JP6823320B2 - 癌型slco1b3を標的とする核酸医薬 - Google Patents
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Description
また非特許文献1には、大腸癌及び膵臓癌細胞において、野生型SLCO1B3のexon1及びexon2の代わりに、exon様配列を有するSLCO1B3変異体が発現していることが記載されている。さらに、Thakkar Nらは、該変異体は、翻訳後修飾を経てプロテアソーム分解されること、及び該変異体は、SLCO1B3の基質の1つであるcholecystokin-8の取り込みが野生型と比較して少ないことを報告している。野生型と比較してこの変異体は細胞膜への局在が少なく、ほとんどが細胞内に局在している(非特許文献1)。
そこで、本発明者らは、Ct-SLCO1B3の発現と機能を効果的に抑制できる、標的となるCt-SLCO1B3の領域を探り、Ct-SLCO1B3の発現と機能を効果的に抑制できる核酸を見出した。
これらの知見から、本発明者らは、Ct-SLCO1B3の発現抑制により癌細胞の増殖や遊走、浸潤を抑制し得ることを実証して、本発明を完成するに至った。
1)センス鎖及びアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、下記(I)〜(II)のいずれかに記載のDNAの塩基配列と完全に相補する標的Ct-SLCO1B3(癌型溶質キャリヤー有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3)RNA配列と相補的である、Ct-SLCO1B3の発現を減少させる二本鎖核酸:
(I)配列番号1の配列からなるDNA、
(II)(I)記載のDNAと実質的に同一の配列を有する核酸。
2)標的Ct-SLCO1B3 RNA配列が、配列番号2の配列に含まれる、1)記載の二本鎖核酸。
3)標的Ct-SLCO1B3 RNA配列が、配列番号6〜13からなる群より選択される、1)又は2)に記載の二本鎖核酸。
4)前記アンチセンス鎖は、配列番号14〜21からなる群より選択される配列を含む、1)〜3)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
5)前記センス鎖は、配列番号22〜29からなる群より選択される配列を含む、1)〜4)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
6)表1記載の配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、配列番号17/配列番号25、配列番号18/配列番号26、配列番号19/配列番号27、配列番号20/配列番号28、及び配列番号21/配列番号29から成る群から選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む、1)〜5)のいずれかに記載の二本鎖核酸。
7)1)〜6)のいずれかに記載の二本鎖核酸の、アンチセンス鎖のみからなる一本鎖核酸。
8)Ct-SLCO1B3の発現を抑制する核酸を有効成分として含む医薬組成物。
9)1)〜7)のいずれかに記載の核酸を有効成分として含む、医薬組成物。
10)癌の治療又は予防用である、8)又は9)記載の医薬組成物。
11)癌がCt-SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌、又は食道癌である、10)記載の医薬組成物。
12)以下の(1)〜(3)の工程を含む、癌の予防及び/又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法:
(1)Ct-SLCO1B3を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
(2)前記細胞におけるCt-SLCO1B3の発現量又は機能を測定する工程、及び
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、Ct-SLCO1B3の発現量又は機能を低下させる化合物を、癌の予防及び/又は治療作用を有する物質の候補として選択する工程。
13)(1)及び(2)の工程を含む、被験動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3の発現量を測定することを特徴とする癌の悪性度又は悪性化リスクを試験する方法:
(1)被験動物より採取した試料中の、Ct-SLCO1B3の発現量を測定する工程、
(2)正常動物由来の試料において測定した場合と比較して、前記発現量が上昇している被験動物を、癌の悪性度が高いか、又は将来悪性化するリスクが高いと判定する工程。
14)癌の予防又は治療用の医薬組成物を製造するための、1)〜7)のいずれかに記載の核酸の使用。
15)癌が、Ct-SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌、又は食道癌である、14)に記載の使用。
16)癌を予防又は治療する方法であって、予防上又は治療上有効量の1)〜7)のいずれかに記載の核酸、又は8)〜11)のいずれかに記載の医薬組成物を、該予防又は治療を必要とする動物に投与する工程を含む方法。
17)癌が、Ct-SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌、又は食道癌である、16)に記載の方法。
18)癌の予防又は治療のための、1)〜7)のいずれかに記載の核酸の使用。
19)癌が、Ct-SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌、又は食道癌である、18)に記載の使用。
溶質キャリヤー有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3(SLCO1B3;Solute carrier organic anion transporter family member 1B3)は、公知のタンパク質である。
SLCO1B3は、有機アニオン輸送ポリペプチド1B3(OATP1B3; organic anion-transporting polypeptide 1B3)又はLST-2(Liver specific organic anion transporter-2)とも称される。
SLCO1B3タンパク質は、SLCO1B3遺伝子によってコードされているタンパク質であり、そのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は公知である。例えば、ヒトSLCO1B3タンパク質のアミノ酸配列は、GenBank Accession No.NP_062818(配列番号3)として登録されている。ヒトSLCO1B3タンパク質をコードするヌクレオチド配列としては、GenBank Accession No.NM_019844(配列番号4)として登録されている。
本明細書中、肝臓型SLCO1B3タンパク質は、配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。
ヒトCt-SLCO1B3タンパク質の例としては、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
本明細書中、Ct-SLCO1B3タンパク質は、配列番号5のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。
あるいは、本明細書において、アミノ酸配列が実質的に同一であるタンパク質としては、アミノ酸配列において、1〜10個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜5個、いっそう好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個、最も好ましくは1個のアミノ酸に、欠失、置換及び/又は付加の変異が生じたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
例えば、Ct-SLCO1B3の機能としては、(1)細胞の足場非依存性増殖促進、(2)細胞の遊走能促進、(3)細胞の浸潤能促進、(4)snail発現量の上昇、(5)slug発現量の上昇、(6)E-cadherin発現量の低下、(7)occludin発現量の低下、(8)MMP9発現量の上昇が挙げられ、好ましい態様において、配列番号5のアミノ酸配列からなるヒトCt-SLCO1B3タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質は、上記(1)〜(8)のいずれか1つ以上の機能を有する。タンパク質が上記(1)〜(8)の機能を有するか否かは、実施例記載の方法又は本発明のスクリーニング法に記載の方法に準じて検証することができる。
本発明の核酸の標的となる、Ct-SLCO1B3遺伝子の塩基配列と完全に相補するRNA配列(本明細書中、単に「標的Ct-SLCO1B3 RNA配列」又は、「本発明の核酸の標的Ct-SLCO1B3 RNA配列」とも称する)について以下に説明する。
(I)配列番号1の配列からなるDNA、
(II)(I)記載のDNAと実質的に同一の配列を有する核酸。
あるいは、塩基配列が実質的に同一である核酸としては、塩基配列において、1〜10個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜5個、いっそう好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個、最も好ましくは1個のヌクレオチドに、欠失、置換及び/又は付加の変異が生じた塩基配列からなる核酸が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、及びこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、1つ又は複数の塩基が付加及び/又は欠失した配列である場合を包含する。例えば、標的Ct-SLCO1B3 RNAと本発明のアンチセンス鎖核酸とは、アンチセンス鎖における塩基の付加及び/又は欠失により、アンチセンス鎖及び/又は標的Ct-SLCO1B3 RNAに1個又は2個のバルジ塩基を有してもよい。
本明細書において、2つのヌクレオチド配列が「完全に相補する」とは、該ヌクレオチド配列間でミスマッチ塩基を0個有する、つまり全ての塩基において相補することを指す。
さらに、好ましい態様において、本発明の二本鎖核酸は、表1記載の配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、配列番号17/配列番号25、配列番号18/配列番号26、配列番号19/配列番号27、配列番号20/配列番号28、及び配列番号21/配列番号29から成る群より選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む。
