CN107400711A

CN107400711A - 使用透化处理的细胞过滤小核酸

Info

Publication number: CN107400711A
Application number: CN201710626674.6A
Authority: CN
Inventors: 孔艳红; 史蒂文·T·奥基诺; 孟祥栋
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2011-08-03
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2017-11-28
Also published as: WO2013019960A1; US9752177B2; US20140220586A1; EP2739752B1; US20160208312A9; EP2739752A4; US20130035239A1; CN103732761A; EP2739752A1; US8728987B2

Abstract

本文描述了使用透化处理的细胞过滤小核酸以及利用所述过滤来检测基因组DNA可及性的方法。

Description

使用透化处理的细胞过滤小核酸

本申请是PCT申请号为PCT/US2012/049344，中国国家阶段申请号为201280038451.3的发明专利申请的分案申请。原申请的发明名称为“使用透化处理的细胞过滤小核酸”，申请日为2012年8月2日。

相关专利申请的交叉参考

本专利申请要求于2011年8月3日提交的美国临时专利申请号61/514,711和于2011年12月14日提交的61/570,581的优先权利益，这两份美国临时专利申请通过引用分别并入本文。

发明背景

染色质分类成两个大组：常染色质，其中DNA是松散包装的、可及的(accessible)，并且通常但不总是能够转录的，和异染色质，其中DNA是紧密包装的、不可及的，并且通常但不总是转录沉默的。

表观遗传学控制在这两种染色质状态之间的至少一些转换。存在至少两种主要的表观遗传学事件：DNA甲基化和组蛋白修饰。这些事件影响DNA如何包装，并且影响DNA是转录活性的还是沉默的。

发明简述

本发明提供，例如，将透化处理的细胞中DNA切割剂可及的DNA与DNA切割剂不可及的DNA分离的方法。在一些实施方案中，该方法包括：透化处理具有基因组DNA的细胞，由此产生透化处理的细胞；在使得DNA切割剂切割细胞中的基因组DNA的条件下向所述具有基因组DNA的透化处理的细胞中引入DNA切割剂，由此产生切割的DNA；并且将从完整的透化处理的细胞中扩散出来的切割的DNA与所述细胞分离。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述透化处理的细胞中引入DNA修饰剂，以使所述DNA修饰剂修饰所述细胞中的基因组DNA。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂和所述DNA切割剂被同时引入，或者所述DNA修饰剂在引入所述DNA切割剂之前引入。在一些实施方案中，所述DNA切割剂是DNA酶I或微球菌核酸酶。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂将修饰添加到所述DNA切割剂的至少一些识别序列上，并且所述DNA切割剂不切割具有所述修饰的识别序列。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂将修饰添加到所述DNA切割剂的至少一些识别序列上，并且所述DNA切割剂切割具有所述修饰的识别序列且不切割缺乏所述修饰的识别序列。

在一些实施方案中，所述DNA修饰剂是DNA甲基转移酶。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂在引入所述DNA切割剂之后引入。

在一些实施方案中，透化处理和引入同时发生。

在一些实施方案中，所述方法还包括分离所述切割的DNA。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述分离之后将在完整的细胞中剩余的DNA分离。

在一些实施方案中，所述细胞用透化处理剂透化处理。在一些实施方案中，细胞通过电穿孔或生物射弹法(biolistics)透化处理。在一些实施方案中，所述透化处理剂是溶血脂质(lysolipid)或非离子去污剂。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂包括DNA酶。在一些实施方案中，所述DNA切割剂是DNA酶I或微球菌核酸酶。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂包括限制酶。在一些实施方案中，所述限制酶是甲基化感应限制酶(methylation sensing restriction enzyme)。在一些实施方案中，所述限制酶是N⁶-甲基腺苷感应限制酶。在一些实施方案中，所述限制酶是甲基胞嘧啶感应限制酶。在一些实施方案中，所述限制酶是5-羟甲基胞嘧啶-感应限制酶。在一些实施方案中，所述限制酶切割包含5’-羟甲基胞嘧啶的识别序列。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂包括与异源DNA识别多肽融合的DNA切割多肽。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂包括与异源蛋白识别多肽融合的DNA切割多肽。

在一些实施方案中，所述分离包括亲和纯化DNA。在一些实施方案中，所述亲和纯化包括免疫沉淀。在一些实施方案中，DNA通过使亲和剂同与DNA缔合的蛋白结合而进行亲和纯化，由此纯化蛋白和与所述蛋白缔合的DNA。在一些实施方案中，所述亲和剂是抗体。在一些实施方案中，所述亲和剂连接到固体支持物上。在一些实施方案中，所述与DNA缔合的蛋白是组蛋白，修饰的组蛋白(修饰的(例如，甲基化的)或未修饰的)，转录因子，RNA聚合酶或TATA盒结合蛋白(TBP)。

在一些实施方案中，所分离的DNA为约50bp至约10kb。

在一些实施方案中，所述方法还包括对所分离的DNA进行分析。在一些实施方案中，分析包括对所分离的DNA进行核苷酸测序。在一些实施方案中，核苷酸测序还检测DNA修饰。在一些实施方案中，分析包括扩增反应。在一些实施方案中，分析包括核酸杂交。在一些实施方案中，两种以上的核酸与一种或多种蛋白缔合，并且分析包括使所述两种以上的核酸连接。

在一些实施方案中，所分离的DNA与一种或多种蛋白缔合。在一些实施方案中，所述方法还包括分析与所分离的DNA缔合的所述一种或多种蛋白。

在一些实施方案中，所分离的DNA与一种或多种RNA缔合。在一些实施方案中，所述方法还包括分析与所分离的DNA缔合的所述一种或多种RNA。

在一些实施方案中，分离包括离心和/或过滤透化处理的细胞，由此将包含切割的DNA的溶液与细胞分开。在一些实施方案中，将DNA修饰剂引入到透化处理的细胞中，并且所述分析包括确定所分离的DNA中存在或不存在修饰。

本发明还提供试剂盒，例如，包括与本文所述的方法一起使用的本文所述的一种或多种试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包括DNA修饰剂和/或DNA切割剂；细胞透化处理剂；和特异性结合DNA结合蛋白的亲和剂。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂包括DNA酶或限制酶或与异源DNA识别多肽融合的DNA切割多肽。在一些实施方案中，所述DNA修饰剂是DNA甲基转移酶。在一些实施方案中，所述透化处理剂是溶血脂质或非离子去污剂。在一些实施方案中，所述亲和剂与组蛋白、RNA聚合酶、转录因子或TATA盒结合蛋白(TBP)特异性结合。在一些实施方案中，所述亲和剂与固体支持物连接。在一些实施方案中，所述固体支持物是珠子或颗粒。在一些实施方案中，所述珠子或颗粒是有磁性的。

定义

“透化处理”细胞膜，用在本文中是指降低细胞膜的完整性，由此允许较小的基因组DNA片段或蛋白-DNA/组蛋白DNA复合物从细胞中扩散出来，并且任选地允许DNA切割剂和/或修饰剂、或其他的酶蛋白、抗体或嵌合蛋白进入细胞中。具有透化处理的细胞膜的细胞通常保留细胞膜，使得细胞结构基本上保持完好。具有透化处理的膜的细胞不是“溶解的”细胞，例如，如在标准DNA纯化技术中存在的“溶解的”细胞。相反，“破坏”细胞膜用在本文中是指降低细胞膜的完整性，以使细胞结构不保持完好(例如，诸如细胞溶解过程中)。

“DNA修饰剂”用在本文中是指以可检测的方式改变DNA的分子。示例性的修饰包括DNA切割、DNA切口形成或者引入或从DNA去除化学结构部分(通常，其中所述引入或去除不直接导致所述DNA的切割)。DNA修饰剂包括，但不限于，DNA甲基转移酶。

“DNA区”用在本文中是指在基因组DNA内的目的靶序列。所述DNA区可以是感兴趣的且是所用的DNA修饰剂可及的任意长度。在一些实施方案中，所述DNA区可以包括单碱基对，但是也可以是基因组DNA内的短序列区段(例如，2-100，2-500，50-500bp)或较大的区段(例如，100-10,000，100-1000或1000-5000bp)。DNA区中DNA的量有时通过在PCR反应中要被扩增的序列(即，在两个引物之间)的量来确定。例如，标准PCR反应通常可以扩增约35至5000碱基对。

不同“程度”的修饰是指在各样品之间或是在一种或多种样品中的两个或更多DNA区之间的一个或多个DNA区域的不同数量的(实际或相对的)修饰的拷贝数。例如，如果在细胞中在染色体DNA上分别存在100拷贝的两个DNA区(便利地命名为“A区”和“B区”)，不同程度的修饰的实例可能是这样的：10个拷贝的A区被修饰，而70个拷贝的B区被修饰。

术语“寡核苷酸”或“多聚核苷酸”或“核酸”互换地是指单体的聚合物，可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物，或其类似物。这包括核苷酸的聚合物，诸如RNA和DNA，及其修饰形式，肽核酸(PNAs)，锁定核酸(LNA^TM)等。在特定的应用中，核酸可以是包括多个单体形式例如RNA和DNA两种亚基的聚合物。

