CN102757968B - 瓜类果斑病菌检测用核酸适体及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于瓜类果斑病菌检测用核酸适体及其检测方法。本发明提供的核酸适体，其核苷酸序列为Seq1:5'-ACAGCCTTCGCCTTCTCCCTCTTCGTGTTCCTCATGGACGTGCTG-3'，所述的核酸适体可与瓜类果斑病菌特异性结合，为瓜类果斑病菌的检测提供了一种新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测瓜类果斑病菌的核酸适体及其检测方法。
背景技术
瓜类果斑病是葫芦科作物上的一种严重的世界性病害，其病原为嗜酸菌属西瓜种(Acidovorax citrulli)，瓜类果斑病菌可以侵染多种葫芦科作物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等，自报道以来已在美国、澳大利亚、巴西、土耳其、日本、泰国、以色列、伊朗、匈牙利、希腊和我国多个省份发生，给当地的西甜瓜种植业造成了严重的损失。
核酸适体(Aptamer，又称适配体)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物靶标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，但与抗体相比具有很多优良的特性，如无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有良好的化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测瓜类果斑病菌的核酸适体及其检测方法。本发明提供的核酸适体序列如下：
5′-ACAGCCTTCGCCTTCTCCCTCTTCGTGTTCCTCATGGACGTGCTG-3′。
本发明还涉及上述核酸适体的筛选方法，包括如下步骤：用靶细菌对核酸文库进行筛选，得到与靶细菌特异结合的核酸适体；所述核酸文库为单链的随机核苷酸序列的文库；所述靶细菌为瓜类果斑病菌。
所述筛选方法具体包括如下步骤：
(1)以上述核酸文库为起始核酸文库；
(2)将所述起始核酸文库的溶液与靶细菌孵育，靶细菌与起始核酸文库中部分核酸序列结合，分离，得到与靶细菌结合的核酸序列文库；
(3)将所述与靶细菌结合的核酸序列文库的溶液与非靶细菌孵育，分离去除非靶细菌结合的核酸序列，得到与靶细菌特异结合的核酸序列；
(4)得到核酸适体。
所述步骤(2)中，还可包括如下步骤：在得到与靶细菌结合的核酸序列文库后，PCR扩增所述与靶细菌结合的核酸序列文库，并制成单链。
所述步骤(3)中，还可包括如下步骤：在得到与靶细菌结合的核酸序列文库后，PCR扩增所述与靶细菌结合的核酸序列文库，并制成单链。
所述筛选的方法中，在所述步骤(3)之后、步骤(4)之前，包括至少1次以上操作：以所述与靶细菌特异结合的核酸序列为起始核酸文库，步骤(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的与靶细菌特异结合的核酸序列为起始核酸文库。
所述筛选方法中，可每一轮筛选逐步增加筛选压力，以增进核酸适体的富集程度。所述增加筛选压力可为线性减少核酸序列文库和靶细菌的孵育时间和相应的线性增加核酸序列文库与非靶细菌的孵育时间。
所述靶细菌具体为瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)；所述非靶细菌具体可为黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae subsp.lachrymans)。
瓜类果斑病菌是一种严重危害包括西瓜在内的葫芦科作物，利用本发明的核酸适体，能够为检测该病菌提供更有效，方便的方法。
附图说明
图1为实施例1中核酸适体随筛选轮次的富集过程；峰形代表瓜类果斑病菌与FAM标记文库及每一轮产物结合的情况。
图2为实施例1中激光共聚焦显微镜检测瓜类果斑病菌与第5，6及13轮产物结合情况。
图3为应用筛选出的核酸适体识别瓜类果斑病菌的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买得到的。
瓜类果斑病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别购自American TypeCulture Collection(ATCC)、National Collection of Plant PathogenicBacteria(NCPPB)，存于中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所。
实施例1：用于瓜类果斑病菌核酸适体的筛选
一、随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包含20个核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机核酸序列文库如下：Seq2：
5′-ACGCTCGGATGCCACTACAG-(N)45-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3′
二、核酸适体的筛选
将随机核酸文库溶于结合缓冲液中(pH6.6PBS，137mM NaCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，0.1mg/mL鲱鱼精DNA，0.05％Tween20)，与瓜类果斑病菌在室温条件下振荡孵育1h；经洗涤缓冲溶液(pH6.6PBS，137mM NaCl)洗涤后，将细菌6000g离心5min所得沉淀溶于100μL去离子水中，所得溶液作为PCR反应的模板，利用引物SeqF：
5′-FAM-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3′和SeqR：
5′-Biotin-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3′进行PCR扩增，电泳检测扩增情况：若电泳条带亮则适当减少二轮PCR扩憎轮数；若电泳条带暗则适当增加二轮PCR扩憎轮数。将PCR产物与链亲和素微球(GE Healthcare，Sweden)孵育，用200μL PBS(pH6.6，137mMNaCl)洗一次，然后加入0.1M的NaOH溶液(含0.2M NaCl)将FAM标记的ssDNA与生物素标记的DNA链分离，将得到FAM标记的ssDNA链用NAP-5柱子(GE-Healthcare，UK)脱盐后测定OD值，真空浓缩，用于下一轮的筛选。
为得到高亲和性的检测瓜类果斑病菌的核酸适体，在筛选的过程中，通过逐步减少DNA文库与靶细菌孵育的时间，增加洗涤次数和洗涤时间以及对照细菌孵育的时间来增强筛选压力。核酸适体随筛选轮次的富集过程见图1，图2。
13轮筛选后，所得到的ssDNA库以没有标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物进行测序，得到以下核酸适体序列：
5′-ACAGCCTTCGCCTTCTCCCTCTTCGTGTTCCTCATGGACGTGCTG-3′
实施例2：核酸适体与瓜类果斑病菌的结合
将瓜类果斑病菌(浓度大约为108cfu/mL)用PBS洗两遍，然后与FAM标记的核酸适体室温条件下振荡孵育30min，PBS清洗两遍后溶于200μL的PBS中，通过流式细胞仪检测结合强度(见图3)。
实施例3：瓜类果斑病菌核酸适体特异性测试
利用实施例2的方法，对不同来源的8株瓜类果斑病菌进行核酸适体结合实验，结果显示该核酸适体可与所有参试的瓜类果斑病菌结合。
以其他6种植物病原细菌为对象测试核酸适体与非目标菌的结合情况，菌种包括兰花细菌性褐斑病菌(Acidovorax avenae subsp.cattleyae)，玉米细菌性条斑病菌(Acidovorax avenae subsp.avenae)，黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)成团泛菌(Pantoea agglomerans)，番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensissubsp.michiganens)，香豌豆束茎病(Rhodococcus fascians)，结果显示该核酸适体与上述参试对照菌不结合。
上述实验证明了该核酸适体具有良好的特异性。
Claims (2)
1.一种瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)检测用核酸适体，其核苷酸序列为:
5'-ACAGCCTTCGCCTTCTCCCTCTTCGTGTTCCTCATGGACGTGCTG-3'。
2.一种检测瓜类果斑病菌的方法，该方法直接利用经FAM荧光染料标记的权利要求1所述的核酸适体，与植物病原细菌进行孵育，然后用流式细胞仪检测荧光强度从而进行结果判定。
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