最も好ましい態様において、本発明の二本鎖核酸は、表1記載の配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、及び配列番号17/配列番号25から成る群より選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む。
Ct-SLCO1B3 mRNAの一部の塩基配列は、好ましくは配列番号1と完全に相補するRNA配列に含まれる連続する塩基配列の一部であり、より好ましくは配列番号2に含まれる配列である。
本発明の医薬組成物は、Ct-SLCO1B3の発現を抑制する核酸を含有することを特徴とする。
実施例に記載するとおり、Ct-SLCO1B3の発現が疑われる細胞からtotal RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを合成して、配列番号30及び配列番号31のプライマーを用いてPCR反応を行ってもよい。
本発明の医薬組成物に有効成分として含まれる核酸は、所望の効果を有する限り、Ct-SLCO1B3のexon1*以外の領域を含む、Ct-SLCO1B3をコードするRNAのいずれの領域も標的とし得る。Ct-SLCO1B3のexon1*以外の領域を標的とする核酸を、本発明の医薬組成物に使用する場合、本発明の医薬組成物は、肝臓型SLCO1B3等の、Ct-SLCO1B3以外のSLCO1B3バリアントが発現していない組織に好適に投与される。
好ましくは、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸を有効成分として含む。
他の抗癌剤としては、例えば、代謝拮抗剤(例、メソトレキセート、5−フルオロウラシル等)、アルキル化剤(例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等)、白金系抗癌剤(例、シスプラチン、カルボプラチン等)、トポイソメラーゼ阻害剤(例、エトポシド等)、抗癌性抗生物質(例、マイトマイシン、アドリアマイシン等)、植物由来抗癌剤(例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等)、チロシンキナーゼ阻害剤(例、ゲフィニチブ、イマニチブ等)、ヒト化抗体(例、ハーセプチン等)等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の核酸を上記の医薬組成物として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、所望の効果を有する限り、本発明の核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の核酸は、被験動物の有する腫瘍(及び/又は腫瘍周囲)への局所投与に適切な形態として製剤化される。例えば、本発明の核酸は、アテロコラーゲンゲル等のゲル、クリーム、リポソーム、エクソソーム等の形態として製剤化してもよい。
該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻止する脂質及びカチオン性脂質等を構成成分とするものがあげられる。
Ct-SLCO1B3の発現は、細胞の足場非依存性増殖を促進し、細胞の遊走能及び浸潤能を亢進させる。
従って、Ct-SLCO1B3の発現及び/又は機能を抑制する化合物は、細胞の足場非依存性増殖、浸潤能亢進及び/又は遊走能亢進を抑制させる、癌の予防剤及び/又は治療剤として使用することができる。つまり、Ct-SLCO1B3を産生する細胞は、Ct-SLCO1B3の発現量及び/又は機能を指標とすることにより、癌の予防及び/治療作用を有する物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。
また、上述の通り、Ct-SLCO1B3の発現は上皮間葉転換に関わるsnail、slugの発現を上昇させる。Ct-SLCO1B3は、癌では発現が低下していることが知られているE-cadherin、occludinの発現を抑制し、浸潤に関わるMMP9の発現を誘導する。
従って、Ct-SLCO1B3を産生する細胞は、Ct-SLCO1B3の発現に起因する、snail、slug、E-cadherin、occludin及びMMP9からなる群より選ばれる分子の発現量を変化させる活性を有する物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。
つまり、本発明は、以下の(1)〜(3)の工程を含む、癌の予防及び/又は治療作用を有する物質のスクリーニング方法(本発明のスクリーニング方法とも称する)を提供する:
(1)Ct-SLCO1B3を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
(2)前記細胞におけるCt-SLCO1B3の発現量又は機能を測定する工程、及び
(3)被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、発現量又は機能を低下させる化合物を癌の予防及び/又は治療作用を有する物質の候補として選択する工程。
Ct-SLCO1B3を発現しているヒト由来の培養細胞株としては、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞であるA549細胞などが好ましく用いられる。
また、Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、NCI-H2細胞、HEK293細胞、COS7細胞、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
具体的には、Ct-SLCO1B3をコードするDNA(配列番号32)で表される塩基配列又は該塩基配列に対し相補性を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むDNAを、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。
Ct-SLCO1B3をコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法(例えば、Sambrook J.,FrischE.F.,Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行(Cold Spring Harbor Laboratory press)等に記載されている方法)に準じて取得することができる。すなわち、Ct-SLCO1B3をコードするDNAは、例えば、配列番号32で表される塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、前記したCt-SLCO1B3を産生する細胞・組織由来のcDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やPCR法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版(上記)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
次いで、得られたCt-SLCO1B3遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じてCt-SLCO1B3(タンパク質)を製造・取得することができる。
例えば、Ct-SLCO1B3遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞(形質転換体)を培養することで得られる培養物からCt-SLCO1B3を取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自律的に複製できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、Ct-SLCO1B3をコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点(以下、SV40 oriと略称する場合がある)などを含有しているものを用いることができる。
また、Ct-SLCO1B3もしくはCt-SLCO1B3遺伝子の発現量を低下させる物質、又はCt-SLCO1B3の機能を低下させる物質を選択する際に、被検物質を接触させない対照細胞を比較対照として用いることもできる。ここで「被検物質を接触させない」とは、被検物質の代わりに被検物質と同量の溶媒(ブランク)を添加する場合や、Ct-SLCO1B3もしくはCt-SLCO1B3遺伝子の発現量又はCt-SLCO1B3の機能に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。
本発明のスクリーニング方法は、Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞における該タンパク質(遺伝子)の発現を、被検物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、癌の治療又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被検物質の種類、被検物質と細胞との接触の態様などは、上記と同様である。
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするmRNAの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
(i)正常あるいは疾患(例えば、A549細胞をBalb/c slc-nu/nuマウスに背部皮下移植して作製したマウスなど)モデル非ヒト哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して被検物質を投与し、一定時間経過した後(30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後)に、特定の臓器(例えば、肺等)、あるいは臓器から単離した組織又は細胞を得る。
Ct-SLCO1B3のmRNAは、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出して定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、Ct-SLCO1B3のタンパク質量は、自体公知の方法により定量することができる。例えば、Ct-SLCO1B3のタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができるがこれらに限定されない。
