CN112280861A - 一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，具体涉及基因检测领域，本发明通过对HRR相关的基因进行筛选，得到目标检测基因池；采集受检者肿瘤样本，提取肿瘤DNA及RNA；构建DNA、RNA文库；通过高通量测序平台，将制备好的文库进行测序，得到肿瘤样本基因序列信息；涵盖绝大部分HRR通路相关基因，可全面的检测HRR通路缺陷信息；通过高通量测序平台对HRR基因全外显子测序，可全面的查看基因点突变、插入/缺失、拷贝数变异等基因变异信息；DNA水平和RNA水平联合超大的检测范围可更为全面地展现肿瘤突变信息，可为常规Panel检测阴性的患者带来更多临床获益。

Description

一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统。
背景技术
环境因素导致的DNA损伤是正常细胞转变为肿瘤细胞的主要诱因之一，而细胞的DNA损伤应答反应是防止肿瘤发生的早期屏障。DNA同源重组修复是DNA双链损伤的重要修复方式。HRR是一条涉及多个步骤的复杂的信号通路，其中关键蛋白为BRCA1和BRCA2。如果BRCA1/2基因出现突变则会导致BRCA1和BRCA2蛋白功能丢失，就会引起HRR功能异常。除了BRCA1/2基因之外，还有ATM、BARD1、BRIP1、CHEK1、CHEK2、PALB2，RAD51C，RAD51D等其他基因异常、BRCA1启动子甲基化等原因都可能引起HRD，导致基因同源重组修复缺陷。
PARP抑制剂是一种靶向聚ADP核糖聚合酶的癌症疗法。PARPi的作用机制简单来说就是“合成致死”，也就是说携带BRCA1/2基因突变的肿瘤携带着特定的DNA修复缺陷，因此对同样能阻碍DNA修复的PARPi尤其敏感，且对铂类化疗药物更敏感。至今，已有多种PARPi：奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼和他拉唑帕尼被FDA批准用于携带BRCA1/2基因突变的乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌、胰腺癌及前列腺癌患者的治疗。而在HRD发生频率较高的高级别浆液性卵巢癌中，HRD阳性患者占到了50％，而其中BRCA1/2仅占19％。从合成致死的原理上，PARPi可以在所有的HRD阳性肿瘤细胞中发挥作用，即不仅仅限于BRCA1/2基因突变。可喜的是，HRD作为生物标志物在临床治疗上的指导意义日益凸显，PARP抑制剂获益人群也已经从BRCA突变患者扩展到HRD阳性人群。基于多项临床试验，2019年10月23号，美国FDA批准尼拉帕利扩展适应症，用于治疗具有HRD阳性的既往接受过3种以上化疗的晚期卵巢癌患者的治疗。2020年5月8日，奥拉帕利获FDA批准扩展适应症，与贝伐珠单抗联合用于治疗一线以铂为基础的化疗后实现完全或部分缓解的HRD+的晚期上皮性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌成人患者。2020年5月19，FDA批准奥拉帕利用于治疗既往已接受过恩扎卢胺或阿比特龙治疗后进展的携带有害或可能有害的同源重组修复通路(HRR)基因突变(胚系/体系)的转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者。HRD的登场填补了部分BRCA1/2阴性的PARPi敏感患者的治疗空白！
目前，同源重组修复基因相关的检测主要还是基于BRCA1/2变异的检测，且传统的检测方法灵敏度、特异性都比较低，通量低，只能检测部分变异，不能全面的展示同源重组修复基因突变景观。目前已有的HRD的检测方法主要是通过HRD对细胞基因组产生影响的表征，直接确定HRD导致的结果，如通过单独计算杂合缺失的数目，端粒等位基因不平衡的数目和大片段迁移的数目中的一个、两个或三个的值进行，并没有考虑到其它重要类型变异导致同源重组缺失发生的情况。研究表明，不仅如此，还有其它变异类型也会影响到DNA损伤修复，例如INDEL(插入和缺失)、CNV等，这些变异类型与染色体损伤之间存在相关，从而影响着机体能否成功修复DNA损伤。特别是同源重组相关代谢途径中的基因发生此类型变异时，会使同源重组机制缺失。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的实施例提供一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，本发明所要解决的问题是：传统的检测方法灵敏度、特异性都比较低，通量低，只能检测部分变异，不能全面的展示同源重组修复基因突变景观。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，包括以下步骤：
S1：筛选HRR相关的基因，获得靶向基因库，确定19个HRR相关基因：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK2、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD54L、RAD51C、RAD51D、CHEK1、FANCL、FANCD2、MRE11、NBN和TP53；
S2：样本采集，采集受检者的新鲜组织或石蜡包埋组织作为检测样本；
S3：提取肿瘤DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA待用；
S4：文库制备，按照标准操作流程进行RNA反转录成cDNA、cDNA扩增、DNA扩增、扩增子的接头连接及纯化、文库纯化、文库洗脱及文库定量，将定量好的文库储存备用；
S5：测序及数据处理，将储存好的文库上机测序并进行数据处理。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S3中通过DNA和RNA共提取流程提取肿瘤细胞中的DNA和RNA的具体操作步骤如下：
