KR20050039829A - 당뇨병 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성장 호르몬 방출 촉진 인자 수용체(GHS-R) 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 당뇨병 예방제 또는 치료제, 및 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 특징으로 하는 혈당치 저하 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 비만 예방제 또는 치료제, 및 GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 식욕 억제제에 관한 것이다.

Description

당뇨병 치료제{REMEDY FOR DIABETES}

본 발명은 신규한 당뇨병 예방제 또는 치료제에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 성장 호르몬 방출 촉진 인자 수용체(GHS-R) 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 당뇨병의 예방제 또는 치료제에 관한 것이다. 또한, GHS-R 길항제를 투여하는 것을 특징으로 하는 혈당치 저하 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 비만 예방제 또는 치료제, 및 GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 식욕 억제제에 관한 것이다.

최근, 우리나라에서는 식생활의 구미화에 따라 “포식의 시대”를 맞이한 한편, 자동차를 비롯한 기계화 문명의 보급에 의해, 국민들 사이에 널리 만성 운동 부족 상태가 만연해 왔다. 이러한 사회적 배경 중에서 최근 당뇨병 인구의 증가는 경이적이고, 오늘날 그 숫자는 잠정적인 환자를 포함하면 500만명 또는 600만명이나 된다고 한다.

당뇨병에는 두가지 타입이 있다. 1형 당뇨병(인슐린 의존형 당뇨병(IDDM))은 소아나 젊은 사람에게 많고, 바이러스의 감염 등에 의해 인슐린을 만들어 분비하는 췌장의 랑게르한스섬이 파괴되어, 인슐린을 전혀 분비할 수 있게 되어 당뇨병이 되는 병이다. 한편, 중노년에 많은 2형 당뇨병(인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM))은 일본인의 당뇨병의 대부분(약 95%)을 차지하는 것으로, 인슐린의 분비량이 저하되기 쉬워 당뇨병이 되기 쉬운 체질을 갖고 있는 사람에게 과식, 운동 부족, 비만, 스트레스, 연령 증가 등의 인슐린의 작용을 방해하는 요소가 가해져 증상이 발현한다.

당뇨병은 비만과 깊이 관련되어 있고, 조사에 따르면, 인슐린 비의존형 당뇨병 환자의 약 2/3가 현재 비만이거나 또는 과거에 비만을 경험하고 있다. 실제로, 비만자에서는 인슐린의 혈당 저하 작용이 약해져 있다는 사실이 알려져 있다.

비만은 온 세계에서, 특히 선진 사회에서 점점 일반화되고 있는 중요한 건강 문제이다. 미국에서는, 성인의 반수 이상이 체중 과잉이다. 앨리슨(Allison) 보고에서는, 1991년의 미국의 사망수의 약 280000이 비만으로 인한 것이라고 한다(Allison DB et a1., JAMA, 282:1530-1538, 1991). 비만의 병태 생리는 소비를 초과하는 과잉의 영양 섭취의 계속이라고 알려져 있다. 지방 함유량이 높은 「서양식 식사」가 비만에 대한 위험성의 증가와 관련되어 있는 것으로 나타내고 있다.

체중 조절은 섭식량과 에너지 소비의 균형이 그 열쇠를 쥐고 있고, 양자의 균형이 비만, 저체중을 야기한다. 1994년에 발견된 렙틴이 지방과다증(adiposity)(체지방량 축적) 시그널로서 체중 조절의 근간에 관여한다는 것이 명백해진 이래, 렙틴의 하류에 위치하는 많은 새로운 식욕 조절에 관여하는 펩티드가 발견되었다. 특히, 그때까지 개개로 독립된 기능으로 밖에 파악되지 않던 시상하부 유래의 신경 펩티드군이, 렙틴의 하류에서 각각이 기능하고, 추가로 이들 신경 펩티드군 상호간에서도 긴밀하게 정보 교환이 이루어진다는 것이 알려져 있다.

이러한 신경 펩티드 중, 식욕을 항진하는 물질로서는, 뉴로펩티드 Y(NPY), 오렉신류(orexins), 모틸린(motilin), 멜라닌 농축 호르몬(melanin-concentrating hormone: MCH) 또는 아고우티 관련 단백질(agouti-related protein: AGRP)이 알려져 있다. 또한, 식욕을 억제하는 물질로서는, α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormone: α-MSH), 부신피질 자극 호르몬 방출 인자(corticotropin-releasing factor: CRF), 코카인- 및 암페타민-제어 전사물(cocain- and amphetamine-regulated transcript: CART) 또는 콜레시스토키닌(cholesystokinin: CCK) 등이 알려져 있다. 이러한 펩티드는 식욕을 제어하는 생리학적 메커니즘에 관여하고 있어, 에너지 항상성에 영향을 준다고 여겨지고 있다.

한편, 성장 호르몬(GH)은, 하수체 전엽으로부터 분비되는 호르몬이며, 그 분비는 교묘하게 제어되고 있고, 시상하부의 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH)에 의해 자극을 받아, 소마토스타틴에 의해 억제된다. 최근, GHRH 또는 소마토스타틴과는 별도의 경로에 의한 GH 분비 조절 기구가 밝혀졌다. 이 다른 경로의 GH 분비 조절 기구는, GH의 분비 촉진 활성을 갖는 합성 화합물인 성장 호르몬 방출촉진 인자(growth hormone secretagogue: GHS)의 연구에 의해 전개되어 왔다. GHS는 GHRH와는 다른 경로로 작용한다. 즉, GHRH는 GHRH 수용체를 활성화하여, 세포내 cAMP 농도를 상승시키는데 비해, GHS는 GHRH 수용체와는 다른 수용체를 활성화하여, 세포내 IP3계를 통해 세포내 Ca⁺⁺ 이온 농도를 상승시킨다. 이 GHS가 작용하는 수용체인 GHS-R는, 1996년에 발현 클로닝법에 의해 구조가 해명되었다(Howard A.D. et al, Science, 273: 974-977, 1996). GHS-R는 세포막을 7회 관통하는 전형적인 G 단백질 공액형 수용체이며, 주로 시상하부, 하수체에 존재한다.