(ii)Ct-SLCO1B3遺伝子を発現する細胞(例えば、Ct-SLCO1B3を導入した形質転換体)を上記の方法に従って作製し、常法に従って培養する際に被検物質を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後(1日後〜7日後、好ましくは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後)、該細胞に含まれるCt-SLCO1B3あるいはそれをコードするmRNAを、上記(i)と同様にして定量、解析することができる。
(i)検出用抗体と、試料液及び標識化されたCt-SLCO1B3とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより試料液中のCt-SLCO1B3を定量する方法や、
(ii)試料液と、担体上に不溶化した検出用抗体及び標識化された別の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量(活性)を測定することにより、試料液中のCt-SLCO1B3を定量する方法等が挙げられる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、これらの常法に従って抗体を製造することができる(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987)Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12~11.13)。
また、検出用抗体は、Ct-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3のいずれをも認識する抗体であってもよい。Ct-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3のいずれをも認識する抗体を用いる場合、Ct-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3を区別するため、さらに生化学的性質、物理学的性質などにより、両者を区別する工程を含めても良い。例えば、試料液をSDS-PAGE電気泳動又はクロマトグラフィーなどを組み合わせることにより、タンパク質のサイズの違いからCt-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3を区別することができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−(ストレプト)アビジン系を用いることもできる。
競合法では、試料液中のCt-SLCO1B3と標識したCt-SLCO1B3とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B、Fいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のCt-SLCO1B3を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体(1次抗体)に対する2次抗体などを用いてB/F分離を行う液相法、及び、1次抗体として固相化抗体を用いるか(直接法)、あるいは1次抗体は可溶性のものを用い、2次抗体として固相化抗体を用いる(間接法)固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のCt-SLCO1B3と固相化したCt-SLCO1B3とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のCt-SLCO1B3と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したCt-SLCO1B3を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のCt-SLCO1B3の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques (Part C))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、検出用抗体を用いることによって、細胞におけるCt-SLCO1B3の量を感度よく定量することができる。
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がCt-SLCO1B3の機能を抑制するか否かを指標として行うこともできる。
例えば、Ct-SLCO1B3の有する下記(1)〜(8)の機能を指標に、癌の悪性化の抑制、浸潤抑制など、Ct-SLCO1B3の発現に特徴づけられる癌の治療及び/又は予防活性を有する活性を有する物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。
(1) 細胞の足場非依存性増殖促進
(2)細胞の遊走能促進
(3)細胞の浸潤能促進
(4)snail発現量の上昇
(5)slug発現量の上昇
(6)E-cadherin発現量の低下
(7)occludin発現量の低下
(8)MMP9発現量の上昇
Ct-SLCO1B3の機能を阻害するとは、上述の(1)〜(8)からなる群より選択されるCt-SLCO1B3の機能のうち、1つ以上の機能を阻害すればよく、好ましくは2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、7つ以上、又は8つ全ての機能を阻害する。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞の足場非依存性増殖が抑制されるか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞の足場非依存性増殖が、被検物質の非存在下における細胞の足場非依存性増殖に比べて、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上阻害された場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、細胞の足場非依存性増殖が亢進した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、細胞の足場非依存性増殖が抑制される細胞
細胞の足場非依存性増殖とは、コラーゲンなどの細胞外マトリックス非存在下における増殖能を意味する。細胞の足場非依存性増殖は、例えば、実施例9に記載の方法に準じて評価することができる。
インビボにおいては細胞の足場非依存性増殖は、例えば、A549細胞をBalb/c slc-nu/nuマウスに背部皮下移植したマウスにおいて、A549細胞の形成する腫瘍の大きさを計測することによって測定することもできる。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞の遊走能が抑制されるか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞の遊走能が、被検物質の非存在下における細胞の遊走能に比べて、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上阻害された場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、細胞の遊走能が亢進した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、細胞の遊走能が抑制される細胞
細胞の遊走能は、自体公知の方法によってアッセイすることができる。例えば、実施例10に記載の方法に準じて評価することができる。細胞の遊走能は、例えば細胞を播種しコンフルエントになるまで培養した後に、ピペットチップの先で細胞の一部を剥ぎ取り、一定時間後(例えば、6時間後、12時間後、24時間後など)の細胞遊走面積を計測することで測定することができる。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞の浸潤能が抑制されるか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞の浸潤能が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上阻害された場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、細胞の浸潤能が亢進した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、細胞の浸潤能が抑制される細胞
細胞の浸潤能は、例えば、実施例11に記載の方法に準じて評価することができる。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞のsnail発現量が低下するか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞のsnail発現量が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1) 又は2) が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、snail発現量が約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上上昇した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、snail発現量が約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した細胞
遺伝子の発現量を比較する方法は上述のとおりである。例えば、snail発現量は実施例13に記載の方法に準じて比較することができる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるsnailタンパク質をコードするmRNAの量を、該mRNA検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるsnailタンパク質の量を、snailタンパク質に対する抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞のslug発現量が低下するか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞のslug発現量が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、slug発現量が約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上上昇した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、slug発現量が約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した細胞