S301：用干净的刀片去除多余石蜡，把石蜡包埋组织样品切成5-10um的切片，若切片已暴露在空气中，去除表面的2-3个切片，立即转移1-5片组织切片至1.5ml离心管中；
S302：用脱蜡液去除石蜡
S3021：加入0.8ml Buffer DPS(脱蜡液)至样品中，涡旋混匀，短暂离心确定样品浸泡到Buffer DPS中；
S3022：短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56℃水浴3分钟；
S3023：静置让样品恢复至室温，14,000x g离心2分钟；
S3024：小心彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀；
S303：加入200ul Buffer FRL和20ul Proteinase K至样品中，涡旋10秒重悬样品；
S304：55℃水浴15-20分钟，然后冰上放置3分钟。
S305：室温，20,000x g离心15分钟。
S306：小心转移上清液至新的1.5ml离心管用于RNA抽提，保留沉淀用于DNA抽提。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S306中RNA抽提的具体操作步骤如下：
S3071：把步骤S305中得到的上清液，80℃水浴15分钟；
S3072：加入200ul Buffer RL和600ul无水乙醇，涡旋混匀15秒；
S3073：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移一半体积的混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3074：倒弃流出液，把柱子装在收集管中。转移剩余混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3075：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3076：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3077：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3078：将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入15-50ul RNase Free Water至柱子的膜中央，静置1分钟，13000x g离心1分钟；
S3079：弃去柱子，把RNA保存于-80℃。
在一个优选的实施方式中，所述步骤S306中DNA抽提的具体操作步骤如下：
S3081：取步骤S306获得的沉淀团，加入180ul BufferATL和20ul Proteinase K至沉淀团中，涡旋15秒重悬沉淀
S3082：55℃水浴1小时，然后再90℃水浴1小时；
S3083：短暂离心，加入200ul BufferAL至样品中，涡旋混匀15秒；
S3084：加入200ul无水乙醇至样品中，涡旋混匀15秒；
S3085：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8000x g离心60秒；
S3086：倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500ul Buffe GW1(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3087：倒弃流出液，把柱子装出收集管中，加入500ul Buffe GW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3088：倒弃滤液，把柱子装回收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3089：将柱子转移至新的1.5ml离心管，加入15-30ul Elution Buffer至柱子的膜中央，静置3分钟，13000x g离心1分钟；
S30810：丢弃结合柱，把DNA保存于2-8℃备用。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明涵盖了绝大部分HRR通路相关基因，可全面的检测HRR通路缺陷信息；通过高通量测序平台对HRR基因测序，可全面的查看基因点突变、插入/缺失、拷贝数变异等基因变异信息；DNA水平和RNA水平联合超大的检测范围可更为全面地展现肿瘤突变信息，可为常规Panel检测阴性的患者带来更多临床获益。
附图说明
图1为本发明检测同源重组修复基因突变HRRm的检测方法及流程图；
图2为本发明检测样本中的DNA、RNA共提取的流程图；
图3为本发明的文库制备流程图示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，包括以下步骤：
S1：筛选HRR相关的基因，获得靶向基因库，确定19个HRR相关基因：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK2、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD54L、RAD51C、RAD51D、CHEK1、FANCL、FANCD2、MRE11、NBN和TP53；
S2：样本采集，采集受检者的新鲜组织或石蜡包埋组织作为检测样本；
S3：提取肿瘤DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA待用；
S4：文库制备，按照标准操作流程进行RNA反转录成cDNA、cDNA扩增、DNA扩增、扩增子的接头连接及纯化、文库纯化、文库洗脱及文库定量，将定量好的文库储存备用；