또한, 생체 내에 존재하지 않는 합성 화합물인 GHS를 결합하는 수용체가 존재한다는 점에서, 이 GHS-R에 결합하여, 활성화하는 내인성의 리간드가 탐색되었다. 그 결과, GHS-R에 특이적인 리간드로서, 그렐린(Ghrelin)이 래트의 위로부터 정제, 동정되었다(Kojima M. et al., Nature, 402: 656-660, 1999).

그렐린은, 아미노산 28잔기로 이루어지는 펩티드로, 3번째의 세린 잔기가 n-옥타노일화되어 있다. 또한, 인간의 그렐린은 래트 그렐린과 아미노산 2잔기가 다르다. 이하에 래트 및 인간의 그렐린의 구조식을 나타낸다.

화학 합성한 그렐린은 나노몰 정도의 양으로 GHS-R를 발현시킨 CHO 세포의 세포내 Ca⁺⁺ 상승 활성, 또는 초대 배양 하수체 세포에서 성장 호르몬의 방출 활성을 갖는다. 또한, 생체내(in vivo)에서도 래트에 있어서 혈중성장호르몬을 상승시킨다. 그렐린의 mRNA는 위에서 현저히 발현하고 있고, 또한 그렐린은 혈중에도 존재한다. 또한, GHS-R은 시상하부, 심장, 폐, 췌장, 소장 및 지방 조직에도 존재하고 있다(상기 Kojima 등). 또한, 그렐린에는 섭식 촉진 작용이 있다는 것이 보고되어 있다(Wren et al., Endocrinology, 141(11): 4325-4328, 2000). 본 발명자들은 그렐린이 NPY와 Y1 수용체를 통해서 현저한 식욕 촉진 작용을 나타낸다는 것을 발견하고, 그렐린이 저영양 증상을 나타내는 질환의 치료제로서 유용하다는 것을 제안했다(PCT/JP02/00765).

발명의 요약

본 발명의 목적은, 신규한 당뇨병 예방제 또는 치료제, 및 비만 예방제 또는 치료제를 개발하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 신규한 혈당치 저하 방법, 비만 예방제 또는 치료제, 및 식욕 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 성장 호르몬 방출 촉진 인자 수용체(GHS-R) 길항제가 혈당치를 유의하게 저하시킨다는 사실, 및 식욕을 현저히 억제한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성되었다.

즉, 본 발명은, 성장 호르몬 방출촉진 인자 수용체(GHS-R) 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 당뇨병의 예방제 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 특징으로 하는 혈당치 저하 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 비만 예방제 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 식욕 억제제를 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 예방법 또는 치료법을 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 비만 예방법 또는 치료법을 제공한다.

본 발명은 또한, 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 식욕 억제법을 제공한다.

도 1에서, A는 인간 그렐린과 인간 모틸린의 아미노산 배열을 나타낸 것이다. B는 인간 그렐린 수용체와 인간 모틸린 수용체의 아미노산 배열을 나타낸 것이다. 동일한 아미노산을 별표로 나타낸다.

도 2는 그렐린 IP 투여의 고지방 식이 하에서의 체중에 미치는 효과를 나타낸다.

도 3은 그렐린 IP 투여의 고지방 식이 하에서의 지방체 덩어리에 미치는 효과를 나타낸다.

도 4는 그렐린 IP 투여 후의 WAT 에서의 렙틴, 아디포넥틴 및 레지스틴 mRNA의 발현(노던 블로팅으로 평가)을 나타낸다.

도 5는, 고지방 식이 하에서의 그렐린 mRNA의 발현(노던 블로팅으로 평가)을 나타낸다.

도 6은 [D-Lys-3]-GHRP-6를 IP 투여했을 때의 먹이 섭취량에 미치는 효과를 나타낸다.

도 7은 [D-Lys-3]-GHRP-6을 ICV 투여했을 때의 먹이 섭취량에 미치는 효과를 나타낸다.

도 8은, IP 투여된 그렐린과 ICV 투여된 [D-Lys-3]-GHRP-6의 동시 투여의 먹이 섭취에 미치는 효과를 나타낸다.

도 9는 [D-Lys-3]-GHRP-6을 IP 투여했을 때의 위 배출 속도에 미치는 효과를 나타낸다.

도 10은 [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P를 IP 투여했을 때의 먹이 섭취량에 미치는 효과를 나타낸다.

도 11은 [D-Lys-3]-GHRP-6을 IP 투여했을 때의 먹이 섭취량에 미치는 효과를 나타낸다.

도 12는 [D-Lys-3]-GHRP-6을 IP 투여했을 때의 ob/ob 마우스에 있어서의 먹이 섭취에 미치는 효과를 나타낸다.

도 13는, [D-Lys-3]-GHRP-6의 반복 투여가 ob/ob 마우스에 있어서의 체중 증가에 미치는 효과를 나타낸다.

도 14는, [D-Lys-3]-GHRP-6의 IP 투여가 ob/ob 마우스에 있어서의 유리 지방산에 미치는 효과를 나타낸다.

본 발명에서 유효 성분으로서 이용하는 GHS-R 길항제란, GHS-R와 결합하여 작용제의 효과를 저해할 수 있는 물질을 말한다. GHS-R 길항제로서는, 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제를 이용할 수 있다.