遺伝子の発現量を比較する方法は上述のとおりである。例えば、slug発現量は実施例13に記載の方法に準じて比較することができる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるslugタンパク質をコードするmRNAの量を、該mRNA検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるslugタンパク質の量を、slugタンパク質に対する抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞のE-cadherin発現量が上昇するか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞のE-cadherin発現量が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上に上昇した場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、E-cadherin発現量が約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、E-cadherin発現量が、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上に上昇する細胞
遺伝子の発現量を比較する方法は上述のとおりである。例えば、E-cadherin発現量は実施例12に記載の方法に準じて比較することができる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるE-cadherinタンパク質をコードするmRNAの量を、該mRNA検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるE-cadherinタンパク質の量を、E-cadherinタンパク質に対する抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞のoccludin発現量が上昇するか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞のoccludin発現量が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上に上昇した場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、occludin発現量が約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、occludin発現量が、約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上に上昇する細胞
遺伝子の発現量を比較する方法は上述のとおりである。例えば、occludin発現量は実施例12に記載の方法に準じて比較することができる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるoccludinタンパク質をコードするmRNAの量を、該mRNA検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるoccludinタンパク質の量を、occludinタンパク質に対する抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、Ct-SLCO1B3を発現する細胞において、被検物質を添加することにより、該細胞のMMP9発現量が低下するか否かを測定することにより実施することができる。例えば、被検物質存在下におけるCt-SLCO1B3を発現する細胞のMMP9発現量が、被検物質の非存在下における細胞の浸潤能に比べて、約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した場合に、該被検物質を、Ct-SLCO1B3の機能抑制物質、従って、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質の候補として選択することができる。
Ct-SLCO1B3を発現する細胞としては、下記1)又は2)が好適に用いられる。
1)Ct-SLCO1B3非発現細胞にCt-SLCO1B3を発現させた細胞であって、親株であるCt-SLCO1B3非発現細胞と比較して、MMP9発現量が約10%以上、好ましくは約20%以上、より好ましくは約30%以上、更に好ましくは約50%以上上昇した細胞
2)Ct-SLCO1B3発現細胞であって、Ct-SLCO1B3の発現を抑制させた場合に親株であるCt-SLCO1B3発現細胞と比較して、MMP9発現量が約70%以下、好ましくは約50%以下、より好ましくは約30%以下、更に好ましくは約20%以下、特に好ましくは約10%以下に低下した細胞
遺伝子の発現量を比較する方法は上述のとおりである。例えば、MMP9発現量は実施例13に記載の方法に準じて比較することができる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるMMP9タンパク質をコードするmRNAの量を、該mRNA検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法、及び
(b)Ct-SLCO1B3を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下又は非存在下に培養し、両条件下におけるMMP9タンパク質の量を、MMP9タンパク質に対する抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、癌の治療及び/又は予防活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、上記Ct-SLCO1B3の発現又は機能を抑制する低分子化合物と同様に製剤化することができ、同様の投与経路及び投与量で、ヒト又は哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して、経口的に又は非経口的に投与することができる。
また、本発明は、被験動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3の発現量を測定することを特徴とする癌の悪性度又は悪性化リスクを試験する方法(以下、本発明の試験方法とも称する)を提供する。当該方法は、以下の工程:
(a)被験動物より採取した試料中の、Ct-SLCO1B3の発現量を測定する工程、及び
(b)正常動物由来の試料において測定した場合と比較して、前記発現量が高い被験動物を、癌の悪性度が高いか、将来悪性化するリスクが高いと判定する工程、
を含む被験動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3の発現量を測定することを特徴とする癌の悪性度又は悪性化リスクを試験する方法を提供する。
上記測定の結果、被験動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3遺伝子の発現量又はCt-SLCO1B3タンパク質の量が、正常動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3遺伝子の発現量又はCt-SLCO1B3タンパク質の量と比較して有意に高かった場合、該被験動物は、癌を発症しているか、将来発症するリスクが高いと判定することができる。あるいは、正常動物における発現量を予め同定しておき、例えば、その平均値+2SD(平均値+標準偏差の2倍)をカットオフ値として規定し、被験動物より採取した試料中のCt-SLCO1B3遺伝子の発現量又はCt-SLCO1B3の量が、当該カットオフ値を超えた場合に、該被験動物は、癌の悪性度が高いか、将来悪性化するリスクが高いと判定することもできる。
本発明は、本発明の核酸を用いた、癌の予防又は治療方法(本明細書中、本発明の予防又は治療方法とも称する)を提供する。本発明の予防又は治療方法に関連する各用語の定義及び態様は、上記に記載したものと同一である。
一態様として、本発明の予防又は治療方法は、予防又は治療を必要とする動物に、予防又は治療上有効量の本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む。予防又は治療を必要とする動物としては、癌に罹患しているか又は癌の罹患の可能性の高い動物が挙げられ、好ましくは、癌に罹患しているか又は癌の罹患の可能性の高いヒトである。また、本発明の予防又は治療方法は、本発明の試験方法により「癌の悪性度が高いか、将来悪性化するリスクが高い」と判定された動物、特に該試験方法により「癌の悪性度が高いか、将来悪性化するリスクが高い」と診断されたヒトに対して用いることができる。
本発明の核酸又は本発明の医薬組成物の好ましい投与方法の一例としては、癌の可能性が疑われる組織、癌に罹患している組織、癌の悪性度が高いか将来悪性化するリスクが高い組織への局所投与が挙げられる。例えば、本発明の試験方法により癌の悪性度が高いか、将来悪性化するリスクが高いと判断された動物(例、ヒト)の予防又は治療を行う場合、本発明の試験方法工程(a)にて当該被験動物より採取した試料が由来する組織(例、肺、肝臓、膵臓、食道等)に、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を局所投与することすることができる。本発明の試験方法と本発明の予防又は治療方法を組み合わせることにより、効果的な予防又は治療を行うことが可能となる。
方法:
(1) 組織からのRNA抽出
術後臨床検体をQIAZOL(QIAGEN)700μLと破砕用φ5mmジルコニアビーズ1個が入ったサンプルチューブに入れ、Micro smash MS-100(TOMY)を用いて破砕し、ホモジネートを得た。破砕条件としては、4800rpm、30秒を2回繰り返し、途中1分間の氷上放置とした。組織ホモジネートにクロロホルム140μLを添加して混和後、12,000gで15分間遠心し、得られた水層をRNA抽出に用いた。全自動核酸抽出装置QIA Qube(QIAGEN)を使用し、miRNeasy Mini kit(QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出精製した。
(2) RNA濃度測定と純度確認