核酸典型地是单链的或双链的，并且通常包含磷酸二酯键，尽管在一些情形中，如本文所述，包括可能具有改变的主链的核酸类似物，包括，例如但不限于，磷酰胺(Beaucage等，(1993)Tetrahedron 49(10)：1925及其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.(有机化学杂志)35：3800；Sprinzl等，(1977)Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)81：579；Letsinger等，(1986)Nucl.Acids Res.(核酸研究)14：3487；Sawai等，(1984)Chem.Lett.(化学通信)805；Letsinger等，(1988)J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)110：4470；和Pauwels等，(1986)Chemica Scripta 26：1419)，硫代磷酸酯(Mag等，(1991)Nucleic AcidsRes.(核酸研究)19：1437和美国专利号5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等，(1989)J.Am.Chem.Soc.美国化学学会杂志)111：2321)，O-甲基亚磷酰胺连接(Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach(寡核苷酸和类似物：实践方法)，Oxford University Press(牛津大学出版社)(1992))和肽核酸主链与连接(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)114：1895；Meier等，(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature(自然)365：566；和Carlsson等，(1996)Nature(自然)380：207)，所述参考文献通过引用分别并入本文。其他类似的核酸包括具有带正电荷主链的那些(Denpcy等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)92：6097)；非离子主链(美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger等，(1988)J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)110：4470；Letsinger等，(1994)Nucleoside & Nucleotide(核苷与核苷酸)13：1597；第2和3章，ASC Symposium Series(ASC讨论会系列)580，″CarbohydrateModifications in Antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)″，Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook编；Mesmaeker等，(1994)Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.(生物有机和医药化学通信)4：395；Jeffs等，(1994)J.Biomolecular NMR(生物分子NMR)34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和非核糖主链，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及第6和7章，ASC Symposium Series(ASC讨论会系列)580，CarbohydrateModifications in Antisense Research(反义研究中的碳水化合物修饰)，Y.S.Sanghvi和P.Dan Cook编中所述的那些，所述参考文献通过引用分别并入本文。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(Jenkins等，(1995)Chem.Soc.Rev.(化学学会综述)pp169-176，其通过引用并入本文)。例如，在Rawls，C & E News，1997年7月2日，第35页(其通过引用并入本文)中也描述了一些核酸类似物。可以进行核糖-磷酸酯主链的这些修饰以促使添加另外的结构部分，如标记结构部分，或改变此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

除了典型地在核酸中存在的天然存在的杂环碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核酸类似物还包括具有非天然存在的杂环碱基或其他修饰的碱基的那些，它们中的许多记述在本文中或在本文中另外提及。具体地，许多非天然存在的碱基进一步记述在，例如，Seela等，(1991)Helv.Chim.Acta 74：1790，Grein等，(1994)Bioorg.Med.Chem.Lett.(生物有机医药化学通信)4：971-976，和Seela等，(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640中，其通过引用分别并入本文。为了进一步举例说明，任选地包括用在核苷酸中作用为解链温度(Tm)改性剂的特定的碱基。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤等)，吡唑[3，4-d]嘧啶，丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC等)等。例如，参见美国专利号5,990,303，其名称为“SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2′-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES(7-脱氮-2′-脱氧鸟苷核苷酸的合成)”，该专利于1999年11月23日授予Seela，其通过引用并入本文。其他代表性的杂环碱基包括，例如，次黄嘌呤，肌苷，黄嘌呤；下列的8-氮杂衍生物：2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；下列的7-脱氮-8-氮杂衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。

DNA区对DNA修饰剂的“可及性(accessibility)”，用在本文中是指在细胞染色体中的特定的DNA区与特定的DNA修饰剂接触并被其修饰的能力。不希望限制本发明的范围，相信包含该DNA区的特定染色质结构将影响DNA修饰剂修饰该特定的DNA区的能力。例如，DNA区可以被组蛋白环绕，并且可以进一步具有防止或减少所述DNA修饰剂与目的DNA区接近的另外的核小体结构。

短语“特异性(或选择性)结合”是指决定靶标(例如，靶蛋白)在异源的蛋白或其他生物制品群体中的存在的结合反应。例如，在免疫测定条件下，抗体或其他蛋白识别多肽以背景的至少两倍结合特定的蛋白，并且基本上不以显著的量与样品中存在的其他蛋白结合。典型地，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景的大于10-100倍。

“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的构架区的多肽。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其又定义免疫球蛋白的种类，分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。

天然存在的免疫球蛋白具有共有的核心结构，其中两个相同的轻链(约24kD)和两个相同的重链(约55或70kD)形成四聚体。每条链的氨基端部分已知为可变(V)区，并且可以与每条链的其余部分的更保守的恒定(C)区区分开。在轻链的可变区内的是已知为J区的C端部分。在重链的可变区内，除了J区之外还存在D区。免疫球蛋白中大部分的氨基酸序列变化局限在直接参与抗原结合的已知为高变区或互补决定区(CDRs)的V区中的三个分开的区域。从氨基端往前，这些区域分别命名为CDR1，CDR2和CDR3。CDRs被更保守的构架区(FRs)保持在适当的位置。从氨基端往前，这些区域分别命名为FR1，FR2，FR3和FR4。CDR和FR区的位置和编号系统已由例如Kabat等，(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices(美国卫生和人类服务部)，U.S.Government Printing Office(美国政府印刷局)(1991))定义。

示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单位包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的N端限定约100-110或更多氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别是指这些轻链和重链。

抗体可以例如作为完整的免疫球蛋白存在或者作为多个通过用不同的肽酶消化产生的充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键下方的抗体，产生F(ab)′₂，其为Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键连接到V_H-C_H1上的轻链。F(ab)′₂可以在温和条件下被还原，破坏铰链区中的二硫键，由此将F(ab)′₂二聚体转换为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有部分铰链区的Fab(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(基础免疫学)(Paul编，第3版，1993))。尽管关于完整抗体的消化定义了许多抗体片段，但是技术人员应该理解此类片段可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，术语抗体在用于本文时还包括通过修饰完整的抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(例如，参见McCafferty等，Nature(自然)348：552-554(1990))。

为了制备单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域已知的任何技术(例如，参见Kohler & Milstein，Nature(自然)256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today(今日免疫学)4：72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)(1985)中第77-96页)。“单克隆”抗体是指来源于单个克隆的抗体。可以采用制备单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)来制备针对本发明的多肽的抗体。此外，转基因小鼠或其他生物体，如其他的哺乳动物，可以用来表达人源化的抗体。备选地，可以使用噬菌体展示技术来鉴定特异性结合所选的抗原的抗体和异聚体Fab片段(例如，参见McCafferty等，Nature(自然)348：552-554(1990)；Marks等，Biotechnology(生物技术)10：779-783(1992))。

附图简述

图1是显示DNA切割剂(显示为咬噬面(eating face))进入透化处理的细胞的示例图。例如，可以用包含透化处理剂和DNA切割剂的缓冲液处理细胞。所述切割剂进入被透化处理的细胞并且消化处于开放/可及构象的基因组DNA(染色质)。不可及的染色质不被消化。

图2是在消化后在细胞内的DNA的图示。可及的染色质以小片段存在，不可及的染色体相对大得多。

图3示例性显示本文提供的发现，即，透化处理的细胞允许小DNA片段或蛋白-DNA复合物(对应可及的染色质)从细胞中扩散出来。不可及的染色质没有被消化，并且由于其太大而不能有效地通过透化处理的细胞膜，因而不能从细胞中扩散出来。

图4举例说明本发明的实施方案，其中将透化处理的和核酸酶处理的细胞离心。包含不可及的染色质的细胞浆处于团块中，并且上清液中将包含尺寸相对小的可及的DNA。

图5举例说明经透化处理且用DNA酶I处理的Hela细胞的上清液的BioAnalyzer追踪。在100-300bp范围内观察到峰，但是存在一些大于2kb的DNA。相反，从所述细胞分离的DNA要大得多(大于10,000bp)。这表明从透化处理的细胞扩散出来的DNA确实小于细胞中的大部分DNA，并且所述透化处理的细胞起作用如同DNA的尺寸滤器。在低和高分子量范围的尖峰是尺寸标准物。

图6举例说明Hela样品(透化处理的和DNA酶I-处理的)的qPCR分析。扩增GAPDH和RHO启动子。相对于处于不可及染色质中的Rho启动子(右侧扩增曲线)处在可及染色质中的GAPDH启动子(左侧扩增曲线)是高度富集的。这表明可及的染色质富集在来自透化处理的和DNA酶I处理的细胞的上清液中。

图7提供关于来自透化处理的和DNA酶I处理的Hela细胞的上清液的DNA的下一代测序数据。显示所述数据来显示基因组中观察到上清液DNA的区域(UCSC基因组浏览器上的“本发明方法”泳道)。将所述数据与使用其他技术以全基因组规格绘制可及染色质图谱的公众可获得的数据(数字化DNA酶和DNA酶-Seq泳道)进行比较。关于上清液DNA的峰与使用其他技术得到的峰充分相关。这证明本文所述的方法绘制可及染色质区域的图谱跟其他目前充分表征的技术一样好。值得注意的是，本文所述的方法比所述其他技术更快且需要更少的起始材料，另外，其不需要进行细胞核分离，而所述其他技术需要进行细胞核分离。

图8举例说明可以被靶向以从用DNA切割剂处理的透化处理的细胞中扩散出来的多种类型的分子。每一栏举例说明上清液中的可能的靶分子(取决于怎样按本文进一步所述进行测定)，分析所述靶分子的一些可能的方式，用于获得相似信息的可比较的当前方法，以及最后举例说明本发明较所述可比较的方法的一些优点。

图9A和9B提供按照本文所述的方法产生的小鼠组织-肾脏(9A)和脑(9B)-上清液样品的示例性BioAnalyzer追踪。这表明组织样品以及细胞可以用作本文所述的方法的起始材料。

图10提供图9A-B中讨论的小鼠组织样品的qPCR分析。在该qPCR分析中，扩增了ACTB和TBP启动子(由其他数据已知这些启动子处在可及染色质中)，以及RHO和HBB启动子(这些启动子处在不可及染色质中)。相对于RHO和HBB启动子，ACTB和TBP启动子被高度富集。这表明，如预测的一样，可及染色质在组织样品中富集，并且显示该步骤可用于组织和活组织检查样品。