그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제는, 예컨대 이하에 기재의 스크리닝 방법에 의해서 동정할 수 있다(PCT/JP02/00765참조).

즉, 그렐린 또는 그렐린 유사체의 존재하 또는 비존재하에, 후보 물질을 동물에게 투여하고, 섭식량, NPY mRNA 발현량, NPY와 NPY의 Y1 수용체와의 결합량, 산소 소비량, 위내용 배출 속도, 또는 미주(迷走) 신경의 활성을 측정함으로써 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제를 스크리닝할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

상기 스크리닝 방법으로 수득된 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제를 본 발명의 당뇨병 예방제 또는 치료제, 비만 예방제 또는 치료제, 및 식욕 억제제의 유효 성분으로서 이용할 수 있다.

본 발명에서는, 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제로서 모틸린 또는 모틸린 유사체의 길항제를 이용할 수도 있다.

모틸린은 십이지장, 공장(空腸) 상부의 내분비세포로부터 분비되는 22 아미노산 잔기의 펩티드이고(Itoh, Z., Peptides, 18:593-608, 1997), 소화관의 공복기(interdigestive) 운동, 담낭 수축 및 위 또는 췌장으로부터의 효소 분비에 관여한다. 모틸린은 GH 분비를 촉진하는 것으로 보고되어 있고, 비펩티드성 모틸린 작용제를 이용하여 위의 운동을 촉진하는 것이 보고되어 있다(상동, Itoh). 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 인간 그렐린과 인간 모틸린은 서로 36%의 아미노산 동일성을 나타낸다(억세스 번호 A 59316 및 P 12872). 또한, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 인간 그렐린 수용체는 인간 모틸린 수용체와 전체로서 50%의 아미노산 동일성을 나타낸다(억세스 번호 Q 92847, Q 92848 및 Q 43193). 또한, 최근에 와서, 토마세토(Tomasetto)도 마우스 위로부터 신규 펩티드를 단리했지만, 이것은 그렐린과 동일하며, 모틸린 관련 펩티드라고 명명했다(Tomasetto C. et al., Gastroenterology, 119:395-405, 2000). 그렐린과 모틸린과의 배열 상동성 및 그렐린 수용체와 모틸린 수용체와의 배열 상동성에 비추어 보았을 때, 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제로서 모틸린 또는 모틸린 유사체의 길항제를 이용할 수 있다.

또한, 그렐린은, 화학식 1에서 표시되는 래트 그렐린 또는 인간 그렐린 또는 그렐린 유사체이다.

화학식 1

본 발명에서 말하는 그렐린 유사체에는, 식욕 촉진 작용을 갖는 한, 28개의 아미노산의 1개 이상의 아미노산이 결손, 치환 또는 부가되어 있는 것도 포함되고, 또한, 이들 각종 유도체〔예컨대, 펩티드 구성 아미노산이 치환된 유도체(아미노산 사이에 기, 예컨대, 알킬렌이 삽입된 것도 포함한다) 및 에스터 유도체〕도 포함된다.

그렐린 또는 그렐린 유사체는 어떠한 방법으로도 제조될 수 있는데, 예컨대, 인간, 래트의 세포로부터 분리, 정제한 것, 합성품, 반합성품, 유전자 공학에 의해 수득된 것 등을 포함하고, 특별히 제한되지 않는다.

28개의 아미노산의 1개 이상의 아미노산이 결손, 치환 또는 부가되어 있는 것의 예로서는, 그렐린의 14번째의 Gln 잔기가 제거된 des-Gln14-그렐린 등이 대표적이다. 래트 des-Gln14-그렐린은 그렐린 유전자의 스프라이싱의 차이에 의해 발생되는 것으로, 래트의 위에서는 그렐린의 4분의 1 정도 존재하고, 성장 호르몬 방출 활성의 강도는 동일하다.

또한, 그렐린 유사체에는, 문헌[J. Med. Chem. 2000, 43, 4370-4376]에 기재된 하기와 같은 것도 포함된다. 예컨대, 그렐린 28개의 아미노산 중, N 말단에서 3 및 4번째의 아미노산(바람직하게는, N 말단 4개의 아미노산)를 갖고, 또한 N 말단에서 3번째의 아미노산(Ser)의 측쇄가 치환되어 있는 펩티드 및 그 유도체이고, 성장 호르몬 유리 촉진 작용을 갖는 것을 들 수 있다.

N 말단으로부터 3번째 아미노산의 측쇄의 예로서는 그렐린의 측쇄인 옥타노일 이외의 아실기 및 알킬기(이들의 탄소수는 6 내지 18이 바람직하다)를 들 수 있다. 구체적인 측쇄로서는, 하기의 것을 들 수 있다:

-CH₂(CH₂)₉CH₃, -CO-(CH₂)₆CH₃ , -CO-CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH₃, -CO-CH(CH₂CH₂CH₃)₂, -CO-(CH₂)₉CH₃ , -CO-(CH₂)₁₄CH₃, -CO-(CH₂)₆CH₂Br, -CO-CH(CH₂)₂CONH(CH₂)₂CH₃, -COPh,

하기 식:

N 말단으로부터 3 및 4번째 아미노산을 갖고, 또한 N 말단으로부터 3번째 아미노산(Ser)의 측쇄가 치환되어 있는 그렐린 유사체의 구체적인 예로서는, 제 37회 펩티드 토론회(2000년 10월 18일∼20일)에서 보고된 화합물: NH₂-(CH₂)₄-CO-Ser(옥틸)-Phe-Leu-NH-(CH₂)₂-NH₂를 들 수 있다.

