CN108179219A - 一种rt-pcr检测猕猴桃软腐病原菌的引物及其方法 - Google Patents

一种rt-pcr检测猕猴桃软腐病原菌的引物及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种实时荧光RT‑PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，其由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇‑TTCAGCCTCGGATTACGGTC‑3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇‑CTCGTGCATGGTGGTCTTGT‑3＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特异性引物进行实时荧光RT‑PCR检测比进行PCR检测的灵敏度至少提高100倍。本发明还提供基于该特异性引物的试剂盒、检测方法和应用。

Description

一种RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌的引物及其方法
技术领域
本发明属于农业及植物检疫技术领域，具体涉及一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的引物及其检测方法和应用。
背景技术
猕猴桃被称为水果之王和维生素C之冠，具有较高的经济效益，国内的主要种植区有四川、陕西和贵州等地。对于猕猴桃病害的检测、防控，是提高其经济价值，促进地区猕猴桃行业经济发展的必要手段。
软腐病是猕猴桃病害的主要病原菌之一。该病原菌在6月中旬至9月底有很高的产孢能力，当猕猴桃幼果感染该菌时，会严重影响果实的生长，在6月感染时，容易发生采前落果。该病原菌对于果底部和果中部均有较强的侵染能力。
实时荧光PCR检测法具有独特的优势，可以精确的检测不同组织、不同材料中病原菌的相对含量，得到了广泛的应用，如中国专利CN 201110316557.2公布了一种检测甘蔗宿根矮化病菌的实时荧光定量PCR方法，中国专利CN 201510051864.0公布了一种苹果茎沟病毒实时荧光定量PCR检测方法。
不过，在检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea方面，尚未发现效果较好的实时荧光定量PCR检测的特异性引物。
因此，研究开发适于检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的实时荧光定量PCR检测的特异性引物及其检测方法，对于猕猴桃软腐病的检测、预防和控制具有良好的学术和经济意义。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，所述特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-TTCAGCCTCGGATTACGGTC-3＇如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-CTCGTGCATGGTGGTCTTGT＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特异性引物进行实时荧光RT-PCR检测比进行PCR检测的灵敏度至少提高100倍。
本发明的另外一个目的在于提供包含上述特异性引物的实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒。本发明还有一个目的在于提供一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将提取的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分别作为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值作为横坐标，制作标准曲线；
(2)从猕猴桃果品中提取DNA，并将其稀释至步骤(1)所得标准曲线范围内；以SEQID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(1)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。
一般情况下，步骤(2)中，可选的提取DNA的方法为CTAB法。
具体到本发明而言，所述CTAB法可以具体以下述步骤进行：
1)取适量的猕猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；
2)加入550μL 65℃预热的CTAB提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次；
3)加入550μL氯仿异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；
4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；
5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；
6)干燥后，加入适量的灭菌ddH2O充分溶解，然后保存于-20℃备用。
步骤(1)中，所述标准曲线为：
y＝-0.050x+29.28，R2＝0.482。
作为本发明的一个可实施方案，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的荧光定量PCR体系为SYBR Green Real time PCR Master Mix Plus，具体为：Solution 5μL、10mM的正向引物0.25μL、10mM的下游引物0.25μL、cDNA2.5μL、ddH2O、2μL。
作为本发明的一个可实施方案，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的程序为：
1)95℃ 60s；
2)95℃ 15s；
3)60℃ 60s；
循环2)～3)39次。
本发明还有一个目的在于提供上述方法在检测由Botryosphaeria dothidea引起的猕猴桃软腐病上的应用。具体而言，所述应用包括对猕猴桃种苗检疫、土壤病原菌检测、猕猴桃软腐病早期病害诊断以及Botryosphaeria dothidea的检测和鉴定。
本发明的有益效果：
(1)本发明对于猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的检测具有高度特异性；
(2)本发明的检测灵敏度高，检测的最低值可达1.0pg菌体DNA，是普通PCR的100倍。
附图说明
图1为实施例1的扩增曲线图；
图2为实施例1的标准曲线图；
图3为针对本发明特异性引物对Botryosphaeria dothidea的特异性检测结果图；其中，B1-B2为发明人分离出的两株不同的猕猴桃软腐病病原菌Botryosphaeria dothidea菌株，分别编号为BC和HM1，P1和P3为发明人分离出的两株不同的猕猴桃溃疡菌菌株，分别编号为CX-2和DJY；H1和H2为发明人分离出的两株不同的猕猴桃褐斑病病原菌菌株，分别编号为HJ和HH；M1和M2为发明人分离出的两株不同的水稻稻瘟病病原菌菌株，分别编号为Guy-11和ZB-13；F1和F2为发明人分离出的两株不同的水稻稻曲病病原菌菌株，分别编号为WJ-1和PJ；
图4为常规PCR对于Botryosphaeria dothidea的检测灵敏度结果图，其中，泳道B1-1、B1-2、B1-3、B1-4、B1-5、B1-6、B1-7的DNA加入量为500ng、200ng、100ng、10ng、1.0ng、100pg、10pg。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
(1)将提取的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分别作为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值作为横坐标，制作标准曲线；得到的扩增曲线如图1所示，得到的标准曲线如图2所示，具体为：y＝-0.050x+29.28，R2＝0.482。
(2)从猕猴桃果品中提取DNA，并将其稀释至步骤(1)所得标准曲线范围内；以SEQID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(1)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。
上述步骤中，采用的荧光定量PCR体系为SYBR Green Real time PCRMasterMixPlus，具体为：Solution 5μL、10mM的正向引物0.25μL、10mM的下游引物0.25μL、cDNA2.5μL、ddH2O、2μL。
采用的程序为：
1)95℃ 60s；
2)95℃ 15s；
3)60℃ 60s；
循环2)～3)39次。
步骤(2)中，提取DNA的方法按照以下述步骤进行：
1)取适量的猕猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；
2)加入550μL 65℃预热的CTAB提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次
3)加入550μL氯仿异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；
4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；
5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；
6)干燥后，加入适量的灭菌ddH2O充分溶解，然后保存于-20℃备用。
通过检测，本发明方法的检测的最低值可达1pg菌体DNA，是普通PCR的100～1000倍。
实施例2
利用普通PCR方法，对实施例1的引物进行特异性检测，结果如图3所示，表面本发明的引物对于猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的检测具有高度特异性。
通过利用NCBI基因库的BLAST分析，本发明引物的E value最低可达0.28。
SEQUENCE LISTING
<110> 绵阳师范学院，绵阳市农业科学研究院
<120> 一种RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌的引物及其方法
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ttcagcctcg gattacggtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> （引物）
<400> 2
ctcgtgcatg gtggtcttgt 20