S5：测序及数据处理，参考Ion GeneStudio S5高通量测序仪操作手册，将储存好的文库上机测序并进行数据处理。
所述步骤S3中通过DNA和RNA共提取流程提取肿瘤细胞中的DNA和RNA的具体操作步骤如下：
S301：用干净的刀片去除多余石蜡，把石蜡包埋组织样品切成5-10um的切片，若切片已暴露在空气中，去除表面的2-3个切片，立即转移1-5片组织切片至1.5ml离心管中；
S302：用脱蜡液去除石蜡
S3021：加入0.8ml Buffer DPS(脱蜡液)至样品中，涡旋混匀，短暂离心确定样品浸泡到Buffer DPS中；
S3022：短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56℃水浴3分钟；
S3023：静置让样品恢复至室温，14,000x g离心2分钟；
S3024：小心彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀；
S303：加入200ul Buffer FRL和20ul Proteinase K至样品中，涡旋10秒重悬样品；
S304：55℃水浴15-20分钟，然后冰上放置3分钟。
S305：室温，20,000x g离心15分钟。
S306：小心转移上清液至新的1.5ml离心管用于RNA抽提，保留沉淀用于DNA抽提。
所述步骤S306中RNA抽提的具体操作步骤如下：
S3071：把步骤S305中得到的上清液，80℃水浴15分钟；
S3072：加入200ul Buffer RL和600ul无水乙醇，涡旋混匀15秒；
S3073：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移一半体积的混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3074：倒弃流出液，把柱子装在收集管中。转移剩余混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3075：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3076：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3077：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3078：将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入15-50ul RNase Free Water至柱子的膜中央，静置1分钟，13000x g离心1分钟；
S3079：弃去柱子，把RNA保存于-80℃。
所述步骤S306中DNA抽提的具体操作步骤如下：
S3081：取步骤S306获得的沉淀团，加入180ul BufferATL和20ul Proteinase K至沉淀团中，涡旋15秒重悬沉淀
S3082：55℃水浴1小时，然后再90℃水浴1小时；
S3083：短暂离心，加入200ul BufferAL至样品中，涡旋混匀15秒；
S3084：加入200ul无水乙醇至样品中，涡旋混匀15秒；
S3085：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8000x g离心60秒；
S3086：倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500ul Buffe GW1(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3087：倒弃流出液，把柱子装出收集管中，加入500ul Buffe GW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3088：倒弃滤液，把柱子装回收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3089：将柱子转移至新的1.5ml离心管，加入15-30ul Elution Buffer至柱子的膜中央，静置3分钟，13000x g离心1分钟；
S30810：丢弃结合柱，把DNA保存于2-8℃备用。
所述步骤S4中文库制备的具体操作步骤如下：
RNA文库制备
目标cDNA的制备及扩增
RNA反转录
(1)RNA在80℃下预热10分钟，然后使其冷却至室温。
(2)配置PCR体系，对于每份样本，向96孔PCR板的每个反应孔中添加以下成分。
成分 体积
5X VILO<sup>TM</sup>Reaction Mix 2μL
10X SuperScript<sup>TM</sup>Enzyme Mix 1μL
Total RNA(10ng) ≤7μL
Nuclease-Free Water 补至10μL
总计 10μL
(3)使用封板膜密封96孔板，充分涡旋混匀，然后离心100rcf 30秒来收集液滴。
(4)在96孔板上放置
Figure BDA0002756462070000091
Compression Pad，将96孔板放入PCR仪中，运行以下程序合成cDNA：
温度 时间
42℃ 30分钟
85℃ 5分钟
10℃ 保持
(5)在进入下一步骤前，将PCR板100rcf离心30秒。
cDNA扩增
(1)cDNA合成反应结束后，移除96孔板封膜，并向每个样品孔中添加以下成分：
成分 体积
Ion Ampliseq HiFi Mix(红盖) 4μL
5X Oncomine<sup>TM</sup>Focus RNA Assay(红 2μL
Nuclease-Free Water 4μL
每个孔的总体积(含10μL cDNA合 20μL
(2)使用一张新的封板膜密封96孔板，充分涡旋混匀，然后离心100rcf30秒收集液滴。
(3)将
Figure BDA0002756462070000092