본 발명에서는, GHS-R 길항제로서, [D-LYs-3]-GHRP-6(Veeraragavan K. et al., Life Sci. 50: 1149-55, 1992) 및 [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P(Cheng, Ket al., Journal of Endocrinology, 152:155-158, 1997)를 이용하여 본 발명의 효과를 확인했다.

본 발명의 예방제 또는 치료제, 및 억제제는 중추 투여(예컨대 뇌실내 투여, 척수강(腔) 주사)로 하는 것도, 말초 투여로 하는 것도 가능하다. 바람직하게는, 말초 투여로 사용한다. 식욕 조절 펩티드의 대부분은 말초 투여에서는 중추 투여와 같은 작용을 나타내지 않지만, 본 발명의 예방제 또는 치료제, 및 억제제는 말초 투여에서도 혈당 농도를 유의하게 저하시켰다. 따라서, 본 발명의 예방제 또는 치료제, 및 억제제는 투여에 따른 환자의 고통이 적고, 또한 간편히 복용할 수 있어, 종래의 식욕 조절성 펩티드에 비해 훨씬 이점이 크다.

GHS-R 길항제는, 공지의 제제 기술에 의해, 단독으로 또는 약리학적으로 수용할 수 있는 담체, 첨가제 등과 함께, 통상의 경구 투여용 제제 및 비경구 투여용 제제로 할 수 있다. 예컨대, 용액 제제(동맥 주사, 정맥 주사 또는 피하 주사 등의 주사제, 점비제, 시럽제 등), 정제, 트로키제, 캡슐제, 가루약, 과립제, 연고제, 좌약 등으로 제제화할 수 있다. 또한, 약물 전달 시스템(drug delivery system)(제방제(除放劑) 등)으로 사용할 수도 있다.

본 발명의 예방제 또는 치료제 및 억제제의 투여량은, 환자의 연령, 체중, 증상, 투여 경로 등에 따라 다르고, 의사의 판단에 따라 결정된다. 통상, 정맥내 투여를 위해서는, GHS-R 길항제로서, 체중 1kg 당 약 0.1μg 내지 1000mg, 바람직하게는 약 0.01mg 내지 100mg, 보다 바람직하게는 0.1mg 내지 10mg이다. 단, 투여량은 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 당뇨병 예방제 또는 치료제는, 당뇨병의 예방 또는 치료에 이용할 수 있고, 특히 2형 당뇨병(NIDDM: 인슐린 비의존형 당뇨병)의 예방제 또는 치료제로서 유용하다. 본 발명의 비만 치료제는, 비만에 연유되는 허혈성 심질환, 변형성 관절증, 요추증, 지질 대사 이상, 수면시 무호흡 증후군, 월경 이상 등의 병에 효과적이다. 본 발명의 식욕 억제제는 과식증, 스트레스 과식, 당뇨병성 과식 등의 병에 효과적이다.

본 발명자들은, 후술하는 실시예에 기재한 바와 같이, 체중, 지방 질량, 글루코스, 인슐린, 및 백색 지방 조직에 있어서의 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), 레지스틴(resistin) 유전자발현을, 고지방 식이 하에서의 그렐린의 반복 투여 후에 측정했다. 또한, 위의 그렐린 유전자 발현을 노던 블로팅 분석에 의해 측정했다. 또한, 에너지 섭취 및 위 배출(gastric emptying)은 GHS-R 길항제 투여 후에 측정했다. GHS-R 길항제의 반복 투여를 ob/ob 비만 마우스로 6일간 계속해서 실시하고, 그 효과를 시험했다.

그 결과, 그렐린은 고지방 식이 하에서 분명한 지방축적(adiposity)을 일으켜 혈당 제어를 악화시켰다. 그렐린은 렙틴 mRNA 발현을 상승시키고, 또한 레지스틴 mRNA 발현을 감소시켰다. 위 그렐린 mRNA 발현은 고지방 식이에 의해 증가했다.

GHS-R 길항제는 야윈 마우스(lean mice)에 있어서, 식이(食餌) 유도성(diet-induced) 비만 마우스에 있어서, 그리고 ob/ob 비만 마우스에 있어서 에너지 섭취를 감소시켰지만, 그 작용 기구는 위 배출의 감소와 관련되어 있다. GHS-R 길항제의 반복 투여는 ob/ob 마우스에 있어서 체중 증가를 감소시켜 혈당 제어를 향상시켰다.

따라서, 그렐린은 특히 고지방 식이 하에서의 과잉 체중 증가, 지방 축적 및 인슐린 저항성과 밀접히 관련된 것이 확인되었다. 또한, GHS-R 길항제는, 비만 및 2형 당뇨병을 위한 유망한 예방 또는 치료제가 될 것으로 기대된다.