图11提供用于检测与扩散的DNA缔合的蛋白的方法的总结。

图12显示qPCR检测在活性启动子区中而不是在无活性的启动子区中与靶蛋白结合的DNA。

如13显示图11所示的方法比标准ChIP更有效地检测蛋白-缔合活性的启动子。

图14显示图11所示的方法(左侧两栏)具有比标准ChIP(右侧两栏)更高的信号-比-噪声比例。

发明详述

I.导言

本发明通过向透化处理的细胞中引入DNA切割剂以使所述DNA切割剂切割所述细胞内的基因组DNA，然后将从所述透化处理的细胞中扩散出来的DNA与所述细胞本身分离而分析染色质结构。不希望限制本发明的范围，相信通常较小的片段将从透化处理的细胞中扩散出来，并且那些较小的片段表示与基因组DNA的其他区域相比DNA切割剂具有更多的接近的基因组DNA区域。相信DNA切割剂的可及性反映基因组DNA区域的染色质状态。通常从细胞中扩散出来的较小的片段表示与通常不从细胞中扩散出来的较大的片段相比DNA切割剂更可及的区域。通过分析已经从透化处理的细胞中扩散出来的较小的片段或者不扩散出来的较大的片段，或者分析二者，人们能够测量DNA切割的可及性，并且因此能够间接地测量目的DNA区域的染色质结构。

DNA的不同的可及性能够反映基因组DNA的染色质结构。例如，在一些实施方案中，DNA切割剂更可及的DNA区域可能出在更“松散的”染色质结构中。染色质状态的测量能够提供关于细胞的生物学状态的有用信息。例如，在一些实施方案中，一个或多个DNA区域的染色质状态能够提供诊断、预后或其他医学信息。作为非限制性的实例，当正常细胞进展为癌症时，染色质状态可能改变。

II.一般方法

在一个方面中，将一种或多种DNA切割剂在使细胞内的基因组DNA切割的条件下引入到细胞中。然后允许较小的切割片段从透化处理的细胞中扩散出来，然后，扩散出来的DNA可以与所述透化处理的细胞分离，由此允许对所述扩散出来的DNA和/或在所述透化处理的细胞中剩余的DNA进行分析。

细胞的透化处理可以在向细胞中引入DNA切割剂之前、过程中或之后发生。外源性DNA切割剂通常在透化处理之后或与透化处理同时引入，以使DNA切割剂能够通过由透化处理步骤在细胞中产生的“孔”进入细胞中。在这些实施方案中，所述透化处理的细胞可以在足够浓度的DNA切割剂中温育，以允许所述DNA切割剂进入细胞中。备选地，所述DNA切割剂可以在透化处理之前表达在细胞中(例如，由可诱导的启动子表达)或以其它方式引入(例如通过电穿孔)到细胞中。在后面这些实施方案中，透化处理不用来辅助将DNA切割剂引入到细胞中，相反只是提供较小的切割的DNA片段能够扩散出来的出口。

III.透化处理细胞

细胞膜可以以本领域已知的任何方式进行透化处理或破坏。透化处理或破坏细胞膜的方法不破坏细胞基因组DNA的结构以致核小体或染色质结构被破坏。

在一些实施方案中，细胞膜与透化处理细胞膜的试剂接触。溶血脂质是一类示例性的透化处理细胞膜的试剂。示例性的溶血脂质包括，但不限于，溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)(在本领域中还称为溶血卵磷脂(lysolecithin))或单棕榈酰磷脂酰胆碱(monopalmitoylphosphatidyleholine)。例如，多种溶血脂质还记述在WO/2003/052095。所述试剂的精确浓度取决于使用的试剂以及，在一些实施方案中，要被透化处理的细胞。例如，在一些实施方案中，使用0.25，0.5％，0.75或1％(或0.25％-1％的浓度)的溶血卵磷脂(w/v)。

非离子去污剂是一类示例性的破坏细胞膜的试剂。示例性的非离子去污剂包括但不限于，NP40、吐温20和Triton X-100。所述试剂的精确浓度取决于使用的非离子去污剂以及，在一些实施方案中，要被透化处理的细胞。

备选地，可以使用电穿孔或生物射弹法透化处理细胞膜，以将DNA切割剂引入到细胞中，并且因此可以接触基因组DNA。公知宽泛种类的电穿孔方法，并且可以被调整以适用于递送如本文所述的DNA修饰剂。示例性的电穿孔方法包括，但不限于，WO/2000/062855中所述的那些。生物射弹法包括但不限于美国专利5,179,022中所述的那些。

V.DNA 切割剂

在透化处理之前、与之同时或在其之后向细胞中引入DNA切割剂，以使该试剂接触并切割所述细胞中的可及的基因组DNA。DNA切割剂是在DNA中引入双链DNA断裂的任意试剂。按照本发明可以使用宽泛种类的DNA切割剂。例如，DNA切割剂可以是具有双链DNA切割活性的蛋白或具有充分的空间位阻以使在细胞的基因组DNA内存在可及性差异的化学制品。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂在去除透化处理试剂后，任选地更换缓冲液，与经透化处理的细胞接触。备选地，在一些实施方案中，所述DNA切割剂与基因组DNA接触，无需一个或多个干预步骤(例如，无需更换缓冲液、洗涤细胞等)。该后一种方法可以便利地用于减少所需要的劳动量和时间，还去除了测定中潜在的误差和污染来源。

所用的DNA切割剂的量，以及反应时间将取决于所用的试剂。本领域技术人员理解如何根据所用的试剂调整条件。通常，调整DNA切割步骤的条件，以便不获得“完全的”消化。因此，例如，在一些实施方案中，设定切割步骤的条件，以使阳性对照-即，切割位点是可及的对照-以高水平但小于100％(例如，50-60％，60-70％，70-80％，80-95％，80-99％，85-95％，90-98％等)发生。

在一些实施方案中，所述DNA切割剂切割修饰的DNA，但是不切割未修饰的DNA。在其他实施方案中，所述DNA切割剂切割未修饰的DNA，但是不切割修饰的DNA。在这些实施方案中的一些中，所述DNA切割剂与DNA修饰剂(本文进一步讨论)联合使用，由此检测可及的。

A.限制酶

在一些实施方案中，所述DNA切割剂是限制酶。已知宽泛种类的限制酶，并且可以用在本发明中。

可以使用任意类型的限制酶。I型酶在远离其识别序列处随机切割DNA。II型酶在接近其识别序列或在其识别序列内的确定的位置处切割DNA。一些II型酶在其识别序列内切割DNA。II-S型酶在其识别序列外到一侧切割。第三个主要种类的II型酶，更准确地称为“IV型”，在其识别序列之外切割。例如，识别连续序列的那些(例如，AcuI：CTGAAG)仅在一侧切割；识别不连续序列的那些(例如，BcgI：CGANNNNNNTGC)在两侧切割，释放包含该识别序列的小片段。III型在其识别序列之外切割，并且需要在同一DNA分子内存在相反方向的两个这样的序列才能完成切割。

本发明的方法可以适合于任意类型的限制酶或其他DNA切割酶一起使用。在一些实施方案中，所述酶在相对接近识别序列处(例如，在5，10或20个碱基对内)切割。由于必须是可及的才能实现切割的DNA的跨度大于识别序列本身，并且因此可能包括不是处于“紧密的”染色质结构中的更宽的DNA跨度，因此，此类酶在测定染色质结构中是特别有用的。

在一些实施方案中，使用多于一种(例如，两种、三种、四种等)限制酶。酶的组合可以包括均是来自一种类型的酶的组合或可以是不同类型的混合物。

在一些实施方案中，所述限制酶是修饰-感应限制酶，意即所述限制酶是修饰-依赖性的(即，识别序列中存在修饰时切割，不存在修饰时不切割)或甲基化-敏感性的(即，在识别序列中不存在修饰时切割，存在修饰时不切割)。例如，示例性的修饰是DNA甲基化或DNA乙酰化。

DNA甲基化可以以几种不同的类型发生，包括在腺苷的N⁶位置以及在胞嘧啶的C⁴和C⁵位置(其可以是甲基化或羟甲基化)。已知多种甲基-腺苷感应和甲基-胞嘧啶感应限制酶。示例性的N⁶-甲基-腺苷敏感性限制酶包括，例如，DpnII。示例性的N⁶-甲基-腺苷依赖性限制酶包括，例如，DpnII。示例性的甲基-胞嘧啶敏感性限制酶包括，例如，MspI和GlaI。示例性的甲基-胞嘧啶依赖性限制酶包括，例如，MspJI。

在一些实施方案中，所述限制酶是羟甲基胞嘧啶感应限制酶。例如，PvuRTS1是一种羟甲基胞嘧啶-依赖性限制酶(Janosi等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)242：45-61(1994))并且可以用作DNA切割剂，由此识别具有或缺乏羟甲基胞嘧啶的可及的或不可及的区域。

B.DNA酶

在一些实施方案中，使用以序列非特异性方式切割DNA的酶作为DNA切割剂。因此，在一些实施方案中，所述DNA切割剂是序列非特异性内切核酸酶(在本文中也称为“DNA酶”)。

按照本发明可以使用任何序列非特异性的内切核酸酶(例如，微球菌核酸酶(MNase)或DNA酶I，II，III，IV，V，VI，VII中的任一种)。例如，可以使用任意的DNA酶，包括但不限于，DNA酶I和MNase。MNase能够诱导核小体接头区域内的双链断裂，但是在核小体本身内仅是单链断裂。所用的DNA酶包括天然存在的DNA酶以及修饰的DNA酶。修饰的DNA酶的实例是TURBO DNA酶(Ambion)，其包括允许“高活性(hyperactivity)”和盐耐受性的突变。示例性的DNA酶，包括但不限于，牛胰腺DNA酶I(例如，可获自纽英伦生物实验室(New EnglandBiolabs))。

