WO2007026969A1 - 創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、並びにスクリーニング方法 - Google Patents

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target
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Yorimasa Suwa
Tadakazu Yamauchi
Morikazu Kito
Yuko Isono
Tsuruki Tamura
Motoi Tobita
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Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd.
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • Drug discovery target protein and gene, and screening method Drug discovery target protein and gene, and screening method
  • the present invention relates to a target protein and a target gene useful for development of bioactive substances, for example, drug discovery; a method for screening bioactive substances, and a substance obtained by the Staring method; It relates to a regulator; a method for producing a derivative of a physiologically active substance; a method for producing the derivative; a complex containing a physiologically active substance and its target protein; and a method for producing the complex.
  • a target protein and a target gene useful for development of bioactive substances for example, drug discovery
  • a method for screening bioactive substances and a substance obtained by the Staring method
  • It relates to a regulator; a method for producing a derivative of a physiologically active substance; a method for producing the derivative; a complex containing a physiologically active substance and its target protein; and a method for producing the complex.
  • target proteins of pharmaceuticals there are about 480 target proteins of pharmaceuticals that have been widely used so far, and it is reported that these target proteins are limited to membrane receptors, enzymes, ion channels, or nuclear receptors. (J. Drews, Science, 297, 1960 -1964, 2000) 0
  • target proteins by searching for target proteins based on genomic information, new proteins that do not belong to the category of conventional target proteins are included. A large number of target proteins are found one after another, and the total number is expected to be about 1,500 (AL Hopkins & CR Groom, Nature Review s; Drug Discovery, 1, 727-730 , 2002).
  • the application includes a method for identifying a protein or partial protein suitable as a new drug discovery target, comprising the following steps: (i) selecting a plurality of proteins or partial proteins having a desired affinity and specificity for the selected target compound;
  • the drugs that have been used so far have no known target protein, or even if the target protein is known, the mechanism through the protein cannot explain all of the medicinal effects and side effects of the drug. There are many and.
  • a typical example is aspirin, one of the oldest used medicines.
  • aspirin When aspirin was first marketed over 100 years ago, its anti-inflammatory mechanism was unknown. About 70 years later, it became clear that aspirin has a cyclooxygenase (C0X) inhibitory action. Over the next 20 years, C0X has COX-1 and C0X-2 subtypes. The main effect of aspirin is due to C0X-2 inhibition, and COX-1 inhibition is a side effect such as gastrointestinal disorders. It was clarified that it was the cause. However, not all target proteins of aspirin have been revealed yet. In recent years, aspirin Although it has been clinically shown that cancer has anti-dementia, these effects cannot be explained by C0X inhibition.
  • Hirayama et al. One of the inventors of the above-mentioned published patents, created a database that integrated the structure and physical properties data of about 1,500 types of pharmaceuticals marketed in Japan. We have found that medicinal compounds have common structural features (Chem-Bio Informatics Journal, 1, 18-22, 2001). Drugs that have been widely used in the past are honor students who have cleared the issues of transferability and safety in the development process. Searching for new target proteins using these drugs as probes, and devising newly developed candidate compounds based on the structures of these drugs are considered to be very rational and efficient.
  • the next issue is how to use genome information in the process of searching for new target proteins.
  • Simply determining the genome sequence reveals the functions of all genes and does not find drug discovery target proteins. It is estimated that there are about 30,000 to 40,000 types of genes in humans, and it is said that there are more than 100,000 types of mRNAs, taking into account alternative splicing variants. Therefore, it is important to efficiently select and identify those genes that have useful functions for industrial use such as drug development among the enormous amount of new genes that are revealed from the genome sequence.
  • the mRNA transcription start point on the genome sequence can be identified from the 5 'end sequence, and the stability of the mRNA contained in the sequence can be determined. It is possible to analyze factors involved in expression control at the translation stage. In addition, because the translation start point ATG codon is included on the 5th side, the protein can be translated into the correct frame. Therefore, by applying an appropriate gene expression system, it is possible to produce a large amount of the protein encoded by the cDNA or to express the protein and analyze its biological activity. Thus, analysis using proteins expressed from full-length cDNA provides important information that cannot be obtained by genome sequence analysis alone, and does not belong to the category of conventional drug discovery target proteins. It is considered possible to discover such novel target proteins. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a target protein and a target gene for development of a physiologically active substance (for example, drug discovery), and various means capable of developing a novel physiologically active substance using these.
  • a physiologically active substance for example, drug discovery
  • the present inventors analyzed the interaction between a human protein and a compound that has been used as a pharmaceutical or a physiologically active substance by surface plasmon resonance, thereby creating a novel drug that can be useful for the development of a new pharmaceutical or physiologically active substance.
  • substances that regulate the expression or function of these genes are substances that can regulate various physiological activities, and substances that can regulate various physiological activities. In order to achieve this, it is necessary to screen for substances that modulate the expression or function of these genes, or to allow these physiologically active substances to regulate the expression or function of their target genes.
  • the present invention has been completed with the idea that derivatization is necessary.
  • the present invention is as follows:
  • test substance can modulate the expression or function of the target protein Y or the gene encoding it
  • the combination of the physiologically active substance X and the target protein Y is any of the following (a 1) to (a 5) (hereinafter abbreviated as “combination A” as necessary in this specification): (a 1) a combination of thiabendazole and a protein derived from FL J 10368, FLJ 1 2389 or FLJ 125 14;
  • a screening method for a substance capable of regulating a function related to target protein Y comprising:
  • the combination of the target protein Y and the physiologically active substance X is any of the following (b 1) to (b 7) (hereinafter abbreviated as “combination B” if necessary in the present specification): (b 1) A combination of a protein derived from FLJ 1 0368 and thiabendazole, reserpine or a derivative thereof capable of binding to the protein;
  • (b 2) A combination of a protein derived from FLJ1 23 89 and thiabendazole or a derivative thereof capable of binding to the protein;
  • (b 6) A combination of a protein derived from FLJ14583 and cephalexin, imipenem or a derivative thereof capable of binding to the protein;
  • (b 7) A combination of a protein derived from FL J 3 1 146 and cephalexin or a derivative thereof capable of binding to the protein.
  • a physiologically active regulator comprising a substance obtained by any one of the methods [1] to [6].
  • the substance that suppresses the expression or function of target protein Y or the gene encoding it is an antisense nucleic acid, a lipozyme, a decoy nucleic acid, siRNA, an antibody or a dominant negative mutant, or an expression vector thereof.
  • An agent, wherein the combination of target protein Y and bioactive substance X is combination B.
  • bioactive substance X so that it can regulate the expression or function of target protein Y or the gene encoding it
  • a physiologically active regulator comprising a derivative of a physiologically active substance obtained by the method of [14] or [15].
  • a complex comprising a physiologically active substance X and its target protein Y, wherein the combination of the physiologically active substance X and the target protein Y is either combination A or combination B.
  • the target protein Y, the nucleic acid encoding the protein, the expression vector containing the nucleic acid, the target protein ⁇ or the gene encoding the same can be measured.
  • An expression vector comprising a cell or a transcriptional regulatory region of a gene encoding the target protein Y and a reporter gene operably linked to the region;
  • a kit in which the combination of bioactive substance X and target protein ⁇ is either combination ⁇ or combination ⁇ .
  • [2 1] A method for determining a disease or condition associated with the action of physiologically active substance X or a disease or condition associated with the function of target protein Y or the risk of developing the disease, the following steps (a), (b):
  • bioactive substance X and target protein Y is either combination A or combination B.
  • (i) means capable of measuring the expression level and / or polymorphism of the target protein Y or the gene encoding it;
  • a kit in which the combination of bioactive substance X and target protein Y is either combination A or combination B.
  • bioactive substance X and target protein Y is either combination A or combination B.
  • a kit for determining susceptibility to bioactive substance X against a disease or condition related to the action of bioactive substance X, or a disease or condition related to the function of target protein Y wherein: (i) , (Ii):
  • the present invention provides target proteins and target genes for the development of physiologically active substances.
  • the physiologically active substance means any substance that exerts some action on the living body.
  • the physiologically active substance can be an exogenous substance such as a drug, a vitamin, a herbal medicine ingredient, a food ingredient, or an endogenous substance such as a site force-in, a growth factor, a hormone.
  • physiologically active substance X When a predetermined physiologically active substance is intended, it is expressed as physiologically active substance X as necessary.
  • the physiologically active substance X includes a physiologically active substance capable of regulating the expression or function of a target protein Y described later or a gene encoding the target protein Y, for example, And physiologically active substances having binding ability.
  • bioactive substance X is a fibendazo / re, resenorepin, imipenem, cephalexin or acralevine, or a derivative thereof (see below) or a salt thereof capable of binding to target protein Y. possible.
  • physiologically active substances are broadly classified into substances that can regulate actions related to physiologically active substance X and substances that can regulate functions related to target protein Y from the viewpoint of the types of activities that can be regulated. You can also.
  • the target protein and target gene for bioactive substance development may be preferably a target protein and target gene for drug discovery.
  • a predetermined target protein and a predetermined target gene are intended, they are expressed as target protein Y and target gene ⁇ as necessary.
  • Protein is synonymous with translation product, and target gene ⁇ is synonymous with gene encoding target protein ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and they are used interchangeably.
  • the target protein ⁇ can be a target protein of the physiologically active substance X.
  • the target protein ⁇ can be a protein derived from FL J 10368, FL J 1 2389, FLJ1 2435, FLJ12502, FLJ12525, FLJ14583 or FLJ3 1146.
  • the FLJ XXXXX-derived protein can be a human protein having a predetermined FLJ number or a corresponding GenBank accession number, H-Inv cDNA ID or H-Inv locus ID.
  • a protein consists of the amino acid sequence registered in FL J XXXX or the corresponding GenBank accession number, H-Inv cDNA ID or H-Inv locus ID (see Table 1 for example). It can be a protein or a protein containing the amino acid sequence (eg, full-length protein).
  • the target protein of the present invention is not limited to the above-mentioned human protein, and includes orthologs derived from heterologous animals (eg, mouse, rat, inu, monkey, etc.).
  • the FL J number can be searched on the FLJ-DB homepage, for example.
  • human proteins are taken for each protein, and various information and examples of bioactive substances that are found by the present inventors are shown in Table 1. Show each one.
  • mutant protein of FLJ XXXXX-derived protein having physiological activity hereinafter, abbreviated as a mutant protein, if necessary.
  • FLJ XX XXX-derived protein or a mutant protein having physiological activity thereof. Is simply abbreviated as FLJ XXXXX-derived protein if necessary).
  • the mutant protein is not particularly limited as long as it is a protein having a physiological activity that can be regulated by interaction with a physiologically active substance.
  • an artificial mutant or a natural mutant for example, splicing variant, SNP, haplotype, etc. Protein having a polymorphism).
  • such a mutein is an amino acid sequence encoded by a protein derived from FLJ 10368, FLJ 1 238 9, FL J 1 2435, FLJ 1 2502, FLJ 1 25 14, FLJ 1458 3 or FLJ 3 1 146.
  • It may be a protein having a physiological activity that consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added or inserted and can be regulated by interaction with a physiologically active substance.
  • the number of amino acids to be substituted, deleted, added or inserted is not limited as long as the function is maintained, for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 20 Even more preferred is about 1-10, most preferred 1-5 or 1 or 2.
  • the site to which amino acid substitution, deletion, addition or insertion is performed is not limited as long as the function is maintained, but may be a site other than a functionally important domain, for example.
  • the mutant protein may also be an amino acid sequence encoded by a protein derived from FLJ 1 0368, FL J 1 2 389, FLJ 1 24 35, FLJ 1 2502, FLJ 1 25 14, FL J 14583 or FL J 3 1 146, for example % Or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90 ° / 0 or more, and most preferably about 95% or more of homology (respected, 100% phase).
  • a protein having a physiological activity that can be regulated by interaction with a physiologically active substance.
  • the numerical value of the homology is calculated by executing a command of the maximum matching method, for example, using DNAS IS (Hitachi Software Engineering) which is sequence analysis software.
  • the parameter 1 at that time is the default setting (initial setting).
  • the protein is labeled but not labeled.
  • a label may be used, and a mixture containing a labeled protein and an unlabeled protein in a predetermined ratio can also be used.
  • the labeling substance for example, FITC, a fluorescent substance FAM like, Noreminoru, luciferin, luminescent substances such as lucigenin, 3 H, 14 C, 3 2 P, 35 S, 1 23 radioisotopes such as I, Biochin, Examples include affinity substances such as streptavidin.
  • the target gene of the present invention is not limited as long as it encodes the target protein of the present invention.
  • the target gene of the present invention may correspond to a protein containing the amino acid sequence.
  • the protein containing the amino acid sequence may correspond to a cDNA clone having a nucleotide sequence corresponding to the FL J nucleotide sequence accession number shown in Table 1.
  • H-InvDB H-1 nvitational Database
  • cD dish clones sharing gene regions on the human genome are classified as clusters, and each of the cDNA clones corresponding to the protein of the present invention is shown in Table 1.
  • the target gene of the present invention is the gene corresponding to the cDNA of FLJ nucleotide sequence accession number shown in Table 1, the H-InvDB H-Inv cDNA ID cDNA cluster, or the H-Inv oral single ID. It can be a mutated gene.
  • the target gene of the present invention comprises a nucleotide sequence that is hybridized under stringent conditions to a sequence complementary to the nucleotide sequence corresponding to the FLJ nucleotide sequence accession number shown in Table 1, and a physiologically active substance. It may be a gene corresponding to a protein that interacts with.
  • hybridization under stringent conditions means, for example, that after warming in a solution of 6 XSSC, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C, 0.1 XSSC, This means that a positive hybridization signal is still observed even when washed at 68 ° C in a solution of 0.5% SDS.
  • the target protein and target gene of the present invention are diseases or conditions related to physiologically active substance X, or diseases related to target gene Y (or target protein Y) Alternatively, it can be used for the development of a medicine for a condition or condition, or the development of a research reagent for the disease or condition.
  • the disease or condition related to bioactive substance X and the disease or condition related to target gene Y are described in detail below.
  • Disease or condition related to bioactive substance X refers to a disease to which bioactive substance X is applied or a disease corresponding to a side effect of bioactive substance X, or a condition in which application of bioactive substance X is desired (for example, Or a state corresponding to an undesirable state caused by physiologically active substance X (for example, an undesirable state caused by excessive intake of physiologically active substance X). Diseases or conditions associated with bioactive substance X can be ameliorated or exacerbated by bioactive substance X. .
  • the action related to bioactive substance X means the same kind of action or the opposite action of the action (including pharmacological action and side effects) actually shown by bioactive substance X.
  • the action relating to the physiologically active substance X is an action that can cause improvement or exacerbation of the “disease or condition associated with the physiologically active substance X”. That is, “the action relating to the physiologically active substance X” indicates a blood pressure lowering action or a blood pressure raising action when the physiologically active substance X is reserpine.
  • “Disease or condition related to bioactive substance X” and “operation related to bioactive substance X” vary depending on the type of bioactive substance X. In the following, typical substances as bioactive substance X will be taken up and “diseases or conditions related to bioactive substance X” will be explained. In addition, since “an action related to bioactive substance X” is any action that can cause improvement or exacerbation of “disease or condition related to bioactive substance X”, “the disease related to bioactive substance X” The explanation of "or state” will naturally clarify "the action related to bioactive substance X”.
  • the disease associated with thiabendazole means a disease to which thiabendazole is applied or a disease corresponding to the side effect of thiabendazole.
  • Thiabendazole is Known as an anthelmintic agent. Examples of diseases to which thiabendazole is applied include parasitic diseases caused by fecal nematodes.
  • side effects of thiabendazole include confusion, hallucinations, abnormal excitement, seizure, severe diarrhea, shock, blisters on the skin, exfoliation, severe itching and rash, chills, chills, fever, muscle pain, joint pain, abnormal fatigue , Weakness, stuffy, yellowish, brown urine, hematuria, back and back pain, yellow skin and eyes, stool is whitish, dizziness, lightheadedness, tinnitus, head sensation, dry eyes and mouth, decreased appetite, etc. Is done.
  • the action associated with thiabendazole may be closely related to its target protein (target gene), for example, a protein derived from FLJ 1 0 3 6 8, FLJ 1 2 3 8 9 or FLJ 1 2 5 1 4.
  • the disease related to reserpine means a disease to which reserpine is applied or a disease corresponding to a side effect of reserpine.
  • Reserpine is known as a therapeutic agent for hypertension, a therapeutic agent for psychiatric neurology, and the like.
  • reserpine targets examples include hypertension (essential), hypertension (renal), malignant hypertension (used in combination with other antihypertensive agents), schizophrenia that is difficult to use phenothiazine drugs
  • side effects of reserpine include depression, nightmares, drowsiness, decreased libido, hypersensitivity, dizziness, headache, general tremor, extrapyramidal symptoms, rash, bradycardia, edema, gastric ulcer, rheumatoid, diarrhea, Examples include anorexia, nausea / vomiting, loose stool, nasal congestion, malaise, dyspnea, and weight gain.
  • Synaptic vesicle amin transporters and actin are known as reserpine targets.
  • the action associated with reserpine may be closely related to its target protein (target gene), for example, a protein derived from FLJ10 03 8.
  • the disease related to imipenem means a disease to which imipenem is applied or a disease corresponding to the side effect of imipenem.
  • Imipenem is known as a powerful rubapenem antibiotic preparation.
  • Applicable species of imipenem include genus pneumococcus, streptococcus, pneumococci, enterococci, Escherichia coli, citrobacter, klebsiella, enteropacter, serratia, proteus, Mole Examples include Ganella 'morgany, Providencia, Haemophilus influenzae, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia' Sepacia, Acinetopacter, Peptostreptococcus, Pacteroides, Prevotella.
  • Diseases to which imipenem is applied include sepsis, infective endocarditis, trauma, secondary infection such as burns and surgical wounds, osteomyelitis, arthritis, acute bronchitis, pneumonia, lung abscess, empyema, chronic Secondary infection of respiratory lesions, cystitis, pyelonephritis, prostatitis (acute, chronic), peritonitis, cholecystitis, cholangitis, liver abscess, bartholinitis, intrauterine infection, uterine adnexitis, uterine fistula Examples include connective inflammation, keratitis (including corneal ulcer), and endophthalmitis (including ocularitis).
  • side effects of imipenem include convulsions, respiratory arrest, consciousness disturbance, loss of consciousness, respiratory depression, confusion, restlessness, shock, anaphylaxis-like symptoms, mucocutaneous ocular syndrome (Stevens-Johnson syndrome), toxic epidermal necrosis Fulminant hepatitis, hepatitis, liver failure, jaundice, asthma attack and induction, fever, cough, dyspnea, chest X-ray abnormalities, interstitial pneumonia with increased eosinophils, PIE syndrome, pancytopenia Disease, myelosuppression, agranulocytosis, hemolytic anemia, acute renal failure, diabetes insipidus, pseudomembranous colitis, thrombophlebitis, rash, pruritus, fever, urticaria, flushing, erythema, granulocytopenia Eosinophilia, basophilia, lymphocyte proliferation, thrombocytopenia and hypertrophy, erythrocyte depletion
  • imipenem targets penicillin-binding protein (PBP s) 2 and sodium-dependent dopamine transporter are known.
  • PBP s penicillin-binding protein
  • the action associated with imipenem may be closely related to its target protein (target gene), for example, a protein derived from FLJ 1 2 4 3 5 or FLJ 1 4 5 8 3.
  • Cephalexin A cephalexin-related disease means a disease to which cephalexin is applied or a disease corresponding to a side effect of cephalexin.
  • Cephalexin is known as a long-acting oral cephem antibiotic preparation.
  • cephalexin-adapted strains include cephalexin-sensitive staphylococci, streptococci, pneumococci, Escherichia coli, Klebsiella, and Proteus mirabilis.
  • cephalexin The diseases to which cephalexin is applied include superficial skin infections, deep skin infections, lymphatic vessels, lymphadenitis, chronic pyoderma, trauma, secondary infections such as burns and surgical wounds, and mastitis Pharynx, laryngitis, tonsillitis (including peritonsitis), acute bronchitis, pneumonia, secondary infection of chronic respiratory lesions, cystitis, pyelonephritis, prostatitis (acute, chronic), Bartholin gland Examples include inflammation, lacrimal cystitis, stye, otitis externa, otitis media, sinusitis, periodontitis, periodontitis, jaw inflammation, tooth extraction wound and secondary surgical wound infection.
  • cephalexin the side effects of cephalexin include shock, anaphylactoid symptoms, acute renal failure, hemolytic anemia, pseudomembranous colitis, mucocutaneous ocular syndrome (Stevens-Johnson syndrome), toxic epidermoid leukemia (Ly ell syndrome) ), Interstitial pneumonia, PIE syndrome, rash, hives, erythema, pruritus, fever, lymphadenopathy, joint pain, granulocytopenia, eosinophilia, thrombocytopenia, jaundice, AST (GOT) Increase, ALT (GPT) increase, A1-P increase, nausea, vomiting, diarrhea, loose stool, abdominal pain, loss of appetite, stomach discomfort, stomatitis, candidiasis, vitamin K deficiency symptoms (hypoprothrombinemia, bleeding tendency, etc.) ), Vitamin B group deficiency symptoms (glossitis, stomatitis, anorexia, neuritis, etc.), headache, di
  • the organic anion transporter 1 As a target for cephalexin, the organic anion transporter 1 is known.
  • the action related to cephalexin may be closely related to its target protein (target gene), for example, a protein derived from FLJ 1 2 5 0 2, FLJ 1 4 5 8 3 or FLJ 3 1 1 4 6.
  • the disease related to aclarubicin means a disease to which aclarubicin is applied or a disease corresponding to the side effect of aclarubicin.
  • Aclarubicin is known as an antitumor antibiotic.
  • Diseases to which aclarubicin is applied include gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, malignant lymphoma, and acute leukemia subjective and objective Examples include remission and improvement of symptoms.
  • aclarubicin side effects include myocardial injury, heart failure, bone marrow suppression, pancytopenia, anemia, leukopenia, thrombocytopenia, bleeding, electrocardiogram abnormality, tachycardia, arrhythmia, anorexia, nausea, vomiting, stomatitis, diarrhea; Gastrointestinal bleeding, abdominal pain, AST (GOT) increase, ALT (GPT) increase, Al-P increase, proteinuria, hematuria, cystitis, micturition pain, urinary frequency, residual urine sensation, rash, hair loss, pigmentation, whole body Examples include fatigue, headache, headache, phlebitis, fever, phlebitis, flushing of the face.
  • target protein target protein
  • target gene for example, a protein derived from FLJ 1 2 5 1 4.
  • Disease or condition related to target gene Y means a change in the function of target gene Y or a gene (downstream gene) positioned downstream of target gene ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in a signal transduction system involving target gene ((for example, A change in function associated with a mutation (eg, polymorphism), or a disease or condition that can be caused by a change in expression level. Changes in the function of the target gene ⁇ or its downstream gene can be brought about by, for example, mutations (eg, polymorphisms) of the gene. Examples of the mutation include a mutation that promotes or suppresses its function in the coding region, and a mutation that promotes or suppresses its expression in the non-coding region. The change in the expression level includes an increase or decrease in the expression level.
  • the disease or condition associated with the target gene ⁇ can be ameliorated or exacerbated by the target protein ⁇ .
  • “Function related to target protein ⁇ (target gene ⁇ )” means a function of the same kind as the target protein ⁇ or a function opposite to that actually shown.
  • the function associated with the target protein ⁇ is a function that can cause improvement or exacerbation of the “disease or condition associated with the target protein ⁇ ”. That is, “function related to target protein ⁇ ”indicates a function or the like that promotes or suppresses immune response when target protein ⁇ is a factor that promotes immune reaction or the like.
  • Target protein ⁇ is a disease or condition related to ⁇ In view of the fact that they are considered to have various physiological functions, various diseases or conditions are envisaged.
  • An example of a disease or condition associated with target protein Y is a disease or condition associated with the functions shown in Table 2.
  • a disease or condition associated with target protein Y is a disease or condition inferred from an annotation of target protein Y, target gene ⁇ ⁇ .
  • a person skilled in the art identifies a homologous protein or gene by homology search, and then examines the function of the protein or gene or the disease or condition in which the protein or gene is involved by a known method, so that such a disease or condition is detected. Can be analogized.
  • a human protein or gene sequence representative of the target protein or gene of the physiologically active substance is used as a query sequence. The results of annotating with this method are shown below.
  • the calculation program uses blastall 2. 2. 6 and the target DB is swiss-prot: 146720 (Mar. 29, 2004), (Refseq) hs: 21170 (May 06, 2004), (Refseq) mouse: 1 7089 (May 06, 2004), (Refseq) rat: 4893 (May 06, 2004) was used.
  • the cutoff value was set to 1.00E-05. In addition, the following data was filtered.
  • CoA 1 (acyl activating enzyme 1)
  • IFAP300 fragments
  • cytoskeleton cytoskeleton
  • phosphorylation Df
  • NP_666243 1 'B-cell leukemia transcription factor interaction tongue', 'protein 1 [ma
  • Condition 1 Use 1E-50 or less
  • Table 4 shows annotation information obtained by this analysis method.
  • the calculation program used was blastall 2.2.6 and nr: 1552011 (July 16, 2004) was used as the target DB.
  • the cutoff value was 1.00E-05.
  • the following data was filtered.
  • the calculation program uses blastall 2. 2. 6 and the target DB is swiss-prot: 146720 (March 29, 2004), (Refseq) hs: 21170 (May 06, 2004), (Refseq) mouse: 17 089 (May 06, 2004), (Refseq) rat: 4893 (May 06, 2004) was used.
  • the cutoff value was set to 1.00E-05. In addition, the following data was filtered.
  • Tier 1 P0T1-like theta terminal binding protein ',' Q 3 ⁇ 4 Nuclear protein; Telomere.
  • NP_666243 1
  • 1 1
  • a possible disease or condition is a disease or condition registered with OM IM.
  • Such a disease or condition can be easily searched by inputting an H-Inv ID number or an H-Inv cluster ID number in H-Inv DB, for example.
  • H-Inv ID number or an H-Inv cluster ID number in H-Inv DB, for example.
  • H-Inv ID number an H-Inv cluster ID number in H-Inv DB
  • HFM gene of cDNA full length O I 270100 Visceral inversion
  • O IM300290 Delayed growth in eclampsia, metaphyseal dysplasia, congenital accessory dysplasia, and genital malformation
  • Another example of a possible disease or condition is a disease or condition with an abnormality in the target gene Y expression site or in the tissue from which the library from which the target gene Y was isolated is derived.
  • the expression site and the tissue can be easily searched by inputting, for example, H-I nvc DNAID number or H-I nv locus ID number in H-I nv DB.
  • An analogy can also be made about the disease or condition.
  • the expression sites of some target genes Y are as follows.
  • Proteins derived from FLJ 1 0 3 6 8 are cerebrum, cerebellum, corpus callosum, glia, retina, spleen, thymus, uterus, placenta, testis, heart, muscle, colon, small intestine, liver, lung, kidney, mammary gland, pituitary gland, It can be expressed in the thyroid and the like.
  • the protein derived from FLJ1 2 3 8 9 can be expressed in brain stem, cerebellum, blood, esophagus, skin, ovary, prostate, testis, heart, muscle, colon, stomach, liver, lung, adrenal gland, mammary gland, salivary gland and the like.
  • FLJ 1 2 4 3 5 derived proteins are brainstem, cerebrum, cerebellum, corpus callosum, glia, retina, spinal cord, lymph node, spleen, thymus, esophagus, skin, uterus, ovary, placenta, prostate, testis, muscle, stomach, It can be expressed in the bladder, adrenal gland, pituitary gland, thyroid gland, etc.
  • Protein derived from FLJ 1 2 5 0 2 is brain stem, cerebellum, lymph node, blood, spleen, prostate, testis, heart, muscle, colon, stomach, liver, lung, kidney, adrenal gland, spleen, pituitary, etc. It can be expressed.
  • Proteins derived from FLJ 1 2 5 1 4 are brain stem, corpus callosum, glia, retina, lymph node, spleen, thymus, skin, placenta, prostate, testis, muscle, colon, small intestine, liver, adrenal gland, thyroid gland, etc. It can be expressed.
  • FLJ 1 4 5 8 3 derived protein is brainstem, cerebrum, cerebellum, corpus callosum, glia, spinal cord, bone marrow, bone, skin, ovary, placenta, prostate, testis, heart, muscle, small intestine, liver, lung, mammary gland, It can be expressed in the knee, pituitary gland, salivary gland.
  • the protein derived from FLJ 3 1 1 4 6 can be expressed in brain stem, cerebrum, eye, spleen, thymus, bone, skin, uterus, placenta, prostate, testis, muscle, colon, lung, adrenal gland, mammary gland and the like.
  • a possible disease or condition is a disease or condition involving a target gene Y or a gene homologous to a downstream gene.
  • a person skilled in the art can infer such a disease or condition by identifying a homologous gene by homology search and then examining the disease or condition involving the homologous gene by a known method.
  • the target protein and target gene of the present invention are useful for, for example, development of a drug for a predetermined disease or condition, or development of a research reagent for the disease or condition.
  • the present invention regulates the expression or function of a target protein of a physiologically active substance or a gene encoding the same (hereinafter sometimes abbreviated as “target protein Y” or “target gene ⁇ ” as necessary).
  • the present invention provides a method for screening a physiologically active substance, including evaluating whether or not it can be performed, and a product thereof.
  • the screening method of the present invention screens a substance capable of regulating an action related to physiologically active substance X and a substance capable of regulating a function related to target protein ⁇ ⁇ from the viewpoint of the type of physiologically active substance to be screened. It can be roughly divided into methods.
  • the screening method of the present invention can also be performed in vitro, in vivo or in silico.
  • the substance capable of regulating the expression of target protein ⁇ obtained by the screening method of the present invention is synonymous with the substance capable of regulating the amount of target protein ⁇ , and the abundance of target protein ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in a given tissue or cell Alternatively, it may be a substance that can change the abundance of the target protein ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ at a predetermined intracellular position. Therefore, examples of substances that can regulate the expression of target protein ⁇ ⁇ ⁇ include not only substances that can regulate biosynthesis of target protein ⁇ from target gene ⁇ , but also the intracellular localization of target protein ⁇ . Also included are substances that can modulate the pharmacokinetics of the target protein ⁇ , and substances that can regulate the metabolism of the target protein ⁇ (eg, synthesis and degradation by metabolism).
  • the present invention provides a screening method for a substance capable of regulating an action associated with physiologically active substance X, comprising evaluating whether a test substance can regulate the expression or function of target protein Y.
  • Screening method I comprises evaluating whether the test substance can modulate the expression or function of target protein Y, and selecting a test substance that can modulate the expression or function of target protein Y.
  • the screening method for substances that can regulate the action related to X (screening method Ia ), and whether or not the test substance can regulate the expression or function of target protein Y.
  • screening method for substances that can regulate the action related to bioactive substance X (in particular, the action related to known target molecule), including selecting test substances that cannot regulate function ( It can be roughly divided into screening methods j b ).
  • Screening method Ia may be useful for the development of regulators of diseases or conditions associated with bioactive substance X.
  • screening method Ib can be useful for the development of a drug having the ability to regulate the action related to a known target molecule and having reduced side effects exhibited by bioactive substance X.
  • Screening method I a which includes selecting a test substance that can regulate the expression or function of target protein Y, and that can regulate the action related to bioactive substance X )
  • the present invention assesses whether or not a test substance can regulate the expression or function of target protein Y, and selects a test substance that can regulate the expression or function of target protein Y. Provide a method of screening for substances that can modulate the associated action.
  • the test substance to be used for the screening method may be any known compound or novel compound, for example, using nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, combinatorial chemistry technique.
  • the prepared compound line For example, a random peptide library prepared by a library, a solid phase synthesis or a phage display method, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • the test substance may be labeled or unlabeled, and a mixture containing a labeled body and an unlabeled body in a predetermined ratio can also be used as the test substance.
  • the labeling substance is the same as described above.
  • the screening method Ia includes the following steps (a), (b) and (c): '
  • Methodology including the steps (a) to (c) above is abbreviated as “Methodology I” as necessary.
  • step (a) of methodology I the test substance is brought into contact with target protein Y.
  • Contact of the test substance with the protein can be performed by contact between the isolated target protein Y and the test substance in a solution, or contact between a test substance and a cell or tissue capable of expressing the target protein Y. .
  • Target protein Y can be prepared by a method known per se.
  • the target protein Y can be isolated and purified from the expression tissue described above.
  • the recombinant protein may be prepared in either a cell system or a cell-free system.
  • Cells capable of expressing target protein Y are not particularly limited as long as they express target protein Y.
  • the cell can be easily identified or prepared by a person skilled in the art, and is derived from a primary cultured cell or the primary cultured cell.
  • Cell lines, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, etc. can be used.
  • tissue capable of expressing the target protein Y the above-described expression tissue can be used.
  • step (b) of methodology I the functional level of the protein in the presence of the test substance is measured.
  • the measurement of the functional level can be performed by a method known per se depending on the type of protein. For example, when the target protein Y is a transcription factor, a reporter assembly is performed using the target protein Y and a transcriptional regulatory region to which the target protein Y binds, thereby screening a substance that regulates the function related to the target protein Y. Jung can.
  • the functional level can be measured based on a change in the catalytic activity of the enzyme.
  • the catalytic activity of the enzyme can be measured by a method known per se by appropriately selecting a substrate, a capture enzyme, etc. according to the type of enzyme.
  • the target protein Y is a membrane protein (for example, a receptor or a transporter)
  • the functional level can be measured based on the change in the function of the membrane protein.
  • the target protein Y when the target protein Y is a receptor, intracellular events mediated by the receptor (for example, inositol phospholipid production, cell ⁇ pH fluctuation, intracellular ion of ions such as calcium ions and chloride ions)
  • the screening method of the present invention can be performed.
  • the target protein Y is a transporter
  • the screening method of the present invention can be performed based on changes in the intracellular concentration of the substrate of the transporter. .
  • the functional level is not measured based on the total functional level of target protein Y, but on the functional level of individual protein isoforms (eg, splicing variants) or the functional level ratio between isoforms. Measurements may be based on this.
  • the functional level of target protein Y in the presence of the test substance is then compared with the functional level of target protein Y in the absence of the test substance.
  • the functional level comparison is preferably based on the presence or absence of a significant difference.
  • the functional level of target protein Y in the absence of the test substance is determined by the target protein Y in the presence of the test substance.
  • the functional level of protein Y it may be the functional level measured in advance or the functional level measured at the same time, but the functional level measured at the same time from the viewpoint of experimental accuracy and reproducibility. Preferably there is.
  • test substance that changes the functional level of the protein is selected.