GHS-R 길항제의 섭식에 대한 작용에 관한 고찰

GHR-R 길항제가 에너지의 부평형(negative energy balance) 상태를 유도할 것이라는 예측에 따라, GHS-R 길항제의 섭식에 대한 작용을 검토했다. GHS-R의 투여에 의해 야윈 마우스 및 고지방식에 의해서 비만이 된 마우스에 있어서 섭식이 감소했다. 과거의 보고에 따르면, GHS- R은 시상하부, 심장, 폐, 취장, 소장 및 지방 조직에 존재하고 있다. 시상하부에서는 GHS-R은 궁상핵(ARC)에 위치하고 있고, 여기서는 2개의 식욕 증진 펩티드, 뉴로펩티드 Y(NRY) 및 아고우티 관련 단백질(AGRP)이 뉴런으로 합성되어 있다. 또한, 비펩타이드 GH 분비 촉진 물질이 시상하부에 작용하여 ARC 뉴런의 전기적 활성을 변화시켜, c-fos의 발현을 활성화하도록 작용하고 있다(예컨대, Lawrence et al., Endocrinology, 143:155-162, 2002). 지금까지, 그 작용 메커니즘이 ARC 내(여기서는 혈액 뇌 관문 장벽의 작용이 약하다)의 시상하부 NPY 및 AGRP 뉴런의 직접적 활성화에 관여하는 섭식 행동을 그렐린이 자극한다는 것이 보고되어 있다(예컨대, Inui, Nat Rev Neurosci, 2:551-560, 2001). 그러나 위로부터의 그렐린 시그널의 별도의 경로는, 미주 신경과 뇌간핵(brainstem nuclei)를 통해 마지막으로 시상하부에 도달하는 상행 신경 네트워크를 통한다. 본 발명에 있어서, 중추에 투여된 GHS-R 길항제는 말초 투여된 그렐린에 의해 유도된 섭식에 대한 자극 작용을 정지시켰다. 이러한 결과에 의해 그렐린이 뇌 내에서 GHS-R를 통해 작용하고 있을 가능성이 시사되었다. 또한, 말초에서 투여된 GHS-R 길항제가 위 배출 속도를 감소시킨다는 것을 밝혀냈지만, 이것은 그 식욕 부진 유발 작용(식욕 억제 작용)에 기여한다. 상당한 증거가 축적되어, 위의 확장이 만복 시그널로서 작용하여 음식물 섭취를 저해하며, 빠른 위 배출이 과식과 비만에 관여하고, 지체된 위 배출이 식욕 부진 및 악액질과 관련된다는 것이 나타나 있다(Inui, Mol Psychiatry, 6:620-624, 2001). 과거의 연구에 의해 그렐린이 미주 신경성 경로를 통해 위 배출 속도 및 운동성을 증가시킨다는 것이 나타나 있다(Inui, Nat Rev Neurosci, 2:551-560,2001).

본 발명에 의해, 섭식 행동의 제어에 있어서 GHS-R가 특정 역할을 가져, GHS-R의 길항 작용이 비만의 치료를 위한 유망한 어프로치가 될 수 있다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명에 의해, 말초에 투여된 GHS-R 길항제가 ob/ob 마우스(인슐린 저항성 및 빠른 위 배출로 비만 및 당뇨병의 유전 모델로서 알려짐)에 있어서 식욕 부진 작용을 일으켜, 체중 감소와 혈당 농도를 저하시킨다는 것을 밝혔다. 이 중간 정도의 혈청 인슐린 레벨의 감소를 수반한 글루코스 레벨의 현저한 감소에 의해, 인슐린 저항성의 개선에 있어서의 GHS-R 길항제의 역할을 보여준다. 다른 한편, 포스파티딜리노시톨 3-키나제 활성의 감소에 관여하는 작용 메커니즘의 글루코스 수송 활성의 저해를 통하여, 혈청 FFA의 상승에 의해 인슐린 저항성이 유도된다는 것을 나타낸다. 최근, 순환성 FFA 농도의 상승이 중년 남성의 돌연사의 독립 위험 인자가 된다는 것이, 장기간의 코호트(cohort) 조사에서 보고되었다(Jouven et al., Circulation, 104: 756-761, 2001). 이하에 나타낸 실시예에서는, GHS-R 길항제는 ob/ob 비만 마우스의 FFA 레벨의 현저한 감소를 일으켰다.

결론적으로, 말초에서 투여된 GHS-R 길항제, [D-Lys-3]-GHRP-6 및 [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P에 의해, 야윈 마우스, 식이 유도성 비만 마우스 및 ob/ob 비만 마우스에 있어서의 식료 섭취가 감소한다는 것을 발견했다. 또한, [D-Lys-3]-GHRP-6의 반복 투여에 의해 마우스에 있어서 체중 증가가 감소하여, 혈당 제어가 향상된다는 것을 발견했다.

본 출원은 일본 특허 출원 제 2002-197582호에 근거하는 우선권을 주장하는 것으로, 상기 출원 내용 전체를 참조적으로 본 출원에 포함한다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 기재에 근거하여 여러가지 변경, 수식이 당업자에는 가능하고, 이러한 변경, 수식도 본 발명에 포함된다.

시험 재료와 방법

(1) 동물 실험

ddy계의 수컷 마우스(34-37g, JAPAN SLC, Shizuoka, Japan) 및 obese(ob/ob) C57BL/6J 마우스(68-74g, Shionogi Co., Ltd., Shiga, Japan)를 사용했다. 마우스는 1마리씩 제어된 환경 속에서 수용되었다(22±2℃, 55±10% 습도, 12:12시간의 명:암 사이클로 오전 7:00에 라이트를 켰다). 마우스는 전체 에너지의 12%를 지방으로서 포함하는 표준 식이 또는 전체 에너지의 45%를 지방으로서 포함하는 고지방 식이(CLEA Japan, INC., Tokyo, Japan)가 주어졌다. 그 외에 기재하지 않는 한 먹이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있었다. 전체 실험은 고베 대학의 동물 케어 위원회에 의해 승인되었다.

(2) 시험 약제

[D-Lys-3]-GHRP-6, [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P 및 래트 그렐린은 BACHEM CALIFORNIA INC.(Torrance, California), NEOSYSTEM(Strasbourg, France) 및 Peptide Institute(Osaka, Japan)으로부터 각각 구입했다. 투여 직전에, 각 약제는 제 3 뇌질내(ICV) 투여를 위해 4㎕의 인공 뇌척수액(ACSF) 중 또는 복막내(IP) 투여를 위해 100㎕ 생리식염수 중에 희석되었다. 결과는 평균치 ±s.e.m으로 나타냈다. 분산 분석(ANOVA)에 이어서 본페로니 t 시험(Bonferroni's t test)을 이용하여 그룹간의 차이를 평가했다. P<0.05는 통계적으로 유의하다고 여겨진다.