C.融合蛋白

在一些实施方案中，所述DNA切割剂或修饰剂融合或另外连接在一种异源的双链序列非特异性核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)、异源序列特异性核酸结合(即，“DNA识别”)多肽或异源蛋白结合(即，“蛋白识别”)多肽。在DNA切割剂或修饰剂是多肽的情形中，所述DNA切割剂或修饰剂以及所述异源多肽可以作为单一多肽(例如，通过重组DNA技术作为蛋白融合体合成)产生。

双链序列非特异性的核酸结合结构域是以序列不依赖性模式与双链核酸结合的蛋白或蛋白的确定区域，即，结合不表现出对特定序列的明显的偏好性。与缺乏双链序列非特异性核酸结合结构域的DNA切割剂或修饰剂相比较，双链序列非特异性核酸结合结构域融合体能够具有提高的活性。在一些实施方案中，双链核酸结合蛋白针对双链核酸表现出是针对单链核酸的10倍或更高的亲和性。在本发明的一些实施方案中，双链核酸结合蛋白是热稳定性的。此类蛋白的实例包括，但不限于，古细菌(Archaeal)小的碱性DNA结合蛋白Sac7d和Sso7d(例如，参见Choli等，Biochimica et Biophysica Acta 950：193-203，1988；Baumann等，Structural Biol.(结构生物学)1：808-819，1994；和Gao等，NatureStruc.Biol.(自然结构生物学)5：782-786，1998)，古细菌HMf-样蛋白(例如，参见Starich等，J.Molec.Biol.(分子生物学杂志)255：187-203，1996；Sandman等，Gene(基因)150：207-208，1994)，和PCNA同系物(例如，参见Cann等，J.Bacteriology(细菌学杂志)181：6591-6599，1999；Shamoo和Steitz，Cell(细胞)：99，155-166，1999；De Felice等，J.Molec.Biol.(分子生物学杂志)291，47-57，1999；和Zhang等，Biochemistry(生物化学)34：10703-10712，1995)。关于DNA结合结构域的另外的信息还参见欧洲专利1283875B1。

Sso7d和Sac7d分别是来自超嗜热性古细菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)和嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)的小的(约7,000kd MW)碱性染色体蛋白。这些蛋白是富含赖氨酸的，并且具有高的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性。它们以不依赖于序列的方式结合DNA，并且当结合时，在一些条件下使DNA的T_M增加了多至40℃(McAfee等，Biochemistry(生物化学)34：10063-10077，1995)。相信这些蛋白及其同系物典型地在升高的温度下参与稳定基因组DNA。

HMf-样蛋白是在氨基酸序列和结构上均与真核生物的H4组蛋白(认为其直接与DNA相互作用)有同源性的古细菌组蛋白。HMf蛋白家族在溶液中形成稳定的二聚体，并且已经从热稳定的物种(例如，炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)和火球菌属(Pyrococcus)菌株GB-3a)中鉴定了一些HMf同系物。HMf家族蛋白，一旦与Taq DNA聚合酶或任意低固有持续合成能力的DNA修饰酶连接，就能够增加该酶沿着DNA底物滑动的能力，并且因此增加其持续合成能力。例如，二聚体HMf-样蛋白能够共价连接到Taq DNA聚合酶的N端，例如，通过化学修饰连接，并且因此提高该聚合酶的持续合成能力。

本领域的技术人员应该认识到其他双链序列非特异性的核酸结合结构域在本领域中是已知的并且也能够如本文所述那样使用。

异源序列特异性核酸结合(即，“DNA识别”)多肽允许DNA切割剂或修饰剂靶向细胞中的特定DNA序列，由此允许人们测定基因组中特定DNA序列的可及性。已知宽泛种类的序列特异性DNA结合多肽和结构域，并且可以作为与所述DNA切割剂或修饰剂的融合配偶体使用。示例性的序列特异性DNA结合多肽包括，但不限于，锌指结构域，TAL结构域等。

异源蛋白识别多肽(即，特异性结合特定的蛋白或结合特定种类的蛋白的多肽)允许DNA切割剂或修饰剂靶向与基因组DNA缔合的特定蛋白，由此靶向对所述试剂是可及的且邻近该特定的靶蛋白的基因组DNA。已知宽泛种类的蛋白识别多肽和结构域，并且可以作为与所述的DNA切割剂或修饰剂的融合配偶体使用。示例性的蛋白识别多肽包括，但不限于，抗体。

V.DNA 修饰剂

除了DNA切割剂之外，还可以将一种或多种DNA修饰剂引入到经透化处理的细胞中。DNA修饰剂产生对DNA的共价修饰。在一些情形中，DNA修饰剂在DNA切割剂之前引入或与DNA切割剂同时引入。在一些实施方案中，DNA修饰剂与透化处理剂同时引入到细胞中，并且然后，将DNA切割剂引入到细胞中。在一些实施方案中，所述DNA切割剂是修饰-感应酶，其中所述DNA切割剂只切割修饰的DNA或包含修饰的识别序列的DNA，或者备选地，只切割未修饰的DNA或包含未修饰的识别序列的DNA。

例如，在一些实施方案中，本发明的DNA修饰剂是甲基转移酶。本领域中已知多种甲基转移酶，并且可以用于本发明。在一些实施方案中，所用的甲基转移酶向DNA中的腺苷上添加甲基结构部分。此类甲基转移酶的实例包括，但不限于，DAM甲基转移酶。由于在真核生物细胞中，腺苷不被甲基化，因此，在用腺苷甲基化转移酶(例如，DAM甲基转移酶或具有相似活性的其他甲基转移酶)处理细胞后在特定的DNA区中存在甲基化的腺苷表示其能够进入所述DNA区。例如，使用作为DNA切割剂的限制酶(其识别序列包括甲基化的腺苷)可以检测腺苷甲基化。此种酶的实例包括，但不限于，DpnI。通过测量从细胞中扩散出来的DNA片段的性质和量可以检测并定量所述限制酶的切割。

在一些实施方案中，甲基转移酶将GC序列中的胞嘧啶甲基化。此类甲基转移酶的实例包括，但不限于，MCviPI。例如，参见Xu等，Nuc.Acids Res.(核酸研究)26(17)：3961-3966(1998)。由于GC序列在真核生物细胞中不被甲基化，因此在特定DNA区中存在甲基化的GC序列表示所述DNA修饰剂(即，将GC序列中的胞嘧啶甲基化的甲基转移酶)能够进入所述DNA区。甲基化的GC序列可以使用任意多种技术鉴定。在一些实施方案中，检测甲基化的GC序列的方法包括二硫化物转化。二硫化物转化包括使DNA与足够量的二硫化物接触，足以使未被甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。甲基化的胞嘧啶不被转化。因此，含有GC序列的DNA区可以与使GC序列中的胞嘧啶甲基化的甲基转移酶接触，分离，然后与二硫化物接触。如果GC序列中的C没有被甲基化，则C将被转化为U(或者如果进行随后，则被转化为T)，而甲基化的C将保持为C。任意多的方法，包括但不限于，核苷酸测序和涉及引物延伸或基于引物的扩增和/或甲基化-敏感性限制性消化的方法，都可以用来检测二硫化物转化的C的存在或不存在(例如，MSnuPE，MSP或甲基光(Methyllight)，高分辨率熔融分析；焦磷酸测序等)。例如，参见，Fraga，等，Biotechniques(生物技术)33：632，634和636-649(2002)；El-Maarri OAdv Exp Med Biol(高级实验医学生物学)544：197-204(2003)；Laird，Nat Rev Cancer(自然癌症综述)3：253-266(2003)；和Callinan，Hum Mol Genet(人类分子遗传学)15 Spec No1：R95-101(2006)。

在一些实施方案中，甲基转移酶使CG(还称为“CpG”)序列中的胞嘧啶甲基化。此类甲基转移酶的实例包括但不限于M.SssI。此类甲基转移酶的使用通常将限于用于典型地不被甲基化的那些DNA区。这是由于CG序列在真核生物细胞中被内源性甲基化，并且因此，除了在甲基化作用罕见的DNA区中之外，通常不可能假设CG序列被修饰剂甲基化而不是被内源性甲基转移酶甲基化。对于GC序列，CG序列的甲基化可以通过任意多种方法检测，包括涉及二硫化物转化的方法。

在一些实施方案中，所述DNA修饰剂包括修饰DNA的化学制剂。由于大部分修饰DNA的化学制剂与染色质相比相对小，因此，使用不具有融合配偶体的修饰DNA的化学制剂在将所述化学制剂引入到细胞中的情形中可能不是有效的，原因在于几乎没有不同DNA区域的可及性程度的任何差别。因此，在一些实施方案中，所述DNA修饰剂包括与修饰DNA的化学制剂连接的具有空间位阻的分子。所述具有空间位阻的分子可以是取决于染色质结构导致DNA修饰剂的差异可及性的任意蛋白或其他分子。例如，这可以通过将结果与使用DNA酶或本文所述的限制酶的那些结果比较而检测。

在一些实施方案中，所述具有空间位阻的分子在尺寸上至少为5，7，10或15kD。本领域技术人员可能发现使用多肽作为具有空间位阻的分子是便利的。可以使用不显著干扰DNA修饰剂修饰DNA的能力的任何多肽。在一些实施方案中，所述多肽是人本文进一步详细讨论的双链序列非特异性核酸结合结构域。

本发明的修饰DNA的化学制剂可以直接与具有空间位阻的分子连接或通过接头连接。多种同型双功能接头或异型双功能接头是已知的，并且可以用于此目的。

VI.分离从经透化处理的细胞中扩散出来的DNA

在细胞中DNA切割和细胞透化处理之后，允许较小的DNA片段和/或蛋白/DNA复合物从所述细胞中扩散出来。将经过发生扩散的适当量的时间后，然后将扩散出来的DNA和/或蛋白/DNA复合物与所述细胞分离。分离可以容易地实现，例如，通过在扩散后离心细胞，由此使完整的经透化处理的细胞沉淀下来。例如，参见图4。在一些实施方案中，分离将包括使用阻断细胞通过但是允许DNA通过的滤器进行的一次或多次过滤。