Compression Pad放在PCR板上，然后将PCR板放置于VeritiTMDx96孔PCR仪内，运行以下程序以扩增cDNA目标区域：
Figure BDA0002756462070000093
(4)在进入下一步骤前，将PCR板100rcf离心30秒。
DNA扩增
(1)向每个样品孔中添加下表中的组分。若准备多个样品，请配置预混液。
成分 体积
Ion Ampliseq HiFi Mix(红盖) 4μL
5X Oncomine<sup>TM</sup>Focus DNA Assay(蓝 4μL
DNA,10ng ≤12μL
Nuclease-Free Water 补齐至20μL
(2)使用一张新的封板膜密封96孔板，充分涡旋混匀，然后离心100rcf30秒收集液滴。
(3)将
Figure BDA0002756462070000101
Compression Pad放在PCR板上，然后将PCR板放置于PCR仪内，运行以下程序以扩增DNA目标区域：
Figure BDA0002756462070000102
(4)在进入下一步骤前，将PCR板100rcf离心30秒。
转移DNA扩增子
(1)请小心撕开DNA和RNA扩增板的封膜。
(2)将DNA扩增板上的每个样品，转移到RNA扩增板上对应样品RNA扩增子旁的空孔中。
引物序列的部分消化
(1)向每个扩增后的样本中添加2μL FuPa Reagent。添加后的反应液总体积为22μL。
(2)使用一张新的封板膜密封96孔板，充分涡旋混匀，然后离心100rcf30秒收集液滴。
(3)将
Figure BDA0002756462070000111
Compression Pad放在PCR板上，然后将PCR板放置于PCR仪内运行以下程序：
温度 时间
50℃ 10分钟
55℃ 10分钟
60℃ 20分钟
10℃ 保持(最多1小时)
(4)在进入下一步骤前，将PCR板100rcf离心30秒。
扩增子的接头连接及纯化
(1)小心地除去96孔板封板膜，向每个消化后的样本中按照下表顺序添加以下成分(每孔总体积30μL)。加样完成后，使用15ul移液器缓慢地上下混匀5次。
顺序 成分 体积
1 Switch Solution(黄盖) 4μL
2 Barcodes Adaptors(BC1-16,稀释) 2μL
3 DNA Ligase(蓝盖) 2μL
(2)使用新的封板膜密封96孔板，涡旋混匀，然后100rcf离心30秒收集液滴。
(3)在96孔板上放置
Figure BDA0002756462070000112
Compression Pad，放入PCR仪中运行以下程序：
温度 时间
22℃ 30分钟
68℃ 5分钟
72℃ 5分钟
10℃ 保持(最多1小时)
(4)在进入下一步骤前，将PCR板100rcf离心30秒。
文库纯化
(1)配置新鲜的70％乙醇：应新鲜制备，350ul x样品数。
(2)小心地除去96孔板封板膜，向每个文库中添加45μL(1.5倍样本体积)的
Figure BDA0002756462070000121
XP试剂，反复吹吸5次，使磁珠悬液和DNA充分混匀。
(3)将混合物在室温下孵育5分钟。
(4)将96孔板放在磁力架上静置2分钟。然后小心吸取并去除上清液，勿扰动磁珠。
(5)加入150μL新制备的70％乙醇，将96孔板在磁力架来回移位，以清洗磁珠，然后小心吸取并去除上清液，勿扰动磁珠。
(6)重复第5步进行第二次磁珠清洗。
(7)把PCR板从磁力架上取出，封膜后100rcf离心30秒。检查是否每个孔的乙醇都被移除干净。
(8)将96孔板放置于磁力架上，室温干燥5分钟。
文库洗脱
(1)将96孔板从磁力架上取下，用50ul Low TE重悬磁珠。使用封板膜密封96孔板，涡旋混匀，然后离心收集液滴。或者在密封之前，将移液器刻度调至反应液总体积一半以上，反复吹吸反应液至少5次，使其充分混匀。
(2)将96孔板放置于磁力架上至少2分钟。吸取45ul上清液到新的1.5ml Low Bind管中，即为文库，从中吸取2ul+198ul Nuclease-Free Water稀释100倍，用于qPCR文库定量分析。
文库定量
(1)使用E.coli DH10B文库(原始浓度68pM，Ion Library Quantitation试剂盒)制备3种10倍梯度稀释液，其浓度分别是6.8pM，0.68pM和0.068pM。使用这些梯度稀释液作为qPCR仪器软件的标准曲线文库样品。
(2)按照下方表格配制反应体系。
Figure BDA0002756462070000131
(3)按如下程序设置qPCR仪反应程序：
·输入标准文库的梯度浓度；
·使用ROXTM荧光作为背景参考荧光；
·选择反应体系20μL；
·使用FAMTMdye/MGB作为TaqMan探针的报告基团/淬灭基团；
·Ion Library TaqMan qPCR Mix适用于下表中的多种定量PCR仪器。Fast循环程序是基于StepOnePlusTM平台的Fast模式建立的。
Figure BDA0002756462070000132
Figure BDA0002756462070000141
(4)PCR反应结束后，将qPCR的定量结果乘以100的稀释倍数，从而得到未稀释IonAmpliseq文库的平均浓度。
(5)基于上面计算的文库浓度，将文库稀释到50pM，用于后续试验。
储存文库
文库在4–8℃中最多保存一个月，或者在–20℃条件下保存更长的时间。
综上所述：本发明通过对HRR相关的基因进行筛选，得到目标检测基因池；采集受检者肿瘤样本，提取肿瘤DNA及RNA；构建DNA、RNA文库；通过Ion GeneStudio S5高通量测序平台，将制备好的文库进行测序，得到肿瘤样本基因序列信息；涵盖了绝大部分HRR通路相关基因，可全面的检测HRR通路缺陷信息；通过高通量测序平台对HRR基因全外显子测序，可全面的查看基因点突变、插入/缺失、拷贝数变异等基因变异信息；DNA水平和RNA水平联合超大的检测范围可更为全面地展现肿瘤突变信息，可为常规Panel检测阴性的患者带来更多临床获益。