(3) ICV에 의한 약제 투여

ICV 투여를 위해, 마우스를 펜토바비탈 나트륨(80-85mg/kg IP)으로 마취하고, 실험전 7일간, 정위(定位)고정 장치(SR-6, Narishige, Tokyo, Japan) 내에 두었다. 각 두개골에, 바늘을 사용하여 중앙 봉합 측방 0.9mm에서 앞 정수리 0.9mm 후방에 구멍을 뚫었다. 일단부를 길이 3mm에 걸쳐 경사시킨 24게이지의 캐뉼러(Safelet-Cas, Nipro, Osaka, Japan)를 제 3 뇌실에 묻어 ICV 투여용으로 했다. 캐뉼러를 치과용 시멘트로 두개골에 고정하고, 실리콘으로 뚜껑을 했다. 27게이지의 주입용 인서트를 PE-20 튜빙으로 마이크로실린지에 부착했다.

(4) 섭식 시험

섭식 시험 전에, 마우스는 물은 자유롭게 마실 수 있었지만 16시간 절식(food deprived)했다. 단, [D-Lys-3]-GHRP-6 및 그렐린의 공(共)투여 먹이 섭취에 대한 영향의 실험에 있어서는 마우스는 먹이와 물을 자유롭게 섭취했다. 먹이 섭취는 투여 후 20분간, 1, 2 및 4시간에서 처음에 미리 측정해 둔 먹이로부터 먹지 않은 먹이를 감산함으로써 측정했다.

(5) RNA 분리 및 노던 블로팅

분석 RNA는 위 및 정소(精巢) 상체 지방으로부터 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Tokyo, Japan)를 이용하여 분리했다. 전체 RNA를 폼알데하이드로 변성하고, 1% 아가로스 겔로 전기 영동하여, Hybond N⁺ 멤브레인상에 블로팅했다. 멤브레인을 플루오레세인 표지 cDNA 프로브로 혼성화(hybridize)시켰다. 하이브리다이제이션 시그널의 전체 적분 밀도(total integrated densities)는 덴시토메트리(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 의해 구했다. 데이타는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소 효소(G3PDH) mRNA 존재도(abundance)로 표준화되어 대조에 대한 %로서 나타내었다.

(6) 그렐린 유전자의 발현

야윈 마우스는 전체 에너지의 12%를 지방으로서 포함하는 표준 식이 또는 전체 에너지의 45%를 지방으로서 포함하는 고지방 식이를 2주간 섭취했다. 마우스는 8시간 절식한 후 경부(頸部) 탈구에 의해 죽었다. 그 직후에 위를 제거하여, 드라이아이스상에서 동결하여 -80℃에서 노던 블로팅의 조제까지 저장했다.

(7) 위 배출

위 배출에 있어서의 실험 전에, 마우스는 수분은 자유롭게 섭취하면서 16시간 절식했다. 절식한 마우스는 미리 칭량한 펠렛을 1시간 자유롭게 섭취한 후 [D-Lys-3]-GHRP-6를 투여했다. 마우스에는 주입 후, 다시 1 또는 2시간 먹이를 주지 않았다. 먹이의 섭취는 먹지 않은 펠렛을 칭량함으로써 측정했다. 마우스는 실험 개시로부터 2 또는 3시간 후에 경추 탈구에 의해 죽었다. 직후에, 개복에 의해 위가 노출되어, 유문과 분문의 양쪽에서 민첩하게 결찰(結紮)되고, 그 이후 제거된 후, 건조 내용물의 중량을 측정했다. 위 배출은 이하의 식에 의해 산출했다:

위 배출(%)= {1-(위로부터 취출된 먹이의 건조 중량/섭취한 먹이의 중량) ×100

(8) 반복 투여

야윈 마우스에 있어서 고지방 식이 또는 표준 식이 하에서 5일간, 및 ob/ob 비만 마우스에 있어서 표준 식이 하에서 6일간, 반복 IP 투여를 각각 계속했다. 마우스는 오전 7:00과 오후 19:00에 투여받았다. 먹이의 섭취와 체중을 매일 측정했다. 실험 종료시에(먹이의 제거 및 최종 IP 투여 후 8시간), 에터 마취 하에서 안와 공동(orbital sinus)으로부터 수득된 혈액으로부터 혈청을 분리했다. 마우스는 경추탈구에 의해 죽었다. 직후에, 백색 지방 조직(WAT)으로서 사정된 정소상 체지방체(fatpad) 덩어리(mass), 및 배복근을 제거하여, 중량을 측정했다. 혈중 글루코스를 글루코스 옥시다제법으로 측정했다. 혈청 인슐린과 유리 지방산(FFA)을 각각 효소 면역법 및 효소법(EIKEN CHEMICAL CO., LTD., Tokyo, Japan)에 의해 측정했다. 혈청 트라이글리세라이드와 전체 콜레스테롤을 효소법(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan)에 의해 측정했다.

실시예 1: 고지방 식이 하에서의 체중 증가 및 혈당 제어에 대한 그렐린 반복 투여의 작용

하루 2회 5일간의 그렐린의 IP 투여(1회 투여량: 3nmo1/마우스)에 의해, 1일 에너지 섭취의 증가에 따라 체중이 유의하게 증가했다(도 2, 도 3, 표 1). 지방체 덩어리는, 표준 식이 및 고지방 식이를 준 생리식염수 처리된 마우스에 비해 각각 49% 및 125% 유의하게 증가했다. 골격근은 중량의 증가를 나타내지 않았다. 혈청 콜레스테롤 및 인슐린 레벨도 증가하여, 혈중 글루코스 농도의 중간 정도의 증가를 수반했다. 다음으로 WAT에서의 렙틴, 아디포넥틴 및 레지스틴의 mRNA 레벨을 측정했다. 그렐린의 반복 투여에 의해 WAT에서 렙틴 mRNA의 발현이 증가함과 동시에 레지스틴 mRNA의 AT에서 렙틴 mRNA의 발현이 증가됨과 동시에 레지스틴 mRNA의 발현이 감소했다(도 4).