  • a test substance that causes a change in the protein can promote or suppress the function of the target protein.
  • the test substance thus selected can be useful for the regulation of a disease or condition associated with bioactive substance X.
  • Methodology I may be performed in the presence of the coupling factor in addition to the target protein ⁇ .
  • a substance that interferes with the interaction between target protein ⁇ and its conjugate factor may promote the function of target protein ⁇ .
  • the activator of target protein ⁇ is used in combination with the target protein ⁇ ⁇ as a conjugating factor
  • a substance that interferes with the interaction between target protein ⁇ ⁇ and its conjugate factor can suppress the function of target protein ⁇ . It is done. It is also beneficial to perform Methodology I in the presence of the target protein ⁇ ⁇ coupling factor.
  • screening method Ia comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • Methodology I I The methodology including the steps (a) to (c) above is abbreviated as “Methodology I I” as necessary.
  • step (a) of methodology II the test substance is brought into contact with cells capable of measuring the expression of target protein Y.
  • cells capable of measuring target protein Y expression The contact of the test substance can be performed in the culture medium.
  • a cell that can measure the expression of target protein Y or the gene that encodes it (abbreviated as“ target gene Y ”if necessary)” means a target gene ⁇ ⁇ ⁇ product, such as a transcript or translation product ( That is, it refers to a cell that can directly or indirectly evaluate the expression level of protein.
  • Cells that can directly evaluate the expression level of the target gene ⁇ product can be cells that can naturally express the target gene ⁇ , while the expression level of the target gene ⁇ product can be indirectly evaluated.
  • the cells may be those that allow reporter assembly for the target gene ⁇ transcriptional regulatory region.
  • Cells that can naturally express the target gene ⁇ are not particularly limited as long as they can potentially express the target gene ⁇ , cells that constantly express the target gene ⁇ , and conditions under which the target gene ⁇ is induced It may be a cell that is expressed by (for example, treatment with a drug). Such cells can be easily identified by those skilled in the art, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
  • a cell that enables reporter assembly for a target gene ⁇ transcriptional regulatory region is a cell that includes a target gene ⁇ transcriptional regulatory region and a reporter gene operably linked to the region.
  • the target gene ⁇ transcriptional regulatory region and the reporter gene are inserted into the expression vector.
  • the target gene ⁇ transcriptional regulatory region is not particularly limited as long as it can control the expression of the target gene ⁇ .
  • the reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or enzyme, for example, GFP (green fluorescent protein) gene, GUS (] 3-Dalcronidase) gene, LUS (luciferase) gene, CAT (chloramphenicol lucetyltransferase). ) Genes are listed.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ] 3-Dalcronidase
  • LUS luciferase
  • CAT chloramphenicol lucetyltransferase.
  • the target gene Y transcriptional regulatory region and the cell into which the reporter gene operably linked to the region is introduced can be analyzed as long as the target gene and transcriptional regulatory function can be evaluated. There is no particular limitation as long as it is possible. However, since it is considered appropriate to express a physiological transcriptional regulatory factor for the target gene ⁇ and to evaluate the expression regulation of the target gene ⁇ , the target gene ⁇ is naturally Cells that can be expressed in are preferred.
  • the culture medium in which the test substance and cells capable of measuring the expression of the target gene ⁇ are appropriately selected according to the type of cells used. For example, about 5 to 20% of fetal bovine serum A minimal essential medium ( ⁇ ⁇ ⁇ ), Dulbecco's modified minimal essential medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, and the like.
  • the culture conditions are also appropriately determined depending on the type of cells used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, and the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C. Yes, the incubation time is about 12 to about 72 hours.
  • step (b) of I first, the expression level of the target gene Y in the cell contacted with the test substance is measured.
  • the expression level can be measured by a method known per se in consideration of the type of cells used.
  • the expression level is targeted for the target gene Y product, for example, a transcription product or a translation product. It can be measured by a method known per se.
  • the expression level of the transcription product can be measured by preparing total RNA from the cells and then using RT-PCR, Northern plotting, or the like.
  • the expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and immunologically.
  • an immunological method a radioisotope immunoassay (RIA method), an ELISA method (Methods in Enzyraol. 70: 419-439 (1980)), a fluorescent antibody method, etc. can be used.
  • the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter. .
  • the expression level is not measured based on the total expression level of the target gene Y, but is expressed for each individual isoform (eg, splicing variant) of the target gene Y or expression between the isoforms. You may measure based on ratio.
  • the target gene Y is a gene of a factor localized in the cell
  • the expression level can also be measured based on the intracellular localization. The amount of target protein Y localized in a given intracellular organ can be measured by a method known per se.
  • a target gene ⁇ fused with a gene encoding a fluorescent protein such as a GFP gene is introduced into an appropriate cell and cultured in a culture medium in the presence of a test substance.
  • the fluorescence signal in a predetermined intracellular organ may be observed with a confocal microscope and compared with the fluorescence signal in the organ in the absence of the test substance.
  • the amount of target protein Y localized in a predetermined intracellular organ can also be measured by immunostaining using an antibody against target protein Y.
  • the expression level of the target gene Y in the cells contacted with the test substance is compared with the expression level of the target gene Y in the control cells not contacted with the test substance.
  • the comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of the target gene Y in the control cells that are not contacted with the test substance is the same as the expression level of the target gene Y in the cells contacted with the test substance.
  • the measured expression level may be used, the expression level measured at the same time is preferable from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • step (c) of I a test substance that regulates the expression level of target gene Y is selected.
  • the regulation of the expression level of the target gene Y can be promotion or suppression of the expression level.
  • the test substance thus selected can be useful for regulating the action relating to bioactive substance X.
  • screening method Ia comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • Methodology including steps (a) to (c) above is abbreviated as “methodology I I I” as necessary.
  • step (a) the test substance is placed in contact with target protein Y.
  • Contact of the test substance with the protein can be performed by mixing the test substance and the protein in a solution.
  • Target protein Y can be prepared by a method known per se.
  • the target protein Y can be isolated and purified from the target gene Y-expressing tissue described above.
  • the recombinant protein may be prepared in either a cell system or a cell-free system.
  • step (b) of I I the ability of the test substance to bind to the protein is measured.
  • the “binding ability” to be measured is not particularly limited as long as the binding between the protein and the test substance can be evaluated, but the binding amount, binding strength (including parameters such as affinity constant, binding rate constant, dissociation rate constant) And binding modes (including concentration-dependent binding).
  • the binding capacity can be measured, for example, by the SEC / MS (size exclusion chromatography mass spectrometry) method (see Moy, FJ et al,, Anal. Chem., 2001, 73, 57 1-581).
  • SEC / MS size exclusion chromatography mass spectrometry
  • the S ECZMS method is superior in that it can analyze the binding ability of both proteins and test substances in an unmodified and non-fixed state.
  • Biacore measures the binding and dissociation of the test substance to the protein in the protein immobilized on the chip, and compares it with the case where a solution not containing the test substance is loaded on the chip. Then, based on the results regarding the rate of binding and release or the amount of binding, a test substance capable of binding to the protein is selected. Biacore can measure not only the binding ability of the test substance to the protein but also the binding strength (for example, Kd value).
  • QCM Quartz Crystal Microbalance
  • DPJJ Dual Polarisati on Interferometer
  • SPR or optical techniques
  • immunoprecipitation isothermal titration and differential scanning force lipmetry
  • capillary electrophoresis energy transfer
  • fluorescence correlation analysis and other X-ray crystal structure analysis
  • nuclear magnetic analysis examples include structural analysis methods such as Resonance (NMR).
  • the target protein Y-binding substance can also be used as a control.
  • target protein Y-binding substance is a compound that can directly interact with target protein Y or its mutant protein, and can be, for example, a protein, a nucleic acid, a carbohydrate, a lipid, or a low molecular weight organic compound.
  • the target protein Y-binding substance is thiabendazole, reserpine, imipenem, cephalexin, or ararubicin, or a derivative thereof (which is determined according to the type of bioactive substance X). Or a salt thereof.
  • the salt is not particularly limited, but a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • an inorganic base for example, an alkali metal such as sodium or potassium; an alkaline earth metal such as calcium or magnesium; aluminum or ammonium
  • an organic base for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, jetanolamine, triethanolamine, dioxyhexamine, N, N-dibenzylethylenediamine, inorganic acids (eg, hydrochloric acid, odor) Hydrofluoric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid), organic acids (for example, formic acid, acetic acid, trifluoro.
  • an inorganic base for example, an alkali metal such as sodium or potassium; an alkaline earth metal such as calcium or magnesium; aluminum or ammonium
  • an organic base for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, jetanolamine, triethanolamine,
  • Oral acetic acid fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid , Benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid), salts with basic amino acids (eg, arginine, lysine, ornithine) or acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid).
  • basic amino acids eg, arginine, lysine, ornithine
  • acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • the binding ability is not measured based on the total binding ability of the target protein Y, but is the ability of the target protein Y to bind to individual isoforms (for example, splicing variants) or between the isoforms. May be measured based on the ratio.
  • the binding ability can also be measured in silico.
  • the binding ability can be measured based on SBDD (Structure-Based Drug Design: SBDD) or CADD (Computer-Aided Drug Design).
  • SBDD Structure-Based Drug Design
  • CADD Computer-Aided Drug Design
  • Examples of such screening include Birchanore screening, de novo design, pharmacophore analysis, and QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship).
  • the 3D structure is revealed by structural analysis methods such as NMR, X-ray crystallography, and synchrotron radiation analysis. If the three-dimensional structure is not known, the information obtained by the structure prediction method such as the homology method or the threading method is used.
  • a program known per se can be used. Examples of such a program include Dock (Kuntz, ID et al., Science, 1992, 257, 1078), Gold (Jones, G. et al., J. Mol. Biol., 1995, 245, 43), F 1 ex X (Rarey, M. et al., J. Mol. Biol., 1996, 261, 470), A uto D ock (Morris, GM et al., J. Comput. Chem., 1998, 19, 1639), ICM (Abagyan, RA et al., J. Coraput. Chem., 1994, 15, 488).
  • test substance capable of binding to target protein Y is selected.
  • a test substance capable of binding to the protein can promote or suppress the function of the target protein ⁇ .
  • the test substance thus selected can be useful for modulating a disease or condition associated with bioactive substance X.
  • screening method Ia comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • Methodology IV The methodology including the steps (a) to (c) above is abbreviated as “Methodology IV” as necessary.
  • step (a) of V both the test substance and target protein Y-binding substance are placed under contact with target protein Y.
  • Contact of the test substance, target protein Y-binding substance to the protein can be performed by mixing the test substance, target protein Y-binding substance, and the protein in a solution. Further, the order in which the test substance and the target protein Y-binding substance are brought into contact with the protein is not particularly limited, and either of them may be brought into contact with the protein first or simultaneously.
  • Target protein Y can be prepared by a method known per se. For example, the protein can be prepared by the methods described above in Methodology II.
  • the target protein Y-binding substance may be labeled or unlabeled.
  • a mixture containing a labeled body and an unlabeled body in a predetermined ratio can also be used as the target protein Y-binding substance.
  • the labeling substance is as described above.
  • step (b) of methodology IV first, the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein is measured in the presence of the test substance.
  • the “binding ability” to be measured is not particularly limited as long as the binding between the protein and the test substance can be evaluated. However, parameters such as binding amount, binding strength (affinity constant, binding rate constant, dissociation rate constant, etc.) can be used. Meter) and binding mode (including concentration-dependent binding).
  • the binding ability can be measured using, for example, a labeled target protein Y-binding substance.
  • the target protein Y-binding substance bound to the protein and the unbound target protein ⁇ -binding substance may be separated before measuring the binding ability. More specifically, the measurement of binding ability can be performed in the same way as methodology I I I.
  • the binding ability is not measured based on the total binding amount of target protein Y, but is based on the binding ability of individual target protein Y to individual isoforms (for example, splicing variants) or the binding ability ratio between isoforms. You may measure based on.
  • the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein in the presence of the test substance is compared with the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein in the absence of the test substance.
  • the comparison of the binding ability is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein in the absence of the test substance was measured in advance for the measurement of the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein in the presence of the test substance.
  • the binding ability may be either the binding ability or the binding ability measured at the same time, but the binding ability is preferably measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • step (c) of methodology IV a test substance that causes a change in the binding ability of the target protein Y-binding substance to the protein is selected.
  • the change in binding ability can be, for example, a decrease or increase in binding ability, but a reduction in binding ability is preferred.
  • the test substance selected in this way may be useful for regulating the action relating to bioactive substance X.
  • Screening method Ia consists of (d) (i) a step (confirmation step) for confirming that the test substance can modulate, for example, promote or inhibit the action related to bioactive substance X, or (ii) It further includes a step of identifying the type of action it has (identification step) Can be removed.
  • the confirmation step or identification step can be carried out, for example, by administering a test substance to a normal animal or to an animal or model animal having a “disease or condition associated with bioactive substance X”. Alternatively, these steps can also be performed by bringing a test substance into contact with cells and evaluating changes in the phenotype of the cells after contact.
  • the type of “effect related to physiologically active substance X” possessed by the selected test substance can be determined, and the selected test substance is either a drug or a research reagent, or its Whether or not both can be used, and the kind of medicine or research reagent that can be used by the test substance can be confirmed.
  • the screening method I a also as possible out also be carried out by the administration of the test substance to the animal.
  • the expression level of the target gene Y for example, not only the expression level of the target gene Y but also the expression level of the target protein Y (for example, the abundance of the target protein Y in the predetermined tissue or cell of the animal to which the test substance is administered, the intracellular localization level)
  • the animal include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, and birds such as chickens.
  • a test substance that regulates the expression level of target gene Y can be selected.
  • the intracellular localization of the target protein Y in the animal may be measured.
  • the intracellular localization can be measured by the same method as described above.
  • the screening method Ia can be performed based on the change in the blood concentration of the factor in the animal.
  • Administration of the test substance to the animal, blood collection from the animal, and measurement of the blood concentration of the factor can be performed by a method known per se.
  • the screening method I a allows for the screening of substances capable of modulating effects associated with physiologically active substances X. Therefore, the screening method Ia is useful for the development of a prophylactic / therapeutic agent for a disease or condition related to the physiologically active substance X, and a research reagent for the disease or condition.
  • Screening method of a substance that can regulate the action related to bioactive substance X, including selecting a test substance that cannot regulate the expression or function of target protein ⁇ Y I b)
  • the present invention evaluates whether or not a test substance can regulate the expression or function of target protein Y, and includes selecting a test substance that cannot regulate the expression or function of target protein Y.
  • Substances that can regulate actions related to X (among others, actions related to known target molecules and / or pharmacological action actually exhibited by bioactive substance X) (for example, pharmacological action exhibited by bioactive substance X)
  • the present invention provides a screening method for a substance that can be used for pharmaceutical use similar to a physiologically active substance, and that does not have the side effects actually exhibited by the physiologically active substance X or has reduced side effects.
  • Screening method Ib is similar to Methodologies 1-IV, except that it selects test substances that do not cause changes or have binding or regulatory capabilities in steps (c) of methodology I-IV described above. Can be done.
  • screening method Ib the test substance used can regulate the expression or function of a known target molecule (eg see Table 8), or the test substance has an action related to bioactive substance X (in particular, physiological The active substance X may have a pharmacological action actually shown).
  • screening method Ib comprises a method for screening a substance capable of regulating an action related to a known target molecule, comprising evaluating whether the test substance can regulate the expression or function of a known target molecule.
  • a screening method for a substance capable of regulating an action related to a known target molecule can be performed in the same manner as the screening method Ia described above.
  • the screening method lb includes evaluating whether the test substance can regulate the action related to the physiologically active substance X (in particular, the pharmacological action actually exhibited by the physiologically active substance X). It can be used in combination with screening methods for substances that can modulate the action associated with active substance X. Such a screening method can be performed using animals or cells in the same manner as in step (d) of screening method Ia described above. (Table 8)
  • Screening method ⁇ b has the ability to modulate the action related to the known target molecule and the pharmacological action actually exhibited by z or bioactive substance X, and the development of a drug with reduced side effects exhibited by bioactive substance X Is possible. Therefore, screening method Ib is useful for improving existing drugs having the ability to modulate the action related to known target molecules.
  • Screening method for substances that can regulate the function related to target protein Y (Screening Method II)
  • the present invention relates to target protein Y, comprising comparing the binding ability of a test substance to target protein Y or an action related thereto with the binding ability of bioactive substance X to target protein Y or an action related thereto.
  • a screening method for substances capable of regulating function is provided.
  • This screening method is abbreviated as “Screening Method I I” as necessary.
  • screening method II comprises the following steps (a), (b) and (c) including:
  • step (b) shows that the comparison control in step (b) is not “functional level of target protein Y in the absence of test substance” but “in the presence of physiologically active substance X”. It is the same as Methodology I except that it is at the “functional level of target protein Y”.
  • screening method I I comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • screening method I I comprises the following steps (a), (b) and (c):
  • step (b) binding ability of physiologically active substance X to target protein Y” is used as a comparative control.
  • Screening method I I enables, for example, screening of a substance capable of regulating a function related to target protein Y or a probe for target protein Y. Therefore, the screening method I I is useful for the prevention / treatment of a disease or condition associated with the target gene Y, and screening of a research reagent for the disease or condition.
  • the present invention provides a product obtained by the above screening method, for example, the screening methods I and I I.
  • the product provided by the screening method of the present invention is a physiologically active regulator (described later) comprising a substance obtained by the screening method of the present invention and a substance obtained by the screening method. obtain.
  • the product provided by the screening method of the present invention is, for example, for the prevention or treatment of a disease or condition related to the physiologically active substance X, or a disease or condition related to the target gene Y, or the disease or the condition. It is useful as a research reagent.
  • the present invention provides a physiologically active regulator comprising a substance that regulates the expression or function of a target gene of a physiologically active substance.
  • the regulators of the present invention can be broadly classified into regulators of actions related to physiologically active substance X and regulators of functions related to target protein Y from the viewpoint of regulated physiological activity. Each regulator is described in detail below. 3.1. Modulator of action related to bioactive substance X (Regulator I)
  • the present invention comprises a substance that regulates the expression or function of target gene Y, Provides modulators of actions associated with active substance X.
  • regulator I This regulator is abbreviated as “regulator I” as necessary.
  • the substance that regulates the expression or function of the target gene Y can be, for example, a substance that suppresses the expression of the target gene Y.
  • Expression means that the target gene Y translation product is produced and functionally localized at its site of action. Therefore, the substance that suppresses expression may act at any stage such as gene transcription, post-transcriptional regulation, translation, post-translational modification, localization, and protein folding.
  • examples of substances that suppress the expression of target gene Y include transcriptional repressors, RNA polymerase inhibitors, RNA degrading enzymes, protein synthesis inhibitors, nuclear translocation inhibitors, proteolytic enzymes, and protein denaturing agents.
  • transcriptional repressors RNA polymerase inhibitors
  • RNA degrading enzymes RNA degrading enzymes
  • protein synthesis inhibitors nuclear translocation inhibitors
  • proteolytic enzymes and protein denaturing agents
  • an example of a substance that suppresses the expression of target gene Y is a transcription product of target gene Y, in particular, an antisense nucleic acid against mRNA or early transcription product.
  • An “antisense nucleic acid” consists of a base sequence that can hybridize with the target mRNA (early transcript) under physiological conditions of a cell that expresses the target mRNA (early transcript), and is hybridized.
  • the type of antisense nucleic acid may be DNA, RNA, or DNA // RNA chimera.
  • the length of the antisense nucleic acid is specifically hybridized with the target gene Y transcript.
  • the target gene Y transcript There is no particular limitation as long as it can be used, and it may be a short one of about 15 bases, and a long one containing a complementary sequence in the entire mRNA (initial transcript) sequence. From the viewpoint of ease of synthesis, antigenicity problems, etc., for example, oligonucleotides comprising about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases are exemplified.
  • the target sequence of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it is a sequence that inhibits the translation of the target gene Y or a functional fragment thereof when the antisense nucleic acid is hybridized. It may be a sequence or an intron part of the initial transcript, but when an oligonucleotide is used as an antisense nucleic acid, the target sequence is encoded from the 5, end of the target gene Y mRNA. It is desirable to be located up to the C-terminus of the region.
  • antisense nucleic acids not only hybridize with target gene Y transcripts to inhibit translation, but also bind to double-stranded DNA forms of target gene Y to form a triplex. It may be capable of inhibiting transcription to mRNA.
  • target gene Y transcript specifically mRNA or early transcript, specific within the coding region (including the intron in the early transcript) It is a ribozyme that can be cleaved.
  • Ribozyme J refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acids, but recently it has been clarified that oligo DNA having a base sequence at the enzyme activity site also has a nucleic acid cleavage activity.
  • RNA Ribonucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • Decoy nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that mimics the region to which a transcriptional regulatory factor binds. Decoy nucleic acid as a substance that suppresses expression of target gene ⁇ is a region to which a transcriptional activator for target gene ⁇ binds Can be a nucleic acid molecule that mimics
  • the decoy nucleic acid examples include an oligonucleotide (S-oligo) having a thiophosphate diester bond in which an oxygen atom of a phosphate diester bond portion is substituted with a sulfur atom, or a methyl phosphate having no charge as a phosphate diester bond. And oligonucleotides modified to make the oligonucleotides less susceptible to degradation in vivo, such as oligonucleotides substituted with groups.
  • the decoy nucleic acid may be completely coincident with the region to which the transcriptional activator binds, but it is sufficient that the decoy nucleic acid retains the identity that allows the transcriptional activator to bind to the target gene.
  • the length of the decoy nucleic acid is not particularly limited as long as a transcriptional activator binds.
  • the decoy nucleic acid may contain the same region repeatedly.
  • RNA interference in which short double-stranded RNA is introduced into cells and its complementary mRNA is degraded, has been known in nematodes, insects, plants, etc. However, recently, it has been confirmed that this phenomenon also occurs in animal cells [Nature, 411 (6836): 494-498 (2001)], and is attracting attention as an alternative to ribozyme.
  • siRNA one synthesized by itself can be used as described later, but a commercially available one may be used.
  • Antisense oligonucleotides and liposomes determine the target gene Y transcript based on the target gene Y cDNA sequence or genomic DNA sequence, specifically the target sequence of the mRNA or early transcript, and are commercially available DNNA automated synthesizers. (Applied Biosystems, Beckman, etc.) can be used to synthesize complementary sequences. Decoy nucleic acid, si RNA The DNA strand and the antisense strand are respectively synthesized by an automatic DNA / RNA synthesizer, denatured in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95 ° C for about 1 minute, and then about 30 to about 7 It can be prepared by annealing at 0 ° C for about 1 to about 8 hours. In addition, longer double-stranded polynucleotides can be prepared by synthesizing complementary oligonucleotide strands so as to overlap each other, annealing them, and then ligating with ligase.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and can be prepared by a well-known immunological technique.
  • the antibody may be an antibody fragment (eg, Fab, F (ab ′) 2 ) or a recombinant antibody (eg, a single chain antibody).
  • a nucleic acid encoding the antibody is also preferred as a substance that suppresses the expression of target gene Y.
  • a polyclonal antibody can be prepared by using a target protein Y or a fragment thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as ushi serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)) as an antigen.
  • a commercially available adjuvant for example, complete or incomplete Freund's adjuvant
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by cell fusion methods (for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal antibody basics and clinical ones”, No. 2- 14 pages, Science Forum Publishing, 1985).
  • cell fusion methods for example, Takeshi Watanabe, principles of cell fusion methods and preparation of monoclonal antibodies, Akira Taniuchi, Toshitada Takahashi, “Monoclonal antibody basics and clinical ones”, No. 2- 14 pages, Science Forum Publishing, 1985.
  • mice are administered the factor 2-4 times subcutaneously or intraperitoneally with a commercially available adjuvant, and the spleen or lymph nodes are about 3 days after the final administration. Collect white blood cells.
  • the leukocytes and myeloma cells are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the factor.
  • Cell fusion may be PEG method [J. Immunol. Methods, 81 (2): 223-228 (19 85)] or voltage pulse method [Hybridoma, 7 (6): 627-633 (1988)].
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a well-known EIA or RIA method.
  • Culture of hybridomas producing monoclonal antibodies can be carried out in vitro, or in vivo in mice or rats, or preferably in mouse ascites. You can get it.
  • the antibody of the present invention may be a chimeric antibody, a humanized or human antibody.
  • chimeric antibodies include “Experimental Medicine (Special Issue), Vol. 6, No. 10, 1988”, Japanese Patent Publication No. 3-73280, and human antibodies include, for example, Japanese Patent Publication No. 4-506458.
  • human antibodies include, for example, ⁇ Natui: e Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997 '', ⁇ Nature Genetic s, Vol. 7, p.
  • the substance that regulates the expression or function of target gene Y can also be a substance that suppresses the function of target gene Y.
  • the substance that suppresses the function of target gene Y is not particularly limited as long as it can interfere with the action of target gene Y, but in order to minimize the adverse effects on other genes and proteins, it is specific to the target molecule. It is important to be a substance that can act in an effective manner.
  • Examples of the substance that specifically suppresses the function of target gene Y include a dominant negative mutant of target protein Y and a nucleic acid encoding the mutant (operably linked to a nucleic acid having promoter activity).
  • a dominant negative mutant of target protein Y is a protein whose activity has been reduced by introducing a mutation into target protein ⁇ . The dominant negative mutant can indirectly inhibit its activity by competing with the natural target protein.
  • the dominant negative mutant can be prepared by introducing a mutation into the nucleic acid encoding the target gene ⁇ .
  • the mutation include an amino acid mutation (for example, deletion, substitution or addition of one or more amino acids) that causes a decrease in the function of the functional domain.
  • the mutation can be introduced by a method known per se using PCR or a known kit.
  • the regulator of the present invention can contain an expression vector encoding the nucleic acid molecule as an active ingredient.
  • the oligonucleotide or polynucleotide encoding the nucleic acid molecule must be operably linked to a promoter capable of exhibiting promoter activity in the mammalian cells to be administered.
  • the promoter used is not particularly limited as long as it can function in the mammal to which it is administered.
  • SV 40-derived early promoter cytomegalovirus LTR, rous sarcoma virus LTR, M o M u LV-derived LTR, adenovirus-derived early promoters such as the promoter, and the -actin gene promoter, p
  • Examples include mammalian constitutive protein gene promoters such as a KG gene promoter and a transferrin gene promoter.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal, ie, a terminator region, downstream of the oligo (poly) nucleotide encoding the nucleic acid molecule.
  • a transcription termination signal ie, a terminator region
  • selectable marker genes for selecting transformed cells such as genes that confer resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, and genes that complement auxotrophic mutations. Further, it can be contained.
  • the basic skeleton vector used as the expression vector is not particularly limited, but suitable vectors for administration to mammals such as humans include retrovirus and adenovirus.
  • suitable vectors for administration to mammals such as humans include retrovirus and adenovirus.
  • virus vectors such as Inoles, Adeno-associated Winores, Henopeseuinores, Wax Share Winores, Box virus, Poliovirus / Sindbis virus, Sendai virus.
  • Adenoviruses have the advantage that gene transfer efficiency is extremely high and they can be introduced into non-dividing cells. However, since the integration of the transgene into the host chromosome is extremely rare, gene expression is transient and usually lasts only about 4 weeks. Considering the persistence of the therapeutic effect, use of adeno-associated virus that is relatively high in gene transfer efficiency, can be introduced into non-dividing cells, and can be incorporated into chromosomes via an inverted terminal repeat (ITR) Is also preferred.
  • ITR inverted terminal repeat
  • the substance that modulates the expression or function of the target protein ⁇ may also be thiabendazole, reserpine, imipenem, cephalexin or aclarubicin, or a derivative thereof that has the ability to bind to the target protein ⁇ ⁇ , or a salt thereof (see below).
  • the regulator I can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the substance that regulates the expression or function of the target gene.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate and other excipients, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, Binders such as polypropylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, starch, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl starch, sodium monoglycolone starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, Disintegrating agents such as calcium citrate, lubricants such as magnesium stearate, air mouth gill, talc, sodium lauryl sulfate, taenoic acid, menthol, glycyllysine-ammonium salt, glycine, Fragrances such as range powder, preservatives such as sodium benzoate, sodium bisulfite, methylparaben, propylparaben, stabilizers such as citrate, sodium
  • Formulations suitable for oral administration include solutions in which an effective amount of a substance is dissolved in a diluent such as water, physiological saline, orange juice, capsules, sachets or solids containing an effective amount of the substance as solids or granules.
  • a diluent such as water, physiological saline, orange juice, capsules, sachets or solids containing an effective amount of the substance as solids or granules.
  • examples thereof include tablets, suspensions in which an effective amount of a substance is suspended in an appropriate dispersion medium, and emulsions in which a solution in which an effective amount of a substance is dissolved is dispersed in an appropriate dispersion medium and emulsified.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Buffer solution, antibacterial agent, tonicity agent and the like may be contained.
  • Aqueous and non-aqueous sterile suspensions can also be mentioned, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
  • the dosage of Modulator I varies depending on the activity and type of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age, etc.
  • the amount of active ingredient per day is about 0.01 to about 500 mg / kg.
  • Modulator I makes it possible to modulate, for example, suppress or promote the action associated with bioactive substance X. Therefore, the modulator I is useful for the prevention / treatment of a disease or condition associated with the physiologically active substance X, as well as a reagent for research of the disease or condition.
  • the present invention provides a regulator of a function related to the target protein Y comprising the physiologically active substance X.
  • regulator I I This regulator is abbreviated as “regulator I I” as necessary.
  • Bioactive substance X is thiabendazole, reserpine, imipenem, cephalex Syn or achalrubicin or a derivative thereof capable of binding to target protein Y (described later), or a salt thereof.
  • the modulator I I can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dosage of Modifier I I is the same as that of Regulator I.
  • Modulators I I allow the modulation, eg suppression or promotion, of the function associated with the target protein Y. Therefore, the regulator I I is useful for the prevention / treatment of a disease or condition associated with the target gene Y, and for research reagents for the disease.
  • the present invention provides a method for producing a derivative of a physiologically active substance, which comprises derivatizing the physiologically active substance so that the expression or function of a target gene can be regulated.
  • Derivatization is a virtual or actual synthesis of a compound obtained by substituting a specific atom or group in a lead compound with another atom or group, or a compound obtained by an addition reaction to the lead compound. It means to do.
  • the lead compound can be bioactive substance X.
  • the derivatization of bioactive substance X is performed as necessary to maintain the ability to regulate the expression or function of target gene Y.
  • the resulting derivative is water-soluble, lipid-soluble, stable, in vivo, and bioavailable. Other properties such as toxicity can be taken into account.
  • the derivatization of the biologically active substance X can be derivatized, for example, so as to improve the ability to regulate the expression or function of the target gene Y.
  • the derivatization of bioactive substance X can also be derivatized so that the function associated with target protein Y can be modulated.
  • SBDD Structure-Based Drug Design
  • CADD Computer-Aided Drug Design
  • SBDD Structure-Based Drug Design
  • CADD Computer-Aided Drug Design
  • Examples of such designs include virtual screening, de novo design, pharmacophore analysis, and QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship).
  • the structure can be determined by structural analysis methods such as NMR, X-ray crystallography, and synchrotron radiation analysis. If the three-dimensional structure is not known, the information obtained by the structure prediction method such as the homology method or the threading method is used. In the partial screening, a program known per se can be used.
  • Examples of such a program include Dock (Kunt z, ID et al., Science, 1992, 257, 1078), Gold (Jones , G. et al., J. Mol. Biol., 1995, 245, 43), F 1 ex X (Rarey, M. et al., J. Mol. Bio 1., 1996, 261, 470), Au toD ock (Morris, GM et al., J. Coraput. Chem., 1998, 19, 1639), ICM (Abagyan, RA et al., J. Comput. Chem., 1994, 15, 488) etc. Can be mentioned.
  • the derivatization of the biologically active substance X that retains the ability to regulate the expression or function of the target gene Y can also be performed based on, for example, biological verification (in vitro or in vivo methods).
  • biological verification in vitro or in vivo methods
  • the above-described methodologies I to I V can be used.
  • the above-described methods such as SBDD and CADD and biological verification may be used in combination.
  • the specific atom in the physiologically active substance X (lead compound) to be substituted for the production of the derivative is not limited as long as it is an atom present in the lead compound.
  • a hydrogen atom, a halogen atom for example, Fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • oxygen atom sulfur atom, nitrogen atom, carbon atom and the like.
  • the specific group in the bioactive substance X to be substituted for the production of the derivative is not limited as long as it is a group present in the bioactive substance X.
  • the molecular weight is 1 to 500, preferably the molecular weight is 1 to 300, and more preferably. May be a group having a molecular weight of 1 to 200, most preferably a molecular weight of 1 to 100.
  • the specific group includes, for example, an optionally substituted c, to C 8 hydrocarbon group, an optionally substituted C to C 8 acyl group, an optionally substituted aromatic or non-aromatic group.
  • the optionally substituted ⁇ C 8 hydrocarbon group includes, for example, an optionally substituted Ci Cg alkyl group, an optionally substituted C 2 to C 8 alkenyl group, and optionally substituted c. It may be 2 to c 8 alkynyl group.
  • the -C 8 alkyl group substituted -C 8 optionally alkyl group may be linear or branched chain, preferably 1 to 6 carbon atoms, for example, methylation, Echiru, Puropinore, Isopuropiru Butyl, isoptyl, sec pentynole, tert-butyl and the like.
  • the -C 8 Ashiru group optionally substituted -C 8 Ashiru group straight chain Either a branched chain or a branched chain may be used, and preferably has 2 to 6 carbon atoms, and examples thereof include formyl, acetyl, propynol, butanol, 2-methylpropynol and the like.
  • the aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group of the aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group which may be substituted may be monocyclic, bicyclic or tricyclic, Preferably, it has 3 to 12 carbon atoms, and examples thereof include phenyl and naphthyl.
  • the non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group of the optionally substituted non-aromatic C 3 to C 14 hydrocarbon ring group includes saturated or unsaturated monocyclic, bicyclic or tricyclic Any one of cyclic groups may be used, and preferably has 3 to 12 carbon atoms.
  • a cycloalkyl group for example, cyclopropinole, cycloputinole, cyclopentinole, cyclohexinole, cycloheptyl, cyclooctyl
  • cyclo Alkenyl groups eg, 2-cyclopentene-1-ynole, 3-cyclopentene 1-isure, 2-cyclohexene 1-inole, 3-cyclohexene-1-inole
  • cycloalkadienyl groups for example, 2,4-cyclopentagen 1-inole, 2,4-cyclohexagen 1-inole, 2,5-cyclohexagen 1-inyl
  • the aromatic C 3 -C i 4 heterocyclic group of the optionally substituted aromatic C 3 -C i 4 heterocyclic group is selected from oxygen atoms, sulfur atoms and nitrogen atoms in addition to carbon atoms as ring constituent atoms
  • Examples of monocyclic aromatic C 3 -C 1 4 heterocyclic group are furyl, thienyl, pyrrolyl, Okisazoriru, Isooki Sazoriru, thiazolyl, isothiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, Okisaji Azoriru, furazanyl, thiadiazolyl, Toriazoriru, tetrazolyl, pyrid , Pyrimidinyl, pyridazinyl, pyrajur, triazinyl and the like.