RNAの濃度測定には極微量分光光度計Nano Dropを使用した。また純度の確認にはRNA 1μLをExperion RNA StdSens Analysis chip(BIO-RAD)に添加し、全自動チップ電気泳動システムExperion Automated Electrophoresis station(BIO-RAD)にて解析した。なおRNA純度は、RQI(RNA Quality Indicator)を指標とした。RQIは、RNAの完全性を1(分解度が極めて高い)から10(分解していない)の間の数値で表している。以後のmicroarray解析にはRQIが7より大きい値のRNAを用いた。
(3) Exon array解析
非小細胞肺癌術後検体(#1−4)の癌部及び非癌部より得られたtotal RNA 100ngを用いて、Ambion WT Expression Kit(Applied Biosystems)によりcDNA合成を行った。得られたcDNA 5.5μgをGeneChip WT Terminal Labeling Kit(Affymetrix)により断片化、ビオチン化した。ビオチン化されたcDNAをもとにHybridization Cocktailを作成後、GeneChip Human Exon 1.0 ST Array(Affymetrix)に注入し、45℃、60rpmで17時間hybridizationを行った。Hybridization終了後、Fluidics Station(Affymetrix)を使用してGeneChip Hybridization Wash and Stain Kit(Affymetrix)によりarrayの自動洗浄・染色を行い、GeneChip Scanner 3000によりスキャンした。データ解析は、Gene Spring 12.1を用いた。
結果:
結果を図1に示す。#2、3の癌部検体においてSLCO1B3の高発現が認められた。しかしながらそれらの検体のexon2のシグナル強度のみ他の検体と同程度の低いシグナル強度を示した。
方法:
(1) 肺癌細胞株からのRNA抽出と濃度測定、純度確認、exon array解析
非小細胞肺癌細胞株A549、EBC-1、HLC-1、LC-1F、LC-2/ad、LK-2、NCI-H1650、NCI-H1975、NCI-H2228、PC-14、II-18、RERF-LC-AI、RERF-LC-KJ、Sq-1のペレットに対しQIAZOL(QIAGEN)を700μL添加し、さらにクロロホルム140μLを添加して混和後、実施例1−(1)と同様の方法にてtotal RNAを抽出精製した。濃度測定、純度確認は実施例1−(2)とexon arrayは実施例1−(3)と同様の方法で行った。
結果:
結果を図2に示す。非小細胞肺癌細胞株でも、肺癌臨床検体と同様にSLCO1B3高発現細胞の存在が確認できた。さらにこれら高発現が認められた細胞においてもSLCO1B3のexon2のシグナル強度は低いことが分かった。
方法:
Human Multiple Tissue cDNA Panel(CLONTECH)をMilli-Q水にて10倍希釈した溶液をtemplateとして使用した。下に示す組成にてPCR反応液を作成し、同じく下に示すPCR条件にて反応を行った。なお、GAPDHはAmpliTaq Gold(Applied biosystems)、SLCO1B3 full lengthはKOD-plus-(TOYOBO)にてPCR反応を行った。
SLCO1B3 fulllength F:ATGGACCAACATCAACATTTGAATAAAAC(配列番号:33)
SLCO1B3 fulllength R:TTAGTTGGCAGCAGCATTGTCTTG(配列番号:34)
GAPDH F:CCATCACCATCTTCCAGGAG(配列番号:35)
GAPDH R:AATGAGCCCCAGCCTTCTCC(配列番号:36)
結果:
結果を図3に示す。調べた正常組織においてSLCO1B3は肝臓にのみ検出された。
方法:
肺癌組織におけるSLCO1B3の5’側の配列を確認するためSMARTer RACE cDNA増幅キット(Clontech)を用いて5’-RACEを行い、塩基配列を決定した。
結果:
結果を図4に示す。肺癌に発現するSLCO1B3はexon2を使用しておらず、代わりにintronをexonとして使用していることが分かった。この解析中にThakkarらが、癌においては肝臓で発現する正常型のSLCO1B3(肝臓型SLCO1B3:Lt-SLCO1B3)と異なり、exon1、2を使用せずintronをexon1*として使用する癌型SLCO1B3(Ct-SLCO1B3)が存在することを報告した。我々が塩基配列を決定したものもCt-SLCO1B3と同じものであった。
方法:
正常肝臓組織及び非小細胞肺癌組織におけるSLCO1B3の発現を抗SLCO1B3抗体を用いた免疫組織化学的解析により検討した。なお使用抗体はAnti-SLCO1B3 antibody(Sigma-Aldrich、HPA004943)である。
結果:
結果を図5に示す。肝臓ではSLCO1B3が知られているように細胞膜に発現していた。一方、非小細胞肺癌組織においては、膜局在は認められず、細胞質に局在していた。
方法:
臨床検体から抽出したtotal RNA 500ngを用いて、PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)にてcDNA合成を行い、Milli-Q水にて10倍希釈してからreal-time PCRに用いた。あらかじめ10μMに希釈したprimer及びSsoAdvanced SYBR Green Supermix(BIO-RAD)又はTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)をMilli-Q水にて希釈したものにcDNAを加えて20μLとし、CFX96 Real-Time System(BIO-RAD)にてreal-time PCRを行った。
SLCO1B3 exon1*-3 F:GCTTGGCTTGGGCTCAGA(配列番号:30)
SLCO1B3 exon1*-3 R:CCAGCAAGAGAAGAGGATATGTCA(配列番号:31)
GAPDHは実施例3と同じ
結果:
結果を図6に示す。Ct-SLCO1B3は腺癌の55%、扁平上皮癌の72%で検出された。一方その発現は、EGF受容体の変異の有無に関わらず約60%で認められた。
方法:
(1) 細胞培養
500mLのDMEM(和光純薬化学工業)及びRPMI1640(和光純薬化学工業)に対し56℃ 30分間のインキュベートにより補体を非働化したFCS(Life Technologies)を55mL、PBSにて希釈した100mg/mLカナマイシン硫酸塩を500μL滅菌後添加した。細胞培養は37℃、5%CO2にて行った。
(2) siRNAトランスフェクション
リバーストランスフェクション法を用いた。まず、LipofectamineRNAiMAX(Life Technologies)、Control siRNA (コスモバイオ)及びCt-SLCO1B3 siRNA(GeneDesign)、Opti-MEM(Life Technologies)のトランスフェクション複合体を作成し、siRNA終濃度が10nMとなるようA549細胞懸濁液に添加した。
使用したsiRNAの配列を下記に示す。
Ct-SLCO1B3 siRNA #1:
ACCUGACAGUGGCAAUGUAtt(配列番号:37)
UACAUUGCCACUGUCAGGUtt(配列番号:38)
Ct-SLCO1B3 siRNA #2:
CUGACAGUGGCAAUGUAUGtt(配列番号:39)
CAUACAUUGCCACUGUCAGtt(配列番号:40)
Ct-SLCO1B3 siRNA #3:
UGGCCACGUUACUGAAUCUtt(配列番号:41)
AGAUUCAGUAACGUGGCCAtt(配列番号:42)
Ct-SLCO1B3 siRNA #4:
ACGUUACUGAAUCUACAUGtt(配列番号:43)
CAUGUAGAUUCAGUAACGUtt(配列番号:44)
上記のsiRNAはGeneDesignより合成依頼した。
(3) cDNA合成
siRNAトランスフェクション後2日目の細胞を回収し、Trizol(Life Technologies)又はillusta RNAspin Mini(GE Healthcare)を用いてtotal RNAを抽出した後、Prime Script RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)を用いてcDNAを合成した。cDNA合成はtotal RNA 500ngを用いて行い、得られたcDNA溶液をMilli-Q水にて10倍希釈してreal-time PCRに使用した。
(4) Real-time PCR
検量線用サンプル、測定サンプル、あらかじめ10μMに希釈した各プライマーを用意し、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)又はTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)と混合し、10μLの反応溶液を調製した。これをキャピラリーに分注し、Light Cyclerクイックシステム350S(Roche)にてreal-time PCRを行った。PCR条件を以下に示す。なお、primerは実施例6のSLCO1B3 exon1*-3及び実施例3のGAPDH primer setを用いた。
結果を図7に示す。使用したCt-SLCO1B3 siRNAの中で#3、#4が約50%以上のノックダウン効果を示した。
方法:
siRNAトランスフェクション後2日目の細胞を回収し、1000 cells/wellとなるよう96 well plateへ播種した。その後24時間ごとに20mM HEPES(pH7.4)に溶解したWST-1(DOJINDO)溶液と1-methoxy PMS(DOJINDO)溶液を9:1で混合したものを10μL/wellずつ添加し、1時間30分後に450nmで吸光度を測定した。対照波長として630nmを使用した。
結果:
結果を図8に示す。Ct-SLCO1B3 siRNA(図8では#4を使用)は、A549細胞の足場依存性増殖に影響を示さなかった。
方法:
FCeM-D(日産化学工業株式会社)に対して10% FCS及びカナマイシンを加えたものを培地として用い、細胞低吸着加工が施されたHydro Cell plate(株式会社セルシード)にて培養を行った。siRNAトランスフェクション後2日目の細胞を500 cells/wellとなるよう96well plateへ再播種し、48時間培養後、実施例8と同様にWST-1試薬を加え、吸光度を測定した。
結果:
結果を図9に示す。Ct-SLCO1B3 siRNA(図9では#4を使用)は、A549細胞の足場非依存性増殖を抑制した。
方法:
siRNAトランスフェクション後2日目の細胞を回収し、24 well plateがコンフルエントとなるよう播種した。24時間後にピペットチップの先で増殖細胞の一部を削り、その0、6、12、24、36、48時間後に細胞の遊走面積をImage Jを用いて定量評価した。細胞の撮影にはFSX100(Olympus)を使用した。
結果:
結果を図10に示す。Ct-SLCO1B3 siRNA(図10では#4を使用)は、A549細胞の遊走能を抑制した。
方法:
BD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration(BD Biosciences)を無血清DMEMにて40倍希釈し、CIM-Plate16(Roche)へコートした。siRNAトランスフェクション後2日目の細胞を回収し、4×104 cells/wellとなるよう希釈してCIM-Plateへ播種し、1時間常温にて放置後xCELLigence(Roche)にセットし測定を開始した。
結果:
結果を図11に示す。コントロールsiRNAトランスフェクションではA549は顕著に浸潤したのに対し、Ct-SLCO1B3 siRNA(図11では#4を使用)はその浸潤作用を顕著に抑制した。
方法:
トランスフェクション48時間後の細胞をカバーガラスを入れた12 well plateに5×104 cells/wellずつ再播種し、さらに48時間37℃でインキュベートした。その後、−20℃ methanol(Wako 137-01823)を培地の代わりに500μL/wellずつ加え、15分間−20℃で固定を行った。PBS-T(0.1% TWEEN20/PBS)で10分3回washし、Blocking Buffer(組成0.3%TWEEN20(Wako167-11515)/5%牛血清アルブミン(SIGMA A3912-1009 Lot#LBF7177V)/PBS)で1時間ブロッキングを行った。抗体希釈Buffer(組成0.3%TWEEN20/1%牛血清アルブミン/PBS)で1000倍希釈したoccludin抗体(SIGMA HPA005933)及びE-cadherin 23E10抗体(Cell Signaling #8834)を添加して4℃で一晩インキュベートした。翌日、PBS-Tで10分 3回washを行い、1000倍希釈したAlexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(Invitrogen)及びRhodamine Red goat anti-rabbit IgG(Invitrogen)を添加して暗所・室温で1時間インキュベートし、PBS-Tによるwashを行った。Dapi Fluoromount-G(Southen Biotech 0100-20)を用いて封入した後に、システム生物顕微鏡BX51(OLIMPUS)を用いて観察した。
結果:
結果を図12に示す。Ct-SLCO1B3 siRNAのトランスフェクションにより、occludinやE-cadherinの発現上昇が認められた。これらの上昇がCt-SLCO1B3の細胞増殖抑制作用に関わっていることが推測された。
方法:
一次抗体はE-cadherin、snail、slug(以上Cell Signaling Technology)、occludin、β−actin(以上SIGMA-ALDRICH)を1000倍希釈して用いた。
細胞をPBSで2回washし、Lysis buffer(10mM Tris、150mM NaCl、1% sodium deoxycholate、0.1% SDS、1% Triton X-100)となるようMilli-Q水に溶解し、使用直前にprotease inhibitorを0.1%量加えて細胞溶解液を回収した。氷上で30分放置後、15,000 rpmにて30分遠心し、上清を回収した。この上清についてDC Protein Assay Reagent(Bio-Rad)を用いLowry法にてタンパク定量を行った。各サンプル間のタンパク濃度をそろえたのち、上清と等量の2×sample buffer(0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.5mL、10% SDS 4mL、2−メルカプトエタノール 0.5mL、スクロース 1mLをMilli-Q水で溶解して10mLとした)を加え、37℃で30分加熱しWestern blot用細胞溶解液を得た。
アクリルアミドゲルを作成し、SDS-PAGE running buffer(Tris base 15.1g、glycine 72.0g、SDS 5.0gをMilli-Q水に溶解して1000mLとした。使用時にMilli-Q水で5倍希釈して用いた)を用いて各lysateの電気泳動を行った。電気泳動終了後のゲルはtransfer buffer(Tris base 30.3g、glycine 144gをMilli-Q水に溶解して1000mLとした。使用時にこのbuffer 20mLに対し、メタノール 40mL、Milli-Q水 140mLを加えて用いた。)に浸し、15分程シェーカーにてなじませた。またImmobilon-P Transfer Membrane(Millipore)はメタノールに浸したのちtransfer bufferに浸し、20分程シェーカーにてなじませた。その後サブマリン式にて25V、60分のtransferを行った。転写終了後のメンブレンはTBS-T(1M Tris-HCl(pH7.4)10mL、5M NaCl 30mL、Tween 20 1mLをMilli-Q水に溶解して1000mLとした。)にて数回washした後、TBS-Tにて3%となるよう希釈したskim milk(森永)にて20分程度のブロッキングを行った。TBS-Tで数回wash後、Can Get Signal Immuno Reaction Enhancer Solution Solution 1 for primary antibody(TOYOBO)にて希釈した一次抗体で一晩4℃にてインキュベートした。翌日TBS-Tで15分×4回washを行った後、Can Get Signal Immuno Reaction Enhancer Solution Solution 2 for secondary antibody(TOYOBO)にて希釈したHRP標識抗rabbit IgG抗体又はHRP標識抗mouseIgG抗体(いずれもCell Signaling Technology)で1時間常温にてインキュベートした。さらにTBS-Tで15分×4回washを行った後、ECL Prime Western Blotting Detection System(GE Healthcare)を滴下して5分間暗所で放置し、ImageQuant LAS 4000mini(GE Healthcare)にて発光を検出した。
結果:
結果を図13に示す。Ct-SLCO1B3のノックダウンにより、上皮間葉転換に関わる転写因子であるsnail、slugの発現低下と、それに起因することが推測される接着分子E-cadherin、occludinの発現上昇が認められた。
方法:
(1) real-time PCR
方法は実施例7と同様。
・primer
MMP9 F :ACCTCGAACTTTGACAGCGACA(配列番号45)
MMP9 R :GATGCCATTCACGTCGTCCTTA(配列番号46)
一次抗体はMMP-9(Cell Signaling Technology)を1000倍希釈して用いた。操作は実施例13と同様。
(3) gelatin zymography
siRNAトランスフェクション48時間後に無血清DMEMで24時間37℃でインキュベートした後、回収した上清500μLをCentrifugal Filter Unit Anicom Ultra-0.5mL、50Kに通してタンパク質を濃縮した。また、サンプルごとの細胞数をカウントした。濃縮した上清は等量の6×Sample Buffer(Milli-Q 1.6mL、625mM Tris 2.4mL、Glycerol 2.4mL、10%SDS、4.8mL BPB(bromo phenol blue)微量)を添加し常温で数分放置した。0.1% Gelatin(Sigma)/10%アクリルアミドゲルを作成し、サンプルを細胞数がそろうようにアプライし、Western Blotと同様の方法で電気泳動した。この時、上清した時の細胞数で上清のサンプルのアプライ量を規定した。ゲルを30分間 Zymogram Renaturating Buffer(life technology)に浸透させた後、30分間 Zymogram Developing Buffer(life technology)に浸透させた。その後、さらにZymogram Developing Bufferを取り換えた後、37℃で1晩インキュベートさせた。ゲルをCBB染色液(組成 methanol 250mL/acetic acid 50mL/MQ 200mL/Coomassie Brilliant Blue(CBB)微量)に浸して約1時間振とうさせた。その後、脱色液(組成 methanol 25mL/acetic acid 37.5mL/MQ 437.5mL)に浸し、約半日振とうさせ、ImageQuant LAS 4000によるバンドの撮影を行いImage Jにて定量した。
結果:
結果を図14に示す。Ct-SLCO1B3のノックダウンにより、浸潤に機能するMMP9のmRNA、タンパク質発現抑制が認められた。またその酵素活性の低下もzymographyにより確認した。
方法:
(1) Ct-SLCO1B3、Lt-SLCO1B3高発現用plasmid vectorの作製
KOD-plus(TOYOBO)を用いてCt-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3全長のPCR反応を行った。KOD-plus-PCR反応液組成及びLt-SLCO1B3 primerは実施例3参照。PCR条件及びCt-SLCO1B3全長primerは以下の通りである。得られたPCR産物はアガロースゲル電気泳動後Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega)にて切り出し精製を行った。この産物90ngとPerfectly Blunt Cloning Kit(Millipore)を用いてpT7 Blue vector(Millipore)へligationを行った。これをDH5α(Life Technologies)にトランスフォーメーション後、ampicillin含有LB寒天培地に播種し、37℃で一晩インキュベートした。形成されたコロニーを採取し、ampicillin含有LB液体培地3mLで一晩培養し、得られた大腸菌液からWizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega)によりプラスミドを精製し、シーケンスの一致を確認した。