다음으로 전체 에너지의 45%를 지방으로서 포함하는 고지방 식이 하에서의 그렐린 mRNA의 발현을 측정했다. 2주간의 고지방 식이에 의해, 먹이 박탈 마우스의 위에 있어서의 그렐린 유전자의 발현은, 표준 식이에 비해 유의하게 증가했다(도 5).

실시예 2: GHS-R 길항제가 에너지 밸런스에 미치는 영향 GHS-R 길항제, [D-Lys-3]-GHRP-6를 먹이 박탈 마우스에 IP 투여했다. 도 6에 나타낸 바와 같이, [D-LVs-3]-GHRP-6에 의해 유의하게 용량 의존적으로 먹이 섭취가 감소했다.

계속해서, 중추 투여 [D-Lys-3]-GHRP-6가 동일한 효과를 가지는 지 여부에 관해서도 검토했다. ICV 및 IP 투여된 [D-Lys-3]-GHRP-6에 의해, 섭식 행동의 강력한 감소가 일어났다(도 7).

그렐린이 뇌 내의 GHS-R을 통해서 작용할 가능성을 평가하기 위해서, 그렐린과 [D-Lys-3]-GHRP-6의 동시 투여 먹이 섭취에 대한 효과를 조사했다. ICV 투여된 [D-Lys-3]-GHRP-6은 그렐린의 IP 투여에 의해 유도된 섭식에 대한 자극 효과를 저해했다(도 8).

다음으로 위 배출 속도에 대한 [D-Lys-3]-GHRP-6의 IP 투여 효과를 조사했다. 말초 투여된 [D-LVs-3]-GHRP-6에 의해, 위 배출 속도의 유의한 감소가, 투여 1시간 후에 일어났다(도 9).

별도의 GHS-R 길항제, [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P(L-756, 867)의 섭식에 대한 효과에 관해서도 먹이 박탈 마우스로 조사했다. 말초 투여된 [D-Arg-1, D-Phe-5, D-Trp-7, 9, Leu-11] substance P는 [D-Lys-3]-GHRP-6와 동일하게 용량 의존적으로 먹이 섭취를 유의하게 감소시킨다(도 10).

고지방 식이에 의해서 야기된 체중 증가가 부형제의 반복 투여에 의해 대폭 손상되었기 때문에(도 2), 식이에 의해 비만이 된 마우스에 있어서의 [D-Lys-3]-GHRP-6의 급성 작용을 검토했다. [D-Lys-3]-GHRP-6의 IP 투여에 의해 먹이의 섭취는 크게 감소하여, 체중 증가가 감소했다(도 11).

치료 효과에 대하여 추가로 전망을 얻기 위해서, IP 투여된 [D-Lys-3]-GHRP-6가 ob/ob 마우스에 있어서 식욕 부진 유발성 작용을 산생하는지 여부를 검토했다. 투여된 [D-Lys-3]-GHRP-6은, ob/ob 마우스 및 야윈 마우스에 있어서 먹이 섭취를 유의하게 감소시켰다(도 12).

마지막으로 [D-Lys-3]-GHRP-6의 반복 투여가 ob/ob 마우스에 있어서의 체중 증가와 혈당제어에 주는 영향을 검토했다. [D-Lys-3]-GHRP-6의 반복 주사에 의해, 근육 중량을 감소시키지 않고 체중 증가와 혈당 농도가 유의하게 저하되었다(도 13, 표 2). 또한, [D-Lys-3]-GHRP-6 처리에 의해 ob/ob 마우스의 FFA 레벨은 생리식염수 처리 ob/ob 마우스에 비해 24% 유의하게 감소했다(도 14).