  • bicyclic or tricyclic aromatic heterocyclic groups include benzofuranyl, isobenzofurerel, benzo [b] chenyl, indolyl, isoindolyl, 1 H-indazolinole, benzimidazolinore, benzoxazolinole , Benzothiazolinol, 1 H-benzotriazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolyl, quinazolyl, Quinoxalinyl, phthalagel, naphthyridiel, purinyl, pteridinyl, force noreno zolinore, monocarboryl,] 3—force nore bonino , Indolizinyl, Pillow mouth [1, 2-b] Pyridazinyl, Pyrazo mouth [1, 5-a] Pyridyl, Imidazo [1, 2-a] Pyridyl, Imidazo [1, 5-a] Pyridyl, Imidazo [1,
  • the non-aromatic C 3 ⁇ C i 4 heterocyclic group substituted non-aromatic may be C 3 ⁇ C i 4 heterocyclic group, an oxygen atom in addition to carbon atoms as ring-constituting atom, a sulfur atom and a nitrogen atom
  • the kind of the substituent in any group that may be substituted may be the same as the specific group (described above) in the physiologically active substance X that is substituted for the production of the derivative.
  • the number of specific atoms or groups in the biologically active substance X to be substituted for the production of the derivative is limited to the target protein Y, for example, as long as the produced derivative can have the ability to regulate the expression or function of gene Y.
  • it may be 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, even more preferably 1 to 2, and most preferably 1.
  • the type of the specific atom or group used for the substitution (that is, the atom or group introduced into the substitution site) is the same as the specific atom or group in the bioactive substance X to be substituted for the production of the derivative. possible.
  • Atoms or groups added to the bioactive substance X for the production of derivatives is a specific atom or group in the biologically active substance X to be substituted for the production of the derivative (described above), which can undergo an addition reaction, such as a hydrogen atom, halogen
  • An atom such as an atom, a group that can act as a nucleophile or an electrophile.
  • the number of atoms or groups added to the physiologically active substance X for the production of the derivative is, for example, capable of binding to the target protein Y as long as the produced derivative is capable of regulating the expression or function of gene Y Although not particularly limited, for example, it may be less than 6, preferably less than 4, more preferably 2 or 1.
  • the production method of the present invention includes, for example, prevention or treatment of a disease or condition related to physiologically active substance X or a disease or condition related to target gene Y, or a research reagent for the disease or condition. Useful for development.
  • the present invention provides a product obtained by the method for producing the derivative.
  • the product provided by the production method can be a derivative of the physiologically active substance X obtained by the production method of the present invention, and a physiologically active regulator comprising the derivative (described above).
  • the product provided by the above production method is, for example, for the prevention or treatment of a disease or condition related to bioactive substance X, or a disease or condition related to target gene Y, or a research reagent for the disease or condition It is useful as such.
  • the present invention provides a complex comprising a physiologically active substance and its target protein.
  • the physiologically active substance can be, for example, the physiologically active substance X described above.
  • the biologically active substance X can be thiabendazole, reserpine, imipenem, cephalexin or aclarubicin or a derivative thereof capable of binding to target protein Y.
  • the type of physiologically active substance X can be appropriately selected according to the type of target protein Y.
  • the target protein of the physiologically active substance is the target protein Y described above.
  • the target protein Y can be a protein derived from FLJ 10368, FL J 1 2389, FL J 1 2435 S FLJ 1 2502, FLJ 1 2 5 14, FLJ 14583 or FLJ 3 1 146.
  • the type of the target protein Y used for forming the complex can be appropriately selected according to the type of the physiologically active substance X.
  • the complex of the present invention can be a complex according to the combination of thiabendazole, reserpine, imipenem, cephalexin or aclarubicin or a derivative thereof capable of binding to the target protein and the target protein.
  • the complex of the invention comprises a protein derived from FLJ 10368, FLJ 1 2389, FLJ 1 243 5, FLJ 1 2502, FLJ 1 25 14, FLJ 1458 3 or FLJ 31 146, and It may be a complex according to a combination with a physiologically active substance having binding ability.
  • the complex of the present invention is preferably the above (a 1) to (a 5) or the above (b 1).
  • the present invention also provides a method for producing a complex comprising a physiologically active substance and its target protein, which comprises contacting the physiologically active substance with its target protein.
  • the contact can be performed, for example, by mixing a physiologically active substance and a target protein in a solution.
  • the complex of the present invention and the method for producing the complex include, for example, the screening method of the present invention, the method of producing the derivative of the present invention, or the structural analysis of the complex, This may be useful when, for example, examining the mode of interaction between a protein and its target protein.
  • the present invention provides a kit containing a physiologically active substance or a salt thereof.
  • kit of the present invention comprises the following (i), (ii):
  • a target protein of a physiologically active substance a nucleic acid encoding the protein, the nucleus
  • the kit of the present invention contains a target protein of a physiologically active substance, the protein is not in a complex with the physiologically active substance.
  • the physiologically active substance, its target protein, target gene, and the combination of the physiologically active substance and its target protein are as described above (for example, see “5. Complex and its production method”).
  • the kit of the present invention can be useful, for example, when performing the screening method of the present invention, the method for producing the derivative of the present invention, and the method for producing the complex of the present invention. 7. Method and kit for determining the onset or risk of developing a disease or condition
  • the present invention provides a determination method / determination kit for the onset or risk of onset of a predetermined disease or condition.
  • the determination method of the present invention can be roughly divided into a determination method based on the measurement of the expression level and the measurement of polymorphisms.
  • ⁇ A determination kit, and further, a disease or condition for which determination of onset or risk of development is desired From the above viewpoint, the disease or condition associated with the physiologically active substance X and the onset or risk of developing the disease or condition associated with the target gene Y can be classified into a determination kit.
  • Each determination method ⁇ Judgment kit is described in detail below.
  • target protein Y or the gene encoding it
  • the present invention provides a method for determining the onset or risk of developing a disease or condition associated with physiologically active substance X, which comprises measuring the expression level of a target gene gene.
  • the determination method I includes the following steps (a) and (b):
  • Methodology including steps (a) to (b) above is abbreviated as “Methodology V” as necessary.
  • step (a) of methodology V the expression level of target gene Y is measured in a biological sample collected from an animal.
  • the animal is not particularly limited, but mammals and birds are preferred, and mammals are more preferred. Mammals include, for example, laboratory animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and rabbits, domestic animals such as pigs, tusks, goats, horses, and sheep, pets such as dogs, cats, monkeys, orangutans , Primates such as Chimpa / Gee and Human. Examples of birds include chickens.
  • the biological sample is not particularly limited as long as it is a sample containing a target gene Y-expressing tissue or a sample containing a secreted target protein Y.
  • the sample containing the target gene Y-expressing tissue varies depending on the type of target gene Y.
  • the expression tissue of the target gene Y can be examined using, for example, H—Inv DB.
  • the sample containing the secreted target protein Y may be, for example, blood, plasma, serum, saliva, cerebrospinal fluid, tears, or urine, depending on the type of target gene Y.
  • Methodology V can include a step of collecting a biological sample from an animal. Collection of biological samples from animals can be performed by a method known per se.
  • the expression level of target gene Y is the product of target gene Y, for example, transcription product or translation product.
  • the expression level of a transcription product can be measured by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like.
  • the expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and immunologically.
  • an immunological method a radioisotope immunoassay (RIA method), an ELISA method (Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)), a fluorescent antibody method, and the like can be used.
  • step (b) of methodology V whether or not the animal is afflicted with a disease or condition associated with bioactive substance X is evaluated based on the expression level of target gene Y. Specifically, first, the measured expression level of the target gene Y is determined based on the expression level of the target gene Y in an animal (for example, a normal animal) not affected by a disease or condition related to the physiologically active substance X. To be compared. The comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of the target gene Y in an animal not afflicted with a disease or condition associated with the physiologically active substance X can be determined by a method known per se.
  • the animal is likely to be affected by a disease or condition related to bioactive substance X, or is likely to be affected in the future. It is judged how.
  • the combination of the disease or condition related to bioactive substance X and target gene Y is as described above. It is known that in animals that develop a specific disease, changes in the expression of genes associated with the disease are often observed. It is also known that changes in the expression of specific genes are often observed before the onset of specific diseases. Therefore, from the analysis of the expression level of the target gene Y, it is possible to determine the onset or possibility of onset of a disease or condition associated with the physiologically active substance X.
  • Determination method I makes it possible to determine the presence or absence of a disease or condition associated with physiologically active substance X, or the possibility of suffering from the disease or condition. Therefore, the determination method I is useful, for example, for easy and early detection of the disease or condition.
  • the present invention provides a determination kit that enables determination method I to be easily performed. This judgment kit is abbreviated as “judgment kit I” as necessary.
  • the determination kit I includes the following (i), (ii):
  • the kit may further contain a means for collecting a biological sample from an animal, or a target gene transcript or target protein kit.
  • the means for measuring the expression level of the target gene ⁇ ⁇ ⁇ is not particularly limited as long as the expression level of the target gene ⁇ can be quantified.
  • the means capable of quantifying the target protein ⁇ , the target gene ⁇ the transcription product can be quantified It is roughly divided into various means.
  • the means may be labeled with a labeling substance. Further, when the means is not labeled with a labeling substance, the determination kit of the present invention can further contain the labeling substance.
  • the labeling substance is as described above.
  • means for quantifying the target protein ⁇ include antibodies to the target protein ⁇ (described above), physiologically active substance X, and the like.
  • the antibody against the target protein ⁇ and the physiologically active substance X may be provided in a form immobilized on a substrate such as a plate.
  • Examples of means capable of quantifying the target gene-transcribed product include a nucleic acid probe for the target gene-transcribed product, and a primer pair capable of amplifying the target gene-transcribed product.
  • the nucleic acid probe and primer pair may be provided together with a transcription product extraction reagent.
  • the nucleic acid probe for the target gene ⁇ transcript is not particularly limited as long as the amount of the target gene ⁇ transcript can be measured.
  • the probe may be either DNA or RNA, but DNA is preferable in consideration of stability and the like.
  • the probe may be either single-stranded or double-stranded.
  • the size of the probe is not particularly limited as long as the transcript of the target gene Y can be detected, but is preferably about 15 to 100. O bp, more preferably about 50 to 500 bp.
  • the probe may be provided in a form fixed on a substrate like a microarray.
  • the primer pair capable of amplifying the target gene Y is selected so that a detectable size nucleotide fragment is amplified.
  • Detectable size nucleotide fragments may have a length of, for example, about 1 00 bp or more, preferably about 2 0 0 bp or more, more preferably about 5 0 0 bp or more.
  • the size of the primer is not particularly limited as long as the target gene Y can be amplified, but is preferably about 15 to 100 bp, more preferably about 18 to 50 bp, and still more preferably about 20 to 30. Can be bp.
  • the determination kit can further contain a reverse transcriptase.
  • the medium that records the relationship between the disease or condition related to bioactive substance X and the expression level of target gene Y is the target for animals affected by disease or condition related to bioactive substance X and those not affected.
  • the difference in the expression level of gene Y may be recorded.
  • the medium can be, for example, a document or a computer-readable recording medium such as a flexible disk, CD, DVD, and hard disk.
  • the expression level of the target gene Y in an animal suffering from a disease or condition associated with the physiologically active substance X can be increased or decreased as compared to an animal not suffering from the disease or the condition.
  • the means by which the biological sample can be collected from the animal is not particularly limited as long as the biological sample can be obtained from the animal.
  • a blood collecting instrument such as a syringe, a biopsy needle, a biopsy instrument such as a biopsy instrument, a female And surgical instruments such as scissors.
  • Target gene Y transcript or target protein Y can be used, for example, as a control.
  • the determination kit I makes it possible to determine the presence or absence of a disease or condition associated with the physiologically active substance X, or the possibility of suffering from the disease or condition. Therefore, the determination kit I is useful, for example, for easy and early detection of the disease or condition.
  • Method and kit for determining the risk of developing a disease or condition based on measurement of the target gene Y polymorphism 7. 2. 1. Method for determining risk of developing a disease or condition related to bioactive substance X based on measurement of polymorphism of target gene Y (Determination Method II)
  • the present invention provides a method for determining the risk of developing a disease or condition associated with physiologically active substance X, comprising measuring a polymorphism of a target gene gene.
  • the determination method I I includes the following steps (a) and (b):
  • Methods (a) to (b) above is abbreviated as “Methodology V I” as necessary.
  • step (a) the polymorphism type of target gene Y is measured in biological samples taken from animals.
  • the animals are as described above.
  • the biological sample As the biological sample, those described above in Methodology V can be used, but according to this Methodology VI, any tissue containing genomic DNA such as hair, nails, skin, and mucous membrane can be used as the biological sample. Considering availability, burden on the human body, etc., the biological sample is preferably hair, nails, skin, mucous membrane, blood, plasma, serum, saliva and the like.
  • this methodology VI can further include a step of collecting a biological sample from the animal. Collection of biological samples from animals can be performed by a method known per se.
  • a target gene Y polymorphism means a nucleotide sequence variation found in a certain frequency in the genomic DNA containing the target gene Y in a population, and one or more DNAs in the genomic DNA containing the target gene Y Substitutions, deletions, additions (eg, SNPs, haplotypes), as well as repeats, inversions, translocations, etc. of the genomic DNA.
  • the polymorphism of the target gene Y is registered in a known database such as H-In VDB.
  • the type of target gene Y polymorphism used in this determination method is the disease or condition related to bioactive substance X among all types of polymorphisms in target gene Y.
  • Nucleotide sequence mutations that differ in frequency between affected and unaffected animals such as changes in expression of target gene Y or functions related to target protein Y (eg, bioactive substance X May cause a change in the binding ability of the target protein Y to.
  • Such polymorphism type can be determined by a method known per se such as linkage analysis. '
  • the polymorphic type can be measured by a method known per se. For example, RFL P (restriction enzyme fragment length polymorphism) method, PCR—S SCP (—strand DN A conformation polymorphism analysis) method, ASO (Allele Specific Oligonucleotide) hybridization method, direct sequence ARMS (Amplification Refracting Mutation System), Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR, Invader method, MALD I—TOF / MS method (Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight / Mass Spectrometry) method, TD I (Template-directed Dye-terminator Incorporation) method can be used.
  • RFL P restriction enzyme fragment length polymorphism
  • PCR S SCP
  • ASO Allele Specific Oligonucleotide hybridization method
  • direct sequence ARMS Amplification Refracting Mutation System
  • Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR Invader method
  • MALD I TOF / MS method (Ma
  • Methodology VI step (b) assesses whether the animal is more or less likely to have a disease or condition associated with bioactive substance X based on the type of polymorphism.
  • the combination of the disease or condition related to bioactive substance X and target gene Y is as described above. It is known that animals prone to develop a specific disease often have a specific type of polymorphism in the gene associated with the disease. Therefore, by analyzing the polymorphism, it is possible to determine the possibility of the onset of a disease or condition related to the physiologically active substance X.
  • Determination method I I makes it possible to determine the possibility of suffering from a disease or condition associated with bioactive substance X. Therefore, the determination method I I is useful because it provides an opportunity for improving lifestyle habits for the purpose of preventing the disease or condition.
  • the present invention also provides a determination kit that makes it possible to easily perform the determination method II.
  • judgment kit I I This judgment kit is abbreviated as “judgment kit I I” as necessary.
  • the determination kit I I includes the following (i), (i i):
  • the kit further comprises means for collecting a biological sample from an animal, a nucleic acid encoding a target gene ⁇ having a specific type of polymorphism, a nucleic acid encoding a target gene ⁇ ⁇ not having a specific type of polymorphism, and the like. May be included.
  • the means by which the polymorphism of the target gene can be measured is not particularly limited as long as the polymorphism of the target gene can be determined.
  • the means may be labeled with a labeling substance. Further, when the means is not labeled with a labeling substance, the kit can further contain the labeling substance.
  • the labeling substance is as described above.
  • the means capable of measuring the polymorphism of the target gene ⁇ ⁇ ⁇ has a nucleic acid probe that can specifically measure the target gene ⁇ having a specific type of polymorphism, or a specific type of polymorphism. It can be a primer pair that can specifically amplify the target gene.
  • the nucleic acid probe, primer pair can be for genomic DNA containing the target gene or a target gene transcript.
  • the nucleic acid probe and primer pair may be provided together with a transcription product or a reagent for extracting genomic DNA.
  • the nucleic acid prop capable of specifically measuring a target gene sequence having a specific type of polymorphism is not particularly limited as long as a target gene sequence having a specific type of polymorphism can be selected.
  • the probe may be either DNA or RNA, but DNA is preferable in consideration of stability and the like.
  • the probe may be either single-stranded or double-stranded.
  • the size of the probe is preferably as short as possible so that a target gene Y having a specific type of polymorphism can be selected, and can be, for example, about 15 to 30 bp in size.
  • the probe is fixed on a substrate like a microarray. May be provided in The probe enables, for example, an ASO (Allele Specific Oligonucleotide) hybridization method.
  • a primer pair capable of specifically amplifying target gene Y having a particular type of polymorphism is selected such that a measurable size nucleotide fragment is amplified.
  • a primer pair is designed, for example, so as to include a polymorphic site at the 3 terminus of either primer.
  • Nucleotide fragments of measurable size can have a length of, for example, about 100 bp or more, preferably about 20 bp or more, more preferably about 500 bp or more.
  • the size of the primer is not particularly limited as long as the target gene Y can be amplified, but is preferably about 15 to 100 bp, more preferably about 18 to 50 bp, and even more preferably about 20 to 3 It can be 0 bp.
  • the determination kit can further comprise a reverse transcriptase.
  • Another means of measuring the target gene Y polymorphism is a restriction enzyme that recognizes a specific type of polymorphic site. By such means, polymorphism analysis by R F L P becomes possible.
  • the medium that records the relationship between the disease or condition related to bioactive substance X and the polymorphism of target gene Y is the medium that is affected by the disease or condition related to bioactive substance X.
  • the nucleotide sequence difference of the genomic DNA containing the target gene Y may be recorded.
  • the medium can be, for example, a document or a computer-readable recording medium such as a flexible disk, CD, DVD, or hard disk.
  • Means for collecting a biological sample from an animal are as described above.
  • a nucleic acid encoding a target gene Y having a specific type of polymorphism, or a nucleic acid encoding a target gene Y not having a specific type of polymorphism can be used, for example, as a control.
  • the determination kit II makes it possible to determine the possibility of suffering from a disease or condition associated with the physiologically active substance X. Therefore, Judgment Kit II predicts the disease or condition. This is useful because it provides an opportunity to improve lifestyle habits for the purpose of prevention.
  • the present invention provides a method for determining the risk of developing a disease or condition associated with a target gene Y, comprising measuring a polymorphism of the target gene Y.
  • the determination method I I I includes the following steps (a) and (b): (a) a step of measuring a polymorphic type of the target gene Y in a biological sample collected from an animal;
  • Determination method I the polymorphic type used to determine the risk of onset changes the binding of target protein Y to bioactive substance X.
  • a polymorphic type can be determined by a method known per se such as a binding assay.
  • Judgment method I I The methodology including the above steps (a) and (b) in the method I I is the same as the method VI except for the type of the target gene Y polymorphism to be measured.
  • Determination method I I I allows determination of the likelihood of suffering from a disease or condition associated with target gene Y. Therefore, the determination method I I I is useful because it provides an opportunity for improving lifestyle habits for the purpose of preventing the disease or condition.
  • the present invention also provides a determination kit that makes it possible to easily perform the determination method I I I.
  • the determination kit III includes the following (i) and (ii): (i) means capable of measuring a polymorphism of the target gene Y; (ii) A medium in which the relationship between a disease or condition related to the target gene Y and the polymorphism of the target gene Y is recorded.
  • the kit further includes means for collecting a biological sample from an animal, a nucleic acid encoding a target gene Y having a specific type of polymorphism, a nucleic acid encoding a target gene Y not having a specific type of polymorphism, and the like. May be included.
  • the polymorphic type used to determine the risk of onset changes the binding of the target protein ⁇ to the physiologically active substance X.
  • Such polymorphic type can be determined by a method known per se such as binding assay.
  • the components of the determination kit I I I are the same as those of the determination kit I I except for the type of target gene Y polymorphism to be measured.
  • the determination kit I I I allows the determination of the possibility of suffering from a disease or condition associated with the target gene Y. Therefore, the determination kit I I I is useful because it provides an opportunity for improving lifestyle habits for the purpose of preventing the disease or condition.
  • the present invention provides a method for determining sensitivity to a physiologically active substance.
  • the determination method of the present invention can be roughly divided into a determination method based on the measurement of the expression level and the measurement of polymorphisms, and a determination kit.
  • the viewpoint of the disease or condition for which sensitivity determination is desired To the determination method / determination kit for the disease or condition related to bioactive substance X and the disease or condition related to target gene Y. Each judgment method and judgment kit are described in detail below.
  • the present invention relates to a physiologically active substance X comprising measuring the expression level of a target gene Y.
  • a method for determining sensitivity to a physiologically active substance X in a related disease or condition is provided.
  • the determination method IV includes the following steps (a) and (b):
  • Method V I I step (a) is the same as method V step (a).
  • step (b) the effect of physiologically active substance X on animals is evaluated based on the expression level of target gene Y. Specifically, first, the measured expression level of the target gene Y is collated with data relating to the correlation between the expression level of the target gene Y and the sensitivity to the physiologically active substance X. The correlation between the expression level of the target gene Y and the sensitivity to the physiologically active substance can be determined by a method known per se.
  • the sensitivity to bioactive substance X is estimated from the verification result.
  • the combination of physiologically active substance X and target gene Y is as described above. Animals that highly express the target gene of a bioactive substance are considered to be highly (or low) sensitive to the bioactive substance, and animals that are lowly expressed are considered to be low (or high). Therefore, it is possible to determine the sensitivity to bioactive substance X by analyzing the expression level of target gene Y. For example, when the physiologically active substance X is a drug, it is possible to determine the ease or difficulty of the drug, or the probability that a side effect of the drug will occur.
  • Determination method I V makes it possible to determine the sensitivity to bioactive substance X. Therefore, the determination method IV is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X on a specific animal.
  • the present invention provides a determination kit that makes it possible to easily perform the determination method IV.
  • the determination kit IV includes the following (i), (ii):
  • kits may further contain a means for collecting a biological sample from an animal, or a target gene Y transcript or target protein Y.
  • the components of the determination kit I V are the same as those of the determination kit I except for the medium of (i i).
  • the medium on which the relationship between the effect of the physiologically active substance X and the expression level of the target gene Y is recorded may be data that stores data on the correlation between the expression level of the target gene Y and the sensitivity to the physiologically active substance X.
  • the expression level of the target gene Y in an animal highly sensitive to the physiologically active substance X can be increased (or decreased) as compared with an animal having low sensitivity.
  • Judgment kit IV enables easy determination of sensitivity to bioactive substance X. Therefore, the determination method IV is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X on a specific animal.
  • the present invention relates to target gene Y A method for determining sensitivity to a physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X is provided.
  • the determination method V includes the following steps (a) and (b): (a) measuring a polymorphism of the target gene Y in a biological sample collected from an animal;
  • Methodology including the steps (a) to (b) above is abbreviated as “methodology V I I I” as necessary.
  • Method V I I I step (a) is similar to method V I I step (a).
  • Methodology V II I In step (b), the effect of bioactive substance X on the disease or condition associated with bioactive substance X is evaluated based on the type of polymorphism of target gene Y. Specifically, first, the measured target gene Y polymorphism type is correlated with the target gene Y polymorphism type and the susceptibility to bioactive substance X in a disease or condition associated with bioactive substance X. Matched with gender data. The correlation can be determined by a method known per se.
  • the sensitivity to the biologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X is predicted from the collation result.
  • the combination of bioactive substance X and target gene Y is as described above. It is known that animals with high sensitivity to physiologically active substances often have a specific type of polymorphism in the target gene of the physiologically active substance. Therefore, it is possible to determine the sensitivity to bioactive substance X by analyzing the polymorphism. For example, when the physiologically active substance X is a drug, it is possible to determine the ease or difficulty of the drug, or the probability that a side effect of the drug will occur. Determination method V allows easy determination of sensitivity to physiologically active substance X in a disease or condition associated with physiologically active substance X. Therefore, the determination method V is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X.
  • the present invention also provides a determination kit that enables the determination method V to be easily performed. To do.
  • judgment kit V This judgment kit is abbreviated as “judgment kit V” as necessary.
  • the determination kit V includes the following (i), (ii):
  • the kit further comprises means for collecting a biological sample from an animal, a nucleic acid encoding a target gene ⁇ having a specific type of polymorphism, a nucleic acid encoding a target gene ⁇ ⁇ not having a specific type of polymorphism, and the like. May be included.
  • the components of the determination kit V are the same as those of the determination kit I I except for the medium of (i i).
  • the medium that records the relationship between the effect of bioactive substance X and the polymorphism of gene Y is the sensitivity to bioactive substance X in the disease or condition associated with bioactive substance X, and the type of polymorphism of target gene Y. It is possible to store data relating to the correlation between the two.
  • the target gene Y polymorphism type in animals with high susceptibility to bioactive substance X in diseases or conditions related to bioactive substance X has a higher binding ability to bioactive substance X compared to less sensitive animals ( (Or low) it can be like encoding a protein.
  • the determination kit V enables determination of sensitivity to the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X. Therefore, the determination kit V is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X.
  • the present invention relates to a target gene Y polymorphism.
  • a method for determining sensitivity to a physiologically active substance X in a disease or condition associated with a target gene Y comprising measuring a type. This judgment method is abbreviated as “judgment method V I” as necessary.
  • the determination method VI includes the following steps (a) and (b): (a) measuring a polymorphism type of the target gene Y in a biological sample collected from an animal;
  • the type of polymorphism used for determination of sensitivity changes the binding property of target protein Y to bioactive substance X.
  • a polymorphic type can be determined by a method known per se such as a binding assay.
  • animals with target genes that include polymorphic types that increase or decrease the binding ability to the physiologically active substance it is considered that the sensitivity to the physiologically active substance is high (or low) and the binding ability decreases.
  • Animals with target genes that contain such polymorphic types are considered less sensitive (or higher). Therefore, the sensitivity to bioactive substance X can be judged from the analysis of such polymorphic types.
  • Methodology including the steps (a) and (b) above in the determination method V I is the same as that of the method V I I I except for the type of the target gene Y polymorphism to be measured.
  • Determination method VI allows easy determination of sensitivity to bioactive substance X in a disease or condition associated with bioactive substance X. Therefore, the determination method VI is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X.
  • the present invention also provides a determination kit that makes it possible to easily perform the determination method VI.
  • the determination kit V I includes the following (i), (i i):
  • the kit further includes means for collecting a biological sample from an animal, a nucleic acid encoding a target gene Y having a specific type of polymorphism, a nucleic acid encoding a target gene Y not having a specific type of polymorphism, and the like. May be included.
  • the type of polymorphism used to determine the risk of onset changes the binding property of the target protein Y to the bioactive substance X.
  • Such polymorphic type can be determined by a method known per se such as binding assay.
  • the components of the determination kit V I are the same as the determination kit V except for the type of the target gene Y polymorphism to be measured.
  • the determination kit VI allows determination of sensitivity to the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X. Therefore, the determination kit VI is useful, for example, for evaluating the action of the physiologically active substance X in a disease or condition associated with the physiologically active substance X.
  • an entry-one vector was obtained by performing a BP reaction with the PCR cloning vector Gateway pDO NR201 using the Invitrogen Gateway system according to the protocol of the kit.
  • a destination vector for the Gateway system we used Toyobo's wheat germ extract.
  • a Gateway cassette containing Gateway recombination sequences was introduced so that the Gateway system could be used, and the N-terminal region of the expressed protein Then, a double tag destination vector modified by PCR was prepared so that a peptide having a histidine tag and a FLAG tag sequence was expressed.
  • the BP reaction was performed using the Invitrogen Gateway system according to the protocol, and transformed into the enterobacterial competent cell DH5a, and the clone into which the expression vector was introduced was selected. . Plasmids were prepared from the obtained clones using QIAfi Iter Midi kit (Qiagen) according to the kit protocol. The obtained plasmid was treated with phenol and Kuroguchi form and subjected to inactivation of RNase according to the protocol of PR0TEI0S (Toyobo) to obtain a purified expression plasmid.
  • QiAfi Iter Midi kit Qiagen
  • Recombinant proteins were synthesized by a cell-free protein synthesis system (PR 0TEI0S) using Toyobo's wheat germ extract.
  • MRNA was prepared from the expression plasmid obtained by the method described in 1. above according to the PR0TEI0S protocol.
  • protein was synthesized in two wells of a 96-well microtiter plate according to the PR0TEI0S protocol.
  • the synthesized protein is purified by high-speed centrifugation and purified using the ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (SIGMA) with anti-FLAG tag antibody immobilized on the obtained soluble fraction. Protein was obtained.
  • SIGMA ANTI-FLAG M2 Affinity Gel
  • the NT5 sensor chip surface NTA sensor chip for S51 was made using Biacore's commercially available S51 CM5 sensor chip with 1M EDC, 1.33M NHS and 16mg / m 1 AB-NTA (pH 9.2). .
  • the protein expressed in the wheat germ system and purified with the FLAG tag was immobilized. Immobilization, 0. 5M NiCl 2, 0. 4M EDC, 0. 1M EDC S ligand solution (Protein 1M Ethanolamine and pH 8.5 were sequentially injected into the Biacore S51 channel system.
  • PBS pH 7.4
  • the following assay was performed using a sensor chip on which a ligand was immobilized.
  • Running Buffer as HBS (10mM HEPES, 150mM NaCl, pH7 6.), 0. 005% P 2 0, 100 mineral ion cocktail (Ca (0Ac) 2, Zn (0Ac) 2 - 2H 2 0, Cu (OAc) 2 ⁇ H 2 0, Co (0Ac) 2 , 4H 2 0, Mn (OAc) 2 ⁇ 4H 2 0, Mg (0Ac) 2 ⁇ 4H 2 0, FeCl 3 ⁇ 6H 2 0) to DMS0 final 5%
  • the one prepared as described above was used.
  • the compound to be measured was prepared in 9points by 1/2 dilution from 62.5 ⁇ to 0.244 ⁇ M.
  • the solvent composition was adjusted to be the same as that of Running Buffer, and only the solvent containing no compound was prepared for 0 concentration measurement. Also, as a solution correction of DMS0 contained in the compound solution and running buffer, prepare the same solution as Running Buffer containing 3. 8-5.1% DMSO (8point). Correction was performed based on the measurement results.
  • the Biacore S51 Compound Characterization Assay program is implemented to measure the interaction between immobilized ligands (proteins) and analytes (compounds; 62.5 / ⁇ ⁇ to 0.244 / z M). The analysis was performed at
  • FLJ Screening of a new drug can be performed by acting a 10368-derived protein and a screening candidate substance. That is, by constructing a system that detects the interaction between a protein derived from FL J 10368 and a candidate substance, for example, by the method of Reference Example 2, screening of a new drug can be performed.
  • cephalexin interacts with FL J 1 2502-derived protein. Therefore, it was found that the protein derived from FLJ1 2 502 is a target protein of cephalexin. Based on this, it is possible to screen new medicines by allowing the F L J 1 2 502-derived protein and the screening agent to act. That is, a new drug can be screened by constructing a system that detects the interaction between the FL J 1 2502-derived protein and the candidate substance, for example, by the method of Reference Example 2.
  • the protein expression was purified from FLJ 1251 according to the method of Reference Example 1, and the interaction between aclarubicin and the protein purified from FLJ 1251 was analyzed according to the method of Reference Example 2.
  • the amount of binding increased depending on the dose of aclarubicin, and saturation of binding was observed at high doses, confirming that aclarubicin interacts specifically with the FL J 1 25 14-derived protein. It was done.
  • aclarubicin interacts with a protein derived from FL J 12514. Therefore, it was found that the protein derived from FLJ 1 2 5 14 is a target protein of aclarubicin. Based on this, it is possible to create a new medical treatment by selecting FLJ 1 2 5 14-derived protein and screening candidates. Drug screening can be performed. That is, a new drug can be screened by constructing a system in which the interaction between the protein derived from FLJ 12514 and the candidate substance is detected by, for example, the method of Reference Example 2.
  • the protein expression was purified from FLJ12514, and the interaction between thiabendazole and the protein purified from FLJ12525 was analyzed according to the method of Reference Example2.
  • the amount of binding increased depending on the dose of thiabendazole, and saturation of binding was observed at high doses, confirming that thiabendazole interacts specifically with the FL J 1254-derived protein. It was done.
  • cephalexin interacts with F L J 14583-derived protein. Therefore, it was found that the protein derived from FLJ14583 is a target protein of cephalexin. Based on this, screening of a new drug can be performed by allowing a protein derived from FLJ 14 583 and a screening candidate substance to act. That is, a new drug can be screened by constructing a system that detects the interaction between a protein derived from FL J 1458 3 and a candidate substance by, for example, the method of Reference Example 2.
  • Protein expression was purified from FLJ 1458 3 according to the method of Reference Example 1, and the interaction between imipenem and the protein purified from FLJ 14583 was analyzed according to the method of Reference Example 2.
  • the protein derived from FLJ14583 is a target protein of imipenem. Based on this, screening of a new drug can be performed by reacting the protein derived from FLJ14583 and a screening candidate substance. That is, by constructing a system in which the interaction between the FL J 14583-derived protein and the candidate substance is detected by, for example, the method of Reference Example 2, screening of a new drug can be performed.
  • the target protein and target gene of the present invention are useful for the development of physiologically active substances, such as drug discovery.
  • the screening method of the present invention and the method of producing the derivative of the present invention are useful for the development of prophylactic / therapeutic agents for various diseases or conditions, and research reagents for the diseases or conditions.
  • the modulators and derivatives of the present invention are useful for the prevention and treatment of various diseases or conditions, and as reagents for studying the diseases or conditions.
  • the complex opi kit of the present invention is useful for the screening method of the present invention, the method for producing the derivative of the present invention, and the like.
  • the determination method and determination kit of the present invention are useful for evaluating the onset or possibility of onset of various diseases or conditions in animals, and for evaluating sensitivity to physiologically active substances.
  • the target protein and target gene of the present invention enable the development of physiologically active substances, such as drug discovery.