扩散出来的DNA可以是任意尺寸的，但是如本文所示，预期小于保留在所述经过透化处理的细胞中的DNA。由于保留在细胞中的DNA通常是10,000碱基对或更大，因此，在一些实施方案中，所扩散出来的DNA通常小于10,000bp，例如，小于5,000bp，小于3,000bp，小于1,000bp，例如5-1,000bp，50-500，50-1000bp，50-5,000bp或50-10,000bp。

可以取出包含扩散出来的DNA的上清液，并且任选地可以进一步纯化所扩散出来的DNA。

在一些实施方案中，在与扩散出来的DNA分离后，将在经透化处理的细胞中剩余的DNA从所述细胞中纯化出来。在需要时，可以使用任意类型的从细胞中纯化DNA的方法。细胞中剩余的DNA代表对DNA切割剂相对不可及的DNA，并且因此可以对其进行分析以确定不可及的DNA区的性质。在一些实施方案中，分析扩散出来的和未扩散出来的DNA二者并且任选地进行比较，例如，作为彼此的对照。

在一些实施方案中，按照任意可用的方法纯化在经透化处理的细胞中的未扩散出来的基因DNA。基本上，可以使用任意DNA纯化方法，只要其产生具有后续分析步骤可接受的纯度的DNA。例如，标准的细胞溶解试剂可以用来溶解细胞。任选地，可以使用蛋白酶(包括，但不限于，蛋白酶K)。如本领域已知，DNA可以从混合物中分离出来。在一些实施方案中，使用酚/氯仿提取法，并且然后沉淀(例如，通过乙醇)并纯化DNA。在一些实施方案中，如果需要，去除或降解RNA(例如，使用RNA酶或使用DNA纯化柱)。任选地，扩增基因组DNA，或者另外直接从细胞溶解物检测，而无需中间纯化步骤。

VII.分析DNA和/或蛋白

可以以使用者可用的任意方式来分析从经透化处理的细胞中扩散出来的DNA和蛋白。因此，下述不意欲是穷尽性列举。分析可以包括，但是不必要限于，确定特定的分子(例如，DNA序列或蛋白)的性质和/或数量。分析还可以包括，例如，克隆DNA，测序DNA或使用微阵列分析DNA。

相信在切割和透化处理后，DNA和与该DNA缔合的染色质蛋白或其他DNA结合蛋白能够从细胞中扩散出来。类似地，相信，在一些实施方案中，在切割和透化处理后，与DNA缔合的RNA能够从细胞中扩散出来。在一些实施方案中，分析扩散出来的DNA。在一些实施方案中，分析缔合的蛋白。在一些实施方案中，分析扩散出来的DNA和缔合的蛋白二者。在一些实施方案中，分析RNA。在一些实施方案中，分析DNA和RNA。此外，如本文所解释的，在一些实施方案中，没有从细胞中扩散出来的DNA可以从细胞中纯化出来并进行分析。在一些实施方案中，该DNA将提供针对(from)所扩散的DNA的对照或“镜像”结果。因此，除非另外指明，在某种程度上，下述讨论涉及“DNA”，其同等地涉及扩散出来的DNA或没有扩散出来、在将所扩散出来的DNA与细胞分离后从经透化处理的细胞中分离出来的DNA。

在一些实施方案中，在DNA分析之前，针对一种或多种特定的DNA序列，富集DNA(即，由渗漏的DNA片段富集的，且任选地从经透化处理的细胞分离的)，例如，使用核酸探针(任选地连接到固体支持物(例如珠子)上)在适当的杂交条件下通过亲和纯化特定的DNA序列。在其他实施方案中，使用抗体或与DNA结合的非抗体蛋白(诸如，但不限于，转录因子，转录因子蛋白或其DNA结合片段，或甲基-DNA结合蛋白)亲和纯化DNA。

备选地，在存在与所扩散出来的DNA缔合的蛋白的情形中，与所述蛋白缔合的DNA可以通过用特异性结合所述蛋白的亲和剂选择性结合所述蛋白，然后从其他不与所述蛋白缔合的DNA中纯化所述蛋白及缔合的DNA而进一步从其他DNA中纯化出来。参见图8。应该理解，在这种方式中可以使用与所述蛋白具有亲和性(例如，特异性结合所述蛋白)的任意试剂。在一些实施方案中，所述试剂是对特定蛋白特异性的抗体。在其他实施方案中，亲和剂是非抗体蛋白。与DNA缔合的蛋白可以是任意DNA结合蛋白，包括，但不限于，染色质蛋白，组蛋白(包括，但不限于H3K4me组蛋白H3，即，在赖氨酸4三甲基化的组蛋白H3)，转录因子，RNA聚合酶，和TATA盒结合蛋白(TBP)。在一些实施方案中，将蛋白与缔合的DNA免疫沉淀，由此将与所述蛋白缔合的DNA与其他DNA分离。在其他实施方案中，将直接或间接与固体支持物连接的亲和剂(例如，抗体)与经透化处理的细胞的上清液在使所述亲和剂同与DNA片段复合的靶结合蛋白结合的条件下温育。然后，可以从上清液中分离产生的复合物(亲和剂、靶蛋白、片段化的DNA)，由此纯化靶DNA结合蛋白及缔合的DNA。可以使用任意的固体支持物。在一些实施方案中，所述固体支持物为珠子或颗粒。在一些实施方案中，所述珠子或颗粒是有磁性的，或者可以连接到磁体上，由此在需要时，允许从上清液中有效的纯化。如果需要，可以分析(例如，扩增、测序、检测等)与蛋白缔合的DNA的存在、不存在或数量，并且任选地在样品之间进行比较，包括但不限于，在患病的样品和健康样品之间比较。

在一些实施方案中，通过核苷酸测序分析与蛋白缔合的DNA。参见图8。例如，可以使用这样的测序方法，其能够同时检测核苷酸序列并且区分测序的核苷酸是否被修饰。后一种类型的测序的实例包括，但不限于，单分子实时(SMRT)测序和纳米孔(nanopore)测序。来自此类分析的结果与由ChIP-Seq(例如，参见Johnson等，Science(科学)316：1497-1502(2007))获得的结果相似，但是仅提供关于可及序列的数据，由于认为可及染色质是基因组的功能活性区，所以，在一些情形中，这可能是有利的。

在一些实施方案中，多个(例如，两个以上)DNA片段以与一种或多种蛋白的复合物形式从细胞中扩散出来。参见图8，右栏。在一些实施方案中，分析复合物中的DNA和/或蛋白。在一些实施方案中，从剩余的DNA中纯化这些复合物，然后进行分析。在一些实施方案中，所述复合物与DNA连接酶接触，由此将所述多个DNA片段连接在一起，然后可以通过任意需要的方式(例如，扩增、杂交、测序等)对其进行分析。例如，该分析将提供关于可及染色质区的缔合和相互作用的信息。

DNA 分析

在一些实施方案中，在分离目的DNA之后，将所述DNA克隆到文库中。在一些情形中，分离和/或克隆一种或多种具体的DNA序列。备选地，所述DNA用来制备文库(代表扩散的DNA或未扩散的DNA)。

在一些实施方案中，产生消减文库(subtractive libraries)。例如，可以产生这样的文库，所述文库以本发明的方法富集患病细胞扩散出来的或未扩散出来的DNA区，然后扣除来自健康细胞的相对应的文库，或反之亦然，由此产生对特定疾病特异性的差异性DNA序列的文库。可以使用任意患病的细胞，包括，但不限于，癌症细胞。也可以使用备选的消减策略，例如，在不同的细胞类型、细胞阶段、药物治疗等之间。

分析可以包括确定DNA的任意物理特征。物理特征包括，但不限于，DNA甲基化、解链温度、GC含量、核苷酸序列和与多核苷酸杂交的能力或被扩增的能力。已知并可以使用多种检测所述特征的方法。

在一些实施方案中，所述物理特征是DNA甲基化。例如，一旦相对可及的DNA已经被DNA切割剂切割，人们可以分离剩余的完整的DNA(代表较少可及性的DNA)，然后可以分析甲基化状态。已知多种DNA甲基化检测方法。在一些实施方案中，将DNA与二硫化物接触，由此将DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。然后，可以通过任意多种甲基化加测方法(包括本文讨论的那些)确定特定DNA区的甲基化。在一些实施方案中，在二硫化物转化后，使用高分辨率熔融测定(HRM)来检测甲基化状态。以这种方法，在二硫化物转化后，扩增DNA区，并且确定产生的扩增子的解链温度。由于解链温度取决于胞嘧啶是否被二硫化物转化而不同(并且随后在扩增反应中复制为“T’s”)，因此，扩增子的解链温度可能与甲基化含量相关。

在一些实施方案中，扩增一种或多种DNA序列，例如，使用终点或定量扩增技术(例如，qPCR)扩增。在一些实施方案中，使用一条或多条特异性引物来特异性扩增DNA内的特定序列。定量扩增(包括，但不限于，实时PCR)方法允许确定DNA区中完整拷贝的量，并且可以与多种对照一起使用来确定目的样品中该DNA区(例如，从经透化处理的细胞扩散出来的或没有从所述细胞扩散出来的)的相对拷贝的量，由此表示具体的DNA区是否是可及的以及可及性至什么程度。