<110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Remedy for Diabetes <130> 021019 <150> JP2002-197582 <151> 2002-07-05 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys 1 5 10 15 Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg 20 25 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys 1 5 10 15 Glu Arg Asn Lys Gly Gln 20 <210> 3 <211> 366 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Asn Ala Thr Pro Ser Glu Glu Pro Gly Phe Asn Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Asp Leu Asp Trp Asp Ala Ser Pro Gly Asn Asp Ser Leu Gly Asp 20 25 30 Glu Leu Leu Gln Leu Phe Pro Ala Pro Leu Leu Ala Gly Val Thr Ala 35 40 45 Thr Cys Val Ala Leu Phe Val Val Gly Ile Ala Gly Asn Leu Leu Thr 50 55 60 Met Leu Val Val Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Thr Thr Thr Asn Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Ser Ser Met Ala Phe Ser Asp Leu Leu Ile Phe Leu Cys Met 85 90 95 Pro Leu Asp Leu Val Arg Leu Trp Gln Tyr Arg Pro Trp Asn Phe Gly 100 105 110 Asp Leu Leu Cys Lys Leu Phe Gln Phe Val Ser Glu Ser Cys Thr Tyr 115 120 125 Ala Thr Val Leu Thr Ile Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Phe Ala 130 135 140 Ile Cys Phe Pro Leu Arg Ala Lys Val Val Val Thr Lys Gly Arg Val 145 150 155 160 Lys Leu Val Ile Phe Val Ile Trp Ala Val Ala Phe Cys Ser Ala Gly 165 170 175 Pro Ile Phe Val Leu Val Gly Val Glu His Glu Asn Gly Thr Asp Pro 180 185 190 Trp Asp Thr Asn Glu Cys Arg Pro Thr Glu Phe Ala Val Arg Ser Gly 195 200 205 Leu Leu Thr Val Met Val Trp Val Ser Ser Ile Phe Phe Phe Leu Pro 210 215 220 Val Phe Cys Leu Thr Val Leu Tyr Ser Leu Ile Gly Arg Lys Leu Trp 225 230 235 240 Arg Arg Arg Arg Gly Asp Ala Val Val Gly Ala Ser Leu Arg Asp Gln 245 250 255 Asn His Lys Gln Thr Val Lys Met Leu Ala Val Val Val Phe Ala Phe 260 265 270 Ile Leu Cys Trp Leu Pro Phe His Val Gly Arg Tyr Leu Phe Ser Lys 275 280 285 Ser Phe Glu Pro Gly Ser Leu Glu Ile Ala Gln Ile Ser Gln Tyr Cys 290 295 300 Asn Leu Val Ser Phe Val Leu Phe Tyr Leu Ser Ala Ala Ile Asn Pro 305 310 315 320 Ile Leu Tyr Asn Ile Met Ser Lys Lys Tyr Arg Val Ala Val Phe Arg 325 330 335 Leu Leu Gly Phe Glu Pro Phe Ser Gln Arg Lys Leu Ser Thr Leu Lys 340 345 350 Asp Glu Ser Ser Arg Ala Trp Thr Glu Ser Ser Ile Asn Thr 355 360 365 <210> 4 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gly Ser Pro Trp Asn Gly Ser Asp Gly Pro Glu Gly Ala Arg Glu 1 5 10 15 Pro Pro Trp Pro Ala Leu Pro Pro Cys Asp Glu Arg Arg Cys Ser Pro 20 25 30 Phe Pro Leu Gly Ala Leu Val Pro Val Thr Ala Val Cys Leu Cys Leu 35 40 45 Phe Val Val Gly Val Ser Gly Asn Val Val Thr Val Met Leu Ile Gly 50 55 60 Arg Tyr Arg Asp Met Arg Thr Thr Thr Asn Leu Tyr Leu Gly Ser Met 65 70 75 80 Ala Val Ser Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Leu Pro Phe Asp Leu Tyr 85 90 95 Arg Leu Trp Arg Ser Arg Pro Trp Val Phe Gly Pro Leu Leu Cys Arg 100 105 110 Leu Ser Leu Tyr Val Gly Glu Gly Cys Thr Tyr Ala Thr Leu Leu His 115 120 125 Met Thr Ala Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys Arg Pro Leu 130 135 140 Arg Ala Arg Val Leu Val Thr Arg Arg Arg Val Cys Ala Leu Ile Ala 145 150 155 160 Val Leu Trp Ala Val Ala Leu Leu Ser Ala Gly Pro Phe Leu Phe Leu 165 170 175 Val Gly Val Glu Gln Asp Pro Gly Ile Ser Val Val Pro Gly Leu Asn 180 185 190 Gly Thr Ala Arg Ile Ala Ser Ser Pro Leu Ala Ser Ser Pro Pro Leu 195 200 205 Trp Leu Ser Arg Ala Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gly Pro Glu Thr 210 215 220 Ala Glu Ala Ala Ala Leu Phe Ser Arg Glu Cys Arg Pro Ser Pro Ala 225 230 235 240 Gln Leu Gly Ala Leu Arg Val Met Leu Trp Val Thr Thr Ala Tyr Phe 245 250 255 Phe Leu Pro Phe Leu Cys Leu Ser Ile Leu Tyr Gly Leu Ile Gly Arg 260 265 270 Glu Leu Trp Ser Ser Arg Arg Pro Leu Arg Gly Pro Ala Ala Ser Gly 275 280 285 Arg Glu Arg Gly His Arg Gln Thr Val Arg Val Leu Leu Val Val Val 290 295 300 Leu Ala Phe Ile Ile Cys Trp Leu Pro Phe His Val Gly Arg Ile Ile 305 310 315 320 Tyr Ile Asn Thr Glu Asp Ser Arg Met Met Tyr Phe Tyr Gln Tyr Phe 325 330 335 Asn Ile Val Ala Leu Gln Leu Phe Tyr Leu Ser Ala Ser Ile Asn Pro 340 345 350 Ile Leu Tyr Asn Leu Ile Ser Lys Lys Tyr Arg Ala Ala Ala Phe Lys 355 360 365 Leu Leu Leu Ala Arg Lys Ser Arg Pro Arg Gly Phe His Arg Ser Arg 370 375 380 Asp Thr Ala Gly Glu Val Ala Gly Asp Thr Gly Gly Asp Thr Val Gly 385 390 395 400 Tyr Thr Glu Thr Ser Ala Asn Val Lys Thr Met Gly 405 410

Claims (9)

1. 성장 호르몬 방출 촉진 인자 수용체(GHS-R) 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 당뇨병 예방제 또는 치료제.
2. 제 1 항에 있어서,

   GHS-R 길항제가 그렐린 또는 그렐린 유사체의 길항제인 예방제 또는 치료제.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   말초 투여용인 예방제 또는 치료제.
4. GHS-R 길항제를 투여하는 것을 특징으로 하는 혈당치 저하 방법.
5. GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 비만 예방제 또는 치료제.
6. GHS-R 길항제를 유효 성분으로서 함유하는 식욕 억제제.
7. 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 예방법 또는 치료법.
8. 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 비만 예방법 또는 치료법.
9. 유효량의 GHS-R 길항제를 투여하는 것을 포함하는 식욕 억제법.