  • the screening method of the present invention and the method of producing the derivative of the present invention make it possible to develop a prophylactic / therapeutic agent for various diseases or conditions, and a reagent for studying the disease or condition.
  • the modulators and derivatives of the present invention make it possible to prevent or treat various diseases or conditions, as well as reagents for studying the diseases or conditions.
  • the complex and kit of the present invention enable execution of the screening method of the present invention, production of the derivative of the present invention, and the like.
  • the determination method and determination kit of the present invention make it possible to evaluate the onset or possibility of onset of various diseases or conditions in animals and to evaluate the sensitivity to physiologically active substances.

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Abstract

本発明は、薬物等の生理活性物質の標的タンパク質及び標的遺伝子、およびこれらを用いる新規生理活性物質を開発し得る手段を提供する。具体的には、生理活性物質の標的タンパク質および標的遺伝子；生理活性を調節し得る物質のスクリーニング方法；生理活性の調節剤；生理活性物質誘導体の製造方法；生理活性物質と標的タンパク質とを含む複合体、および当該複合体の製造方法；並びに生理活性物質またはその塩を含むキット；所定の疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法、生理活性物質に対する感受性の判定方法、および当該判定方法に用いられる判定用キットなどを提供する。

Description

明細書
創薬標的タンパク質及び標的遺伝子、 並びにスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 生理活性物質の開発、 例えば創薬に有用な標的タンパク質および標 的遺伝子；生理活性物質のスクリ一二ング方法およぴ該スタリ一ユング方法によ り得られる物質；生理活性の調節剤；生理活性物質の誘導体おょぴ該誘導体の製 造方法；ならびに生理活性物質とその標的タンパク質とを含む複合体おょぴ当該 複合体の製造方法などに関する。 背景技術
従来、 新薬開発研究は極めて成功率の低いものであり、 約 100個の研究プロジ ェクトのうち上市にまで至るものは 1〜 2個にすぎない （D. Brown and G. Supe rti-Furga, Drug Discovery Today, Dec, 2003)。 これは多くの場合、開発候捕化 合物の経済性、 安全性あるいは効能のいずれかに問題が生じ、 開発が中止されて しまうことによる （Diraasi, Clin Pharmacol Ther, 69, 297—307， 2001)。
製薬企業は売上高の 1 0〜20%を研究開発費に費やしており、研究開発費の効率 的な運用が企業の競争力を確保するために極めて重要である。 さらに研究開発費 の約 80%が開発段階における高コストの臨床試験に費やされるため、開発段階に 移行する前の初期段階で適切な候^！化合物の選択を行うことが最も重要であると いえる。
—方、 近年、 世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進 められており、 特にヒ トのゲノムについては世界的な協力体制のもとでその解析 が進められて、 2 0 0 3年 4月に全配列解析の終了が宣言された。 全ゲノム配列 が解明されたことにより、 全ての遺伝子の機能や制御、 あるいは遺伝子間、 タン パク質間、 細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な 生命現象を解析することが可能になりつつある。 このようなゲノム情報は単に学 術分野における重要性のみならず、 医薬品開発等の各種産業にも大きな変革をも たらしている。
例えば、これまでに汎用されてきた医薬品の標的タンパク質は約 480種であり、 また、 それら標的タンパク質は、 膜受容体、 酵素、 イオンチャネル、 あるいは核 内受容体等に限定されることが報告ざれている （J. Drews, Science, 297, 1960 -1964, 2000) 0 これに対して、 ゲノム情報に基づく標的タンパク質探索が行われ ることによって、従来の標的タンパク質の範疇に属さない新規タンパク質も含め、 極めて多数の標的タンパク質が次々と見出され、 その総数は約 1, 500種類になる のではないかと予想されている （A. L. Hopkins & C. R. Groom, Nature Review s ; Drug Discovery, 1， 727-730， 2002)。
し力 し、 ゲノム情報のような大量のデータに対応するためのインフラ整備と、 臨床開発費用の高騰等によって、 製薬企業の研究開発費はますます増大している にも関わらず、 新薬の承認数はむしろ減少する傾向にある （Nature Reviews ; Dr ug Discovery, Feb, 2003)。 これは、 上記のようなゲノム情報の活用が実際には 効率的に行われていないことを示している。
これらの状況を解決するための手段として、 永島らは 「医療おょぴ他の用途に 用いる化合物の発見おょぴ創製のための方法、 システム、 装置、 および機器」 を 発明し、 特許出願した （特表 2 0 0 4 - 5 0 9 4 0 6号公報)。
この出願では、 化合物とタンパク質との相互作用を評価するために有用であり かつ医療おょぴ他の分野における化合物の発見を目的とするそのような評価の結 果として生ずる情報を利用するために有用な方法、 システム、 データベース、 ュ 一ザ一インターフェース、 ソフトウェア、 媒体、 およびサービスが開示されてお り、 さらに創薬のための新規標的タンパク質の非常に大きなプール、 新規薬物を 設計するための新規な方法およぴ治療的な目的のための従前には思いもよらない 仮想的に合成された低分子のプールを生成することをめざした。 ' 詳細には、 この出願には、 以下の工程を含む、 新規の創薬標的として適当であ るタンパク質または部分タンパク質を同定する方法： ( i ) 選択された標的化合物に対して所望の親和性および特異性をもつ複数のタ ンパク質または部分タンパク質を選択する工程；
( i i ) 該タンパク質または該部分タンパク質の構造および機能を特定するェ 程；および
( i i i ) 所望の機能をもつ単一タンパク質または単一部分タンパク質を選択す る工程
であり、 また、 以下の段階を含む、 薬物の発見方法：
( i ) 上記の方法を用いて選択された該標的化合物の化学構造を検討する工程； および
( i i ) 選択された該標的化合物の構造を化学的に修飾して、 新規の薬物標的と して適当である該タンパク質または該部分タンパク質に対して、 修飾された化合 物の親和性および特異性を最適化する工程
が開示されていた。
さらにここで開示された方法の特徴は、 選択された該標的化合物が医療用とし て承認されたものであることであった。
従来、使用されてきた医薬品には、その標的タンパク質が知られていないもの、 あるいは標的タンパク質が知られていても、 そのタンパク質を介したメカニズム では、 その医薬品の薬効や副作用のすべてを説明できないもの、 が数多く存在す る。
代表的な例として、 最も古くから使われてきた医薬品のひとつであるァスピリ ンの例を挙げることができる。 ァスピリンは 100年以上前にはじめて市販された 当時は、 その抗炎症作用のメカニズムは不明であった。 それから約 70年を経て、 ァスピリンがシクロォキシゲナーゼ（C0X)阻害作用を有することが明らかになつ た。 その後さらに 20年を経て、 C0Xには COX- 1 と C0X-2のサブタイプが存在し、 ァスピリンの主薬効は C0X- 2阻害によるものであり、 COX- 1阻害作用が胃腸障害 等の副作用の原因であることが解明された。 しかし、 それでもまだ、 アスピリン の標的タンパク質の全てが明らかになつたわけではない。 近年、 アスピリンに制 癌作用ゃ抗痴呆作用があることが臨床的に明らかになっているが、 これらの薬効 は C0X阻害では説明できない。 一方、 最近になってアスピリンが ΙΚΚ のような 転写因子や PPAR- γのような核内受容体に作用するとの報告が数多くなされてい るが、 これらとァスピリンの種々の薬効との関連は今のところ明確ではない。 このようなことから、 従来使用されてきた医薬品の標的タンパク質を解明する ことは、 新規の創薬標的タンパク質を発見するうえで、 非常に有効な方法である といえる。
また、 上記の公開特許の発明者の一人である平山らは、 日本国内で市販されて いる約 1, 500種類の医薬品について、 それらの構造と物性データを統合したデー タベースを作成し、 既存の医薬品化合物に共通の構造的な特徴があることを見出 している （Chem- Bio Informatics Journal, 1， 18 - 22, 2001)。従来汎用されてき た医薬品は、 その開発過程において、 体内移行性や安全性の問題をクリアしてき た優等生である。それら医薬品をプローブとして新規標的タンパク質探索を行い、 さらにそれら医薬品の構造を基に新規開発候補化合物を考案することは、 非常に 合理的かつ効率的と考えられる。
次に、 新規標的タンパク質を探索する過程において、 どのようにゲノム情報を 活用していくかが問題となる。 単にゲノム配列が決定されただけで、 全ての遺伝 子の機能が明らかになり、 創薬標的タンパク質が見出されるわけではない。 ヒ ト には約 3〜 4万種類の遺伝子が存在すると推測されており、 さらにオルタナティ ブスプライシングによるバリアントも考慮に入れると 1 0万種以上の m R N Aが 存在すると言われている。 そこで、 ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量 の新しい遺伝子のなかで、 医薬品開発等の産業利用において有用な機能を有する ものを、 効率的に選別同定していくことが重要となる。
真核生物のゲノム配列は多くの場合、 一つの遺伝子がィントロンによって複数 のェキソンに分断されているため、 遺伝子の配列情報だけからそれによつてコー ドされるタンパク質の構造を正確に予測することはできない。 これに対して、 ィ ントロンが除かれた m R N Aから作製される c D N Aでは、 タンパク質のアミノ 酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、 容易にその一次構 造を明らかにすることが可能である。
特に完全長 c D N Aを対象とした解析を行うことにより、 その 5 ' 末端配列か らゲノム配列上での m R N A転写開始点が特定できる上、 その配列の中に含まれ る m R N Aの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。 また、 翻訳開始点である A T Gコ ドンを 5， 側に含むことから、 正しいフレーム でタンパク質への翻訳を行うことができる。 したがって、 適当な遺伝子発現系を 適用することで、 その c D N Aがコードするタンパク質を大量に生産したり、 タ ンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。 このよう に、 全長 c D N Aから発現されたタンパク質を用いた解析を行うことにより、 ゲ ノム配列解析のみでは得られない重要な情報が得られ、 さらには従来の創薬標的 タンパク質の範疇に属さないような新規標的タンパク質を発見することが可能で あると考えられる。 発明の開示
本発明は、 生理活性物質開発 （例えば、 創薬） の標的タンパク質および標的遺 伝子、 並びにこれらを利用する新規生理活性物質を開発し得る種々の手段などを 提供することを目的とする。
本発明者らは、 ヒトタンパク質と医薬品または生理活性物質として使用されて きた化合物の相互作用を表面プラズモン共鳴で解析することにより、 新規医薬ま たは生理活性物質の開発に有用であり得る新規創薬標的タンパク質について鋭意 探索したところ、 生理活性物質の開発、 例えば創薬に有用な新規標的タンパク質 および新規標的遺伝子を見出した。 この知見より、 本発明者らは、 これらの遺伝 子の発現または機能を調節する物質が、 種々の生理活性を調節し得る物質である こと、 並びに種々の生理活性を調節し得る物質を開発するためには、 これらの遺 伝子の発現または機能を調節する物質をスクリーニングすればよいこと、 あるい はこれらの生理活性物質を、 その標的遺伝子の発現または機能を調節し得るよう に誘導体化すればよいことなどを着想し、 本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、 下記の通りである ：
〔 1〕 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリ一二ング方法で あって、
被験物質が標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能 を調節し得るか否かを評価することを含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが以下 （a 1) 〜 （a 5) (本明 細書中以下、 必要に応じて、 「組合せ A」 と省略する） のいずれかである、 方法： (a 1) チアベンダゾールと、 FL J 10368、 F L J 1 2389または F L J 125 14由来タンパク質との組合せ；
(a 2) レセルピンと、 F L J 10 368由来タンパク質との組合せ；
(a 3) イミぺネムと、 F L J 1 2435または F L J 14583由来タンパク 質との組合せ；
(a 4) セファレキシンと、 FL J 1 2502、 F L J 1458 3または F L J 3 1 146由来タンパク質との組合せ；
(a 5) アクラルビシンと、 F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ。
〔2〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 上記 〔1〕 の方法：
(a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の存在下における該タンパク質の機能レベルを測定し、 該機能レ ベルを被験物質の非存在下における該タンパク質の機能レベルと比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 該タンパク質の機能レベルの変化をも たらす被験物質を選択する工程。
〔3〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 上記 〔1〕 の方法：
(a) 被験物質と標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現を測定 可能な細胞とを接触させる工程；
(b) 被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定し、 該発現量 を被験物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較する工程； (c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 該遺伝子の発現量を調節する被験物質 を選択する工程。
〔4〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 上記 〔1〕 の方法：
(a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定する工程；
(c) 上記 （b) の結果に基づいて、 該タンパク質に結合能を有する被験物質を 選択する工程。 '
〔5〕 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 上記 〔1〕 の方法：
(a) 被験物質、 標的タンパク質 Y結合性物質を標的タンパク質 Yに接触させる 工程；
(b) 被験物質の存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に 対する結合能を測定し、 該結合能を被験物質の非存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に対する結合能と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 標的タンパク質 Y結合性物質の該タン パク質に対する結合能の変化をもたらす被験物質を選択する工程。
〔6〕 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物質のスクリーニング方法 であって、
標的タンパク質 Yに対する被験物質の結合能またはそれに関連する作用を、 標 的タンパク質 Yに対する生理活性物質 Xの結合能またはそれに関連する作用と比 較することを含み、
標的タンパク質 Yと生理活性物質 Xとの組合せが以下 （b 1) 〜 （b 7) (本明 細書中以下、 必要に応じて、 「組合せ B」 と省略する） のいずれかである、 方法： (b 1) F L J 1 0368由来タンパク質と、 チアベンダゾール、 レセルピンま たは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 2) F L J 1 23 89由来タンパク質と、 チアベンダゾールまたは該タンパ ク質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 3) FL J 1 2435由来タンパク質と、 ィミぺネムまたは該タンパク質に 結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 4) FL J 1 2502由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 5) F L J 1 25 14由来タンパク質と、 アクラルビシン、 チアベンダゾー ルまたは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 6) F L J 14583由来タンパク質と、 セファレキシン、 ィミぺネムまた は該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 7) FL J 3 1 146由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ。
〔7〕 上記 〔1〕 〜 〔6〕 のいずれかの方法により得られる物質。
〔8〕上記〔1〕〜〔6〕 のいずれかの方法により得られる物質を含有してなる、 生理活性の調節剤。
〔 9〕 生理活性物質 Xに関連する作用の調節剤であって、
標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調節する 物質を含有してなり、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aのいずれかである、 剤。
〔10〕 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調 節する物質が、 該遺伝子の発現または機能を抑制する物質である、 上記 〔9〕 の 剤。
〔1 1〕 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を抑 制する物質が、 アンチセンス核酸、 リポザィム、 デコイ核酸、 s i RNA、 抗体 またはドミナントネガティブ変異体、 あるいはそれらの発現ベクターである、 上 記 〔10〕 の剤。
〔1 2〕 標的タンパク質 Y、 または該タンパク質をコードする核酸を含む発現べ クタ一を含有してなる、 上記 〔9〕 の剤。
〔1 3〕 標的タンパク質 Υに関連する機能の調節剤であって、 生理活性物質 Xを含有してなり、
標的タンパク質 Yと生理活性物質 Xとの組合せが組合せ Bのいずれかである、 剤。
〔1 4〕 生理活性物質 Xの誘導体の製造方法であって、
標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調節し得 るように生理活性物質 Xを誘導体化することを含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aのいずれかである、 方法。
〔1 5〕 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物質の誘導体の製造方法 であって、
標的タンパク質 Yに対する結合能を調節し得るように生理活性物質 Xを誘導体 化することを含み、
標的タンパク質 Yと生理活性物質 Xとの組合せが組合せ Bのいずれかである、 方法。
〔1 6〕 上記 〔1 4〕 または 〔1 5〕 の方法により得られる、 生理活性物質の誘 導体。
〔1 7〕 上記 〔1 4〕 または 〔1 5〕 の方法により得られる生理活性物質の誘導 体を含有してなる、 生理活性の調節剤。
[ 1 8〕 生理活性物質 Xとその標的タンパク質 Yとを含む複合体であって、 生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aあるいは組合せ Bの いずれかである、 複合体。
〔1 9〕生理活性物質とその標的タンパク質とを接触させることを含む、上記〔1 8〕 の複合体の製造方法。
〔2 0〕 キットであって、 以下 （ i )、 （ i i ) ：
( i ) 生理活性物質 Xまたはその塩；
( i i ) 標的タンパク質 Y、 該タンパク質をコードする核酸、 該核酸を含む発現 ベクター、 標的タンパク質 Υまたはそれをコードする遺伝子の発現を測定可能な 細胞、 あるいは標的タンパク質 Yをコードする遺伝子の転写調節領域および該領 域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む発現ベクター；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Υとの組合せが組合せ Αあるいは組合せ Βの いずれかである、 キット。
〔2 1〕 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパ ク質 Yの機能に関連する疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法であ つて、 以下の工程 （a )、 ( b ) ：
( a ) 動物から採取した生体試料において標的タンパク質 Yまたはそれをコード する遺伝子の発現量および または多型を測定する工程；
( b ) 測定された発現量および/または多型に基づき疾患または状態の発症また は発症可能性を評価する工程；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aあるいは組合せ Bの いずれかである、 方法。
〔2 2〕 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパ ク質 Yの機能に関連する疾患または状態の発症または発症リスクの判定用キット であって、 以下 （i )、 （ i i ) ：
( i ) 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現量および または 多型を測定し得る手段；
( i i ) 該疾患または状態と該発現量おょぴ または多型との関係を記録した媒 体；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aあるいは組合せ Bの いずれかである、 キット。
〔2 3〕 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパ ク質 Yの機能に関連する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性 の判定方法であって、 以下の工程 （a )、 ( b ) ：
( a ) 動物から採取した生体試料において標的タンパク質 Yまたはそれをコード する遺伝子の発現量および/または多型を測定する工程；
( b ) 測定された発現量および/または多型に基づき生理活性物質の効果を予測 する工程；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aあるいは組合せ Bの いずれかである、 方法。
[ 2 4 ] 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパ ク質 Yの機能に関連する疾患または状態に対する生理活性物質 Xに対する感受性 の判定用キットであって、 以下 （ i )、 （ i i ) ：
( i ) 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現量およびノまたは 多型を測定し得る手段；
( i i ) 生理活性物質 Xの効果と該発現量および Zまたは多型との関係を記録し た媒体；を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが組合せ Aあるいは組合せ Bの いずれかである、 キット。 発明を実施するための最良の形態
1 . 生理活性物質の標的タンパグ質及び標的遺伝子
本発明は、 生理活性物質開発の標的タンパク質および標的遺伝子を提供する。 生理活性物質とは、 生体に何らかの作用を及ぼす任意の物質を意味する。 生理 活性物質は、 薬物、 ビタミン、 生薬成分、 食品成分等の外因性物質、 ならびにサ イト力イン、 成長因子、 ホルモン等の内因性物質であり得る。 所定の生理活性物 質を意図する場合、 必要に応じて、 生理活性物質 Xと表現する。
生理活性物質 Xとしては、 後述する標的タンパク質 Yまたはそれをコードする 遺伝子の発現または機能を調節し得る生理活性物質、 例えば、 標的タンパク質 Y に結合能を有する生理活性物質が挙げられる。 詳細には、 生理活性物質 Xは、 チ ァベンダゾー/レ、 レセノレピン、 イミぺネム、 セファレキシンまたはアクラ レビシ ン、 あるいは標的タンパク質 Yに結合能を有するそれらの誘導体（後述）、 あるい はそれらの塩であり得る。
また、 生理活性物質は、 その調節可能な活性の種類の観点から、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質、 および標的タンパク質 Yに関連する機能を 調節し得る物質に大別することもできる。
生理活性物質開発の標的タンパク質、 標的遺伝子は、 好ましくは、 創薬の標的 タンパク質、 標的遺伝子であり得る。 なお、 所定の標的タンパク質、 所定の標的 遺伝子を意図する場合、 必要に応じて、 標的タンパク質 Y、 標的遺伝子 Υとそれ ぞれ表現する。 また、 タンパク質は翻訳産物と、 標的遺伝子 Υは標的タンパク質 Υをコードする遺伝子とそれぞれ同義であり、 交換可能に使用される。
例えば、 標的タンパク質 Υは、 上記生理活性物質 Xの標的タンパク質であり得 る。 詳細には、 標的タンパク質 Υは、 FL J 10368、 FL J 1 23 89、 F L J 1 2435、 F L J 1 2502、 F L J 1 25 14, FL J 14583また は FL J 3 1 146由来タンパク質であり得る。
F L J XXXXX由来タンパク質は、 所定の FLJ番号、 あるいはそれに対応す る GenBankァクセッション番号、 H- Inv cDNA IDまたは H- Invローカス IDを有す るヒ トタンパク質であり得る。 このようなタンパク質は、 FL J XXXXX、 あ るいはそれに対応する GenBankァクセッション番号、 H- Inv cDNA IDまたは H- In vローカス ID (例えば、 表 1参照） に登録されているアミノ酸配列からなるタン パク質または該アミノ酸配列を含むタンパク質 （例えば、 全長タンパク質） であ り得る。 なお、 本明細書中、 本発明の標的タンパク質は、 上記のヒトタンパク質 に限定されず、 異種動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ィヌ、 サル等） 由来のオル ソログをも含む。 FL J番号は、 例えば、 F L J—DBホームページにて検索可 能である。 参考のため、 各タンパク質についてヒトタンパク質を取り上げ、 諸情 報並びに本発明者らにより見出された結合する生理活性物質の例を、 表 1にそれ ぞれ示す。
Figure imgf000014_0001
また、 本発明によれば、 生理活性を有する'、 F L J XXXXX由来タンパク質 の変異タンパク質 （以下、 必要に応じて、 変異タンパク質と省略する。 また、 F L J XX XXX由来タンパク質または生理活性を有するその変異タンパク質を、 必要に応じて、単に F L J XXXXX由来タンパク質と省略する）が提供される。 該変異タンパク質は、 生理活性物質との相互作用により調節され得る生理活性を 有するタンパク質である限り特に限定されず、 例えば、 人工変異体または天然変 異体 （例えば、 スプライシングバリアント、 または SNP、 ハプロタイプ等の多 型を有するタンパク質） が挙げられる。
詳細には、 このような変異タンパク質は、 F L J 10368、 F L J 1 238 9、 FL J 1 2435, F L J 1 2502, F L J 1 25 14, F L J 1458 3または F L J 3 1 146由来タンパク質がコードするアミノ酸配列において、 1又は複数のアミノ酸が置換、 欠失、 付加または揷入されたアミノ酸配列からな り、 且つ生理活性物質との相互作用により調節され得る生理活性を有するタンパ ク質であり得る。 置換、 欠失、 付加または揷入されるアミノ酸の数は、 機能が保 持される限り限定されないが、 例えば約 1〜50個、 好ましくは約 1〜30個、 より好ましくは約 1〜20個、 さらにより好ましくは約 1〜10個、 最も好まし くは 1〜5個あるいは 1または 2個である。 アミノ酸の置換、 欠失、 付加または 挿入が施される部位は、 機能が保持される限り限定されないが、 例えば、 機能上 重要なドメイン以外の部位であり得る。
変異タンパク質はまた、 F L J 1 0368、 FL J 1 2 389、 F L J 1 24 35、 F L J 1 2502、 F L J 1 25 14、 FL J 14583または FL J 3 1 146由来タンパク質がコードするアミノ酸配列において、 例えば約 50%以 上、 好ましくは約 70 %以上、 より好ましくは約 80 %以上、 さらにより好まし くは約 90 °/0以上、 最も好ましくは約 95 %以上の相同性 （伹し、 100 %の相 同性を除く） を有するアミノ酸配列からなり、 且つ生理活性物質との相互作用に より調節され得る生理活性を有するタンパク質であり得る。 ここで、 上記相同性 の数値は、 配列解析ソフトウェアである DNAS I S (日立ソフトウェアェンジ ニアリング） を用いて、 例えば、 マキシマムマッチング法のコマンドを実行する ことにより算出される。 その際のパラメータ一は、デフォルトの設定（初期設定） とする。
本発明の標的タンパク質を使用する場合、 該タンパク質は標識されていても未 標識であってもよく、 また、 標識タンパク質と未標識タンパク質を所定の割合で 含む混合物も使用できる。 標識用物質としては、 例えば、 F I T C、 FAM等の 蛍光物質、 ノレミノール、 ルシフェリン、 ルシゲニン等の発光物質、 3H、 14 C、 3 2 P、 35 S、 1 23 I等の放射性同位体、 ビォチン、 ストレプトアビジン等の親和 性物質などが挙げられる。
本発明の標的遺伝子は、 本発明の標的タンパク質をコードするものである限り 限定されない。 例えば、 本発明の標的遺伝子は、 上記アミノ酸配列を含むタンパ ク質に対応するものであり得る。例えば、上記アミノ酸配列を含むタンパク質は、 表 1に示される F L Jヌクレオチド配列ァクセッション番号に相当するヌクレオ チド配列を有する cDNAクローンに対応するものであり得る。 そして、例えば H - 1 nvitational Database (H- InvDB)においてはヒ トゲノム上で遺伝子領域を共有す る cD皿クローンがクラスターとして分類されており、本発明のタンパク質に対応 する cDNAクローンには各々表 1に示される H- Inv c腿 IDが対応付けられており その遺伝子ローカスとして H- Inv ローカス IDが対応付けられている。 従って、 本発明の標的遺伝子は、 表 1に記載される F L Jヌクレオチド配列ァクセッショ ン番号の cDNA、 H- InvDBの H- Inv cDNA IDの cDNAクラスターあるいは H - Inv 口 一カス IDに対応する遺伝子又はその変異遺伝子であり得る。
また、 本発明の標的遺伝子は、 表 1に示される F L Jヌクレオチド配列ァクセ ッシヨン番号に相当するヌクレオチド配列と相補的な配列に対してストリンジェ ント条件下でハイプリダイズするヌクレオチド配列からなり、 且つ生理活性物質 に対して相互作用を示すタンパク質に対応する遺伝子であり得る。 ここで、 スト リンジェント条件下でハイブリダィズするとは、 例えば、 6 X S S C、 0. 5 % SD S、 5 0 %ホルムアミ ドの溶液中で 4 2 °Cにて加温した後、 0. 1 X S S C、 0. 5 % S D Sの溶液中で 6 8°Cにて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブ リダイゼーションシグナルが観察されることを意味する。
本発明の標的タンパク質および標的遺伝子は、 生理活性物質 Xに関連する疾患 または状態、 または標的遺伝子 Y (もしくは標的タンパク質 Y) に関連する疾患 または状態に対する医薬の開発、 あるいは該疾患または状態に対する研究用試薬 の開発などに使用され得る。 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態、 標的遺 伝子 Yに関連する疾患または状態について以下詳述する。
(生理活性物質 Xに関連する疾患または状態）
「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」 とは、 生理活性物質 Xが適用さ れる疾患または生理活性物質 Xの副作用に相当する疾患、 あるいは生理活性物質 Xの適用が所望される状態 （例えば、 生理活性物質 Xが欠乏した状態） または生 理活性物質 Xにより引き起こされる望ましくない状態 （例えば、 生理活性物質 X の過剰摂取により引き起こされる望ましくない状態）に相当する状態を意味する。 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態は、 生理活性物質 Xにより改善または 増悪され得る。 .