定量扩增方法(例如，定量PCR或定量线性扩增)包括核酸模板的扩增，直接或间接(例如，确定Ct值)确定所扩增的DNA的量，然后基于扩增循环数计算初始模板的量。使用DNA基因座反应进行扩增是公知的(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；PCR PROTOCOLS：AGUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(PCR流程：方法和应用指导)(Innis等编，1990))。典型地，使用PCR来扩增DNA模板。然而，已经记述了备选的扩增方法，并且也可以使用这些方法，只要所述备选的方法以高于扩增切割的或降解的DNA的方法的程度扩增完整的DNA。例如，定量扩增的方法公开在美国专利号6,180,349；6,033,854；和5,972,602中，以及公开在例如Gibson等，Genome Research(基因组研究)6：995-1001(1996)；DeGraves，等，Biotechniques(生物技术)34(1)：106-10，112-5(2003)；Deiman B，等，Mol Biotechnol.(分子生物技术)20(2)：163-79(2002)中。扩增可以被“实时”监测。

在一些实施方案中，定量扩增是基于监测表示在扩增(例如PCR)反应循环中的模板的拷贝数的信号(例如，探针的荧光)。在初始PCR循环中，观察到非常低的信号，原因在于所形成的扩增子的量不支持来自测定的可测量的信号输出。在初始循环后，随着形成的扩增子的量增加，信号强度增加至可测量的水平，并且在以后的循环中，达到平台，此时PCR进入非对数期。通过信号强度相对于循环数的图，可以推论出在哪个具体循环从PCR反应获得可测量的信号，并且该具体的循环用于倒推计算在PCR开始前靶标的量。通过该方法确定的具体的循环数典型地称为循环阈值(Ct)。示例性的方法记述在，例如，Heid等，GenomeMethods(基因组方法)6：986-94(1996)中，其中提及了水解探针。

在一些实施方案中，确定一个或多个DNA片段的核苷酸序列，或其序列。例如，可以对目的样品的基因组DNA序列进行测序，并且与相对应的已知的基因组DNA序列比较，以确定所述目的样品中DNA可及性或不可及性的位点。核酸测序的方法在本领域中是公知的。序列分析的实例包括，但不限于，Maxam-Gilbert测序，Sanger测序，毛细管阵列DNA测序，热循环测序(Sears等，Biotechniques(生物技术)，13：626-633(1992))，固相测序(Zimmerman等，Methods Mol.Cell Biol.(分子细胞生物学方法)，3：39-42(1992))，使用质谱如矩阵辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu等，Nature Biotech.(自然生物技术)，16：381-384(1998))的测序，和通过杂交的测序(Chee等，Science(科学)，274：610-614(1996)；Drmanac等，Science(科学)，260：1649-1652(1993)；Drmanac等，Nature Biotech.(自然生物技术)，16：54-58(1998))。

多种方法可以用来确定核苷酸序列，并且，如果需要，确定测序的核苷酸被修饰(例如，被甲基化)的程度，细胞内天然的修饰的程度或通过引入的DNA修饰剂修饰的程度。可以使用本领域已知的任一种测序方法。在一些实施方案中，测序方法同时确定核苷酸序列和所测序的核苷酸是否被修饰。例如，当测序方法确定核酸片段中核苷酸的顺序时，此时其还可以区分修饰的核苷酸(例如，甲基化的核苷酸)与未修饰的核苷酸(例如，未甲基化的核苷酸)。能够同时检测核苷酸序列并区分所测序的核苷酸是否被修饰的测序方法的实例包括，但不限于，单分子实时(SMRT)测序和纳米孔测序。

在一些实施方案中，核苷酸测序包括引起标记的核苷酸(例如，荧光标记的核苷酸)的结合的DNA区的模板-依赖性复制，并且其中到达时间和/或由不同的结合核苷酸产生的信号之间的间隔的持续决定修饰的存在或不存在和/或所结合的核苷酸的性质。

单分子实时测序法

在一些实施方案中，包含靶DNA区的基因组DNA通过单分子实时(SMRT)测序法测序。SMRT测序法是这样一种方法，通过该方法在单DNA聚合酶分子催化与模板核酸链互补的荧光标记的核苷酸的结合的同时实时观察单DNA聚合酶分子。SMRT测序方法在本领域中是已知的，并且最初由Flusberg等，Nature Methods(自然方法)，7：461-465(2010)所述，该参考文献通过引用结合在本文中用于所有的目的。

简言之，在SMRT测序时，核苷酸的结合作为荧光脉冲检测，其颜色鉴定该核苷酸。当与核苷酸末端磷酸结合的荧光团在聚合酶易位到DNA模板中的下一个碱基之前被聚合酶切割时，脉冲终止。荧光脉冲特征在于发射光谱以及脉冲持续时间(脉冲宽度)和连续脉冲之间的时间间隔(“脉冲间持续时间”或“IPD”)。脉冲宽度是在核苷酸结合后至荧光团释放的所有动力学步骤的函数，并且IPD是核苷酸结合和聚合酶易位的动力学的函数。因此，可以通过确定SMRT测序中的荧光脉冲来监测DNA聚合酶动力学。

除了测量关于每种荧光标记的核苷酸(即，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和胞嘧啶)的荧光脉冲特征的差异之外，还可以测量非甲基化的碱基相对于甲基化的碱基的差异。例如，与其非甲基化的对应体相比，甲基化的状态的存在改变甲基化甲基的IPD(例如，甲基化的腺苷与非甲基化的腺苷相比)。另外，与其非甲基化的对应体相比，甲基化的碱基的存在改变该甲基化的碱基的脉冲宽度(例如，甲基化的胞嘧啶与非甲基化的胞嘧啶相比)，并且，不同的修饰具有不同的脉冲宽度(例如，5-羟甲基胞嘧啶具有比5-甲基胞嘧啶更明显的偏移(excursion))。因此，在给定情形中，基于其IPD与脉冲宽度的组合，每种类型的未修饰的碱基和修饰的碱基具有独特的特征。SMRT测序的灵敏性可以通过优化溶液条件、聚合酶突变和利用核苷酸动力学特征的算法方法以及帮助解析相邻的甲基胞嘧啶碱基的重叠合法技术(deconvolution techiques)而进一步提高。

纳米孔测序法

在一些实施方案中，核苷酸测序不包括DNA区的模板-依赖性复制。在一些实施方案中，包含靶DNA区的基因组DNA通过纳米孔测序法测序。纳米孔测序法是这样的方法，通过该方法，在施加的电势下，多核苷酸或核酸片段通过孔，同时记录通过该孔的离子电流的调幅(modulations)。纳米孔测序方法在本领域中是已知的；例如，参见，Clarke等，NatureNanotechnology(自然生物技术)4：265-270(2009)，其通过引用结合在本文中用于所有目的。

简言之，在纳米孔测序法中，由于单链DNA分子通过蛋白孔，所以每个碱基按顺序登记为电路幅度的特征性减少，所述电路幅度的特征性减少由每个碱基阻塞所述孔的程度导致。单个核酸碱基可以在静电链上鉴定，并且通过充分减慢DNA易位的速率(例如，通过使用酶)或提高孔捕获DNA的比率(例如，通过突变在蛋白孔内的关键残基)，也可以在移动时鉴定单个核碱基。

在一些实施方案中，纳米孔测序包括使用外切核酸酶从DNA链上释放单个核苷酸，其中以释放的次序鉴定碱基，并且使用共价连接到孔上的衔接子(adaptor)分子以允许在DNA分子通过孔移动时进行连续的碱基检测。当核苷酸通过孔时，其特征在于在适配器内的特征剩余电流和特征停留时间，这使得其能够区分非甲基化的核苷酸。另外，在甲基化核苷酸与相对应的非甲基化核苷酸之间观察到不同的停留时间(例如，5-甲基-dCMP具有比dCMP长的停留时间)，因此使得其能够同时确定核苷酸序列和所测序的核苷酸是否被修饰。纳米孔测序法的灵敏性可以通过优化盐浓度、调节应用的电势、pH和温度，或突变外切核酸酶以改变其持续合成能力比率而进一步提高。

在一些实施方案中，DNA与另一种核酸杂交。在一些实施方案中，核酸连接到固体支持物上。例如，在一些实施方案中，DNA杂交到微阵列上。例如，微阵列可用于监测DNA中多个序列的存在、不存在或数量。在一些实施方案中，来自不同样品的DNA可以与一种或多种核酸杂交，由此确定样品之间一种或多种特定序列的差异量。因此，例如，可以比较患病细胞和健康细胞，或在不同时间获得的细胞，或在治疗前和治疗后或治疗过程中获得的细胞。

本发明的方法可以包括使DNA区的可及性与从该区的转录相关。在一些实施方案中，进行实验来确定可及性与基因表达之间的相关性，然后DNA修饰剂对特定DNA区的可及性可以用来预测从该DNA区的转录。在一些实施方案中，确定从DNA区的转录和该区对DNA修饰剂的可及性二者。用于测量转录的宽泛种类的方法是已知的，并且包括，但不限于，使用northern印迹和RT-PCR。

在一些实施方案中，区域的DNA甲基化状态可能与DNA区对DNA修饰剂的可及性相关。在一些实施方案中，进行实验来确定该区域内可及性与DNA甲基化之间的相关性，然后DNA修饰剂对特定DNA区的可及性可以用来预测该DNA区的DNA甲基化。在一些实施方案中，确定DNA区的甲基化和该区对DNA修饰剂的可及性二者。用于测量DNA甲基化的宽泛种类的方法是已知的，并且包括但不限于使用二硫化物(例如，在测序时和/或与甲基化-敏感性酶组合(例如，参见Eads等，Nucleic Acids Research(核酸研究)28(8)：E32(2002)))和高分辨率熔融测定(HRM)(例如，参见Nucleic Acids Research(核酸研究)35(6)：e41(2007))。