得られたプラスミド及びpcDNA 3.0をMilli-Q水にて44μLにメスアップし、5μLの10×buffer K、1μL BamHI(TaKaRa)を加え30℃で16時間酵素処理を行った。その後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up Systemにて精製した。これらを再びMilli-Q水にて44μLにメスアップし、5μLの10×buffer tangoと1μLのXbaI(fermentas)を加え37℃で20時間酵素処理した。アガロースゲル電気泳動後Wizard SV Gel and PCR Clean-up Systemにて切り出し精製を行った。得られた産物をligation high(TOYOBO)を用いて20時間ligation反応を行った後、DH5α(Life Technologies)にトランスフォーメーションした。これをampicillin含有LB寒天培地に播種し、37℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーについて以下のプロトコルを用いてdirect PCRを行い、PCR産物が出来たコロニーをCt-SLCO1B3、Lt-SLCO1B3の全長が組み込まれたpcDNA3.0として以降の実験に用いた。
・primer
CMV promoter Forward primer:TGACGCAAATGGGCGGTA(配列番号47)
SLCO1B3 exon1*-3 Reverse primer:CCAGCAAGAGAAGAGGATATGTCA (配列番号31)
NCI-H23細胞を24 well plateへ5×104 cells/wellとなるよう播種した。翌日Ct-SLCO1B3、Lt-SLCO1B3導入pcDNA3.0 vectorを500ng、Lipofectamine 2000(Life Technologies)2μLをOpti-MEM培地内で混合してtransfectionを行い、5時間後に培地を交換した。さらに翌日から終濃度1.0μg/mLのG418(WAKO)を添加し、7日間セレクションを行った。transfectionを行っていないNCI-H23細胞がすべて死滅したことを確認した後、各実験に細胞を用いた。
(3) real-time PCR
方法は実施例7と同じであり、使用したprimerは以下の通りである。
SLCO1B3 exon8-9 F :CCATACCATTTTTTTTCTTGCCGA(配列番号48)
SLCO1B3 exon8-9 R :ACAGGGGATTGGTAAGGATGC(配列番号49)
(4) western blot
一次抗体はSLCO1B3(abcam)を500倍希釈にて用いた。操作は実施例13と同様である。
結果:
Lt-SLCO1B3とCt-SLCO1B3安定高発現細胞NCI-H23を樹立することができた。ウエスタンブロット及びRT―PCRの結果を図15に示す。
方法:
Ct-SLCO1B3及びLt-SLCO1B3高発現NCI-H23細胞を回収し、6000 cells/90μLとなるようFCeM−R培地(日産化学工業株式会社)に希釈しnon coating 96 well plate(IWAKI)へ90μLずつ播種した。その後24、72、120、168時間後にWST-1溶液と1-methoxy PMS溶液(いずれもDOJINDO)を9:1で混合したものを10μL/wellずつ添加し、1時間30分後に450nmで吸光度を測定した。対照波長として630nmを使用した。
結果:
結果を図16に示す。Ct-SLCO1B3高発現NCI-H23細胞において、足場非依存性増殖促進作用が認められた。
方法:
細胞を1×105cells/wellとなるよう48 well plateへ播種した。24時間後にチップの先で傷を付け、0、6、12、24、36、48時間後に細胞の遊走面積をImage Jソフトウエアを用いて遊走能を測定した。撮影はFSX100(Olympus)を用いた。
結果:
結果を図17に示す。Ct-SLCO1B3高発現NCI-H23細胞において、遊走能の亢進が認められた。
方法:
(1) Ct-SLCO1B3 exon1* guide sequence導入px330の作製
5μgのpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(Addgene)をBbsI(Thermo Scientific)にて37℃で一晩消化した後、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega)にて精製した。これをAlkaline Phosphatase、Calf Intestinal(CIP)(NEB)にて37℃で一晩脱リン酸化反応を行い、アガロースゲル電気泳動後Wizard SV Gel and PCR Clean-up Systemにて切り出し精製を行った。一方でCt-SLCO1B3 exon1*内の配列を標的とするguide sequence(下表)について、100μMのsence oligo DNA及びantisence oligo DNA 20μLずつをアニールさせた。その後T4 Polynucleotide Kinase(TAKARA)及びATP(TAKARA)を用い37℃で一晩リン酸化反応を行った。得られたリン酸化oligo DNAとBbsIにて消化し脱リン酸化したpx330とligation high(TOYOBO)によるligation反応を行った。得られたplasmidを用いてCompetent Quick DH5α(TOYOBO)に対してtransformationを行い、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega)にてplasmidを精製した。
px330には細胞へのtransfection後のselectionに使用できる薬剤耐性遺伝子が存在しない。そこでウミシイタケルシフェラーゼベクター pGL4.84[hRlucCP/Puro](Promega)よりBglII(Thermo Scientific)-BamHI(TAKARA)でルシフェラーゼ遺伝子部分(hRlucCP)を抜き出し、改変puromycin耐性vectorを作製した。
2μgのpGL4.84[hRlucCP/Puro]をBglII及びBamH Iにて消化後、アガロースゲル電気泳動を行いWizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega)にて切り出し精製を行った。得られた産物をligation high(TOYOBO)を用いてligation反応を行った。得られたplasmidを用いてCompetent Quick DH5α(TOYOBO)に対してtransformationを行い、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega)にてplasmidを精製した。
(3) Ct-SLCO1B3 knock out A549の作製
A549細胞を24 well plateへ2×104 cells/wellとなるよう播種した。翌日Ct-SLCO1B3 exon1* guide sequence導入px330 vectorを500ng、puromycin耐性vectorを50ng、Lipofectamine 2000(Life Technologies)を1μLをOpti-MEM(Life Technologies)内で混合し、co-transfectionを行い、6時間後に培地を交換した。さらに翌日から終濃度1.0μg/mLのpuromycinを添加し、3日間セレクションを行った。transfectionを行っていないA549細胞がすべて死滅したことを確認した後、限界希釈法によりクローニングを行った。
(4) Western blot
一次抗体はSLCO1B3(abcam)を500倍希釈にて用いた。操作は実施例13と同様である。
結果:
いずれのコンストラクトでも顕著なCt-SLCO1B3の発現抑制株が樹立できた。ウエスタンブロットの結果を図18に示す。
方法:
(1) soft agar assay
DMEM-10%FCS、2×DMEM-20%FCS(粉末状DMEM(Invitrogen)を1/2量のMilli-Q水にて希釈し、フィルター滅菌して用いた)、1.2% agar(BD pharmigen)を用いて、6 well plateに0.4% agarのbottom agarを作成した。さらに0.3% agarのtop agarを作成し、細胞を1000 cells/wellとなるようtop agar中に播種した。37℃、5%CO2で約3週間培養後、0.05%クリスタルバイオレット(WAKO)/50%メタノールを用いて4℃で一晩染色し、翌日にコロニー数を計数した。
(2) 3D培養WST-1 assay
実施例9と同様にして行った。
結果:
結果を図19に示す。いずれの細胞も顕著なコロニー形成抑制、3次元培養での増殖抑制作用が認められた。
方法:
15cm dishにて培養したCt-SLCO1B3 knock out A549 clone No.1-1及びcontrol-1に0.025%EDTA/PBSを滴下し5分放置後、スクレーパーを用いて細胞を回収した。PBSによるwashを2回行い、CountessTM Automated Cell Counter(Invitrogen)にて細胞数及び細胞のviabilityを測定した。4×106 cells/50μLとなるようserum free DMEMにて希釈し、等量のBD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration(BD Biosciences)を加えた。これをインスリン投与用注射筒へとり、100μLずつ雄のBalb/c slc-nu/nuマウス(5週齢、清水実験材料)へ皮下注射を行った。腫瘍径の測定にはノギスを用いた。腫瘍体積の算出式は腫瘍の長径×短径×短径÷2とした。
結果:
結果を図20に示す。Ct-SLCO1B3発現抑制A549細胞では、コントロール細胞と比べ顕著な腫瘍形成低下が認められた。
非小細胞肺癌でCt-SLCO1B3の高発現が見られる。その発現は上皮間葉転換に関わるsnail、slugの発現を上昇させる。それらの転写因子はタイトジャンクション形成に関わり、また癌では発現が低下していることが知られているE-cadherinやoccludinの発現抑制に関わることが指示された。一方、snailやslugは浸潤に関わるMMP9の発現を誘導する。またMMP9はE-cadherinやoccludinの発現も抑制する。Ct-SLCO1B3はこれらの機序により非小細胞肺癌の悪性化を惹起していることが考えられた。よってCt-SLCO1B3はそれが発現する非小細胞肺癌の有望な分子標的となり、その発現を抑制する核酸は分子標的治療薬となることが期待される。
方法:
Ct-SLCO1B3に対する最適siRNA配列を決定する目的で表8に示すsiRNA配列を設定し、合成した。
方法:
96 well plateにてA549細胞4000 cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、2日後にCellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR(Real Time)(TaKaRa)にてRNAを回収した。このRNA 2μLを用い、PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)にてcDNAを合成しMilli-Q水にて10倍希釈した。Light Cycler 96(Roche)を用いてduplicateにてreal-time PCRを行った(方法は実施例7と同様)。
結果を図22に示す。
方法:
96 well plateにてA549細胞500 cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、4日後にWST-1試薬を添加し、吸光度を測定した(方法は実施例8と同様)。
結果:
結果を図23に示す。
96 well plateにてA549細胞4000 cells/wellとなるよう表8に記載の二本鎖核酸のsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、2日後に10% FCS/FCeM-D(日産化学工業)にて30倍希釈した溶液をHydro Cell plate(株式会社セルシード)へ再播種した。浮遊条件下で9日間培養後、WST-1試薬を加え、吸光度を測定した(方法は実施例9と同様)。
結果:
結果を図24に示す。
方法:
96 well plateにてA549細胞1500 cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、4日後にWST-1試薬を添加し、吸光度を測定した(方法は実施例8と同様)。
結果を図25に示す。上記実施例22−25の1次評価により、#26、#27、#29、#30、#32、#33と#4がCt-SLCO1B3特異的作用によりCt-SLCO1B3発現肺癌細胞の足場非依存性増殖を抑制することが示された。そこで次にそれらのsiRNAを用いた2次評価へと進めた。
12 well plateにてA549細胞4×104cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、2日後にTrizol(Life Technologies)にてRNAを回収し、PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa)にてcDNAを合成しMQ水にて10倍希釈した。Light Cycler クイックシステム 350S(Roche)を用いてreal-time PCRを行った(方法は実施例7と同様)。
結果:
結果を図26に示す。
方法:
6 well plateにてA549細胞1×105cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、2日後に96 well plateへ500 cells/wellとなるよう再播種し、接着条件下で5日間培養後、WST-1試薬を加え、吸光度を測定した(方法は実施例8と同様)。
結果:
結果を図27に示す。
方法:
6 well plateにてA549細胞1×105cells/wellとなるようsiRNA transfectionを行い(方法は実施例7と同様)、1日後に培地交換、2日後に10% FCS/FCeM-D(日産化学工業)にて500 cells/wellとなるよう希釈した細胞懸濁液をHydro Cell plate(株式会社セルシード)へ再播種し、浮遊条件下で9日間培養後、WST-1試薬を加え、吸光度を測定した(方法は実施例9と同様)。
結果:
結果を図28に示す。
実施例26−28の2次評価結果を踏まえて、Ct-SLCO1B3に対する特異的作用を示すsiRNA標的配列を決定した。その配列はACGTTACTGAATCTACATGTTGCAAGAAGAAAAA(配列番号140)を含む領域に集約されることが分かった(図29)。
二次評価の結果
#26、27、29、30、32、33と#4はA549細胞に対して顕著なノックダウン効果を示した。足場非依存増殖に対しては#29は抑制作用を示さず、#30は弱い抑制作用を示したが、#26、27、32、33と#4は顕著な抑制作用を示した。一方#27にはA549細胞の足場依存性増殖抑制作用も弱いながら認められた。よって#4、26、32、33がより特異性が高く、効果的なCt-SLCO1B3に対する配列であることが示された。
方法:
実施例6と同様に、食道癌、肝細胞癌又は膵癌の臨床検体から抽出したtotal RNA 500ngを用いてcDNA合成を行い、real-time PCRによりCt-SLCO1B3の発現量を比較した。
結果を図30に示す。Ct-SLCO1B3は食道癌、肝細胞癌、膵臓癌では有意な差はみられなかったものの、非癌部と比べて癌部で高発現している検体が存在していることがわかった。
方法:
A549細胞を0.05% EDTAを用いてdishから剥がし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した。細胞はDMEM (Code No.041-29775、和光純薬工業株式会社)とBD Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration (Cat.No.354248、BD Bioscience)を1:1で希釈し、4×106 cells/mouse/100 μlでBALB/c Slc-nuマウス各群6匹(5週齢、日本SLC)に皮下移植した。Control siRNA とCt-SLCO1B3 siRNA#4をAteloGene Local Use “Quick Gelation” (Product No. #1490、高研株式会社)のプロトコルに準拠して、siRNA の終濃度2 nmol/200μlとなるように調整し、4日毎・計4回腫瘍の周囲に投与した。腫瘍径の測定にはノギスを用いた.腫瘍体積の算出式は腫瘍の長径×短径×短径÷2とした。
Ct-SLCO1B3 siRNA#4:5’-ACGUUACUGAAUCUACAUGtt(配列番号:43)、5’-CAUGUAGAUUCAGUAACGUtt(配列番号:44)
Control siRNA:5’-AUCCGCGCGAUAGUACGUAtt(配列番号:141)、5’-UACGUACUAUCGCGCGGAUtt(配列番号:142)
結果:
結果を図31に示す。Ct-SLCO1B3 siRNA投与により抗腫瘍作用が認められた。
Claims (12)
- センス鎖及びアンチセンス鎖から成り、19個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号1の配列からなるDNAの塩基配列と完全に相補する標的Ct−SLCO1B3(癌型溶質キャリヤー有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3)RNA配列と相補的である、Ct−SLCO1B3の発現を減少させる二本鎖核酸であって、
前記アンチセンス鎖/センス鎖が、配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、配列番号17/配列番号25、配列番号18/配列番号26、配列番号19/配列番号27、配列番号20/配列番号28、及び配列番号21/配列番号29から成る群から選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む、Ct−SLCO1B3を発現する癌の治療又は予防用の医薬組成物。 - 癌がCt−SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌又は食道癌である、請求項1記載の医薬組成物。
- 癌がCt−SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌である、請求項2記載の医薬組成物。
- 二本鎖核酸が、表1記載の配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、及び配列番号17/配列番号25から成る群から選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 二本鎖核酸が、表1記載の配列番号14/配列番号22のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含む、請求項4記載の医薬組成物。
- 二本鎖核酸が、配列番号43/配列番号44のアンチセンス鎖/センス鎖の配列からなる、請求項5記載の医薬組成物。
- 癌の治療又は予防が、癌の浸潤及び/又は転移を抑制することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 二本鎖核酸が、表1記載の配列番号14/配列番号22、配列番号15/配列番号23、配列番号16/配列番号24、及び配列番号17/配列番号25から成る群から選択される1対のアンチセンス鎖/センス鎖の配列を含み、癌がCt−SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌であり、かつ、癌の治療又は予防が、癌の浸潤及び/又は転移を抑制することを含む、請求項1記載の医薬組成物。
- センス鎖及びアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、配列番号1の配列からなるDNAの塩基配列と完全に相補する標的Ct−SLCO1B3(癌型溶質キャリヤー有機アニオントランスポーターファミリーメンバー1B3)RNA配列と相補的である、Ct−SLCO1B3の発現を減少させる二本鎖核酸であって、
標的Ct−SLCO1B3 RNA配列が、配列番号2の配列に含まれる、二本鎖核酸であり、
Ct−SLCO1B3を発現する細胞の足場非依存性増殖を抑制する二本鎖核酸を含む、Ct−SLCO1B3を発現する癌の治療又は予防用の医薬組成物。 - 癌がCt−SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌、肝癌、膵癌又は食道癌である、請求項9記載の医薬組成物。
- 癌がCt−SLCO1B3を発現する非小細胞肺癌である、請求項10記載の医薬組成物。
- 癌の治療又は予防が、癌の浸潤及び/又は転移を抑制することを含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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