「生理活性物質 Xに関連する作用」 とは、生理活性物質 Xが実際に示す作用（薬 理作用、副作用を含む）と同種の作用または反対の作用を意味する。換言すれば、 生理活性物質 Xに関連する作用は、 「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」 の改善または増悪を引き起こし得る作用である。即ち、「生理活性物質 Xに関連す る作用」 は、 生理活性物質 Xがレセルピンである場合には血圧低下作用 '血圧上 昇作用等を示す。
「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」、 「生理活性物質 Xに関連する作 用」 は、 生理活性物質 Xの種類に応じて異なる。 以下、 生理活性物質 Xとして代 表的な物質を取り上げ、「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」について説 明する。 なお、 「生理活性物質 Xに関連する作用」 は、 「生理活性物質 Xに関連す る疾患または状態」 の改善または増悪を引き起こし得る任意の作用であるため、 「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」 の説明により 「生理活性物質 Xに 関連する作用」 についても自ずと明らかになるであろう。
チアベンダゾール
チアベンダゾールに関連する疾患とは、 チアベンダゾールが適用される疾患ま たはチアベンダゾールの副作用に相当する疾患を意味する。チアベンダゾールは、 駆虫剤などとして知られている。 チアベンダゾールが適用される疾患としては、 糞線虫による寄生虫症等が例示される。 一方、 チアベンダゾールの副作用として は、 錯乱、 幻覚、 異常な興奮、 ひきつけ、 激しい下痢、 ショック、 皮膚の水疱、 剥離、 ひどい痒みと発疹、 寒気、 悪寒、 発熱、 筋肉痛、 関節痛、 異常な倦怠感、 脱力、 ものが霞む、黄色くみえる、褐色尿、血尿、腰背部痛、皮膚や目が黄色い、 便が白っぽい、 めまい、 ふらつき感、 耳鳴り、 頭重感、 目や口が乾く、 食欲低下 等が例示される。 チアベンダゾールに関連する作用は、 その標的タンパク質 （標 的遺伝子）、例えば F L J 1 0 3 6 8、 F L J 1 2 3 8 9または F L J 1 2 5 1 4 由来タンパク質と密接に関係し得る。
レセノレピン
レセルピンに関連する疾患とは、 レセルピンが適用される疾患またはレセルピ ンの副作用に相当する疾患を意味する。 レセルピンは、 高血圧症治療剤、 精神神 経疾患治療剤などとして知られている。 レセルピンが適用される疾患としては、 高血圧症 （本態性）、 高血圧症 （腎性等）、 悪性高血圧 (他の降圧剤と併用する）、 フエノチアジン系薬物の使用困難な統合失調症等が例示される。 一方、 レセルピ ンの副作用としては、 うつ状態、 悪夢、 眠気、 性欲減退、 神経過敏、 めまい、 頭 痛、 全身振戦、 錐体外路症状、 発疹、 徐脈、 浮腫、 胃潰瘍、 ロ渴、 下痢、 食欲不 振、 悪心 ·嘔吐、 軟便、 鼻閉、 けん怠感、 呼吸困難、 体重増加等が例示される。 なお、 レセルピンの標的としては、 シナプス小胞ァミントランスポーターおよび ァクチンが知られている。 レセルピンに関連する作用は、その標的タンパク質（標 的遺伝子）、 例えば F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質と密接に関係し得る。
ィミぺネム
イミぺネムに関連する疾患とは、 イミぺネムが適用される疾患またはイミぺネ ムの副作用に相当する疾患を意味する。 イミぺネムは、 力ルバぺネム系抗生物質 製剤などとして知られている。 イミぺネムの適応菌種としては、 イミぺネムに感 性のプドウ球菌属、 レンサ球菌属、 肺炎球菌、 腸球菌属、 大腸菌、 シトロバクタ ー属、 クレブシエラ属、 ェンテロパクター属、 セラチア属、 プロテウス属、 モル ガネラ 'モルガニー、 プロビデンシァ属、インフルエンザ菌、シユードモナス属、 緑膿菌、 バークホルデリア 'セパシァ、 ァシネトパクター属、 ぺプトストレプト コッカス属、 パクテロイデス属、 プレボテラ属等が例示される。 イミぺネムが適 用される疾患としては、 敗血症、 感染性心内膜炎、 外傷 ·熱傷及び手術創等の二 次感染、 骨髄炎、 関節炎、 急性気管支炎、 肺炎、 肺膿瘍、 膿胸、 慢性呼吸器病変 の二次感染、 膀胱炎、 腎盂腎炎、 前立腺炎 （急性症、 慢性症）、 腹膜炎、 胆嚢炎、 胆管炎、肝膿瘍、バルトリン腺炎、子宮内感染、子宮付属器炎、子宮旁結合織炎、 角膜炎 （角膜潰瘍を含む）、 眼内炎 （全眼球炎を含む） 等が例示される。 一方、 ィ ミぺネムの副作用としては、 痙攣、 呼吸停止、 意識障害、 意識喪失、 呼吸抑制、 錯乱、 不穏、 ショック、 アナフィラキシー様症状、 皮膚粘膜眼症候群 （Stevens - Johnson症候群）、 中毒性表皮壊死症、 劇症肝炎、 肝炎、 肝不全、 黄疸、 喘息発作 及び誘発、 発熱、 咳嗽、 呼吸困難、 胸部 X線異常、 好酸球増多等を伴う間質性肺 炎、 PIE症候群、 汎血球減少症、 骨髄抑制、 無顆粒球症、 溶血性貧血、 急性腎不 全、尿崩症、偽膜性大腸炎、血栓性静脈炎、発疹、 そう痒、発熱、蓴麻疹、潮紅、 紅斑、 顆粒球減少、 好酸球増多、 好塩基球増多、 リンパ球増多、 血小板減少及び 増多、 赤血球減少、 へモグロビン減少、 へマトクリツト減少、 AST (GOT)上昇、 AL T (GPT)上昇、 LDH上昇、 A1-P上昇、 γ - GTP上昇、尿ゥロビリノーゲン上昇、乏尿、 BUN上昇、 血清クレアチュン上昇、 頻尿、 血中アミラーゼ上昇、 舌変色、 腹痛、 下痢、 嘔気、 嘔吐、 食欲不振、 幻覚、 譫妄、 しびれ感、 振戦、 口内炎、 カンジダ 症、 ビタミン K欠乏症状 (低プロ.トロンビン血症、 出血傾向等）、 ビタミン B群欠 乏症状 （舌炎、'口内炎、 食欲不振、 神経炎等）、 頭痛、 倦怠感、 浮腫、 胸痛、 味覚 異常、 注射部位の疼痛及び硬結、 血清ナトリゥム低下、 血清力リゥム上昇 ·低下 等が例示される。 なお、 イミぺネムの標的としては、 ペニシリン結合タンパク質 ( P B P s ) 2およびナトリウム依存性ドーパミン輸送体が知られている。 イミ ぺネムに関連する作用は、その標的タンパク質（標的遺伝子）、例えば F L J 1 2 4 3 5または F L J 1 4 5 8 3由来タンパク質と密接に関係し得る。
セファレキシン セファレキシンに関連する疾患とは、 セファレキシンが適用される疾患または セファレキシンの副作用に相当する疾患を意味する。 セファレキシンは、 持続性 経口用セフエム系抗生物質製剤などとして知られている。 セファレキシンの適応 菌種としては、セファレキシンに感性のブドウ球菌属、レンサ球菌属、肺炎球菌、 大腸菌、 クレブシエラ属、 プロテウス ' ミラビリス等が例示される。 セファレキ シンが適用される疾患としては、 表在性皮膚感染症、 深在性皮膚感染症、 リンパ 管 · リンパ節炎、 慢性膿皮症、 外傷 ·熱傷及び手術創等の二次感染、 乳腺炎、 咽 頭，喉頭炎、 扁桃炎 （扁桃周囲炎を含む）、 急性気管支炎、 肺炎、 慢性呼吸器病変 の二次感染、 膀胱炎、 腎盂腎炎、 前立腺炎 （急性症、 慢性症）、 バルトリン腺炎、 涙嚢炎、 麦粒腫、 外耳炎、 中耳炎、 副鼻腔炎、 歯周組織炎、 歯冠周囲炎、 顎炎、 抜歯創 · 口腔手術創の二次感染等が例示される。 一方、 セファレキシンの副作用 としては、 ショ ック、 アナフィラキシー様症状、 急性腎不全、 溶血性貧血、 偽膜 性大腸炎、 皮膚粘膜眼症候群 （Stevens- Johnson症候群）、 中毒性表皮壌死症 （Ly ell症候群）、 間質性肺炎、 PIE症候群、 発疹、 蓴麻疹、 紅斑、 そう痒、 発熱、 リ ンパ腺腫脹、 関節痛、 顆粒球減少、 好酸球増多、 血小板減少、 黄疽、 AST (GOT)上 昇、 ALT (GPT)上昇、 A1- P上昇、 悪心、 嘔吐、 下痢、 軟便、 腹痛、 食欲不振、 胃不 快感、 口内炎、 カンジダ症、 ビタミン K欠乏症状 （低プロ トロンビン血症、 出血 傾向等）、 ビタミン B群欠乏症状 （舌炎、 口内炎、 食欲不振、 神経炎等）、 頭痛、 めまい、 全身倦怠感等が例示される。 なお、 セファレキシンの標的としては、 有 機ァニオン輸送体 1が知られている。 セファレキシンに関連する作用は、 その標 的タンパク質（標的遺伝子）、例えば F L J 1 2 5 0 2、 F L J 1 4 5 8 3または F L J 3 1 1 4 6由来タンパク質と密接に関係し得る。
アクラルビシン
ァクラルビシンに関連する疾患とは、 ァクラルビシンが適用される疾患または アクラルビシンの副作用に相当する疾患を意味する。 アクラルビシンは、 抗腫瘍 性抗生物質などとして知られている。アクラルビシンが適用される疾患としては、 胃癌、 肺癌、 乳癌、 卵巣癌、 悪性リンパ腫、 急性白血病の自覚的ならびに他覚的 症状の寛解および改善等が例示される。一方、ァクラルビシンの副作用としては、 心筋障害、 心不全、 骨髄抑制、 汎血球減少、 貧血、 白血球減少、 血小板減少、 出 血、 心電図異常、 頻脈、 不整脈、 食欲不振、 悪心、 嘔吐、 口内炎、 下痢； 消化管 出血、 腹痛、 AST (GOT)上昇、 ALT (GPT)上昇、 Al- P 上昇、 蛋白尿、 血尿、 膀胱炎、 排尿痛、 尿意頻数、 残尿感、 発疹、 脱毛、 色素沈着、 全身倦怠、 頭痛、 頭重感、 滕炎、 発熱、 静脈炎、 顔面紅潮等が例示される。 なお、 アクラルビシンの標的と しては、 D N Aトポイソメラーゼ I Iが知られている。 アクラルビシンに関連す る作用は、その標的タンパク質（標的遺伝子）、例えば F L J 1 2 5 1 4由来タン パク質と密接に関係し得る。
(標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態）
「標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態」 とは、 標的遺伝子 Y、 または標的 遺伝子 Υが関与するシグナル伝達系において標的遺伝子 Υの下流に位置付けられ る遺伝子 （下流遺伝子） の機能の変化 （例えば、 変異 （例えば、 多型） に伴う機 能の変化）、 または発現量の変化に伴い引き起こされ得る疾患または状態をいう。 標的遺伝子 Υまたはその下流遺伝子の機能の変化は、例えば、該遺伝子の変異（例 えば、 多型） によりもたらされ得る。 該変異としては、 例えば、 コーディング領 域におけるその機能を促進または抑制させる変異、 非コーディング領域における その発現を促進または抑制させる変異などが挙げられる。発現量の変化としては、 発現量の増加または低下が挙げられる。 標的遺伝子 Υに関連する疾患または状態 は、 標的タンパク質 Υにより改善または増悪され得る。
「標的タンパク質 Υ (標的遺伝子 Υ) に関連する機能」 とは、 標的タンパク質 Υが実際に示す機能と同種の機能または反対の機能を意味する。 換言すれば、 標 的タンパク質 Υに関連する機能は、 「標的タンパク質 Υに関連する疾患または状 態」 の改善または增悪を引き起こし得る機能である。 即ち、 「標的タンパク質 Υに 関連する機能」 は、 標的タンパク質 Υが免疫反応などを促進する因子である場合 には、 免疫反応を促進または抑制する機能等を示す。
標的タンパク質 Υに関連する疾患または状態としては、 標的遺伝子 Υが生体内 で種々の生理学的機能を担っていると考えられることを考慮すれば、 実に様々な 疾患または状態が想定される。 標的タンパク質 Yに関連する疾患または状態の一 例は、 表 2に示される機能が関連する疾患または状態である。
標的タンパク質 Yに関連する疾患または状態の別の例は、 標的タンパク質 Y、 標的遺伝子 Υのァノテーシヨンより類推される疾患または状態である。当業者は、 相同性検索により相同タンパク質または遺伝子を同定し、 次いで該タンパク質ま たは遺伝子の機能あるいはそれが関与する疾患または状態を公知の方法により精 査することで、 このような疾患または状態を類推できる。 ァノテーシヨン解析を 行う方法には各種あるが、 本出願における生理活性物質の標的遺伝子について、 生理活性物質の標的タンパク質または遺伝子として代表的なヒトタンパク質また は遺伝子の配列をクエリー配列として使用し、 各種の方法でァノテーシヨンを行 つた結果について、 以下に示す。
アミノ酸としての解析 1
B L A S Τ Ρによる相同' |·生角军析
計算プログラムは blastall 2. 2. 6を使用し、 target DB として、 swiss - prot： 146720 (2004. 03. 29)、 (Refseq) hs： 21170 (2004. 05. 06)、 (Refseq) mouse： 1 7089 (2004. 05. 06)、 (Refseq) rat： 4893 (2004. 05. 06)を用いた。 cutoff値は 1. 00E- 05とした。 また、 以下のデータについてフィルター処理を行った。
Swiss-protに ；)"して、
■「ALU SUBFAMILY] で始まる definitionのもの
■「Alu subfamilyj で始まる definitionのもの
■「！！！！ ALU SUBFAMILYJ で始まる definitionのもの
- Γβ-CELL GROWTH FACTOR PRECURSOR J で始まる definitionのもの
•「NRK2」 を含む definitionのもの
- TPROLINE-RICHJ で始まる definitionのもの
■ rGLYCINE-RICHj で始まる definitionのもの
• fEXTENSIN PRECURSOR] で始まる definitionのもの • 「C0LLAGEN」 で始まる definitionのもの
• 「100KD」 で始まる definitionのもの
■ 「RETR0VIRUS- RELATED POL POLYPROTEINj で始まる definitionのもの - Γ CUTICLE C0LLAGENJ で始まる definitionのもの
■ 「HYP0THETICALJ で始まる definitionのもの
• 「Hypothetical」 で台まる definitionのもの
• 「SALIVARY PROLINE- RICH PR0TEIN」 で始まる definitionのもの
• 「 IMMEDIATE- EARLY PR0TEINJ で始まる definitionのもの
'ァクセッション No力 S ΓΡ49646] であるもの
Ref - seqに対して、
• 「hypothetical protein FLJJ で始まる definitionのもの
■ 「KIAA」 で台まる definitionのもの
• rhypothetical protein DKFZJ で始まる definitionのもの
■ 「DKFZ」 で台まる definitionのもの .
· 「RIKEN cDNA」 で台まる definitionのもの
- 「hypothetical protein MGC」 で始まる definitionのもの
• 「hypotnetical proteinj である definitionのもの
• 「hypothetical protein PPJ で始まる definitionのもの
■ 「neuronal thread proteinj である definitionのもの
· 「clone FLBJ で始まる definitionのもの
• 「hypothetical protein P 0J で始まる definitionのもの
• 「PR00483 proteinj である definitionのもの
• 「MNC」 を含む definitionのもの
• 「M0ST- 1」 を含む definitionのもの
· 「similar toj で始まる definitionのもの
■ 「TPR gene on Y」 を含む definitionのもの
• 「HSPCJ で始まる definitionのもの •「CGI- J で台まる definitionのもの
• 自分自身のみで構成される ReFSeq配列 （LL— tmplより情報を参照している） 本解析法により得られたァノテーション情報を表 2— 1〜 2— 2に示す。
(表 2— 1 )
FLJ番号 ァクセッション番号および定義 キーワード
FLJ10368 Q9NUX5 テ ア 1の保護 (hPotl) (P0T1様テ ァ末端結合タンノ、'ク質〉 オルタ- Wスフ'ライシンク'；
Q95K48 テロ灯 1の保護 （P0T1様テ ア末端結合タン'、'ク質） 染色体タン'、'ク質； DM結 Q91WC1 テロ 1ァ 1の保護 （mPotl) (P0T1様テ nメァ末端結合タン'、'ク質） 合； 核タン'、'ク質； テ ァ。
Q9 UX5 テ ァ 1の保護 (hPotl) (P0T1様テ ァ末端結合タン'、'ク質）
NP_056265. 1 テ Ρ "ァ 1の保護 [fcH
NP_598692. 1 P0T1様テ》メァ末端結合タンハ'ク質 [マウス]
NP_056265. 1 テ η »ァ 1の保護 [ヒト〕
FLJ12389 Q9Z3R3 ァセ t tf*補酵素 Α合成酵素 （EC6.2. 1. 16) (ァセトァセ卜ト ァセチル化； 全フ テオ-ム； ！)
CoA！)力' 1) (ァシル活性化酵素 1) 力 。
093730 ァセチル補酵素 A合成酵素 （EC 6. 2. 1. 1) (ァセ Ϊ "ト CoAリ力' - セ'）（ァシル活性化酵素）
Q9QXG4 ァお A補酵素 A合成酵素、細胞質性 (EC6. 2.1. 1) (ァセ 7~ト
CoA !) -fe*) (ァシ 性化酵素）（ァセチル CoA合成酵素） (ACS) (AceCS)
Q9Z3R3 ァセトァ 捕酵素 A合成酵素 (EC6.2. 1. 16) (7tl-T-feT-h
CoA 1) (ァシル活性化酵素 1)
NP_076417.2 ァセトァセチル CoA合成酵素 [ヒト]
P_084 86. 1 ァセ 1·ァセチ CoA合成酵泰 [マウス]
NP_075592. 1 ァセトァセチル CoA合成酵素 [ラツト]
NP.076417. 2 ァセトァセチル CoA合成酵素 [！：ト]
FLJ12435 Q9JI55 フ 'レクチン (Plectin) 1 (PLTN) (PCN) (300kDa中間径フィラメ ァクチン結合； コイル コイル;
ント関連タンハ'ク質）（IFAP300) (フラク ント） 細胞骨格； リン酸化； Df
Q9JI55 フ'レクチン 1 (PUN) (PCN) (300kDa中間径 7イラメント関連タンハ'ク - 構造タンハ'ク«。 質） (IFAP300) (フラク'メント)
P_065385. フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タン'、'ク質 1 [ヒ
ト]
NP_666243. 1 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タン'、'ク質 1 [マ
ウス]
NP— 065790. 1 細胞周期進行 1
P— 065385.2 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タンハ'ク質 1 [ヒ
ト]
FLJ12502 Q9H8Y9 タンハ 'ク質 C14oril59、 ミトコンドリア前駆体 才 ^ィ 7'スフ'ライシンク'； ミ
(UNQ2439/PR05000) トコント 'リア； トランシ 'クトへ 'フ'チ
Q8BH86 タンハ'ク質 C orfl59ホモ ϋク'、 ミトコ; '))ァ前駆体 に
Q9H8Y9 タンハ'ク質 C14orfl59、 ミトコンドリア前駆体
(U Q2439/PR05000)
NP_079228. 3 14番染色体ォ -フ'ン！) ~ インク'フレ-ム 159 [tH
NP— 079228.3 14番染色体ォ -フ'ン！) 'インク'フレ-ム 159 [ヒト]
FLJ12514 NP_056257. 1 CCR4- NOT転写複合体、 サフ' クト 10 [tト]
NP— 705813. 2 CCR4—N0T ¾写複合体、 サフ ' ツト 10 [マウス]
P_056257. 1 CCR4-N0T転写複合体、 サフ * ； 10 [匕ト] (表 2— 2 )
Figure imgf000026_0001
アミノ酸としての解析 2
P f a mによるモチーフ解析
計算プログラムは hmmpfam (v2. 3. 2)を使用し、 target DB として、 Pfara DB en try：7426 families (Pfaml3. 0, Pf.am_ls) . (April 2004)を用いた。 cutoff値は 1 E - 10とした。 本解析法により得られたァノテーシヨ ン情報を表 3に示す。 (表 3 )
Figure imgf000027_0001
アミノ酸としての解析 3
S i g n a 1 I Pによる分泌シグナル配列予測
計算プログラムは SignalP ver3. 0 (May 18, 2004)を使用した。
アミノ酸としての解析 4
GeneOntologyによる機能カテゴリー分類
以下の方法で実施する。
1) BLASTPでの相同性解析結果 （フィルターありの RefSeq ' SwissProt) の各上位 3つ計 6つの BLAST結果より以下の条件を満たす E- valueのものを抽出。
条件 1 ： 1E- 50以下のものは全て使用する
条件 2： 1E- 10以上のものは全て使用しない
条件 3： 1E-50より大きい場合、 Top Hitとの E- value格差が 1E+20以内で あれば使用する
条件 4： Top Hitの E- valueが 0の場合、 1E- 50以下のみ使用する
2) SwissProtの Keywordより spkw2goを使って G0を検索。
3) SwissProtのァクセッション番号より xref. goaを検索し Ref seqIDを取得し、 さらに RefseqIDより LL_tmplを使って LOCUS IDを取得し、 LOCUS IDより loc2g oを使って GO termを取得する。
4) Ref seqのァクセッション番号より LL— tmplを使って LOCUS IDを取得し、 L0CU S IDより loc2goを使って GO termを取得する。
5) 取得した各 GOterra こっ ヽて、 Molecular Function text file - Biological P rocess text file■ Cellular Component text fileを参照して各 GO termの上位 カテゴリー情報を取得する。
6) 上記 1) - 5)で取得した各 GOtertn情報の重複を除き出力する。
本解析法により得られたァノテーシヨン情報を表 4に示す。
(表 4)
FLJ番号 GO分類 GO番号 （用語）
GO:0003676¥MF|核酸結合
LJ10368 MF GO:0003677¥MFil)NA結合
GO:0042162¥MF|テロメァ DNA結合
GO:0006260¥BP|DNA gS¾
BP GO： 0007004¥BP |テロメラーゼ依存性テ口メァ維持 GO: 0016233¥BP |テロメアキヤシビング
CC GO:0000781¥CC|染色体、 テロメァ領域
G0 :000382舊 1触媒活性
FLJ12389 GO:0016405¥MF|CoA |)力'-セ'活性
MF GO:0016874¥MF|！)力'-セ'活性
GO:0030729¥MF|ァセトァセテート- CoAリカ *~t'活性
GO:0006629¥BP|脂質代謝
BP GO:0006631¥BP|脂肪酸代謝
GO :0008腿 BP i代謝
CC
FLJ12435 MF GO： 0003714¥ F |転写コレプレツサ一活性
GO:0016481¥BP|転写のネガティブ調節
BP GO:0030154¥BP|細胞分ィ匕
GO:0005634¥CC|細胞核
CC
G0:0005829¥CC|細胞質
GO:0003723¥MF|RNA結合
FLJ12502 MF
GO:0005525¥MF|GTP結合
BP GO:0006614¥BP|SRP依存性タンパク 胰共翻訳標的
GO: 0005739¥CC|ミトコンドリア
CC
GO： 0005786¥CC |シグナル認識粒子 (真核生物の意）
GO:0005488¥ F|結合
FLJ12514 MF
GO:0005554¥ F |未知の分子機能
BP GO： 0000004¥BP |未知の生体内作用
CC GO:0008372¥CC |未知の細胞成分
結合
FLJ14583 MF GO:0005515¥MF|タンパク質
G0:0007 5¥BP|細胞接着
BP G0:0007 6¥BF>|ホモ親和性細胞接着
GO:0007566¥BP|胚着床
GO： 0005886¥CC |原形質膜
CC
GO： 0005887VCC |原形質膜の構成成分
MF GO： 0005554¥MF |未知の分子機能
FLJ31146
GO： 0006464¥BP |タンパク質修飾
BP GO:0006950¥BP|ストレス応答性
GO： 0006986¥BP |未フォールドタンパク質応答性
GO:0005783¥CC|小胞体
CC GO:0005789¥CC|小胞体膜
GO: 0016021¥CC |膜の構成成分 核酸としての解析 1
B L A S T Xによる相同性解析 1
計算プログラムは blastall 2. 2. 6を使用し、 target DB として、 nr : 1552011 (2004. 07. 16)を用いた。 cutoff 値は 1. 00E- 05 とした。 また、 以下のデータにつ いてフィルター処理を行った。
•「ALU SUBFAMILYJ で始まる definitionのもの
•「Alu sub family J を含む definitionのもの
·「！！！！ ALU SUBFAMILY」 で始まる definitionのもの
•「Drosophila melanogaster genomic scaffoldj で始まるもの
■「Human DNA sequence from」 で始まるもの
•「genoraic DNA」 を含むもの
•「BAC clonej を含むもの
•「PAC clonej を含むもの
■「cosmid」 を含むもの
■ 「complete genomej a'むちの
•「complete sequencej で終わるもの
■「genomic sequence] を含むもの
•「exon」 を含むもの
•HIT LENGHT (ヒット配列の配列長） が 50000以上本解析法により得られたもの 本解析法により得られたァノテ一ション情報を表 5— 1〜 5— 2に示す。
(表 5— 1 )
FLJ番号 nrァクセッション番号および定義
FLJ10368 dbj IBAA91568.11名称不明のタン/、'ク質産物 [ヒト] ¥ ref | NP— 056265.11テロメァ 1 の保護 [ヒト]
gb| 22613.11 テロメァタンハ。ク質 1変異体 1の保護 [ヒト] ¥ dbj|BAB14110.11 名 称不明のタンノ、'ク質産物 [tト] ¥ dbj|BAA91988.1| 名称不明のタン ク質産物 [ヒ ト] ¥ gb|AAH02923. l| TPメァ 1の保護 [ヒ卜] ¥ sp|Q9NUX5|P0TEl一 HUMANテ [^ァ 1 の保護 (hPotl) (P0T1様テロメァ末端結合タンハ'ク質）
emb|CAH92225. l| Wホ。セティカルタンハ'ク質 [オランウ タン]
dbj|BAB62219.1| ハイホ。セティカルタンパク質 [力二クイサ、'ル ]¥ sp|Q95K48|P0TElJ!ACFAテ ロメァ 1の保護 （P0T1様テ Pメァ末端結合タンハ'ク質） (QtrA-10940)
ref |XP_519345. l| PREDICTED: P0T1テロメァ 1ホモ uク *の保護 [チ 、'ンシ *一] dbj|BAA91568.1) 名称不明のタンハ'ク質産物 [ヒト]¥ ref | NP_056265.11 テロ ア 1 の保護 [ヒト]
FLJ12389 dbj|BAB14040.1| 名称不明のタン/、'ク質産物 [t!
gb|AAH51862. l| ァセトァセチル CoA合成酵素 [ヒト] ¥ ref |NP_076417.21 ァセトァセチ 'レ CoA合成酵素 [ヒト] ¥ dbj|BAD22560.1| ァセトァセチル CoA合成酵素 [ヒト] gb|AAH40490.2| ァセトァセチル CoA合成酵素 [匕ト]
dbj|BAB01571.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [力ニクイサ'ル]
dbj|BAB41151.1| ハイホ'セティ jiルタンハ'ク質 [力二クイサ'ル]
dbj|BAB14040.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [ヒト]
FLJ12435 gb|AAG02026.1| 造血 PBX相互作用タ 、'ク質 [ヒト]
emb|CAI13239.11 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タン/、'ク質 1 [ヒ
!>]¥ ref|NP_065385.2| プレ B細胞白血病転写因子相互作用タン/、。ク質 1 [ヒ ト]¥ gb|MH16852.1| ダレ B細胞白血病転写因子相互作用タン ク質 1 [ヒト] dbj|BAB14059.1| 名称不明のタンハ。ク質産物 [ヒト]
emb 1 CAI 13238.1| フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タンハ°ク質 1 [ヒト] dbj|BAB14471.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [ヒト]
gb|AAG02026.11 造血 PBX相互作用タンハ'ク質 [ヒト]
FLJ12502 dbj|BAB14102.1| 名称不明のタン/、。ク質産物 [ヒト] ¥ sp|Q7Z3D6|CN159_HU ANタ ンハ。ク質 C14orfl59、 ミトコンドリア前駆体 （UNQ2439/PR05000)¥ gb|MH10614.11 Cl4orf 159タンハ'ク質 [ヒト] ¥ gb|AAH65558.11 C14orf 159タンハ'ク質 [匕ト] gb|AAQ88880. l| PFTL2439 [ヒト] ¥ ref |NP_079228.3| 14番染色体†~フ。ンリ -テ' インク 'フレーム 159 [ヒト]
emb|CAD61880.1| 名称不明のタン/、'ク質産物 [ヒト]
emb|CAG33570. l| C14orfl59 [ヒト] (表 5— 2 ) emb|CAD97934. l| ノ ホ。セティカ;レタンハ。ク質 [ヒト]
dbj|BAB14102.1| 名称不明のタン ク質産物 [ヒト] ¥ sp|Q7Z3D6|CN159一 HUMA タ ンハ。ク質 C orfl59、 ミトコンドリア前駆体 (UNQ2439/PR05000) ¥ gb|AAHl0614.11 C14orfl59タンハ。ク質 [ヒト]¥ gb | AAH65558.11 C14orf 159タンハ。ク質 [ヒト]
FLJ12514 dbj|BAB14108.1| 名称不明のタ 、'ク質産物 [ヒト]
dbj|BAB14327.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [ ]¥ gb |MH02931.11 CCR4-N0T 転写複合体、 サ ;！^ット 10 [ヒト] ¥ ref|NP_056257.1| CCR4—N0T転写複合体、 サフ" ット 10 [ヒト]
dbj|BAB14478.1| 名称不明のタンハ。ク質産物 [tト]
ref |NP_705813.2| CCR4-N0T転写複合体、サフ * ット 10 [マウス] ¥ gb|MH39183.11 CCR4-N0T転写複合体、 サフ"ュニット 10 [マウス] ¥ dbj |BAC26299.11名称不明のタン ハ。ク質産物 [マウス]
gb|AAH83782. l| RIKEN cDNA 2600001P13 に類似 [ラッ
ト] ¥ ref|NP_001007004. l| RIKEN cDNA 260000 IP 13に類似 [ラット] dbj|BAB14108.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [ヒト]
FLJ14583 ref |NP_057241.2| ト。フィニンアイ； /フォーム 2 [ヒト] ¥ ref | P一 808224.11 ト。フィニンアイソフ才
-ム 2 [ヒト] ¥ dbj|BAB55149.1| 名称不明のタンハ'ク質産物 [ヒト]
gb|AAK30171.1| マ フィニン j3 [ヒト]
dbj|BAA83066.3| KIAA1114タンハ'ク質 [ヒト]
ref|NP— 808223.1| トロフィニンアイ; /フォ-ム 1 [ヒト] ¥ gb|MH26914.11 トロフィニン、 アイゾフ才 -ム 1 [ヒト]
gb|MK30170.1| マ フィニン α [ヒト]
ref | Ρ— 057241.21 トロフィニンァイソフォーム 2 [ヒト ]¥ ref |ΝΡ— 808224.11 ト Ρフィニンアイソフ才 —ム 2 [ヒト] ¥ dbj|BAB55149.1| 名称不明のタンハ。ク質産物 [ヒト]
FLJ31146 Gb 1 AAH05091.1！ FLJ22313タンハ'タ質 [ヒト] ¥ ref | P_071768.21ハイホ'セティカルタンハ' ク質 L0C64224 [ヒト] ¥ gb|AAH20264.1| ハイホ。セティか ンハ。ク質 FLJ22313 [ヒト] gb|EAL23973.1| ハイホ。セティカルタン/、'ク質 FLJ22313 [ヒト]
gb|AAH29691. l| RIKEN cDNA 5031400M07 [マウス]
ref 1 NP_065611 · 11ハイホ'セティ；!)ルタンハ'ク質 L0C80517 [マウス] ¥ gb | AAH43693.11 RIKEN cDNA 5031400M07 [マウス] ¥ dbj |BAA95064.11名称不明のタンハ'ク質産物 [マウス]
dbj|BAB31889.1| 名称不明のタンハ。ク質産物 [マウス]
gb 1 AAH05091.1 [ FLJ22313タンハ'ク質 [ヒト] ¥ ref |NP_071768.21ハイホ'セティカルタンハ' ク質 LOC64224 [tf]¥ gb| H20264.1| ハイホ'セティカルタンハ。ク質 FLJ22313 ト] 核酸としての解析 2
B L A S T Xによる相同性解析 2
計算プログラムは blastall 2. 2. 6を使用し、 target DB として、 swiss- prot： 146720 (2004. 03. 29)、 (Refseq) hs： 21170 (2004. 05. 06)、 (Refseq) mouse： 17 089 (2004. 05. 06)、 (Refseq) rat： 4893 (2004. 05. 06)を用いた。 cutoff値は 1. 00E- 05とした。 また、 以下のデータについてフィルター処理を行った。
Swiss - protに对して、
■ 「ALU SUBFAMILY」 で始まる definitionのもの
- 「Alu subfamilyj で台まる definitionのもの
. 「！！！！ ALU SUBFAMILYJ で始まる definitionのもの
■ 「B- CELL GROWTH FACTOR PRECURSOR で始まる definitionのもの
• 「NRK2」 を含む definitionのもの
• 「PR0LINE- RICH」 で始まる definitionのもの
• 「GLYCINE_RICH」 で始まる definitionのもの
· rEXTENSIN PRECURSOR で始まる definitionのもの
. 「C0LLAGEN」 で始まる definitionのもの
• 「100KD」 で始まる definitionのもの
■ 「RETROVIRUS- RELATED POL P0LYPR0TEIN」 で始まる definitionのもの
• 「CUTICLE C0LLAGENJ で始まる definitionのもの
· 「HYP0THETICAL」 で始まる definitionのもの
• 「Hypothetical」 で台まる definitionのもの
• Γ SALIVARY PROLINE- RICH PR0TEIN」 で始まる definitionのもの
• 「 IMMEDIATE- EARLY PR0TEINJ で始まる definitionのもの
•ァクセッション No力 S ΓΡ49646] であるもの
Ref— seqに対して、
■ I hypothetical protein FLJ」 で合 る definitionのもの
■ 「KIAA」 で台まる definitionのもの •「hypothetical protein DKFZJ で始まる definitionのもの
•「DKFZ」 で合まる definitionのもの
•「RIKEN cDNA」 で始まる definitionのもの
■ 「hypothetical protein MGCJ で始まる definitionのもの
• 「hypothetical proteinj でめる definitionのもの
■「hypothetical protein PPJ で始まる definitionのもの
• I neuronal thread proteinj である deiinitionのもの
•「clone FLBJ で始まる definitionのもの
•「hypothetical protein PR0J で始まる definitionのもの
■「PR00483 proteinj である definitionのもの
•「MNC」 を含む definitionのもの
•「M0ST- 1」 を含む definitionのもの
■「similar to」 で始まる definitionのもの
•「TPR gene on Y」 を含む definitionのもの
•「HSPC」 で始まる definitionのもの
•「CGI-」 で始まる definitionのもの
• 自分自身のみで構成される ReFSeq配列 （LL— tmplより情報を参照している） 本解析法により得られたァノテーシヨン情報を表 6— 1〜6— 2に示す。
(表 6 _ 1 )
FLJ番号 ァクセッション番号および定義 キーワード
FLJ10368 Q9 UX5 テ ア 1の保護 (hPotl) (P0T1様テ W 末端結合タン 'ク オルタ-杼 スフ'ライシンク'； 染 質） 色体タン Λ'ク質； DNA結合；
Q95K48 テ ア 1の保護 （P0T1様テ ア末端結合タン'、'ク ¾) 核タンハ'ク質； テロメァ。
Q91WC1 テ 0メァ 1の保護 (mPotl) (P0T1様テ ア末端結合タ 、'ク
質）
Q9 UX5 テロ！ァ 1の保護 （hPotl) (P0T1様テ ァ末端結合タン'、'ク
NP_056265. 1 テ t"メァ 1の保護 [ヒト]
P一 598692. 1 P0T1様テ Pメァ末端結合タン、·ク質 [マウス]
NP.056265. 1 メァ 1の保護 [tト]
FLJ12389 Q9Z3R3 ァセトァせル補酵素 A合成酵素 （EC 6. 2. 1. 16) (ァセトァセ -ト ァ ル化； 全； Τ ηテオ-ム； ！)力、
CoA W-^' 1) (ァ'ンル活性化酵素 1) セ'。
Q9NR19 ァセチル捕酵素 Α合成酵素、細胞質性 (EC6. 2. 1. 1) (ァセ Ϊ- ト CoA！)力 ' Hr' (ァシ 性化酵素）（ァセチル CoA合成酵
素） (ACS) (AceCS)
Q9RRL7 ァセチ捕酵素 Λ合成酵素 （EC 6, 2. 1. 1) (アセテート CoA D力'
）（ 活性化酵素）
Q9Z3R3 ァ tトァ fル補酵素 A合成酵泰 （EC 6· 2. 1. 16) (ァセトァセチル
CoA !)*'-t* 1) (ァシル活性化酵素 1)
P_076417. 2 ァセトァセチ CoA合成酵素 [ヒト]
P_08 486. 1 ァセトァセチル CoA合成酵素 [マウス]
NP— 075592. 1 ァセ! "ァ杼ル CoA合成酵素 〖ラ'ノト]
P—076417. 2 ァセトァセチ CoA合成酵素 [1:ト]
FLJ12435 NPJ65385. 2 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タンハ'ク質 I
〖匕ト]
NP_666243. 1 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タンハ'ク質 1
[マウス]
NP_065790. 1 細胞周期進行 1 [tト]
P_065385. 2 フ'レ B細胞白血病転写因子相互作用タン'、'ク質 1
[tト]
FLJ12502 Q9H8Y9 タン ク質 C14orfl59、 'ミトコント 'リア前駆体 オター; ィフ 'スフ'ライシンク'； ミ卜コ
(U Q2439/PR05000) ン !/ァ； 1·ラン ットへ チに。
Q8BH86 タンハ 'ク質 CHor 59ホモ Pク'、 ミトコンド !)ァ前駆体
Q9H8Y9 タンハ 'ク質 C14orf 9、 ミトコント '打前駆体
(UNQ2439/PRO5000)
NP_079228. 3 14番染色体ォ 'ン!) ~Τインク 'フレ-ム 159 [th]
P— 079228. 3 14番染色^ Η7'ン！) 'インク'フレーム 9 [t h]
FLJ12514 P_056257. 1 CCR4-N0T転写複合体、 サフ ' ツト 10 [ヒト]
NP_705813. 2 CCR4- NOT転写複合体、 サフ ' ツト 10 [マウス]
P_056257. 1 CCR4-N0T転写複合体、 サフ ' ツト 10 [th] (表 6— 2 )
Figure imgf000036_0001
可能性のある疾患または状態の別の例は、 OM I Mに登録されている疾患また は状態である。 このような疾患または状態は、 例えば、 H— I n v D Bにおい て H— I n v I D番号または H— I n Vクラスター I D番号を入力することで 容易に検索できる。 本出願における生理活性物質の標的遺伝子について、 その遺 伝子の存在する染色体、 遺伝子ローカスと、 その遺伝子が関連することが予想さ れるォ一ファン疾患の OM I M情報を、 表 7— 1〜 7— 4にそれぞれ示す。 (表 7— 1)
Figure imgf000037_0001
(表 7— 2 )
FLJ12502 14 89570827 - chrl4+855 0MI 213600 基底核石灰化、 特発性、 1; IBGC1
89681737, plus OMIM164210 片側顔 小人 ¾E (hemifacial microsomia)： HFM (cDNA全長のゲノム O I 270100 内臓逆位
配列範囲： 99. 6 ½) 0 IM138800 甲状 β、 多結節性 1； MNG1
OMIM160500 ミオパシー、 遠位型 1; MPD1
0 IM252930 ムコ多糖症 IIIC型
0MI 276900 アッシャー症候群、 ΙΑ型； USH1A
FL丁 12514 3 32698624-32786972 chr 3+381 0MIM604400 催不 β'Ι4*室異形成、 家族性、 5; ARVD5
OMIM601154 心筋症、 拡張性、 IE; CMD1E '
0 IM601869 難聴、 常染色体劣性 15; DFNB15
OMI 608088 神経障害、 遺伝性感覚性、 I型、 咳および胃食道逆流を伴 う
0 I 182280 小細胞肺癌
0MIM276905 アツシャ一症候群、 ΠΒ型； USH2B
(表 7— 3 )
FLJ14583 X 53914048 - chrX+442 0MIM301830: 先天性多発性関節拘縮症、 遠位型、 X連鎖
53924653, plus 0MIM300404: 脳奇形、精神遅滞、外胚葉'性形成異常、骨格奇形、 ヒルシ