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，其特征在于，包括以下步骤：
S1：筛选HRR相关的基因，获得靶向基因库，确定19个HRR相关基因：BRCA1、BRCA2、ATM、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK2、PALB2、PPP2R2A、RAD51B、RAD54L、RAD51C、RAD51D、CHEK1、FANCL、FANCD2、MRE11、NBN和TP53；
S2：样本采集，采集受检者的新鲜组织或石蜡包埋组织作为检测样本；
S3：提取肿瘤DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA待用；
S4：文库制备，按照标准操作流程进行RNA反转录成cDNA、cDNA扩增、DNA扩增、扩增子的接头连接及纯化、文库纯化、文库洗脱及文库定量，将定量好的文库储存备用；
S5：测序及数据处理，将储存好的文库上机测序并进行数据处理。
2.根据权利要求1所述的一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，其特征在于，所述步骤S3中通过DNA和RNA共提取流程提取肿瘤细胞中的DNA和RNA的具体操作步骤如下：
S301：用干净的刀片去除多余石蜡，把石蜡包埋组织样品切成5-10um的切片，若切片已暴露在空气中，去除表面的2-3个切片，立即转移1-5片组织切片至1.5ml离心管中；
S302：用脱蜡液去除石蜡
S3021：加入0.8ml Buffer DPS(脱蜡液)至样品中，涡旋混匀，短暂离心确定样品浸泡到Buffer DPS中；
S3022：短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56℃水浴3分钟；
S3023：静置让样品恢复至室温，14,000x g离心2分钟；
S3024：小心彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀；
S303：加入200ul Buffer FRL和20ul Proteinase K至样品中，涡旋10秒重悬样品；
S304：55℃水浴15-20分钟，然后冰上放置3分钟。
S305：室温，20,000x g离心15分钟。
S306：小心转移上清液至新的1.5ml离心管用于RNA抽提，保留沉淀用于DNA抽提。
3.根据权利要求2所述的一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，其特征在于，所述步骤S306中RNA抽提的具体操作步骤如下：
S3071：把步骤S305中得到的上清液，80℃水浴15分钟；
S3072：加入200ul Buffer RL和600ul无水乙醇，涡旋混匀15秒；
S3073：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移一半体积的混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3074：倒弃流出液，把柱子装在收集管中。转移剩余混合液至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3075：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3076：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500ul Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3077：倒弃流出液，把柱子装在收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3078：将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入15-50ul RNase Free Water至柱子的膜中央，静置1分钟，13000x g离心1分钟；
S3079：弃去柱子，把RNA保存于-80℃。
4.根据权利要求2所述的一种检测同源重组基因突变HRRm的检测系统，其特征在于，所述步骤S306中DNA抽提的具体操作步骤如下：
S3081：取步骤S306获得的沉淀团，加入180ul BufferATL和20ul Proteinase K至沉淀团中，涡旋15秒重悬沉淀
S3082：55℃水浴1小时，然后再90℃水浴1小时；
S3083：短暂离心，加入200ul BufferAL至样品中，涡旋混匀15秒；
S3084：加入200ul无水乙醇至样品中，涡旋混匀15秒；
S3085：把HiPure RNA Mini Column装在2ml收集管中，转移混合液至柱子中，8000x g离心60秒；
S3086：倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500ul Buffe GW1(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3087：倒弃流出液，把柱子装出收集管中，加入500ul Buffe GW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8000x g离心30-60秒；
S3088：倒弃滤液，把柱子装回收集管中，13000x g离心空柱3分钟，以甩干柱子的基质；
S3089：将柱子转移至新的1.5ml离心管，加入15-30ul Elution Buffer至柱子的膜中央，静置3分钟，13000x g离心1分钟；
S30810：丢弃结合柱，把DNA保存于2-8℃备用。
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