在一些实施方案中，比较在扩散出来的较小的DNA片段和/或在未扩散出来的较大的DNA中的第一DNA区的存在、不存在或数量与来自同一细胞的第二DNA区的存在、不存在或数量相比较。在一些实施方案中，第二DNA区是对照区，例如，是已知为可及的或不可及的DNA区。备选地，或另外，人们可以比较在两种不同的细胞中的在扩散出来的较小的DNA片段和/或在未扩散出来的较大的DNA中的第一DNA区的存在、不存在或数量。例如，这两种细胞可以代表患病的和健康的细胞或组织，不同的细胞类型，不同的发育阶段(包括，但不限于干细胞或祖细胞)，在不同时间从个体获得的细胞等。因此，通过使用本发明的方法，人们能够检测细胞之间染色质结构的差异和/或确定一种细胞内两个以上DNA区(例如，基因)之间的相对染色质结构。另外，人们能够确定药物、化学制剂或环境刺激对相同细胞中或不同细胞中特定区域的染色质结构的作用。

蛋白分析

如上文所示，除了DNA分析，还可以分析与扩散出来的DNA缔合的蛋白。需要时，可以分析蛋白。在一些实施方案中，对蛋白进行显微测序以确定其氨基酸序列。在一些实施方案中，用一种或多种免疫学方法分析蛋白。例如，可以将具有已知的特异性的抗体与蛋白接触以确定该蛋白是否结合该抗体，由此显示蛋白的性质。

VIII.样品

多种真核细胞可以用在本发明中。在一些实施方案中，细胞和动物细胞，包括但不限于，人，或非人哺乳动物细胞。非人哺乳动物细胞包括，但不限于，灵长类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猪细胞和牛细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非哺乳动物细胞，例如，禽类、爬虫类动物或其他细胞。在一些实施方案中，所述细胞是植物细胞。例如，细胞可以是培养的原代细胞、无限增殖的培养细胞或可以来自活组织检查或组织样品，任选地进行培养和刺激以在测定之前分开。在透化处理和/或DNA修饰步骤之前和/或过程中，培养的细胞可以是悬浮的或贴壁的。在一些实施方案中，细胞可以来自肿瘤活组织检查。

IX.诊断和预后方法

本发明还提供用于诊断或提供关于疾病或病况的预后(prognosis)或基于基因组DNA中DNA区的可及性或不可及性确定对于疾病或病况的治疗过程的方法。

在一些实施方案中，与正常(即，未患病的)细胞或组织相比，在患病细胞或组织中，目的DNA区对DNA切割剂的可及性增加(或至少是存在的)或减少(或不存在)。在这些实施方案中，检测目的DNA区的存在或不存在或拷贝数量可以用作诊断或预后工具。

一旦使用本发明的方法确定诊断或预后，可以确定治疗方案或者考虑该诊断或预后可以改变现有的治疗方案。例如，根据本发明的方法检测癌症细胞可以导致对检测其癌症细胞的个体施用化疗剂和/或射线治疗。

可以为研究目的和/或作为对照DNA区检测多个DNA区来验证试剂是否如预期一样作用。例如，在一些实施方案中，测定已知为可及的或不可及的DNA区。例如，此类DNA区可用作可及性的阳性对照或阴性对照。

X.试剂盒

本发明还提供用于执行本文所述的方法的试剂盒。试剂盒可以任选地包括书面使用说明或电子使用说明(例如，在CD-ROM或DVD上)。本发明的试剂盒可以包括，例如，DNA修饰剂和/或DNA切割剂；细胞透化处理剂；和特异性结合DNA-结合蛋白的亲和剂。DNA切割剂可以包括，例如，DNA酶或限制酶或与异源DNA-识别多肽融合的DNA切割多肽。例如，DNA修饰剂可以是DNA甲基转移酶。例如，透化处理剂可以是溶血脂质或非离子去污剂。例如，亲和剂可以特异性结合组蛋白、修饰的组蛋白、RNA聚合酶、转录因子、TATA盒结合蛋白(TBP)、或其他DNA-结合蛋白，并且，例如，可以是抗体。在一些情形中，亲和剂可以连接在固体支持物上。示例性的固体支持物包括，例如，珠子或颗粒。在一些实施方案中，所述珠子或颗粒是有磁性的或连接到磁体上。

本发明的试剂盒还可以包括一种或多种对照细胞和/或核酸。示例性的对照核酸包括，例如，包含在基本上动物的所有细胞中是可及的(例如，看家基因序列或其启动子)或在大部分动物细胞中是不可及的基因序列的那些核酸。在一些实施方案中，试剂盒包括一组或多组用于扩增所述基因序列的引物(不管实际上基因序列或细胞是否包括在该试剂盒中)。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒包括DNA修饰剂、DNA切割剂和细胞透化处理剂和/或细胞破坏剂、特异性结合DNA-结合蛋白的亲和剂和用于扩增对照DNA区(包括但不限于本文所述的对照基因)的一个或多个引物组，以及任选地用于扩增第二DNA区(例如，靶DNA区)的一个或多个引物组。

实施例

实施例1

本实施例证明在向细胞中引入DNA酶I后可以从经透化处理的Hela细胞中获得小DNA片段。将Hela细胞在标准6孔组织培养板上生长至95％汇合，每孔约一百万给细胞。吸出培养基，并且在细胞上轻轻层加500μl透化处理/消化缓冲液。所述透化处理/消化缓冲液由溶血卵磷脂、Tris-HCl、MgCl₂、CaCl₂和DNA酶I组成。然后，将经透化处理的细胞在37℃温育30分钟。温育后，将所述透化处理/消化缓冲液收集在1.5mleppendorf管中并且在冰上放置2分钟。然后，将样品在微量离心机中以13,000rpm离心2分钟，并且将上清液转移至一个新的1.5ml eppendorf管中。然后，将样品再以13,000rpm离心5分钟，并且将400μl上清液转移至一个新的1.5ml eppendorf管中。然后，向样品中加入100μl溶解/终止缓冲液；混合所述样品并且在37℃温育10分钟。所述溶解/终止缓冲液由Tris-HCl、NaCl、EDTA、N-月桂酰肌氨酸、RNA酶A和蛋白酶K组成。然后，使用商业核酸纯化试剂盒(Aurum，Bio-Rad)按照标准步骤分离DNA。然后，使用高灵敏性芯片在BioAnalyzer(Agilent)中分析1μl的每种样品。将10μl的每种样品稀释至50μl，并且通过在Bio-Rad CFX 384-孔实时PCR仪器上使用RHO和GAPDH引物组并且按照下述流程：96℃，5分钟，然后40个循环的96℃30秒/66℃1分钟进行qPCR而进行分析。

图5显示经透化处理且用DNA酶I处理的Hela细胞上清液的BioAnalyzer追踪。在100-300bp范围内观察到峰，但是存在一些大于2kb的DNA。相反，从细胞中分离的DNA要大得多(大于10,000bp)。这表明上清液中的DNA确实小于细胞中的大部分DNA，并且经透化处理的细胞如DNA的尺寸滤器一样起作用。

上清液中的DNA还通过qPCR进行分析。具体地，使用下述流程扩增GAPDH和RHO启动子：96℃，5分钟，然后是40个循环的96℃，30秒/66℃，1分钟。如图6所示，相对于处在不可及染色质中的RHO启动子(右侧扩增曲线)，处在可及染色质中的GAPDH启动子(左侧扩增曲线)被高度富集。这表明可及的染色质富集在来自经透化处理和DNA酶I处理的细胞的上清液中。

在经透化处理和DNA酶I处理的Hela细胞的上清液中的DNA还在Illumina GenomeAnalyzer II上用36个循环的单一末端测序流程进行测序。图7提供来自上清液的DNA的测序结果的总结。图7显示在基因组内观察到上清液DNA的区域(在UCSC基因组浏览器上“本发明方法”泳道)。将数据与公众可获得的使用其他技术以全基因组规模绘制可及染色质区的数据(数字DNA酶和DNase-Seq泳道)进行比较。上清液DNA的峰与使用其他技术的峰良好相关。这证明本文所述的方法绘制可及染色质跟其他目前充分表征的技术一样好。注意的是，本文所述的方法更快速，需要较少的起始材料，并且不需要分离细胞核。

实施例2

本实施例证明在向细胞中引入DNA酶I后能够从来自组织样品的经透化处理的细胞获得小的DNA片段。

图9A和9B提供按照本文所述的方法产生的小鼠组织-肾(9A)和脑(9B)-上清液样品的示例性的BioAnalyzer追踪。这表明组织样品以及细胞能够用作起始材料。

与实施例1类似，将来自组织上清液的DNA进行定量PCR。在该情形中，扩增已知为可及的两种启动子(ACTB和TBP启动子)和已知为不可及的两种启动子(RHO和HBB启动子)。参见图10。相对于RHO和HBB启动子，ACTB和TBP启动子得到高度富集。这表明，跟预期一样，可及的染色质富集在组织样品中，并且表明该方法在组织和活组织检查样品中起作用。

实施例3

本实施例证明能够从经透化处理的细胞获得与基因组DNA缔合的DNA结合蛋白。本实施例还证明使用特异性结合靶DNA-结合蛋白的试剂能够富集(然后分析)与DNA-结合蛋白复合的DNA。

染色质免疫沉淀法(ChIP)是鉴定与特定蛋白、转录因子或组蛋白变体缔合的DNA区的有力工具。其可以用来绘制全基因组转录调节和控制元件。如上文所解释那样，开发了一种新型的用于分离活性染色质的技术。当用核酸酶处理经透化处理的细胞时，与活性染色质相对应的小DNA片段从细胞中扩散出来，并且能够被收集起来。这些小DNA片段，例如，当通过下一代测序法分析时，提供活性染色质区的综合图谱。