(cDNA全長のゲノム ュスプリング病、耳 Z眼奇形、 口蓋裂 Z停留睾丸、および腎異形成 Z形 配列範囲： 100 %) 成不全
0MI 300220 精神遅滞および異常行動を伴う舞踏病ァテトーシス
0 I 302802 シャルコ一一マリ一一ツース病、 X連鎖劣性、 3; C TX3
0MIM300331 血小板增加症、 家族性 X連鎖
0MI 300268 血管神経性浮腫、 遺伝性、 正常な C1ィンヒビター濃度お よび機能を伴う
0 I 300136: 糖尿病、 インスリン依存性、 X連鎖、 羅病性
O IM300290: 子宫内発育遅延、 骨幹端異形成症、 先天性副臂形成不全、 および生殖器奇形
0MI 300345 小眼症、 欠損症の、 1; 0PCB1
0MI 309530 精神遅滞、 X連鎖 1; 醒
0 I 300062 精神遅滞、 X連鎖 14; MRX14
0MIM300047 精神遅滞、 X連鎖 20; MRX20
0 I 300115 精神遅滞、 X連鎖 50; MRX50
0 I 300210 精神遅滞、 X連鎖 58; MRX58
0MIM309545 精神遅滞、 X連鎖非特異的、 失語症を伴う； MRXA
0 IM300218 精神遅滞、 X連鎖、 症候性 7; RXS7
0MIM300263 サイデリウス （siderius)X連鎖精神遅滞症候群
0MIM311400 PAINE症候群
OMIM300373 頭盖硬化を伴う線状ォステオパシー； 0SCS
OMI 309610 プリート （prieto) X連鎖精神遅滞症候群； PRS
0 IM309500 RENPENNING症候群 1; ENS1
OMIM300258 R0IF A 症候群
0MIM309585 ウィルソン一ターナー X連鎖精神遅滞症候群； WTS
(表 7— 4)
FLJ31146 7 35414680 - chr7-422 0 IM141400: 橈骨神経異常を伴う片側顔面小人症
35475974, minus 0MI 607454: 脊髄小脳失調 21; SCA21
(cDNA全長のゲノム
配列範囲： 99.3 %)
可能性のある疾患または状態の別の例は、 標的遺伝子 Yの発現部位における、 または標的遺伝子 Yが単離されたライブラリーが由来する組織における異常を伴 う疾患または状態である。 該発現部位おょぴ該組織は、 例えば、 H— I n v D Bにおいて H— I n v c D N A I D番号または H— I n vローカス I D番号 を入力することで容易に検索でき、 これより、 当業者であれば、 疾患または状態 についても類推できる。
例えば、 幾つかの標的遺伝子 Yの発現部位は、 下記の通りである。
F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質は、大脳、小脳、脳梁、 グリア、網膜、脾臓、 胸腺、 子宮、 胎盤、 精巣、 心臓、 筋肉、 結腸、 小腸、 肝臓、 肺、 腎臓、 乳腺、 下 垂体、 甲状腺等で発現し得る。
F L J 1 2 3 8 9由来タンパク質は、 脳幹、 小脳、 血液、 食道、 皮膚、 卵巣、 前立腺、 精巣、 心臓、 筋肉、 結腸、 胃、 肝臓、 肺、 副腎、 乳腺、 唾液腺等で発現 し得る。
F L J 1 2 4 3 5由来タンパク質は、脳幹、大脳、小脳、脳梁、 グリア、網膜、 脊髄、 リンパ節、 脾臓、 胸腺、 食道、 皮膚、 子宮、 卵巣、 胎盤、 前立腺、 精巣、 筋肉、 胃、 膀胱、 副腎、 下垂体、 甲状腺等で発現し得る。
F L J 1 2 5 0 2由来タンパク質は、 脳幹、 小脳、 リンパ節、 血液、 脾臓、 前 立腺、 精巣、 心臓、 筋肉、 結腸、 胃、 肝臓、 肺、 腎臓、 副腎、 脖臓、 下垂体等で 発現し得る。
F L J 1 2 5 1 4由来タンパク.質は、 脳幹、 脳梁、 グリア、 網膜、 リンパ節、 脾臓、 胸腺、 皮膚、 胎盤、 前立腺、 精巣、 筋肉、 結腸、 小腸、 肝臓、 副腎、 甲状 腺等で発現し得る。
F L J 1 4 5 8 3由来タンパク質は、脳幹、大脳、小脳、脳梁、 グリア、脊髄、 骨髄、 骨、 皮膚、 卵巣、 胎盤、 前立腺、 精巣、 心臓、 筋肉、 小腸、 肝臓、 肺、 乳 腺、 膝臓、 下垂体、 唾液腺等で発現し得る。
F L J 3 1 1 4 6由来タンパク質は、脳幹、 大脳、 眼、脾臓、 胸腺、骨、 皮膚、 子宮、 胎盤、 前立腺、 精巣、 筋肉、 結腸、 肺、 副腎、 乳腺等で発現し得る。 可能性のある疾患または状態のさらに別の例は、 標的遺伝子 Yまたは下流遺伝 子と相同な遺伝子が関与する疾患または状態である。 当業者は、 相同性検索によ り相同遺伝子を同定し、 次いで該相同遺伝子が関与する疾患または状態を公知の 方法により精査することで、 このような疾患または状態を類推できる。
本発明の標的タンパク質、 標的遺伝子は、 例えば、 所定の疾患または状態に対 する医薬の開発、 あるいは該疾患または状態に対する研究用試薬の開発などに有 用である。
2 . スクリーニング方法、 および該方法により得られる成果物
本発明は、 被験物質が生理活性物質の標的タンパク質またはそれをコードする 遺伝子 （以下、 必要に応じて 「標的タンパク質 Y」 あるいは 「標的遺伝子 Υ」 と 省略する場合がある） の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含 む、 生理活性物質のスクリーニング方法、 およびその成果物を提供する。 本発明 のスクリーニング方法は、スクリーニングされる生理活性物質の種類の観点から、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質、 および標的タンパク質 Υに関 連する機能を調節し得る物質をスクリーニングする方法に大別できる。 本発明の スクリーニング方法はまた、 インビトロ、 インビポまたはインシリコで行うこと ができる。 なお、 本発明のスクリーニング方法により得られる標的タンパク質 Υ の発現を調節し得る物質は、 標的タンパク質 Υの量を調節し得る物質と同義であ り、 所定の組織または細胞における標的タンパク質 Υの存在量、 あるいは所定の 細胞内位置における標的タンパク質 Υの存在量を変化させ得る物質であり得る。 従って、 標的タンパク質 Υの発現を調節し得る物質としては、 例えば、 標的遺伝 子 Υからの標的タンパク質 Υの生合成を調節し得る物質のみならず、 標的タンパ ク質 Υの細胞内局在を調節し得る物質、 標的タンパク質 Υの体内動態を調節し得 る物質、 標的タンパク質 Υの代謝 （例えば、 代謝による合成、 分解） を調節し得 る物質もまた含まれる。
以下、 それぞれのスクリーニング方法を詳述する。
2 . 丄. 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリーニング方法 (スクリーニング方法 I )
本発明は、 被験物質が標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得るか否か を評価することを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスク リーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法を、必要に応じて「スクリーニング方法 I」と省略する。 スクリーニング方法 Iは、 被験物質が標的タンパク質 Yの発現または機能を調 節し得るか否かを評価し、 標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得る被験 物質を選択することを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質の スクリーユング方法（スクリーユング方法 I a )、並びに被験物質が標的タンパク 質 Yの発現または機能を調節し得るか否かを評価し、 標的タンパク質 Yの発現ま たは機能を調節し得ない被験物質を選択することを含む、 生理活性物質 Xに関連 する作用 （なかでも、 既知標的分子に関連する作用） を調節し得る物質のスク リ 一ユング方法 （スクリーニング方法 j b ) に大別できる。 スクリーニング方法 I aは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の調節薬の開発などに有用であ り得る。 また、 スクリーニング方法 I bは、 既知標的分子に関連する作用の調節 能を有し、 且つ生理活性物質 Xが示す副作用が低減した医薬の開発などに有用で あり得る。
2 . 1 . 1 . 標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得る被験物質を選択す ることを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリーニン グ方法 （スクリーニング方法 I a )
本発明は、 被験物質が標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得るか否か を評価し、 標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得る被験物質を選択する ことを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリーユング 方法を提供する。
スクリーニング方法に供される被験物質は、 いかなる公知化合物及び新規化合 物であってもよく、 例えば、 核酸、 糖質、 脂質、 タンパク質、 ペプチド、 有機低 分子化合物、 コンビナトリァルケミストリ一技術を用いて作製された化合物ライ ブラリー、 固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムぺプチ ドライブラリー、 あるいは微生物、 動植物、 海洋生物等由来の天然成分等が挙げ られる。 被験物質は、 標識されていても未標識であってもよく、 また、 標識体と 未標識体を所定の割合で含む混合物も被験物質として使用できる。標識用物質は、 上述したものと同様である。
一実施形態では、スクリーユング方法 I aは、下記の工程（a )、 ( b )及ぴ（c ) を含む： '
( a ) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
( b ) 被験物質の存在下における該タンパク質の機能レベルを測定し、 該機能レ ベルを被験物質の非存在下における該タンパク質の機能レベルと比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 該タンパク質の機能レベルの変化をも たらす被験物質を選択する工程。
上記 （a ) 〜 （c ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 I」 と省略 する。
方法論 Iの工程 （a ) では、 被験物質が標的タンパク質 Yと接触条件下におか れる。 被験物質の該タンパク質に対する接触は、 溶液中での単離された標的タン パク質 Yと被験物質との接触、 あるいは標的タンパク質 Yを発現可能な細胞又は 組織と被験物質との接触により行われ得る。
標的タンパク質 Yは自体公知の方法により調製できる。 例えば、 上述した発現 組織から標的タンパク質 Yを単離 .精製できる。 しかしながら、 迅速、 容易かつ 大量に標的タンパク質 Yを調製し、 また、 ヒト標的タンパク質 Yを調製するため には、 遺伝子組換え技術により組換えタンパク質を調製するのが好ましい。 組換 えタンパク質は、 細胞系、 無細胞系のいずれで調製したものでもよい。
標的タンパク質 Yを発現可能な細胞は、 標的タンパク質 Yを発現するものであ る限り特に限定されず、 標的タンパク質 Yの発現組織由来の細胞、 標的タンパク 質 Y発現ベクターで形質転換された細胞などであり得る。 該細胞は、 当業者であ れば容易に同定又は調製でき、 初代培養細胞、 当該初代培養細胞から誘導された 細胞株、 市販の細胞株、 セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。 標 的タンパク質 Yを発現可能な組織は、 上述した発現組織を使用できる。
方法論 Iの工程 （b ) では、 被験物質の存在下における該タンパク質の機能レ ベルが測定される。 機能レベルの測定は、 タンパク質の種類に応じて自体公知の 方法により行われ得る。 例えば、 標的タンパク質 Yが転写因子である場合には、 標的タンパク質 Yとそれが結合する転写調節領域とを用いてレポーターアツセィ を行うことにより、 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節する物質をスクリー ユングできる。
また、 標的タンパク質 Yが酵素の場合には、 当該酵素の触媒活性の変化に基づ き機能レベルの測定を行うこともできる。 酵素の触媒活性は、 酵素の種類に応じ て基質、 捕酵素等を適宜選択することで、 自体公知の方法により測定できる。 さらに、 標的タンパク質 Yが膜タンパク質 （例えば、 受容体、 トランスポータ 一） の場合には、 当該膜タンパク質の機能の変化に基づき、 機能レベルの測定を 行うことができる。 例えば、 標的タンパク質 Yが受容体である場合には、 当該受 容体により媒介される細胞内事象 （例えば、 イノシトールリン脂質の産生、 細胞 內 p H変動、カルシウムイオン'塩素イオン等のイオンの細胞内動態）に基づき、 本発明のスクリーエング方法が行われ得る。 また、 標的タンパク質 Yがトランス ポーターである場合には、 当該トランスポーターの基質の細胞内濃度変化に基づ き、 本発明のスクリーニング方法が行われ得る。 .
また、 機能レベルは、 標的タンパク質 Yの総機能レベルに基づいて測定するの ではなく、 標的タンパク質 Yの個々のァイソフォーム （例えば、 スプライシング バリアント） に対する機能レベルあるいはァイソフォーム間の機能レベル比に基 づいて測定してもよい。
次いで、 被験物質の存在下における標的タンパク質 Yの機能レベルが、 被験物 質の非存在下における標的タンパク質 Yの機能レベルと比較される。 機能レベル の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被験物質の非存在 下における標的タンパク質 Yの機能レベルは、 被験物質の存在下における標的タ ンパク質 Yの機能レベルの測定に対し、 事前に測定した機能レベルであっても、 同時に測定した機能レベルであってもよいが、 実験の精度、 再現性の観点から同 時に測定した機能レベルであることが好ましい。
方法論 Iの工程 （c ) では、 該タンパク質の機能レベルの変化をもたらす被験 物質が選択される。 該タンパク質の変化をもたらす被験物質は、 標的タンパク質 Υの機能を促進または抑制し得る。 このように選択された被験物質は、 生理活性 物質 Xに関連する疾患または状態の調節に有用であり得る。
なお、 方法論 Iは、 標的タンパク質 Υに加え、 その共役因子の存在下で行って もよい。 例えば、 標的タンパク質 Υの共役因子として標的タンパク質 Υの阻害因 子を併用した場合、 標的タンパク質 Υとその共役因子との相互作用を妨げる物質 は、 標的タンパク質 Υの機能を促進し得ると考えられる。 また、 標的タンパク質 Υの共役因子として標的タンパク質 Υの活性化因子を併用した場合、 標的タンパ ク質 Υとその共役因子との相互作用を妨げる物質は、 標的タンパク質 Υの機能を 抑制し得ると考えられる。 このように方法論 Iを標的タンパク質 Υの共役因子の 存在下で行うこともまた有益である。
別の実施形態では、 スクリーニング方法 I aは、 下記の工程 （a )、 ( b ) 及び ( c ) を含む：
( a ) 被験物質と標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現を測定 可能な細胞とを接触させる工程；
( b ) 被験物質を接触させた細胞における発現量を測定し、 該発現量を被験物質 を接触させない対照細胞における発現量と比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 発現量を調節する被験物質を選択する 工程。
上記 （a ) 〜 （c ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 I I」 と省 略する。
方法論 I Iの工程 （a ) では、 被験物質が標的タンパク質 Yの発現を測定可能 な細胞と接触条件下におかれる。 標的タンパク質 Yの発現を測定可能な細胞に対 する被験物質の接触は、 培養培地中で行われ得る。
「標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子（必要に応じて、 「標的遺伝 子 Y」 と省略） の発現を測定可能な細胞」 とは、 標的遺伝子 Υの産物、 例えば、 転写産物、 翻訳産物 （即ち、 タンパク質） の発現レベルを直接的又は間接的に評 価可能な細胞をいう。 標的遺伝子 Υの産物の発現レベルを直接的に評価可能な細 胞は、 標的遺伝子 Υを天然で発現可能な細胞であり得、 一方、 標的遺伝子 Υの産 物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、 標的遺伝子 Υ転写調節領域につい てレポーターアツセィを可能とする細胞であり得る。
標的遺伝子 Υを天然で発現可能な細胞は、 標的遺伝子 Υを潜在的に発現するも のである限り特に限定されず、 標的遺伝子 Υを恒常的に発現している細胞、 標的 遺伝子 Υを誘導条件下（例えば、薬物での処理）で発現する細胞などであり得る。 該細胞は、 当業者であれば容易に同定でき、 初代培養細胞、 当該初代培養細胞か ら誘導された細胞株、 市販の細胞株、 セルバンクより入手可能な細胞株などを使 用できる。
標的遺伝子 Υ転写調節領域についてレポーターアツセィを可能とする細胞は、 標的遺伝子 Υ転写調節領域、 当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子 を含む細胞である。 標的遺伝子 Υ転写調節領域、 レポーター遺伝子は、 発現べク ター中に挿入されている。
標的遺伝子 Υ転写調節領域は、 標的遺伝子 Υの発現を制御し得る領域である限 り特に限定されないが、 例えば、 転写開始点から上流約 2 k b ρまでの領域、 あ るいは該領域の塩基配列において 1以上の塩基が欠失、 置換若しくは付加された 塩基配列からなり、 且つ標的遺伝子 Yの転写を制御する能力を有する領域などを 挙げることができる。
レポーター遺伝子は、 検出可能なタンパク又は酵素をコードする遺伝子であれ ばよく、 例えば G F P (緑色蛍光タンパク質） 遺伝子、 G U S ( ]3—ダルクロニ ダーゼ） 遺伝子、 L U S (ルシフェラーゼ） 遺伝子、 C A T (クロラムフエニコ ルァセチルトランスフェラーゼ） 遺伝子等が挙げられる。 標的遺伝子 Y転写調節領域、 当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝 子が導入される細胞は、 標的遺伝子 Υ転写調節機能を評価できる限り、 即ち、 該 レポータ 遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。 し かしながら、 標的遺伝子 Υに対する生理的な転写調節因子を発現し、 標的遺伝子 Υの発現調節の評価により適切であると考えられることから、 該導入される細胞 としては、 標的遺伝子 Υを天然で発現可能な細胞が好ましい。
被験物質と標的遺伝子 Υの発現を測定可能な細胞とが接触される培養培地は、 用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、 例えば、 約 5〜2 0 %の ゥシ胎仔血清を含む最少必須培地（Μ Ε Μ)、 ダルベッコ改変最少必須培地（D M E M)、 R P M I 1 6 4 0培地、 1 9 9培地などである。 培養条件もまた、用いら れる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、 例えば、 培地の p Hは約 6〜約 8であり、 培養温度は通常約 3 0〜約 4 0 °Cであり、 培養時間は約 1 2〜約 7 2 時間である。
方法論 I Iの工程 （b ) では、 先ず、 被験物質を接触させた細胞における標的 遺伝子 Yの発現量が測定される。 発現量の測定は、 用いた細胞の種類などを考慮 し、 自体公知の方法により行われ得る。
例えば、 標的遺伝子 Yの発現を測定可能な細胞として、 標的遺伝子 Yを天然で 発現可能な細胞を用いた場合、 発現量は、 標的遺伝子 Yの産物、 例えば、 転写産 物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。 例えば、 転写産 物の発現量は、 細胞から total R N Aを調製し、 R T— P C R、 ノザンプロッテ イング等により測定され得る。 また、 翻訳産物の発現量は、 細胞から抽出液を調 製し、 免疫学的手法により測定され得る。 免疫学的手法としては、 放射性同位元 素免疫測定法 （R I A法）、 E L I S A法（Methods in Enzyraol. 70： 419-439 (1 980) )、 蛍光抗体法などが使用できる。
一方、 標的遺伝子 Yの発現を測定可能な細胞として、 標的遺伝子 Y転写調節領 域についてレポーターアツセィを可能とする細胞を用いた場合、 発現量は、 レポ 一ターのシグナル強度に基づき測定され得る。 また、 発現量は、 標的遺伝子 Yの総発現量に基づいて測定するのではなく、 標 的遺伝子 Yの個々のァイソフォーム （例えば、 スプライシングバリアント） に対 する発現量あるいはァイソフォーム間の発現比に基づいて測定してもよい。 さらには、 標的遺伝子 Yが細胞内に局在する因子の遺伝子である場合、 発現量 は、 細胞内局在に基づいて測定することもできる。 所定の細胞内器官に局在する 標的タンパク質 Yの量は、 自体公知の方法により測定できる。 例えば、 G F P遺 伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子と融合させた標的遺伝子 γを適切な 細胞に導入し、 培養培地において被験物質の存在下で培養する。 次いで、 共焦点 顕微鏡により所定の細胞内器官における蛍光シグナルを観察し、 被験物質の非存 在下での該器官における蛍光シグナルと比較すればよい。 また、 標的タンパク質 Yに対する抗体を用いる免疫染色によっても、 所定の細胞内器官に局在する標的 タンパク質 Yの量を測定できる。
次いで、 被験物質を接触させた細胞における標的遺伝子 Yの発現量が、 被験物 質を接触させない対照細胞における標的遺伝子 Yの発現量と比較される。 発現量 の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行なわれる。 被験物質を接触さ せない対照細胞における標的遺伝子 Yの発現量は、 被験物質を接触させた細胞に おける標的遺伝子 Yの発現量の測定に対し、 事前に測定した発現量であっても、 同時に測定した発現量であってもよいが、 実験の精度、 再現性の観点から同時に 測定した発現量であることが好ましい。
方法論 I Iの工程 （c ) では、 標的遺伝子 Yの発現量を調節する被験物質が選 択される。標的遺伝子 Yの発現量の調節は、発現量の促進または抑制であり得る。 このように選択された被験物質は、 生理活性物質 Xに関連する作用の調節に有用 であり得る。
別の実施形態では、 スクリーニング方法 I aは、 下記の工程 （a )、 ( b ) 及ぴ ( c ) を含む：
( a ) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
( b ) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定する工程； (c) 上記 （b) の結果に基づいて、 該タンパク質に結合能を有する被験物質を 選択する工程。
上記 （a) 〜 （c) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 I I I」 と 省略する。
方法論 I I Iの工程 （a) では、 被験物質が標的タンパク質 Yと接触条件下に おかれる。 被験物質の該タンパク質に対する接触は、 溶液中での被験物質と該タ ンパク質との混合により行われ得る。
標的タンパク質 Yは自体公知の方法により調製できる。 例えば、 上述した標的 遺伝子 Yの発現組織から標的タンパク質 Yを単離 ·精製できる。 しかしながら、 迅速、 容易かつ大量に標的タンパク質 Yを調製し、 また、 ヒ ト標的タンパク質 Y を調製するためには、 遺伝子組換え技術により組換えタンパク質を調製するのが 好ましい。 組換えタンパク質は、 細胞系、 無細胞系のいずれで調製したものでも よい。
方法論 I I Iの工程 （b) では、 該タンパク質に対する被験物質の結合能が測 定される。 測定される 「結合能」 としては、 タンパク質と被験物質の結合を評価 できるものである限り特に限定されないが、 結合量、 結合強度 （親和定数、 結合 速度定数、解離速度定数などのパラメーターを含む）、結合様式（濃度依存的結合 を含む） が挙げられる。
結合能の測定は、 例えば、 SEC/MS (サイズ排除クロマトグラフィー 質 量分析） 法により行われ得る （Moy, F. J. et al, , Anal. Chem.， 2001， 73， 57 1-581 参照）。 SEC/MS法では、 （1) 精製したタンパク質に混合した多重化 化合物標品を添加した後、 遊離の化合物とタンパク質とを SECで分離する工程 と、 （2) タンパク質分画に含まれる結合化合物を MSによって同定する解析工程 と力、ら構成される。 S ECZMS法は、タンパク質、被験物質の双方とも非修飾、 非固定の状態で結合能を解析できる点で優れている。 SEC/MS法では、 被験 物質のタンパク質に対する結合能のみならず、 タンパク質に対する結合における 被験物質の濃度依存性などについても同時に測定できる。 結合能の測定はまた、 表面プラズモン共鳴を利用した測定手段、 例えば、 B i a c o r eにより行われ得る。 B i a c o r eでは、 チップ上に固定したタンパ ク質において、 被験物質のタンパク質に対する結合及び解離を測定し、 被験物質 を含有しない溶液をチップ上にロードした場合と比較する。 そして、 結合及ぴ解 離の速度あるいは結合量についての結果に基づいて、 タンパク質に結合能を有す る被験物質が選択される。 B i a c o r eでは、 被験物質のタンパク質に対する 結合能のみならず、 結合強度 （例えば、 K d値） などについても同時に測定でき る。
結合能を測定し得る他の方法としては、 例えば、 水晶振動子マイクロバランス (QuartzCrystal Microbalance： QCM) 法、 二面偏波式干渉計 (Dual Polarisati on Interferometer： DPJJ 法、 Coupled Waveguide Plasmon Resonance法等の SP Rあるいは光学的な手法、免疫沈降法、等温滴定ぉよび示差走査力口リメ トリー、 キヤピラリー電気泳動法、 エナジートランスファー、 蛍光相関分析等の蛍光分析 法、 さらには X線結晶構造解析、 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)等の構造解析 法が挙げられる。
また、 結合能の測定に際しては、 標的タンパク質 Y結合性物質をコントロール として用いることもできる。
「標的タンパク質 Y結合性物質」 とは、 標的タンパク質 Yまたはその変異タン パク質と直接的に相互作用可能な化合物であり、 例えば、 タンパク質、 核酸、 糖 質、 脂質、 低分子有機化合物であり得る。 好ましくは、 標的タンパク質 Y結合性 物質は、 チアベンダゾール、 レセルピン、 イミぺネム、 セファレキシンまたはァ クラルビシンまたは標的タンパク質 Y (生理活性物質 Xの種類に応じて決定され る） に結合能を有するそれらの誘導体（後述）、 あるいはそれらの塩から選択され 得る。 ，
塩としては、 特に限定されないが、 医薬上許容され得る塩が好ましく、 例えば 無機塩基 （例えば、 ナトリウム、 カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、 マ グネシゥムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニゥム）、有機塩基（例 えば、 トリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジン、 ピコリン、 エタノール ァミン、ジェタノーノレアミン、 トリエタノーノレアミン、ジシク口へキシノレアミン、 N , N—ジベンジルエチレンジァミン）、 無機酸 （例えば、 塩酸、 臭化水素酸、 硝 酸、硫酸、 リン酸）、有機酸（例えば、 ギ酸、酢酸、 トリフルォ.口酢酸、 フマル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 クェン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホ ン酸、ベンゼンスルホン酸、 p―トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例えば、 アルギニン、 リジン、 オル二チン） または酸性アミノ酸 （例えば、 ァスパラギン 酸、 グルタミン酸） との塩などが挙げられる。
さらに、 結合能は、 標的タンパク質 Yの総結合能に基づいて測定するのではな く、 標的タンパク質 Yの個々のァイソフォーム （例えば、 スプライシングバリア ント） に対する結合能あるいはァイソフォーム間の結合能比に基づいて測定して あよい。
また、 結合能の測定は、 インシリコで行うこともできる。 例えば、 結合能の測 定は、 S B D D (Structure-Based Drug Design : SBDD)、 C A D D (Computer - A ided Drug Design) に基づいて行われ得る。 このようなスクリーユングの例とし ては、 バーチヤノレスクリーニング、 de novo デザイン、 ファーマコフォー分析、 Q S A R (Quantitative Structure Activity Relationship)など力 S挙げられる。 このようなスクリーユングの際にタンパク質自体、 あるいはタンパク質の標的部 位の立体構造の情報が必要とされる場合、 NMR、 X線結晶解析、 放射光解析等 の構造解析法により立体構造が判明しているならばその情報が使用され、 立体構 造が判明していないならば homology法、 Threading法等の構造予測法により得ら れる情報などが使用される。 また、 バーチャルスクリーユングでは、 自体公知の プログラムを用いることができ、 このようなプログラムとしては、 例えば、 D o c k (Kuntz, I. D. et al. , Science, 1992， 257， 1078)、 G o l d (Jones, G. et al. , J. Mol. Biol. , 1995， 245, 43)、 F 1 e x X (Rarey, M. et al.， J. Mol. Biol. , 1996， 261， 470)、 A u t o D o c k (Morris, G. M. et al. , J. Comput. Chem.， 1998, 19， 1639)、 I C M (Abagyan, R. A. et al. , J. Coraput. Chem. , 1994, 15， 488) などが挙げられる。
方法論 I I Iの工程 （c ) では、 標的タンパク質 Yに結合能を有する被験物質 が選択される。 該タンパク質に結合能を有する被験物質は、 標的タンパク質 Υの 機能を促進または抑制し得る。 このように選択された被験物質は、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の調節に有用であり得る。
さらに別の実施形態では、 スクリーニング方法 I aは、 下記の工程（a )、 ( b ) 及ぴ （c ) を含む：
( a ) 被験物質、 標的タンパク質 Y結合性物質を、 標的タンパク質 Yに接触させ る工程；
( b ) 被験物質の存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に 対する結合能を測定し、 該結合能を被験物質の非存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に対する結合能と比較する工程；
( c ) 上記 （b ) の比較結果に基づいて、 標的タンパク質 Y結合性物質の該タン パク質に対する結合能の変化をもたらす被験物質を選択する工程。
上記 （a ) 〜 （c ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 I V」 と省 略する。
方法論 I Vの工程 （a ) では、 被験物質、 標的タンパク質 Y結合性物質のいず れもが標的タンパク質 Yと接触条件下におかれる。 被験物質、 標的タンパク質 Y 結合性物質の該タンパク質に対する接触は、 溶液中での被験物質、 標的タンパク 質 Y結合性物質、 該タンパク質の混合により行われ得る。 また、 該タンパク質に 対して被験物質、 標的タンパク質 Y結合性物質を接触させる順番は特に限定され ず、 いずれかを先に該タンパク質に接触させても、 同時に接触させてもよい。 標的タンパク質 Yは自体公知の方法により調製できる。 例えば、 該タンパク質 の調製は、 方法論 I I Iで上述した方法により行われ得る。
標的タンパク質 Y結合性物質は、 標識されていても未標識であってもよい。 ま た、 標識体と未標識体を所定の割合で含む混合物も標的タンパク質 Y結合性物質 として使用できる。 標識用物質は上述の通りである。 方法論 I Vの工程 （b ) では、 先ず、 被験物質の存在下、 標的タンパク質 Y結 合性物質の該タンパク質に対する結合能が測定される。 測定される 「結合能」 と しては、 タンパク質と被験物質の結合を評価できるものである限り特に限定され ないが、 結合量、 結合強度 （親和定数、 結合速度定数、 解離速度定数などのパラ メーターを含む）、 結合様式 （濃度依存的結合を含む） が挙げられる。
結合能の測定は、 例えば、 標識された標的タンパク質 Y結合性物質を用いて行 われ得る。 該タンパク質に結合した標的タンパク質 Y結合性物質と未結合の標的 タンパク質 γ結合性物質は、結合能の測定前に分離されてもよい。より詳細には、 結合能の測定は、 方法論 I I Iと同様に行われ得る。
また、結合能は、標的タンパク質 Yの総結合量に基づいて測定するのではなく、 標的タンパク質 Yの個々のァイソフォーム（例えば、スプライシングバリアント） に対する結合能あるいはァイソフォーム間の結合能比に基づいて測定してもよい。 次いで、 被験物質の存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク 質に対する結合能が、 被験物質の非存在下における標的タンパク質 Y結合性物質 の該タンパク質に対する結合能と比較される。 結合能の比較は、 好ましくは、 有 意差の有無に基づいて行われる。 被験物質の非存在下における標的タンパク質 Y 結合性物質の該タンパク質に対する結合能は、 被験物質の存在下における標的タ ンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に対する結合能の測定に対し、 事前に測定 した結合能であっても、 同時に測定した結合能であってもよいが、 実験の精度、 再現性の観点から同時に測定した結合能であることが好ましい。
方法論 I Vの工程 （c ) では、 標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に 対する結合能の変化をもたらす被験物質が選択される。結合能の変化は、例えば、 結合能の低下または増加であり得るが、 結合能の低下が好ましい。 このように選 択された被験物質は、 生理活性物質 Xに関連する作用の調節に有用であり得る。 スクリーニング方法 I aは、 （d ) ( i ) 被験物質が生理活性物質 Xに関連する 作用を調節、例えば促進または抑制し得ることを確認する工程（確認工程）、 また は （ i i ) 被験物質が有する作用の種類を同定する工程 （同定工程） をさらに含 むことができる。 確認工程または同定工程は、 例えば、 正常な動物に対し、 ある いは 「生理活性物質 Xに関連する疾患または状態」 の動物またはモデル動物に対 し、 被験物質を投与することで行なわれ得る。 あるいは、 これらの工程は、 被験 物質を細胞に接触させ、 接触後の細胞の表現型の変化を評価することで行うこと もできる。 また、 かかる同定工程によれば、 選択された被験物質が有する 「生理 活性物質 Xに関連する作用」 の種類を決定でき、 選択された被験物質が医薬また は研究用試薬のいずれか、 あるいはその両方として使用可能であるか否かを、 お よび該被験物質が使用可能な医薬または研究用試薬の種類を確認できる。
スクリーニング方法 I aはまた、 動物への被験物質の投与により行うこともで きる。 この場合、 例えば、 標的遺伝子 Yの発現量のみならず、 標的タンパク質 Y の発現量 （例えば、 被験物質が投与された動物の所定の組織または細胞における 標的タンパク質 Yの存在量、 細胞内局在量） もまた測定され得る。 該動物として は、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスタ 、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 サル等 の哺乳動物、 ニヮトリ等の鳥類が挙げられる。 動物を用いて本発明のスクリー二 ング方法が行われる場合、 例えば、 標的遺伝子 Yの発現量を調節する被験物質が 選択され得る。
スクリーニング方法 I aを動物への被験物質の投与により行う場合、 該動物に おける標的タンパク質 Yの細胞内局在を測定してもよい。 細胞内局在の測定は、 上述と同様の方法により行うことができる。
さらに、 標的遺伝子 Yが可溶性 （分泌） 因子の遺伝子である場合には、 動物に おける当該因子の血中濃度の変化に基づき、 スクリーニング方法 I aが行われ得 る。動物への被験物質の投与、動物からの採血、および因子の血中濃度の測定は、 自体公知の方法により行われ得る。
スクリーニング方法 I aは、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質 のスクリーニングを可能とする。 従って、 スクリーニング方法 I aは、 生理活性 物質 Xに関連する疾患または状態の予防 ·治療剤、 並びに該疾患または該状態の 研究用試薬の開発などに有用である。 2 . 1 . 2 . 標的タンパク晳 Yの発現または機能を調節し得ない被験物質を選択 することを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリ一二 ング方法 （スクリーニング方法 I b )
本発明は、 被験物質が標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得るか否か を評価し、 標的タンパク質 Yの発現または機能を調節し得ない被験物質を選択す ることを含む、 生理活性物質 Xに関連する作用 （なかでも、 既知標的分子に関連 する作用および または生理活性物質 Xが実際に示す薬理作用） を調節し得る物 質 （例えば、 生理活性物質 Xが実際に示す薬理作用を有する、 生理活性物質 と 同様の医薬用途に用いられ得る物質であって、 生理活性物質 Xが実際に示す副作 用を有しないまたは該副作用が低減された物質） のスクリーニング方法を提供す る。
スクリーニング方法 I bは、 上述した方法論 I〜 I Vの工程 （c ) において変 化をもたらさない、 あるいは結合能又は調節能を有しない被験物質を選択するこ と以外は、 方法論 1〜 I Vと同様に行われ得る。
スクリーニング方法 I bでは、 用いられる被験物質は、 既知の標的分子 （例え ば表 8参照） の発現または機能を調節し得るもの、 あるいは被験物質が生理活性 物質 Xに関連する作用 （なかでも、 生理活性物質 Xが実際に示す薬理作用） を有 するものであり得る。 従って、 スクリーニング方法 I bは、 被験物質が既知の標 的分子の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、 既知の標的 分子に関連する作用を調節し得る物質のスクリーニング方法と組合せて用いるこ とができる。 既知の標的分子に関連する作用を調節し得る物質のスクリーニング 方法は、 上述したスクリーニング方法 I aと同様に行われ得る。 あるいは、 スク リーユング方法 l bは、 被験物質が生理活性物質 Xに関連する作用 （なかでも、 生理活性物質 Xが実際に示す薬理作用） を調節し得るか否かを評価することを含 む、 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリーニング方法と組 合せて用いることができる。 このようなスクリーニング方法は、 動物または細胞 を用いて、 上述したスクリーニング方法 I aの工程 （d ) と同様に行われ得る。 (表 8 )
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スクリーニング方法〗 bは、 既知標的分子に関連する作用の調節能および zま たは生理活性物質 Xが実際に示す薬理作用を有し、 且つ生理活性物質 Xが示す副 作用が低減した医薬の開発を可能とする。 従って、 スクリーニング方法 I bは、 既知標的分子に関連する作用の調節能を有する既存医薬の改良などに有用である。 2 . 2 . 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物質のスクリーニング方 法 （スクリ一ユング方法 I I )
本発明は、 標的タンパク質 Yに対する被験物質の結合能またはそれに関連する 作用を、 標的タンパク質 Yに対する生理活性物質 Xの結合能またはそれに関連す る作用と比較することを含む、 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物 質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング方法を、 必要に応じて 「スクリーニング方法 I I」 と省略す る。
一実施形態では、スクリーニング方法 I Iは、下記の工程（a )、（b )及ぴ（c ) を含む：
(a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の存在下における該タンパク質の機能レベルを測定し、 該機能レ ベルを生理活性物質 Xの存在下における該タンパク質の機能レベルと比較するェ 程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 該タンパク質の機能レベルの変化をも たらす被験物質を選択する工程。
上記の工程 （a) 〜 （c) を含む方法論は、 工程 （b) の比較対照が 「被験物 質の非存在下における標的タンパク質 Yの機能レベル」 ではなく 「生理活性物質 Xの存在下における標的タンパク質 Yの機能レベル」 であること以外は、 方法論 Iと同様である。
別の実施形態では、 スクリーニング方法 I Iは、 下記の工程 （a)、 （b) 及び (c) を含む：
(a) 被験物質と標的タンパク質 Y又はそれをコードする遺伝子の発現を測定可 能な細胞とを接触させる工程；
(b) 被験物質を接触させた細胞における発現量を測定し、 該発現量を生理活性 物質 Xを接触させた対照細胞における発現量と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 発現量を調節する被験物質を選択する 工程。
