果は、現在は知ら れていない。しかしながら、レビン（Levin）らは、肝臓の肝グリコーゲン含有 量がレプチンを注入したｏｂ／ｏｂマウスでは有意に減少するが、同量の食物を 与えたマウスでは減少しなかったと述べている［プロシーディングス・ナショナ ル・アカデミック・サイエンス(Proc．Natl，Acad．Sci.)、ユー・エス・エイ(U SA)９３、１７２６−１７３０（１９９６）］。現在のデータと合わせると、こ れらの知見は、レプチンが肝グリコーゲン代謝に直接影響を与え得ることを示唆 する。 要約すれば、本研究結果は、レプチンの分子生物学および広範な末梢代謝活性 と共に食物摂取に関する中枢作用を有することの機能的証明を提供する。 特許出願ＧＢ２２９２３８２および国際特許出願公開ＷＯ９４／０１４２０を 含めた上記参照の開示を引用して本明細書の一部とする。 以下の図面および表は本発明を例示するものであり、決して本発明を限定する ものではない。 ０−１５分：安定化時間 １６−３０分：処理時間（ＰＢＳまたはレプチン） ＡＵＣ：曲線下面積 ％変化：１６−３０分の平均値対０−１５分の平均値 結果は、平均値士ＳＥＭ（ｎ＝４．５）である。^* Ｐ＜０．０５（アンペアード・テスト（un-paired test））

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 エミルソン，バラー イギリス、エムケイ18・１イージー、バッ キンガム、ハンター・ストリート、ユニバ ーシティ・オブ・バッキンガム (72)発明者 リウ，ヨン−リン イギリス、エムケイ18・１イージー、バッ キンガム、ハンター・ストリート、ユニバ ーシティ・オブ・バッキンガム

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インスリン分泌不足に起因する疾患および高血糖症の治療用の医薬品を製 造するためのレプチン拮抗物質の使用。 ２．インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療のための請求項１記載の 使用。 ３．インスリン耐性の治療用の医薬品を製造するためのレプチン拮抗物質の使 用。 ４．肥満に伴うインスリン耐性の治療のための請求項３記載の使用。 ５．ヒトまたはヒト以外の哺乳類における、インスリン分泌不足に起因する疾 患および高血糖症を治療する方法であって、かかる治療を必要としているヒトま たはヒト以外の哺乳類に、有効で、医薬上許容される、無毒な量のレプチン拮抗 物質を投与することよりなる治療方法。 ６．インスリン耐性を治療する方法であって、かかる治療を必要としているヒ トまたはヒト以外の哺乳類に、有効で、医薬上許容される、無毒な量のレプチン 拮抗物質を投与することよりなる治療方法。 ７．レプチン拮抗物質、またはその医薬上許容される誘導体、および医薬上許 容される担体を含む、インスリン分泌不足に起因する疾患および高血糖症を治療 するための医薬組成物。 ８．レプチン拮抗物質、またはその医薬上許容される誘導体、および医薬上許 容される担体を含む、インスリン耐性を治療するための医薬組成物。 ９．レプチン拮抗物質が小さな有機分子拮抗物質である請求項１ないし８いず れか１項記載の使用。