我们在本实施例中表明从细胞中扩散出来的活性染色质仍然与其相关的DNA-结合蛋白和组蛋白缔合。基于这一发现，提供了一种不需要蛋白-DNA交联或DNA剪切的新型的ChIP方法。使用该方法，分别证明(1)RNA聚合酶II(RNAPII)，(2)TBP和(3)在赖氨酸4处三甲基化的组蛋白H3(H3K4me3)与活性启动子缔合，但是在沉默的启动子处很少检测到。本文所述的ChIP方法与标准ChIP测定的比较显示免疫沉淀(IP)效率相似，但是IP特异性显著不同。为了测量IP特异性，相对于沉淀的无活性的启动子DNA(噪声)，比较用RNAPII沉淀的活性启动子DNA(信号)的比率。我们发现本文所述的新的ChIP方法产生高度特异性的IP，其信号-比-噪声比率为＞300；然而，标准ChIP的特异性低得多，其信号-比-噪声比率约为6。我们推论，与标准ChIP相比，本文所述的新ChIP方法提供两个显著的优点：显著减少背景，并且更易于开展工作流程。

如图3所示，在核酸酶处理后，来自活性染色质的DNA片段从细胞中扩散出来。与其靶DNA位点结合的蛋白也从细胞中扩散出来并且进入上清液中。当提供生理性细胞条件时，这些蛋白将保持与其DNA靶位点的结合状态。为了验证蛋白仍然结合在其在扩散出来的DNA片段上的靶位点上，我们选择RNAPII、TATA盒结合蛋白(TBP)和H3K4m3，已知这三种蛋白与活性启动子结合，但不与无活性的启动子结合。

图11描述了我们的一般方法。简言之，如上述，生长Hela细胞，并用DNA酶I处理，然后离心并取出上清液。将上清液与对通过蛋白质G连接到磁珠上的RNAII、TBP或H3K4m3特异性的抗体温育，离心，并且去除上清液。洗涤珠子，然后通过用500μl的1mM TRIS-HCl，pH8.5温育珠子进行洗脱，并且在95℃温育5分钟。使用引物进行qPCR分析，所述引物从活性或沉默的基因扩增启动子区，以检测洗脱物中的DNA。

结果(参见图12)表明，对于所有三种蛋白，qPCR检测到与在活性(GAPDH)启动子区中的DNA结合的蛋白，但是几乎检测不到与在无活性的(RHO)启动子区中的DNA结合的蛋白。

我们还将我们的数据与标准ChIP技术进行了比较，并且表明图11所述的本发明的测定具有与标准ChIP技术相似或更好的检测效率。参见图13。

此外，我们使用qPCR-检测的RNAPII结合的来自活性启动子GAPDH的DNA作为信号和来自无活性的启动子RHO的DNA作为噪声，从而确定我们的方法和标准ChIP的特异性。结果(图14)显示我们的方法具有比标准ChIP显著的信号-比-噪声比率。

为了产生另外的数据，我们对通过qPCR分析的样品进行了下一代测序。测序在Illumina Genome Analyzer IIx上使用36碱基单末端读取流程进行。将读数绘制在人基因组(hg19)上，并且产生显示标签计数(tag-count)的bigWig文件。将来自bigWig文件的数据重新绘制在人基因组上，并且在UCSC基因组浏览器上显现。我们发现我们的方法在检测生物学相关的蛋白-DNA相互作用方面比通过ENCODE协会进行的传统ChIP分析(且在UCSC基因组浏览器上公众可获得)(数据未显示)更好。

我们开发了一种新型的用于鉴定基因组中的蛋白结合位点的方法。该新型的ChIP测定不需要DNA-蛋白交联和DNA剪切。其使得运行ChIP测定变得容易得多。我们的方法检测与基因组中的活性DNA区结合的蛋白。其显著减少测定背景。与标准ChIP测定相比，我们的测定对其靶标的特异性更高，具有比标准ChIP显著更高的信号-比-噪声比率。例如，这将提供更准确的基因调节网络的基因组范围的绘图。

应该理解，本文所述的实施例和实施方案仅是用于举例说明的目的，并且根据其的多种改进或变化是本领域技术人员能够想到的，并且包括在本申请的精神和范围以及附上的权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部并入本文用于所有的目的。

Claims

1.将透化处理的细胞中DNA切割剂可及的DNA与所述DNA切割剂不可及的DNA分离的方法，所述方法包括：

透化处理具有基因组DNA的细胞，由此产生透化处理的细胞；

在DNA切割剂切割所述细胞中基因组DNA的条件下将DNA切割剂引入到所述具有基因组DNA的透化处理的细胞中，由此产生切割的DNA；和

将从完整的透化处理的细胞中扩散出来的切割的DNA与所述细胞分离。

2.权利要求1的方法，所述方法还包括将DNA修饰剂引入到所述透化处理的细胞中，以使所述DNA修饰剂修饰所述细胞中的基因组DNA。

3.权利要求2的方法，其中所述DNA修饰剂和所述DNA切割剂同时引入，或者所述DNA修饰剂在引入所述DNA切割剂之前引入。

4.权利要求2或3的方法，其中所述DNA切割剂是DNA酶I或微球菌核酸酶。

5.权利要求3的方法，其中所述DNA修饰剂将修饰添加到所述DNA切割剂的至少一些识别序列，并且所述DNA切割剂不切割具有所述修饰的识别序列。

6.权利要求3的方法，其中所述DNA修饰剂将修饰添加到所述DNA切割剂的至少一些识别序列，并且所述DNA切割剂切割具有所述修饰的识别序列且不切割缺乏所述修饰的识别序列。

7.权利要求2的方法，其中所述DNA修饰剂是DNA甲基转移酶。

8.权利要求2的方法，其中所述DNA修饰剂在引入所述DNA切割剂之后引入。

9.权利要求1的方法，其中所述透化处理和所述引入同时发生。

10.权利要求1或2的方法，所述方法还包括分离所述切割的DNA。

11.权利要求1或2的方法，所述方法还包括在所述分离之后将完整细胞中剩余的DNA分离。

12.权利要求1的方法，其中所述细胞用透化处理剂透化处理。

13.权利要求1的方法，其中所述细胞通过电穿孔或生物射弹法透化处理。

14.权利要求12的方法，其中所述透化处理剂是溶血脂质或非离子去污剂。

15.权利要求1的方法，其中所述DNA切割剂包括DNA酶。

16.权利要求15的方法，其中所述DNA切割剂是DNA酶I或微球菌核酸酶。

17.权利要求1的方法，其中所述DNA切割剂包括限制酶。

18.权利要求17的方法，其中所述限制酶是甲基化感应限制酶。

19.权利要求17的方法，其中所述限制酶是N6-甲基腺苷感应限制酶。

20.权利要求17的方法，其中所述限制酶是甲基胞嘧啶感应限制酶。

21.权利要求17的方法，其中所述限制酶是5-羟甲基胞嘧啶感应限制酶。

22.权利要求21的方法，其中所述限制酶切割包含5’-羟甲基胞嘧啶的识别序列。

23.权利要求1的方法，其中所述DNA切割剂包括与异源DNA识别多肽融合的DNA切割多肽。

24.权利要求1的方法，其中所述DNA切割剂包括与异源蛋白识别多肽融合的DNA切割多肽。

25.权利要求1的方法，其中所述分离包括亲和纯化所述DNA。

26.权利要求25的方法，其中所述亲和纯化包括免疫沉淀。

27.权利要求25的方法，其中所述DNA通过使亲和剂与DNA缔合的蛋白结合而进行亲和纯化，由此纯化所述蛋白和与所述蛋白缔合的DNA。

28.权利要求27的方法，其中所述亲和剂是抗体。

29.权利要求27或28的方法，其中所述亲和剂连接到固体支持物。

30.权利要求27的方法，其中所述蛋白是组蛋白、转录因子或TATA盒结合蛋白(TBP)。

31.权利要求1的方法，其中所分离的DNA为约50bp至约10kb。

32.权利要求1或2的方法，所述方法还包括对所分离的DNA进行分析。

33.权利要求32的方法，其中所述分析包括对所分离的DNA进行核苷酸测序。

34.权利要求33的方法，其中所述核苷酸测序还检测DNA修饰。

35.权利要求32的方法，其中所述分析包括扩增反应。

36.权利要求32的方法，其中所述分析包括核酸杂交。

37.权利要求32的方法，其中两种以上的核酸与一种或多种蛋白缔合，并且所述分析包括使所述两种以上的核酸连接。

38.权利要求10或11的方法，其中所分离的DNA与一种或多种蛋白缔合。

39.权利要求38的方法，所述方法还包括分析与所分离的DNA缔合的所述一种或多种蛋白。

40.权利要求10或11的方法，其中所分离的DNA与一种或多种RNA缔合。

41.权利要求40的方法，所述方法还包括分析与所分离的DNA缔合的所述一种或多种RNA。

42.权利要求1的方法，其中所述分离包括离心和/或过滤所述透化处理的细胞，由此将包含所述切割的DNA的溶液与所述细胞分离。

43.权利要求32的方法，其中将DNA修饰剂引入到所述透化处理的细胞中，并且所述分析包括确定所分离的DNA中修饰的存在或不存在。

44.试剂盒，所述试剂盒包括：

DNA修饰剂和/或DNA切割剂；

细胞透化处理剂；和

特异性结合DNA结合蛋白的亲和剂。

45.权利要求44的试剂盒，其中所述DNA切割剂包括DNA酶或限制酶或与异源DNA识别多肽融合的DNA切割多肽。

46.权利要求44的试剂盒，其中所述DNA修饰剂是DNA甲基转移酶。

47.权利要求44的试剂盒，其中所述透化处理剂是溶血脂质或非离子去污剂。

48.权利要求44的试剂盒，其中所述亲和剂与组蛋白、RNA聚合酶、转录因子或TATA盒结合蛋白(TBP)特异性结合。

49.权利要求44或48的试剂盒，其中所述亲和剂与固体支持物连接。

50.权利要求49的试剂盒，其中所述固体支持物是珠子或颗粒。

51.权利要求50的试剂盒，其中所述珠子或颗粒是有磁性的。