上記の工程 （a) 〜 （c) を含む方法論は、 工程 （b) の比較対照が 「被験物 質を接触させない対照細胞における発現量」 ではなく 「生理活性物質 Xを接触さ せた対照細胞における発現量」 であること以外は、 方法論 I Iと同様である。 さらに別の実施形態では、 スクリーニング方法 I Iは、 下記の工程 （a)、 (b) 及び （c) を含む：
(a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定し、 該結合能を生理活性物 質 Xの該タンパク質に対する結合能と比較する工程； ( c ) 上記 （b ) の結果に基づいて、 該タンパク質に結合能を有する被験物質を 選択する工程。
上記の工程 （a ) 〜 （c ) を含む方法論は、 工程 （b ) において 「生理活性物 質 Xの標的タンパク質 Yに対する結合能」 を比較対照とすること以外は、 方法論 I I Iと同様である。
スクリーニング方法 I Iは、 例えば、 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節 し得る物質、 あるいは標的タンパク質 Yに対するプローブのスクリーニングなど を可能とする。 従って、 スクリーニング方法 I Iは、 標的遺伝子 Yに関連する疾 患または状態の予防■治療剤、 並びに該疾患または該状態の研究用試薬のスクリ 一ユングなどに有用である。
2 . 3 . スクリーニング方法により得られる成果物
本発明は、 上記スクリーユング方法、 例えばスク リーニング方法 I、 I Iによ り得られる成果物を提供する。
本発明のスクリーユング方法により提供される成果物は、 本発明のスクリー二 ング方法により得られる物質、 および該スクリーニング方法により得られる物質 を含有してなる、 生理活性の調節剤 （後述） であり得る。
本発明のスクリーニング方法により提供される成果物は、 例えば、 生理活性物 質 Xに関連する疾患または状態、 あるいは標的遺伝子 Yに関連する疾患または状 態の予防 ·治療に、 あるいは該疾患または該状態の研究用試薬などとして有用で ある。
3 . 調節剤
本発明は、 生理活性物質の標的遺伝子の発現または機能を調節する物質を含有 してなる、 生理活性の調節剤を提供する。 本発明の調節剤は、 調節される生理活 性の観点から、 生理活性物質 Xに関連する作用の調節剤、 および標的タンパク質 Yに関連する機能の調節剤に大別できる。 以下、 それぞれの調節剤を詳述する。 3 . 1 . 生理活性物質 Xに関連する作用の調節剤 （調節剤 I )
本発明は、 標的遺伝子 Yの発現又は機能を調節する物質を含有してなる、 生理 活性物質 Xに関連する作用の調節剤を提供する。
本調節剤を、 必要に応じて 「調節剤 I」 と省略する。
標的遺伝子 Yの発現又は機能を調節する物質は、 例えば、 標的遺伝子 Yの発現 を抑制する物質であり得る。 発現とは、 標的遺伝子 Y翻訳産物が産生され且つ機 能的な状態でその作用部位に局在することをいう。 従って、 発現を抑制する物質 は、 遺伝子の転写、 転写後調節、 翻訳、 翻訳後修飾、 局在化及びタンパク質フォ 一ルディング等の、 いかなる段階で作用するものであってもよい。
詳細には、 標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質としては、 転写抑制因子、 R N Aポリメラーゼ阻害剤、 R N A分解酵素、 タンパク質合成阻害剤、 核内移行阻害 剤、 タンパク質分解酵素、 タンパク質変性剤等が例示されるが、 細胞内で発現す る他の遺伝子■ タンパク質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、 標的分子に 特異的に作用し得る物質であることが重要である。
標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質の例は、 標的遺伝子 Yの転写産物、 詳細に は m R N Aもしくは初期転写産物に対するアンチセンス核酸である。「アンチセン ス核酸」 とは、 標的 m R NA (初期転写産物） を発現する細胞の生理的条件下で 該標的 m R N A (初期転写産物） とハイブリダィズし得る塩基配列からなり、 且 つハイプリダイズした状態で該標的 m R N A (初期転写産物） にコードされるポ リぺプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。 アンチセンス核酸の種類は D N Aで あっても R N Aであってもよいし、 あるいは D N A// R N Aキメラであってもよ い。 また、 天然型のアンチセンス核酸は、 細胞中に存在する核酸分解酵素によつ てそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、 本発明のアンチセンス核 酸は、 分解酵素に安定なチォリン酸型 （リン酸結合の P = 0を P = Sに置換） や 2， -0-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成もできる。 アンチセンス核 酸の設計に重要な他の要素として、 水溶性及ぴ細胞膜透過性を高めること等が挙 げられるが、 これらはリボソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形のェ 夫によっても克服できる。
アンチセンス核酸の長さは、 標的遺伝子 Yの転写産物と特異的にハイプリダイ ズし得る限り特に制限はなく、 短いもので約 1 5塩基程度、 長いもので mRNA (初期転写産物） の全配列に相捕的な配列を含むような配列であってもよい。 合 成の容易さや抗原性の問題等から、 例えば約 1 5塩基以上、 好ましくは約 1 5〜 約 30塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
アンチセンス核酸の標的配列は、 アンチセンス核酸がハイプリダイズすること により、 標的遺伝子 Yもしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば 特に制限はなく、 mRNAの全配列であっても部分配列であってもよいし、 ある いは初期転写産物のィントロン部分であってもよいが、 アンチセンス核酸として オリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列は標的遺伝子 Yの mRNAの 5， 末端からコード領域の C末端までに位置することが望ましい。
さらに、 アンチセンス核酸は、 標的遺伝子 Yの転写産物とハイプリダイズして 翻訳を阻害するだけでなく、 二本鎖 DN A形態の標的遺伝子 Yと結合して三重鎖 (トリプレックス） を形成し、 mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよ い。
標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質の別の例は、 標的遺伝子 Y転写産物、 詳細 には mRNAもしくは初期転写産物を、 コード領域の内部 （初期転写産物の場合 はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザィムである。「リボザィム J とは核酸を切断する酵素活性を有する RN Aをいうが、 最近では当該酵素活性部 位の塩基配列を有するオリゴ DNAも同様に核酸切断活性を有することが明らか になっているので、 本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限り DNAを も包含する概念として用いるものとする。 リボザィムとして最も汎用性の高いも のとしては、 ウイロイドゃウィルソィド等の感染性 RNAに見られるセルフスプ ライシング RN Aがあり、 ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。 ま た、 リポザィムを、 それをコードする DNAを含む発現ベクターの形態で使用す る場合には、 細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさら に連結したハイブリッドリボザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res.， 29(13): 2780—2788 (2001)]。 標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質のさらに別の例は、 デコイ核酸である。 デ コィ核酸とは、 転写調節因子が結合する領域を模倣する核酸分子をいい、 標的遺 伝子 Υの発現を抑制する物質としてのデコイ核酸は、 標的遺伝子 Υに対する転写 活性化因子が結合する領域を模倣する核酸分子であり得る。
デコイ核酸としては、 例えば、 リン酸ジエステル結合部分の酸素原子を硫黄原 子で置換したチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド （S—オリ ゴ）、又はリン酸ジエステル結合を電荷を持たないメチルホスフエ一ト基で置換し たオリゴヌクレオチドなど、 生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくす るために改変したオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。 デコイ核酸は転写活性 化因子が結合する領域と完全に一致していてもよいが、 標的遺伝子 Υに対する転 写活性化因子が結合し得る程度の同一性を保持していればよい。 デコイ核酸の長 さは転写活性化因子が結合する限り特に制限されない。 また、 デコイ核酸は、 同 一領域を反復して含んでいてもよい。
標的遺伝子 Υの発現を抑制する物質のさらに別の例は、標的遺伝子 Υ転写産物、 詳細には mRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列 （初期転写産 物の場合はイントロン部分を含む） に相補的な二本鎖オリゴ RNA、 いわゆる s i RNAである。 短い二本鎖 RNAを細胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが分解される、 いわゆる RNA干渉 （RNA i ) と呼ばれる現象は、 以 前から線虫、 昆虫、 植物等で知られていたが、 最近、 この現象が動物細胞でも起 こることが確認されたことから [Nature, 411(6836)： 494-498 (2001)]、 リボザ ィムの代替技術として注目されている。 s i RNAとしては、 後述の通り自ら合 成したものを使用できるが、 市販のものを用いてもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチド及ぴリポザィムは、 標的遺伝子 Yの c DNA 配列もしくはゲノミック DNA配列に基づいて標的遺伝子 Y転写産物、 詳細には mRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、 市販の D N N A自動 合成機 （アプライド 'バイオシステムズ社、 ベックマン社等） を用いて、 これに 相補的な配列を合成することにより調製できる。 デコイ核酸、 s i RNAは、 セ ンス鎖及びアンチセンス鎖を D N A/R N A自動合成機でそれぞれ合成し、 適当 なァニーリング緩衝液中、 約 9 0〜約 9 5 °Cで約 1分程度変性させた後、 約 3 0 〜約 7 0 °Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせることにより調製できる。 また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、 こ れらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーシヨンすることにより、 より長 い二本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。
標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質の別の例は、 標的タンパク質 Yに対する抗 体である。 該抗体は、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体のいずれであつ てもよく、 周知の免疫学的手法により作製できる。 また、 該抗体は、 抗体のフラ グメント （例えば、 Fab、 F (ab ' ) 2)、 組換え抗体 （例えば、 単鎖抗体） であって もよい。 さらに、 該抗体をコードする核酸 （プロモーター活性を有する核酸に機 能可能に連結されたもの） もまた、 標的遺伝子 Yの発現を抑制する物質として好 ましい。
例えば、 ポリクローナル抗体は、 標的タンパク質 Yあるいはそのフラグメント (必要に応じて、 ゥシ血清アルブミン、 K L H (Keyhole Limpet Hemocyanin) 等 のキャリアタンパク質に架橋じた複合体とすることもできる） を抗原として、 巿 販のアジュバント （例えば、 完全または不完全フロイントアジュバント） ととも に、 動物の皮下あるいは腹腔内に 2〜3週間おきに 2〜4回程度投与し （部分採 血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、 その上昇を確認してお く）、最終免疫から約 3〜約 1 0日後に全血を採取して抗血清を精製することによ り取得できる。 抗原を投与する動物としては、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ャギ、 モルモッ ト、 ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、 モノクローナル抗体は、 細胞融合法 （例えば、 渡邊武、 細胞融合法の原 理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、 高橋利忠編、 「モノクローナル抗体とが ん一基礎と臨床一」、 第 2- 14頁、 サイエンスフォーラム出版、 1985年） により作 成することができる。 例えば、 マウスに該因子を市販のアジュパントと共に 2〜 4回皮下あるいは腹腔内に投与し、 最終投与の約 3日後に脾臓あるいはリンパ節 を採取し、 白血球を採取する。 この白血球と骨髄腫細胞 （例えば、 NS- 1、 P3X63A g8など） を細胞融合して該因子に対するモノク口ーナル抗体を産生するハイブリ ドーマを得る。 細胞融合は P E G法 [J. Immunol. Methods, 81 (2)： 223-228 (19 85) ] でも電圧パルス法 [Hybridoma, 7 (6) : 627-633 (1988) ] であってもよい。 所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマは、 周知の E I Aまたは R I A法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、 培養上清中から検出すること により選択できる。 モノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマの培養は、 ィ ンビトロ、 またはマウスもしくはラット、 このましくはマウス腹水中等のインビ ボで行うことができ、 抗体はそれぞれハイプリ ドーマの培養上清および動物の腹 水から取得できる。
しかしながら、ヒ トにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗体は、 キメラ抗体、 ヒ ト化又はヒ ト型抗体であってもよい。 キメラ抗体は、 例えば 「実 験医学 （臨時増刊号） , Vol. 6, No. 10, 1988」、 特公平 3- 73280号公報等を、 ヒ ト 化抗体は、例えば特表平 4-506458号公報、特開昭 62-296890号公報等を、 ヒ ト抗 体は、 例えば 「Natui:e Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997」、 「Nature Genetic s, Vol. 7, p. 13-21, 1994」、 特表平 4- 504365号公報、 国際出願公開 W094/25585 号公報、 「日経サイエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年」、 「Nature, Vol. 368, p. 856-859， 1994」、 特表平 6- 500233号公報等を参考にそれぞれ作製す ることができる。
標的遺伝子 Yの発現又は機能を調節する物質はまた、 標的遺伝子 Yの機能を抑 制する物質であり得る。
標的遺伝子 Yの機能を抑制する物質としては、 標的遺伝子 Yの作用を妨げ得る 物質である限り特に限定されないが、 他の遺伝子 ·タンパク質に及ぼす悪影響を 最小限にするためには、 標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要で ある。 標的遺伝子 Yの機能を特異的に抑制する物質としては、 標的タンパク質 Y のドミナントネガティブ変異体、 該変異体をコードする核酸 （プロモーター活性 を有する核酸に機能可能に連結されたもの） が例示される。 標的タンパク質 Yのドミナントネガティブ変異体とは、 標的タンパク質 Υに対 する変異の導入によりその活性が低減したものをいう。 該ドミナントネガティブ 変異体は、 天然の標的タンパク質 Υと競合することで間接的にその活性を阻害す ることができる。 該ドミナントネガティブ変異体は、 標的遺伝子 Υをコードする 核酸に変異を導入することによって作製することができる。 変異としては、 例え ば、 機能性ドメインにおける、 当該ドメインが担う機能の低下をもたらすような アミノ酸の変異（例えば、 1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加） が挙げられる。 該変異は、 P C Rや公知のキットを用いる自体公知の方法により導入できる。 標的遺伝子 Υの発現を抑制する物質が、 核酸分子である場合、 本発明の調節剤 は、 該核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。 当該 発現ベクターは、 上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリ ヌクレオチドが、 投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し 得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。 使用されるプロモ 一ターは、投与対象である哺乳動物で機能し得るものであれば特に制限はないが、 例えば、 S V 4 0由来初期プロモーター、 サイトメガロウィルス L T R、 ラウス 肉腫ウィルス L T R、 M o M u L V由来 L T R、 アデノウイルス由来初期プロモ 一ター等のウイノレスプロモーター、 並びに —ァクチン遺伝子プロモーター、 p
G K遺伝子プロモーター、 トランスフェリン遺伝子プロモータ 等の哺乳動物の 構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
発現ベクターは、 好ましくは核酸分子をコードするオリゴ （ポリ） ヌクレオチ ドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有する。さらに、 形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子 （テトラサイクリン、 アンピシリ ン、 カナマイシン、 ハイグロマイシン、 ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵 抗性を付与する遺伝子、 栄養要求性変異を相補する遺伝子等） をさらに含有する こともできる。
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは特に制限されないが、 ヒ ト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、 レトロウイルス、 アデノウ イノレス、 アデノ随伴ウイノレス、 へノレぺスゥイノレス、 ワクシェアウイノレス、 ボック スウィルス、 ポリオウィ^/ス、 シンドビスウィルス、 センダイウイ ス等のウイ ルスベクターが挙げられる。 アデノウイルスは、 遺伝子導入効率が極めて高く、 非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。 但し、 導入遺伝子の宿主染色 体への組込みは極めて稀であるので、 遺伝子発現は一過性で通常約 4週間程度し か持続しない。 治療効果の持続性を考慮すれば、 比較的遺伝子導入効率が高く、 非分裂細胞にも導入可能で、 且つ逆位末端繰り返し配列 （I T R ) を介して染色 体に組み込まれ得るアデノ随伴ウィルスの使用もまた好ましい。
標的タンパク質 Υの発現又は機能を調節する物質はまた、 チアベンダゾール、 レセルピン、 イミぺネム、 セファレキシンまたはアクラルビシンまたは標的タン パク質 Υに結合能を有するそれらの誘導体（後述）、あるいはそれらの塩であり得 る。
調節剤 Iは、標的遺伝子 Υの発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、 例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。
医薬上許容され得る担体としては、 例えば、 ショ糖、 デンプン、 マンニット、 ソルビット、 乳糖、 グルコース、 セルロース、 タルク、 リン酸カルシウム、 炭酸 カルシウム等の賦形剤、 セルロース、 メチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルセ ルロース、 ポリプロピルピロリ ドン、 ゼラチン、 アラビアゴム、 ポリエチレング リコール、 ショ糖、 デンプン等の結合剤、 デンプン、 カルポキシメチルセルロー ス、 ヒ ドロキシプロピルスターチ、 ナトリウム一グリコーノレ一スターチ、 炭酸水 素ナトリウム、 リン酸カルシウム、 クェン酸カルシウム等の崩壌剤、 ステアリン 酸マグネシウム、 エア口ジル、 タルク、 ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、 タエ ン酸、 メントール、 グリシルリシン -アンモニゥム塩、 グリシン、 オレンジ粉等 の芳香剤、 安息香酸ナトリウム、 亜硫酸水素ナトリウム、 メチルパラベン、 プロ ピルパラベン等の保存剤、 クェン酸、 クェン酸ナトリウム、 酢酸等の安定剤、 メ チルセルロース、ポリビニルピロリ ドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、 界面活性剤等の分散剤、 水、 生理食塩水、 オレンジジュース等の希釈剤、 カカオ 月旨、 ポリエチレングリコール、 白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、 それらに限定されるものではない。
経口投与に好適な製剤は、 水、 生理食塩水、 オレンジジュースのような希釈液 に有効量の物質を溶解させた液剤、 有効量の物質を固体や顆粒として含んでいる カプセル剤、 サッシェ剤または錠剤、 適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させ た懸濁液剤、 有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化さ せた乳剤等である。
非経口的な投与 (例えば、 皮下注射、 筋肉注射、 局所注入、 腹腔内投与など） に好適な製剤としては、 水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、 これ には抗酸化剤、 緩衝液、 制菌剤、 等張化剤等が含まれていてもよい。 また、 水性 および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、 安定化剤、 防腐剤等が含まれていてもよい。 当該製剤は、 アンプルやバイアルの ように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、 有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、 使用直前に適当な無菌の ビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
調節剤 Iの投与量は、 有効成分の活性や種類、 病気の重篤度、 投与対象となる 動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、 通常、 成人 1日あたり有効成分量として約 0 . 0 0 1〜約 5 0 0 m gノ k gであ る。
調節剤 Iは、 生理活性物質 Xに関連する作用の調節、 例えば抑制又は促進を可 能とする。 従って、 調節剤 Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の予 防 ·治療に、 並びに該疾患または該状態の研究用試薬などに有用である。
3 . 2 . 標的タンパク質 Yに関連する機能の調節剤 （調節剤 I I )
本発明は、 生理活性物質 Xを含有してなる標的タンパク質 Yに関連する機能の 調節剤を提供する。
本調節剤を、 必要に応じて 「調節剤 I I」 と省略する。
生理活性物質 Xは、 チアベンダゾール、 レセルピン、 イミぺネム、 セファレキ シンまたはァクラルビシンまたは標的タンパク質 Yに結合能を有するそれらの誘 導体 （後述）、 あるいはそれらの塩であり得る。
調節剤 I Iは、 生理活性物質 Xに加え、 任意の担体、 例えば、 医薬上許容され 得る担体を含むことができる。 調節剤 I Iの投与量は、 調節剤 I と同様である。 調節剤 I Iは、 標的タンパク質 Yに関連する機能の調節、 例えば抑制又は促進 を可能とする。 従って、 調節剤 I Iは、 標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態 の予防 ·治療に、 並びに該疾患の研究用試薬などに有用である。
4 . 誘導体の製造方法、 および該方法により得られる成果物
4 . 1 . 誘導体の製造方法
本発明は、 標的遺伝子の発現または機能を調節し得るように生理活性物質を誘 導体化することを含む、 生理活性物質の誘導体の製造方法を提供する。
誘導体化とは、 リード化合物中の特定の原子または基を、 他の原子または基で 置換することにより得られる化合物、 あるいはリード化合物に対する付加反応に より得られる化合物を仮想的に、または実際に合成することを意味する。例えば、 リード化合物は、 生理活性物質 Xであり得る。
生理活性物質 Xの誘導体化は、 標的遺伝子 Yの発現または機能の調節能を保持 するように、 必要に応じて、 得られる誘導体の水溶性 z脂溶性、 安定性、 体内動 態、 バイオアベイラビリティ一、 毒性等のその他の性質についても考慮するよう に行われ得る。 生理活性物質 Xの誘導体化は、 例えば、 標的遺伝子 Yの発現また は機能の調節能を向上し得るように誘導体化され得る。 生理活性物質 Xの誘導体 化はまた、 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得るように誘導体化され得 る。
標的遺伝子 Yの発現または機能の調節能を保持するような生理活性物質 Xの誘 導体化は、 例えば、 S B D D (Structure-Based Drug Design : SBDD)、 C A D D (Computer - Aided Drug Design) に基づいて行われ得る。 このような設計の例と しては、バーチャルスクリーユング、 de novoデザイン、 ファーマコフォー分析、 Q S A R (Quantitative Structure Activity Relationship)など力 S挙げられる。 このような設計の際にタンパク質自体、 あるいはタンパク質の標的部位の立体構 造の情報が必要とされる場合、 NMR、 X線結晶解析、 放射光解析等の構造解析 法により立体構造が判明しているならばその情報が使用され、 立体構造が判明し ていないならば homology法、 Threading法等の構造予測法により得られる情報な どが使用される。 また、 パーチャルスクリーニングでは、 自体公知のプログラム を用いることができ、 このようなプログラムとしては、 例えば、 D o c k (Kunt z, I. D. et al. , Science, 1992, 257, 1078)、 G o l d (Jones, G. et al. , J. Mol. Biol. , 1995， 245, 43)、 F 1 e x X (Rarey, M. et al. , J. Mol. Bio 1.， 1996, 261， 470)、 Au t oD o c k (Morris, G. M. et al. , J. Coraput. Chem. , 1998, 19, 1639)、 I CM (Abagyan, R. A. et al. , J. Comput. Chem. , 1994, 15， 488) などが挙げられる。
標的遺伝子 Yの発現または機能の調節能を保持するような生理活性物質 Xの誘 導体化はまた、 例えば、 生物学的検証 （インビトロまたはインビボ方法） に基づ いて行われ得る。 この場合、 例えば、 上述の方法論 I〜 I Vが用いられ得る。 さ らに、上述した S BDD、C ADD等の方法と生物学的検証とを併用してもよい。 誘導体の製造のため置換される生理活性物質 X (リード化合物） 中の特定の原 子は、 リ一ド化合物中に存在する原子である限り限定されず、例えば、水素原子、 ハロゲン原子 （例えば、 フッ素原子、 塩素原子、 臭素原子、 ヨウ素原子）、 酸素原 子、 硫黄原子、 窒素原子、 炭素原子などが挙げられる。
誘導体の製造のため置換される生理活性物質 X中の特定の基は、 生理活性物質 X中に存在する基である限り限定されず、 例えば分子量 1〜500、 好ましくは 分子量 1〜300、 より好ましくは分子量 1〜200、 最も好ましくは分子量 1 〜100の基であり得る。 該特定の基としては、 例えば、 置換されていてもよい c,〜C8炭化水素基、 置換されていてもよい C 〜C8ァシル基、 置換されてい てもよい芳香族または非芳香族の C3〜C14炭化水素環基、 あるいは置換されて いてもよい芳香族または非芳香族の C3〜C14複素環基、 アミノ基、 炭素数 1〜 4のアルキル基あるいは炭素数 2〜 8のァシル基でモノあるいはジ置換されたァ ミノ基、 アミジノ基、 力ルバモイル基、 炭素数 1〜4のアルキル基でモノあるい はジ置換された力ルバモイル基、 スルファモイル基、 炭素数 1~4のアルキル基 でモノあるいはジ置換されたスルファモイル基、 カルボキシル基、 炭素数 2〜8 のアルコキシカルボニル基、 ヒ ドロキシ基、 1〜 3個のハロゲン原子で置換され ていてもよい炭素数 1〜6のアルコキシ基、 1〜 3個のハロゲン原子で置換され ていてもよい炭素数 2〜 5のアルケニルォキシ基、 炭素数 3 ~ 7のシクロアルキ ルォキシ基、 炭素数 7〜 9のァラルキルォキシ基、 炭素数 6〜 14のァリールォ キシ基、 チオール基、 1〜 3個のハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数 1 〜 6のアルキルチオ基、 炭素数 7〜 9のァラルキルチオ基、 炭素数 6〜 14のァ リールチオ基、 スルホ基、 シァノ基、 アジド基、 ニトロ基、 ニトロソ基などが挙 げられる。
置換されていてもよい 〜C8炭化水素基は、 例えば、 置換されていてもよ い Ci Cgアルキル基、 置換されていてもよい C2 〜C8アルケニル基、 置換さ れていてもよい c2 〜c8アルキニル基であり得る。
置換されていてもよい 〜C8アルキル基の 〜C8アルキル基としては、直 鎖または分岐鎖のいずれでもよく、 好ましくは炭素数 1〜6であり、 例えば、 メ チル、 ェチル、 プロピノレ、 ィソプロピル、 ブチル、 ィソプチル、 s e c一プチノレ、 t e r t—プチル等が挙げられる。
置換されていてもよい C2 〜C8アルケニル基の C2 〜C8アルケニル基とし ては、 直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、 好ましくは炭素数 2〜 6であり、 例 えば、 エテュノレ、 1一プロぺニル、 2—プロぺニノレ、 2—メチル一 1—プロぺニ ル、 1ープテニル、 2—プテニル、 3—プテュル等が挙げられる。
置換されていてもよい C2 〜C8アルキニル基の C2 〜C8アルキニル基とし ては、 直鎖または分岐鎖のいずれでもよく、 好ましくは炭素数 2〜 6であり、 例 えば、 ェチュノレ、 1—プロビュル、 2—プロピニノレ、 1一ブチニノレ、 2—プチ二 ル、 3—'ブチュル等が挙げられる。
置換されていてもよい 〜C8ァシル基の 〜C8ァシル基としては、 直鎖 または分岐鎖のいずれでもよく、 好ましくは炭素数 2〜6であり、 例えば、 ホル ミル、 ァセチル、 プロピノィル、 ブタノィル、 2—メチルプロピノィル等が挙げ られる。
置換されていてもよい芳香族 C 3〜C 1 4炭化水素環基の芳香族 C 3〜C 1 4炭化 水素環基としては、 単環式、 二環式または三環式のいずれでもよく、 好ましくは 炭素数 3〜1 2であり、 例えば、 フエニル、 ナフチルが挙げられる。
置換されていてもよい非芳香族 C 3〜C 1 4炭化水素環基の非芳香族 C 3〜C 1 4 炭化水素環基としては、 飽和または不飽和の単環式、 二環式または三環式のいず れでもよく、 好ましくは炭素数 3〜1 2であり、 例えば、 シクロアルキル基 （例 えば、 シクロプロピノレ、 シクロプチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシノレ、 シク 口へプチル、 シクロォクチル）、 シクロアルケニル基 （例えば、 2—シクロペンテ ンー 1—ィノレ、 3—シク口ペンテン一 1—イスレ、 2—シク口へキセン一 1—ィノレ、 3—シクロへキセン一 1—ィノレ）、 シクロアルカジエニル基 （例えば、 2， 4—シ クロペンタジェン一 1 —ィノレ、 2 , 4—シクロへキサジェン一 1—ィノレ、 2 , 5 —シクロへキサジェン一 1一ィル） 等が挙げられる。
置換されていてもよい芳香族 C 3〜 C i 4複素環基の芳香族 C 3〜 C i 4複素環基 としては、 環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、 硫黄原子および窒素原子 から選ばれるヘテロ原子を 1〜 5個含有する単環式、 二環式または三環式の芳香 族複素環基であり、 好ましくは炭素数 3〜1 2である。 単環式芳香族 C 3〜C 1 4 複素環基の例としては、 フリル、 チェニル、 ピロリル、 ォキサゾリル、 イソォキ サゾリル、 チアゾリル、 イソチアゾリル、 イミダゾリル、 ピラゾリル、 ォキサジ ァゾリル、 フラザニル、 チアジアゾリル、 トリァゾリル、 テトラゾリル、 ピリジ ル、 ピリミジニル、 ピリダジニル、 ピラジュル、 トリアジニルなどが挙げられる。 また、 二環式または三環式の芳香族複素環基の例としては、 ベンゾフラニル、 ィ ソベンゾフラエル、 ベンゾ [ b ] チェニル、 インドリル、 イソインドリル、 1 H ーィンダゾリノレ、ベンズィミダゾリノレ、ベンゾォキサゾリノレ、ベンゾチアゾリノレ、 1 H—ベンゾトリアゾリル、 キノリル、ィソキノリル、シンノリル、キナゾリル、 キノキサリニル、 フタラジェル、 ナフチリジエル、 プリニル、 プテリジニル、 力 ノレノ ゾリノレ、 一カルボ二リル、 ]3—力ノレボニリノレ、 力ノレボニリノレ、 アタリ ジニノレ、 フエノキサジニノレ、 フエノチアジュノレ、 フエナジ二ノレ、 フエノキサチイ ニル、 チアントレュル、 インドリジニル、 ピロ口 [ 1， 2— b ] ピリダジニル、 ピラゾ口 [ 1 , 5— a ] ピリジル、 イミダゾ [ 1 ， 2— a ] ピリジル、 ィミダゾ [ 1， 5 - a ] ピリジル、 イミダゾ [ 1， 2— b ] ピリダジニル、 イミダゾ [ 1 , 2 - a ] ピリミジ -ル、 1， 2， 4—トリァゾロ [ 4 , 3— a ] ピリジル、 1 ， 2， 4一トリァゾロ [ 4 , 3 - b ] ピリダジニルなどが挙げられる。
置換されていてもよい非芳香族 C 3〜 C i 4複素環基の非芳香族 C 3〜 C i 4複素 環基としては、 環構成原子として炭素原子以外に酸素原子、 硫黄原子および窒素 原子から選ばれるヘテロ原子を 1〜 5個含有する単環式、 二環式または三環式の 飽和又は不飽和の複素環基であり、 好ましくは炭素数 3〜 1 2であり、 例えば、 ォキシラニノレ、 ァゼチジュル、 ォキセタニル、 チェタニル、 ピロリジニノレ、 テト ラヒ ドロフリル、 テトラヒ ドロビラニル、 モルホリニル、 チオモルホリニル、 ピ ペラジニル、 ピロリジュル、 ピペリジノ、 モルホリノ、 チオモルホリノなどが挙 げられる。
置換されていてもよい任意の基における置換基の種類は、 誘導体の製造のため 置換される生理活性物質 X中の特定の基 （上述） と同様であり得る。
誘導体の製造のため置換される生理活性物質 X中の特定の原子または基の数は 製造される誘導体が、 遺伝子 Yの発現または機能の調節能を有し得る限り、 例え ば標的タンパク質 Yに結合能を有する限り特に限定されないが、 例えば 1〜1 0 個、 好ましくは 1〜5個、 より好ましくは 1〜3個、 さらにより好ましくは 1〜 2個、 最も好ましくは 1個であり得る。
置換に使用される特定の原子または基 （即ち、 置換部位に導入される原子また は基） の種類は、 誘導体の製造のため置換される生理活性物質 X中の特定の原子 または基と同様であり得る。
誘導体の製造のため生理活性物質 Xに付加される原子または基 （即ち、 付加反 応に使用される原子または基） は、 誘導体の製造のため置換される生理活性物質 X中の特定の原子または基 （上述） のうち、 付加反応が可能なもの、 例えば、 水 素原子、 ハロゲン原子等の原子、 求核試薬または求電子試薬として作用し得る基 である。
誘導体の製造のため生理活性物質 Xに付加される原子または基の数は、 製造さ れる誘導体が、 遺伝子 Yの発現または機能の調節能を有し得る限り、 例えば標的 タンパク質 Yに結合能を有する限り特に限定されないが、 例えば 6個未満、 好ま しくは 4個未満、 より好ましくは 2個又は 1個であり得る。
本発明の製造方法は、 例えば、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態ある いは標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態の予防■治療剤、 あるいは該疾患ま たは該状態の研究用試薬の開発などに有用である。
4 . 2 . 誘導体の製造方法により得られる成果物
本発明は、 上記誘導体の製造方法により得られる成果物を提供する。
上記製造方法により提供される成果物は、 本発明の製造方法により得られる生 理活性物質 Xの誘導体、 および該誘導体を含有してなる、 生理活性の調節剤 （上 述） であり得る。
上記製造方法により提供される成果物は、 例えば、 生理活性物質 Xに関連する 疾患または状態、 あるいは標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態の予防 ·治療 に、 あるいは該疾患または該状態の研究用試薬などとして有用である。
5 . 複合体、 及ぴその製造方法
本発明は、 生理活性物質とその標的タンパク質とを含む複合体を提供する。 生理活性物質は、 例えば、 上述した生理活性物質 Xであり得る。 詳細には、 生 理活性物質 Xは、 チアベンダゾール、 レセルピン、 イミぺネム、 セファレキシン またはアクラルビシンあるいは標的タンパク質 Yに結合能を有するそれらの誘導 体であり得る。 生理活性物質 Xの種類は、 標的タンパク質 Yの種類に応じて適宜 選択され得る。
生理活性物質の標的タンパク質は、 例えば、 上述した標的タンパク質 Yであり 得る。 詳細には、 標的タンパク質 Yは、 F L J 10368、 FL J 1 2389、 FL J 1 243 5S F L J 1 2502, F L J 1 2 5 14, F L J 14583ま たは F L J 3 1 146由来タンパク質であり得る。 複合体の形成に用いられる標 的タンパク質 Yの種類は、 生理活性物質 Xの種類に応じて適宜選択され得る。 一実施形態では、 本発明の複合体は、 チアベンダゾール、 レセルピン、 イミぺ ネム、 セファレキシンまたはアクラルビシンあるいは標的タンパク質に結合能を 有するそれらの誘導体と、 その標的タンパク質との組合せに従う複合体であり得 る。
別の実施形態では、本発明の複合体は、 F L J 10368、 F L J 1 2389、 F L J 1 243 5、 F L J 1 2502、 F L J 1 25 14、 F L J 1458 3ま たは F L J 31 146由来タンパク質と、 該タンパク質に結合能を有する生理活 性物質との組合せに従う複合体であり得る。
本発明の複合体は、 好ましくは、 上記 （a 1) 〜 （a 5) あるいは上記 （b 1)
〜 （b 7) のいずれかの組合せに従う複合体であり得る。
本発明はまた、生理活性物質とその標的タンパク質とを接触させることを含む、 生理活性物質とその標的タンパク質とを含む複合体の製造方法を提供する。 該接 触は、 例えば、 溶液中での生理活性物質、 標的タンパク質の混合により行われ得 る。
本発明の複合体、 及び当該複合体の製造方法は、 例えば、 本発明のスクリー二 ング方法、 本発明の誘導体の製造方法を行う際に、 あるいは、 複合体の構造解析 を行い、 生理活性物質とその標的タンパク質との相互作用の様式を精査する場合 などに有用であり得る。
6. キット
本発明は、 生理活性物質またはその塩を含むキットを提供する。
一実施形態では、 本発明のキットは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i ) 生理活性物質またはその塩；
( i i ) 生理活性物質の標的タンパク質、 該タンパク質をコードする核酸、 該核 酸を含む発現ベクター、 生理活性物質の標的遺伝子の棻現を測定可能な細胞、 あ るいは生理活性物質の標的遺伝子の転写調節領域及ぴ該領域に機能可能に連結さ れたレポーター遺伝子を含む発現ベクター。
本発明のキットが生理活性物質の標的タンパク質を含む場合、 該タンパク質は 生理活性物質と複合体を形成していない状態にある。
生理活性物質、 その標的タンパク質，標的遺伝子、 および生理活性物質とその 標的タンパク質との組合せは、 上述の通りである （例えば、 「5 . 複合体、 及びそ の製造方法」 を参照）。 また、発現ベクター、 生理活性物質の標的遺伝子の発現を 測定可能な細胞、 生理活性物質の標的遺伝子の転写調節領域及び該領域に機能可 能に連結されたレポーター遺伝子についても、 上述と同様である （例えば、 「2 . スクリーニング方法、 及び該方法により得られる成果物」 を参照）。
本発明の上記キットは、 例えば、 本発明のスクリーニング方法、 本発明の誘導 体の製造方法、並びに本発明の複合体の製造方法を行う際などに有用であり得る。 7 . 疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法および判定用キット