Claims (10)

1.一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物为：5＇-TTCAGCCTCGGATTACGGTC-3＇，如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物为：5＇-CTCGTGCATGGTGGTCTTGT-3＇，如SEQ ID NO.2所示；利用所述特异性引物进行实时荧光RT-PCR检测比进行PCR检测的灵敏度至少提高100倍。
2.一种包含权利要求1所述特异性引物的实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的试剂盒。
3.一种实时荧光RT-PCR检测猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将提取的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea标准品的DNA进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释的猕猴桃软腐病原菌Botryosphaeria dothidea的DNA，以其为模板，以SEQ ID NO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子分别作为正向引物和反向引物进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值作为横坐标，制作标准曲线；
(2)从猕猴桃果品中提取DNA，并将其稀释至步骤(1)所得标准曲线范围内；以SEQ IDNO.1所示的DNA分子和SEQ ID NO.2所示的DNA分子引物进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(1)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，提取DNA的方法为CTAB法。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CTAB法的步骤为：
1)取适量的猕猴桃果品放入1.5ml EP管中，加入液氮后，用研磨棒快速研磨成粉末；
2)加入550μL 65℃预热的CTAB提取液，剧烈振荡后，放于65℃恒温箱中1h，其间间隔10min振荡混匀一次
3)加入550μL氯仿-异戊醇，剧烈震荡并充分混匀，静置10min，于13000r/min转速下离心5min；
4)取上清，加入600μL冰乙醇，于13000r/min转速下离心5min，倒掉上清，用75％乙醇冲洗沉淀；重复该步骤至少1次；
5)于7500r/min转速下空离心3min，用移液器吸去底部多余的液体，放于室温自然干燥；
6)干燥后，加入适量的灭菌ddH2O充分溶解，然后保存于-20℃备用。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准曲线为：y＝-0.050x+29.28，R2＝0.482。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的荧光定量PCR体系为SYBR Green Real time PCR Master Mix Plus，具体为：Solution 5μL、10mM的正向引物0.25μL、10mM的下游引物0.25μL、cDNA 2.5μL、ddH2O、2μL。
8.根据权利要求3或7所述的方法，其特征在于，进行实时荧光定量PCR扩增时，采用的程序为：
1)95℃60s；
2)95℃15s；
3)60℃60s；
循环2)～3)39次。
9.权利要求3～8任一项所述方法在检测由Botryosphaeria dothidea引起的猕猴桃软腐病上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括对猕猴桃种苗检疫、土壤病原菌检测、猕猴桃软腐病早期病害诊断以及Botryosphaeria dothidea的检测和鉴定。
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