本発明は、 所定の疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法 ·判定用 キットを提供する。 本発明の判定方法 ·判定用キットは、 発現量の測定、 および 多型の測定に基づく判定方法 ·判定用キットに大別でき、 さらに、 発症または発 症リスクの判定が所望される疾患または状態の観点から、 生理活性物質 Xに関連 する疾患または状態、 ならびに標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態の発症ま たは発症リスクの判定方法 ·判定用キットに分類できる。 以下、 それぞれの判定 方法 ·判定用キットを詳述する。 なお、 必要に応じて、 「標的タンパク質 Yまたは それをコードする遺伝子の発現」 については、 「標的タンパク質 Yの発現」 あるい は「標的遺伝子 Yの発現」 と、 「標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子 の機能」 については、「標的タンパク質 Yの機能」あるいは「標的遺伝子 Yの機能」 と省略する場合がある。
7 . 1 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 疾患または状熊の発症または 症リスクの判定方法および判定用キッヒ 7 . 1 . 1 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する 疾患または状熊の発症または発症リスクの判定方法 （判定方法 I )
本発明は、 標的遺伝子 Υの発現量を測定することを含む、 生理活性物質 Xに関 連する疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法を提供する。
本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 I」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 Iは、 以下の工程 （a )、 ( b ) を含む：
( a )動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの発現量を測定する工程；
( b ) 標的遺伝子 Yの発現量に基づき生理活性物質 Xに関連する疾患または状態 の発症または発症可能性を評価する工程。
上記 （a ) ~ ( b ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 V」 と省略 する。
方法論 Vの工程 （a ) では、 動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Y の発現量が測定される。 動物は特に限定されないが、 哺乳動物および鳥類が好ま しく、 哺乳動物がより好ましい。 哺乳動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモッ ト、 ゥサギ等の実験動物、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ゥマ、 ヒッ ジ等の家畜、 ィヌ、 ネコ等のペット、 サル、 オランウータン、 チンパ /ジー、 ヒ ト等の霊長類が挙げられる。 鳥類としては、 例えば、 ニヮトリが挙げられる。 生体試料は、 標的遺伝子 Yの発現組織を含む試料、 あるいは分泌された標的タ ンパク質 Yを含む試料である限り特に限定されない。 標的遺伝子 Yの発現組織を 含む試料は、 標的遺伝子 Yの種類に応じて異なる。 標的遺伝子 Yの発現組織は、 例えば、 H— I n v D Bを使用して調べることができる。 また、 分泌された標 的タンパク質 Yを含む試料は、 標的遺伝子 Yの種類に応じて異なるが、 例えば、 血液、 血漿、 血清、 唾液、 脳脊髄液、 涙液、 尿であり得る。
本工程では、 動物から事前に採取された生体試料が用いられるが、 勿論、 本方 法論 Vは、 動物から生体試料を採取する工程をさちに含むことができる。 動物か らの生体試料の採取は、 自体公知の方法により行われ得る。
標的遺伝子 Yの発現量は、 標的遺伝子 Yの産物、 例えば転写産物又は翻訳産物 を対象として自体公知の方法により測定できる。 例えば、 転写産物の発現量は、 細胞から total R N Aを調製し、 R T— P C R、 ノザンブロッテイング等により 測定され得る。 また、 翻訳産物の発現量は、 細胞から抽出液を調製し、 免疫学的 手法により測定され得る。免疫学的手法としては、放射性同位元素免疫測定法（R I A法）、 E L I S A法 （Methods in Enzymol. 70： 419-439 (1980) )、 蛍光抗体 法などが使用できる。
方法論 Vの工程 （b ) では、 標的遺伝子 Yの発現量に基づき、 動物が生理活性 物質 Xに関連する疾患または状態に罹患しているか否かが評価される。詳細には、 先ず、 測定された標的遺伝子 Yの発現量が、 生理活性物質 Xに関連する疾患また は状態に罹患していない動物 （例えば、 正常な動物） における標的遺伝子 Yの発 現量と比較される。 発現量の比較は、 好ましくは、 有意差の有無に基づいて行わ れる。 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態に罹患していない動物における 標的遺伝子 Yの発現量は、 自体公知の方法により決定できる。
次いで、 標的遺伝子 Yの発現量の比較結果より、 動物が生理活性物質 Xに関連 する疾患または状態に罹患している可能性があるか否か、 あるいは将来的に罹患 する可能性が高いか低いかが判断される。 生理活性物質 Xに関連する疾患または 状態と標的遺伝子 Yとの組合せは上述の通りである。 特定の疾患を発症した動物 では、 当該疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知ら れている。 また、 特定の疾患の発症前に、 特定の遺伝子の発現の変化がしばしば 観察されることが知られている。 従って、 標的遺伝子 Yの発現量の解析より、 生 理活性物質 Xに関連する疾患または状態の発症あるいは発症可能性を判断するこ とが可能である。
判定方法 Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の有無、 あるいは該 疾患または状態に罹患する可能性の判定を可能とする。 従って、 判定方法 Iは、 例えば、 該疾患または状態の容易且つ早期の発見などに有用である。
7 . 1 . 2 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する 疾患または状態の発症または発症リスクの判定用キット (判定用キット I ) 本発明は、判定方法 Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを提供する。 本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット I」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット Iは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i ) 標的遺伝子 Yの発現量を測定し得る手段；
( i i ) 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの発現量との 関係を記録した媒体。
該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは標的遺伝子 Υの転 写産物または標的タンパク質 Υなどをさらに含んでいてもよい。
標的遺伝子 Υの発現量を測定し得る手段は、 標的遺伝子 Υの発現量を定量可能 である限り特に限定されず、 例えば標的タンパク質 Υを定量可能な手段、 標的遺 伝子 Υ転写産物を定量可能な手段に大別される。 該手段は、 標識用物質で標識さ れていてもよい。 また、 該手段が標識用物質で標識されていない場合、 本発明の 判定用キットは、 該標識用物質をさらに含むこともできる。 標識用物質は上述の 通りである。
詳細には、 標的タンパク質 Υを定量可能な手段としては、 標的タンパク質 Υに 対する抗体（上述）、生理活性物質 Xなどが挙げられる。標的タンパク質 Υに対す る抗体、 生理活性物質 Xは、 プレート等の基板上に固定された形態で提供されて あよい。 ,
また、 標的遺伝子 Υ転写産物を定量可能な手段としては、 標的遺伝子 Υ転写産 物に対する核酸プローブ、 標的遺伝子 Υ転写産物を増幅可能なプライマー対など が挙げられる。 核酸プローブ、 プライマー対は、 転写産物抽出用試薬とともに提 供されてもよい。
標的遺伝子 Υ転写産物に対する核酸プローブは、 標的遺伝子 Υ転写産物の量を 測定可能である限り特に限定されない。 該プローブは D N A、 R N Aのいずれで もよいが、 安定性等を考慮すると D N Aが好ましい。 また、 該プローブは、 1本 鎖又は 2本鎖のいずれであってもよい。 該プローブのサイズは、 標的遺伝子 Yの 転写産物を検出可能である限り特に限定されないが、 好ましくは約 1 5〜 1 0 0 O b p、 より好ましくは約 5 0〜5 0 0 b pである。 該プローブは、 マイクロア レイのように基板上に固定された形態で提供されてもよい。
標的遺伝子 Yを増幅可能なプライマー対は、 検出可能なサイズのヌクレオチド 断片が増幅されるように選択される。 検出可能なサイズのヌクレオチド断片は、 例えば約 1 0 0 b p以上、 好ましくは約 2 0 0 b p以上、 より好ましくは約 5 0 0 b p以上の長さを有し得る。 プライマーのサイズは、 標的遺伝子 Yを増幅可能 な限り特に限定されないが、 好ましくは約 1 5〜 1 0 0 b p、 より好ましくは約 1 8〜5 0 b p、 さらにより好ましくは約 2 0〜3 0 b pであり得る。 標的遺伝 子 Y転写産物を定量可能な手段が標的遺伝子 Yを増幅可能なプライマー対である 場合、 判定キットは、 逆転写酵素をさらに含むことができる。
生理活性物質 Xに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの発現量との関係を 記録した媒体は、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態に罹患した動物と罹 患していない動物との標的遺伝子 Yの発現量の差異を記録したものであり得る。 媒体は、 例えば、 書面、 あるいはフレキシブルディスク、 C D、 D V D , ハード ディスク等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体であり得る。 生理活性物質 X に関連する疾患または状態に罹患した動物における標的遺伝子 Yの発現量は、 該 疾患または該状態に罹患していない動物に比し、 増加または低下し得る。
生体試料を動物から採取し得る手段は、 動物から生体試料を入手可能である限 り特に限定されないが、 例えば、 注射器等の採血用器具、 生検針、 生検紺子等の 生検器具、 メス、 はさみ等の外科用器具などが挙げられる。
標的遺伝子 Y転写産物または標的タンパク質 Yは、 例えばコントロールとして 用いられ得る。
判定用キット Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の有無、 あるい は該疾患または状態に罹患する可能性の判定を可能とする。 従って、 判定用キッ ト Iは、 例えば、 該疾患または状態の容易且つ早期の発見などに有用である。
7 . 2 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 疾患または状態の発症リスクの判 定方法および判定用キット 7. 2. 1. 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する疾 患または状態の発症リスクの判定方法 （判定方法 I I )
本発明は、 標的遺伝子 Υの多型を測定することを含む、 生理活性物質 Xに関連 する疾患または状態の発症リスクの判定方法を提供する。
本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 I I」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 I Iは、 以下の工程 （a)、 (b) を含む：
(a) 動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの多型を測定する工程； ( b ) 多型のタィプに基づき生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の発症可 能性を評価する工程。
上記 （a) 〜 （b) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 V I」 と省 略する。
方法論 V Iの工程 （a) では、 動物から採取された生体試料において標的遺伝 子 Yの多型のタイプが測定される。 動物は上述の通りである。
生体試料は、方法論 Vで上述したものを使用できるが、本方法論 V Iによれば、 生体試料として毛髪、 爪、 皮膚、 粘膜等のゲノム DNAを含む任意の組織も使用 できる。 入手の容易性、 人体への負担等を考慮すれば、 生体試料は、 毛髪、 爪、 皮膚、 粘膜、 血液、 血漿、 血清、 唾液などが好ましい。
また、本工程では、動物から事前に採取された生体試料が用いられるが、勿論、 本方法論 V Iは、 動物から生体試料を採取する工程をさらに含むことができる。 動物からの生体試料の採取は、 自体公知の方法により行われ得る。
標的遺伝子 Yの多型とは、 ある母集団において、 標的遺伝子 Yを含むゲノム D NAに一定頻度で見出されるヌクレオチド配列の変異を意味し、 標的遺伝子 Yを 含むゲノム DN Aにおける 1以上の DNAの置換、欠失、付加（例えば、 SNP、 ハプロタイプ）、 並びに該ゲノム DNAの反復、 逆位、 転座などであり得る。 標的 遺伝子 Yの多型は、 例えば、 H— I n V D B等の公知のデータベースに登録さ れている。 本判定方法に用いられる標的遺伝子 Yの多型のタイプは、 標的遺伝子 Yにおける全てのタイプの多型のうち、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状 態に罹患した動物と罹患していない動物との間で頻度が異なるヌクレオチド配列 の変異であり、 例えば、 標的遺伝子 Yの発現の変化、 または標的タンパク質 Yに 関連する機能 （例えば、 生理活性物質 Xに対する標的タンパク質 Yの結合能） の 変化をもたらすものであり得る。 このような多型のタイプは、 連鎖解析等の自体 公知の方法により決定できる。 '
多型のタイプの測定は、 自体公知の方法により行われ得る。 例えば、 RFL P (制限酵素切断断片長多型） 法、 PCR— S SCP (—本鎖 DN A高次構造多型 解析） 法、 ASO (Allele Specific Oligonucleotide) ハイブリダィゼーシヨン 法、 ダイレク卜シークェンス法、 ARMS (Amplification Refracting Mutatio n System) 法、 変性濃度勾配ゲル電気泳動 (Denaturing Gradient Gel Electrop horesis) ?¾、 RN a s e A切断法、 DO L (Dye-labeled Oligonucleotide Lig ation) 法、 T a qMa n PCR法、 インベーダー法、 MALD I— TOF/M S法 (Matrix Assisted Laser Desorpt ion-time of Flight/Mass Spectrometry) 法、 TD I (Template-directed Dye-terminator Incorporation) 法など力 S使用 できる。
方法論 V Iの工程 （b) では、 多型のタイプに基づき、 動物が生理活性物質 X に関連する疾患または状態に罹患する可能性が高いか低いかが評価される。 生理 活性物質 Xに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yとの組合せは上述の通りで ある。 特定の疾患を発症しやすい動物では、 当該疾患に関連する遺伝子に特定の タイプの多型をしばしば有することが知られている。 従って、 多型の解析より、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態の発症可能性を判断することが可能で ある。
判定方法 I Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態に罹患する可能性 の判定を可能とする。 従って、 判定方法 I Iは、 該疾患または状態の予防を目的 とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
7. 2. 2. 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する疾 患または状態の発症リスクの判定用キット （判定用キット I I ) 本発明はまた、 判定方法 I Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを提 供する。
本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット I I」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット I Iは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i ) 標的遺伝子 Yの多型を測定し得る手段；
( i i ) 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの多型との関 係を記録した媒体。
該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは特定のタイプの多 型を有する標的遺伝子 Υをコードする核酸、 特定のタイプの多型を有しない標的 遺伝子 Υをコードする核酸などをさらに含んでいてもよい。
標的遺伝子 Υの多型を測定し得る手段は、 標的遺伝子 Υの多型を決定可能であ る限り特に限定されない。該手段は、標識用物質で標識されていてもよい。また、 該手段が標識用物質で標識されていない場合、 本キットは、 該標識用物質をさら に含むこともできる。 標識用物質は上述の通りである。
詳細には、 標的遺伝子 Υの多型を測定し得る手段は、 特定のタイプの多型を有 する標的遺伝子 Υを特異的に測定可能である核酸プローブ、 あるいは特定のタイ プの多型を有する標的遺伝子 Υを特異的に増幅可能であるプライマー対であり得 る。 核酸プローブ、 プライマー対は、 標的遺伝子 Υを含むゲノム D N Aまたは標 的遺伝子 Υ転写産物に対するものであり得る。 核酸プローブ、 プライマー対は、 転写産物またはゲノム D N Aの抽出用試薬とともに提供されてもよい。
特定のタイプの多型を有する標的遺伝子 Υを特異的に測定可能である核酸プロ ープは、 特定のタイプの多型を有する標的遺伝子 Υを選別可能である限り特に限 定されない。 該プローブは D N A、 R N Aのいずれでもよいが、 安定性等を考慮 すると D N Aが好ましい。 また、 該プローブは、 1本鎖又は 2本鎖のいずれであ つてもよい。 該プローブのサイズは、 特定のタイプの多型を有する標的遺伝子 Y を選別可能とするため短ければ短いほどよく、 例えば、 約 1 5〜 3 0 b pのサイ ズであり得る。 該プローブは、 マイクロアレイのように基板上に固定された形態 で提供されてもよい。 該プローブにより、 例えば A S O (Allele Specific Ol ig onucleotide) ハイブリダィゼーション法が可能となる。
特定のタイプの多型を有する標的遺伝子 Yを特異的に増幅可能であるプライマ 一対は、 測定可能なサイズのヌクレオチド断片が増幅されるように選択される。 このようなプライマー対は、 例えば、 いずれか一方のプライマーの 3， 末端に多 型部位を含むように設計される。 測定可能なサイズのヌクレオチド断片は、 例え ば約 1 0 0 b p以上、 好ましくは約 2 0 0 b p以上、 より好ましくは約 5 0 0 b p以上の長さを有し得る。 プライマーのサイズは、 標的遺伝子 Yを増幅可能な限 り特に限定されないが、 好ましくは約 1 5〜 1 0 0 b p、 より好ましくは約 1 8 〜5 0 b p、 さらにより好ましくは約 2 0〜3 0 b pであり得る。 標的遺伝子 Y の多型を測定し得る手段が標的遺伝子 Y転写産物に対するプライマー対である場 合、 判定キットは、 逆転写酵素をさらに含むことができる。
標的遺伝子 Yの多型を測定し得る別の手段としては、 特定のタイプの多型部位 を認識する制限酵素を挙げることもできる。 このような手段によれば、 R F L P による多型解析が可能となる。
生理活性物質 Xに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの多型との関係を記 録した媒体は、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態に罹患した動物と罹患 していなレ、動物との間における標的遺伝子 Yを含むゲノム D NAのヌクレオチド 配列の差異を記録したものであり得る。 媒体は、 .例えば、 書面、 あるいはフレキ シプルディスク、 C D、 D V D、 ハードディスク等のコンピュータ読み取り可能 な記録媒体であり得る。
生体試料を動物から採取し得る手段は、 上述の通りである。
特定のタイプの多型を有する標的遺伝子 Yをコードする核酸、 特定のタイプの 多型を有しない標的遺伝子 Yをコードする核酸は、 例えばコントロールとして用 いられ得る。
判定用キット I Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態に罹患する可 能性の判定を可能とする。 従って、 判定用キット I Iは、 該疾患または状態の予 防を目的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
7 . 2 . 3 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 標的遺伝子 Yに関連する疾患 または状態の発症リスクの判定方法 （判定方法 I I I )
本発明は、 標的遺伝子 Yの多型を測定することを含む、 標的遺伝子 Yに関連す る疾患または状態の発症リスクの判定方法を提供する。
本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 I I I」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 I I Iは、 下記の工程 （a )、 ( b ) を含む： ( a ) 動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの多型のタイプを測定す る工程；
( b ) 多型のタイプに基づき標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態の発症可能 性を評価する工程。
判定方法 I I Iでは、 発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 標的タ ンパク質 Yの生理活性物質 Xに対する結合性を変化させるものである。 このよう な多型のタイプは、 バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定でき る。
判定方法 I I Iにおける上記 （a )、 ( b ) の工程を含む方法論は、 測定される べき標的遺伝子 Yの多型のタイプを除き、 方法論 V Iと同様である。
判定方法 I I Iは、 標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態に罹患する可能性 の判定を可能とする。 従って、 判定方法 I I Iは、 該疾患または状態の予防を目 的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
7 . 2 . 4 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 標的遣伝子 Yに関連する疾患 または状態の発症リスクの判定用キット （判定用キット I I I )
本発明はまた、 判定方法 I I Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを 提供する。
本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット I I I」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット I I Iは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む： ( i ) 標的遺伝子 Yの多型を測定し得る手段； ( i i ) 標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの多型との関係 を記録した媒体。
該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは特定のタイプの多 型を有する標的遺伝子 Yをコードする核酸、 特定のタイプの多型を有しない標的 遺伝子 Yをコードする核酸などをさらに含んでいてもよい。
判定用キット I I Iでは、 発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 標 的タンパク質 γの生理活性物質 Xに対する結合性を変化させるものである。 この ような多型のタイプは、 バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定 できる。
判定用キット I I Iの構成要素は、 測定されるべき標的遺伝子 Yの多型のタイ プを除き、 判定用キット I Iと同様である。
判定用キット I I Iは、 標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態に罹患する可 能性の判定を可能とする。 従って、 判定用キット I I Iは、 該疾患または状態の 予防を目的とする生活習慣改善の契機などを提供するため有用である。
8 . 生理活性物質に対する感受性の判定方法および判定用キット
本発明は、生理活性物質に対する感受性の判定方法 ·判定用キットを提供する。 本発明の判定方法 ·判定用キットは、 発現量の測定、 および多型の測定に基づく 判定方法 ·判定用キットに大別でき、 さらに、 感受性の判定が所望される疾患ま たは状態の観点から、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態、 ならびに標的 遺伝子 Yに関連する疾患または状態における判定方法 ·判定用キットに分類でき る。 以下、 それぞれの判定方法 ·判定用キットを詳述する。
8 . 1 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 生理活性物質に対する感受性の 判定方法および判定用キット
8 . 1 . 1 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する 疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法 （判定方法 I V)
本発明は、 標的遺伝子 Yの発現量を測定することを含む、 生理活性物質 Xに関 連する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法を提供 する。
本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 I V」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 I Vは、 以下の工程 （a )、 ( b ) を含む：
( a )動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの発現量を測定する工程； ( b ) 標的遺伝子 Yの発現量に基づき生理活性物質 Xの効果を予測する工程。 上記 （a ) 〜 （b ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 V I I J と 省略する。
方法論 V I Iの工程 （a ) は、 方法論 Vの工程 （a ) と同様である。
方法論 V I Iの工程 （b ) では、 標的遺伝子 Yの発現量に基づき、 生理活性物 質 Xの動物に及ぼし得る効果が評価される。 詳細には、 先ず、 測定された標的遺 伝子 Yの発現量が、 標的遺伝子 Yの発現量と生理活性物質 Xに対する感受性との 相関性に関するデータと照合される。 標的遺伝子 Yの発現量と生理活性物質 に 対する感受性との相関性は、 自体公知の方法により決定できる。
次いで、 照合結果より、 生理活性物質 Xに対する感受性が推定される。 生理活 性物質 Xと標的遺伝子 Yとの組合せは上述の通りである。 生理活性物質の標的遺 伝子を高発現している動物では、 生理活性物質に対する感受性が高い （または低 い） と考えられ、低発現する動物は、感受性が低い（または高い） と考えられる。 従って、 標的遺伝子 Yの発現量の解析より、 生理活性物質 Xに対する感受性を判 断することが可能である。 例えば、 生理活性物質 Xが薬物である場合、 薬物の効 き易さまたは効き難さ、 あるいは薬物の副作用が発現する確率を判断することが 可能である。
判定方法 I Vは、生理活性物質 Xに対する感受性の判定を可能とする。従って、 判定方法 I Vは、 例えば、 特定の動物に対する生理活性物質 Xの作用の評価など に有用である。
8 . 1 . 2 . 標的遺伝子 Yの発現量の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する 疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定用キット （判 ¾a キット I V)
本発明は、 判定方法 I Vを容易に行うことを可能とする判定用キットを提供す る。
本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット I V」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット I Vは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i ) 標的遺伝子 Yの発現量を測定し得る手段；
( i i )生理活性物質 Xの効果と標的遺伝子 Yの発現量との関係を記録した媒体。 該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは標的遺伝子 Yの転 写産物または標的タンパク質 Yなどをさらに含んでいてもよい。
判定用キット I Vの構成要素は、 （ i i ) の媒体以外は、判定用キット Iと同様 である。
生理活性物質 Xの効果と標的遺伝子 Yの発現量との関係を記録した媒体は、 標 的遺伝子 Yの発現量と生理活性物質 Xに対する感受性との相関性に関するデータ を格納したものであり得る。 生理活性物質 Xに対する感受性が高い動物における 標的遺伝子 Yの発現量は、感受性が低い動物に比し、増加（または低下） し得る。 判定用キット I Vは、 生理活性物質 Xに対する感受性の容易な判定を可能とす る。 従って、 判定方法 I Vは、 例えば、 特定の動物に対する生理活性物質 Xの作 用の評価などに有用である。
8 . 2 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 生理活性物質 Xに対する感受性の 判定方法および判定用キット
8 . 2 . 1 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する疾 患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法 （判定方法 V) 本発明は、 標的遺伝子 Yの多型を測定することを含む、 生理活性物質 Xに関連 する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法を提供す る。
本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 V」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 Vは、 以下の工程 （a )、 ( b ) を含む： ( a ) 動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの多型を測定する工程；
( b ) 多型の特定のタイプの有無に基づき標的遺伝子 Yに関連する疾患または状 態における生理活性物質 Xの効果を予測する工程。
上記 （a ) 〜 （b ) の工程を含む方法論を、 必要に応じて 「方法論 V I I I」 と省略する。
方法論 V I I Iの工程 （a ) は、 方法論 V I Iの工程 （a ) と同様である。 方法論 V I I Iの工程 （b ) では、 標的遺伝子 Yの多型のタイプに基づき、 生 理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xの効果が評価さ れる。 詳細には、 先ず、 測定された標的遺伝子 Yの多型のタイプが、 標的遺伝子 Yの多型のタイプと、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活 性物質 Xに対する感受性との相関性に関するデータと照合される。 該相関性は、 自体公知の方法により決定できる。
次いで、 照合結果より、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生 理活性物質 Xに対する感受性が予想される。 生理活性物質 Xと標的遺伝子 Yとの 組合せは上述の通りである。 生理活性物質に対する感受性が高い動物では、 該生 理活性物質の標的遺伝子に特定のタイプの多型をしばしば有することが知られて いる。 従って、 多型の解析より、 生理活性物質 Xに対する感受性を判断すること が可能である。 例えば、 生理活性物質 Xが薬物である場合、 薬物の効き易さまた は効き難さ、あるいは薬物の副作用が発現する確率を判断することが可能である。 判定方法 Vは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物 質 Xに対する感受性の容易な判定を可能とする。従って、判定方法 Vは、例えば、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xの作用の評価 などに有用である。
8 . 2 . 2 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 生理活性物質 Xに関連する疾 患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定用キット （判定用キ ット V)
本発明はまた、 判定方法 Vを容易に行うことを可能とする判定用キットを提供 する。
本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット V」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット Vは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i ) 標的遺伝子 Yの多型を測定し得る手段；
( i i ) 生理活性物質 Xの効果と遺伝子 Yの多型との関係を記録した媒体。
該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは特定のタイプの多 型を有する標的遺伝子 Υをコードする核酸、 特定のタイプの多型を有しない標的 遺伝子 Υをコードする核酸などをさらに含んでいてもよい。
判定用キット Vの構成要素は、 （ i i ) の媒体以外は、判定用キット I Iと同様 である。
生理活性物質 Xの効果と遺伝子 Yの多型との関係を記録した媒体は、 生理活性 物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性と、 標 的遺伝子 Yの多型のタイプとの相関性に関するデータを格納したものであり得る。 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受 性が高い動物における標的遺伝子 Yの多型のタイプは、感受性が低い動物に比し、 生理活性物質 Xに対する結合能が高い （または低い） タンパク質をコードするよ うなものであり得る。
判定用キット Vは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活 性物質 Xに対する感受性の判定を可能とする。 従って、 判定用キット Vは、 例え ば、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xの作用の 評価などに有用である。
8 . 2 . 3 . 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 標的遺伝子 Yに関連する疾患 または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法 （判定方法 V I ) 本発明は、 標的遺伝子 Yの多型を測定することを含む、 標的遺伝子 Yに関連す る疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定方法を提供する。 本判定方法を、 必要に応じて 「判定方法 V I」 と省略する。
一実施形態では、 判定方法 V Iは、 下記の工程 （a )、 ( b ) を含む： (a) 動物から採取した生体試料において標的遺伝子 Yの多型のタイプを測定す る工程；
(b) 多型の特定のタイプの有無に基づき標的遺伝子 Yに関連する疾患または状 態における生理活性物質 Xの効果を予測する工程。
本判定方法では、 感受性の判定に使用される多型のタイプは、 標的タンパク質 Yの生理活性物質 Xに対する結合性を変化させるものである。 このような多型の タイプは、 バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定できる。 生理 活性物質に対する結合能が増強または低下するような多型のタイプを含む標的遺 伝子を有する動物では、 生理活性物質に対する感受性が高い （または低い） と考 えられ、 該結合能が低下するような多型のタイプを含む標的遺伝子を有する動物 は、 感受性が低い （または高い） と考えられる。 従って、 このような多型のタイ プの解析より、 生理活性物質 Xに対する感受性を判断することが可能である。 判定方法 V Iにおける上記 （a)、 （b) の工程を含む方法論は、 測定されるべ き標的遺伝子 Yの多型のタイプを除き、 方法論 V I I Iと同様である。
判定方法 V Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性 物質 Xに対する感受性の容易な判定を可能とする。 従って、 判定方法 V Iは、 例 えば、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xの作用 の評価などに有用である。
8. 2. 4. 標的遺伝子 Yの多型の測定に基づく、 標的遺伝子 Yに関連する疾患 または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の判定用キット （判定用キッ ト V I)
本発明はまた、 判定方法 V Iを容易に行うことを可能とする判定用キットを提 供する。
本判定用キットを、 必要に応じて 「判定用キット V I」 と省略する。
一実施形態では、 判定用キット V Iは、 以下 （ i )、 （ i i ) を含む：
( i) 標的遺伝子 Yの多型を測定し得る手段；
( i i) 標的遺伝子 Yに関連する疾患または状態と標的遺伝子 Yの多型との関係 を記録した媒体。
該キットは、 生体試料を動物から採取し得る手段、 あるいは特定のタイプの多 型を有する標的遺伝子 Yをコードする核酸、 特定のタイプの多型を有しない標的 遺伝子 Yをコードする核酸などをさらに含んでいてもよい。
判定用キット V Iでは、 発症リスクの判定に使用される多型のタイプは、 標的 タンパク質 Yの生理活性物質 Xに対する結合性を変化させるものである。 このよ うな多型のタイプは、 バインディングアツセィ等の自体公知の方法により決定で きる。
判定用キット V Iの構成要素は、 測定されるべき標的遺伝子 Yの多型のタイプ を除き、 判定用キット Vと同様である。
判定用キット V Iは、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理 活性物質 Xに対する感受性の判定を可能とする。 従って、 判定用キット V Iは、 例えば、 生理活性物質 Xに関連する疾患または状態における生理活性物質 Xの作 用の評価などに有用である。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載 された内容は、 本明細書での引用により、 その全てが明示されたと同程度に本明 細書に組み込まれるものである。
以下、 実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、 本発明の技術的範囲は 以下の実施例に限定されるものではない。 実施例
[参考例 1 ] ヒ ト完全長 cDNAクローンからのタンパク質発現方法
1 . 発現プラスミ ドの作製
ヒ ト完全長 cDNAクローンの目的遺伝子に対して、 Invitrogenの Gatewayシス テムを用いキットのプロトコールに従い、 PCRクローニングベクター Gateway pDO NR201と BP反応を行うことによりエントリ一ベクターを得た。 Gatewayシステム のデスティネーションベクターとしては、 東洋紡績 （株） の小麦胚芽抽出液を用 いた無細胞タンパク質合成システム （PR0TEI0S)に適応する pEU3- Nil (東洋紡績） を基にして、 Gatewayシステムが利用できるよう Gateway組換え配列を有する Ga tewayカセットを導入し、 さらに発現タンパク質の N末端領域にヒスチジンタグ と FLAGタグ配列を有するぺプチドが発現するように PCR法を用いて改変したダブ ルタグデスティネーションベクターを作製した。
作製したダブルタグデスティネーションベクターとェントリーベクターを用い Invitrogenの Gateway システムを用いプロトコールに従い BP反応を実施し、 大 腸菌コンビテントセル DH5 aに形質転換し、 発現ベクターが導入されたクローン を選択した。 得られたクローンから QIAfi Iter Midi kit (キアゲン） を用いて、 キットのプロトコールに従ってプラスミドを調製した。得られたプラスミドは、 P R0TEI0S (東洋紡績） のプロトコールに従い、 フエノール■クロ口ホルム処理を行 い RNA分解酵素の不活化処理を施し、 精製発現プラスミドを得た。
2 . 精製タンパク質の取得
東洋紡績 （株） の小麦胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成システム （PR 0TEI0S) により組換えタンパク質を合成した。 上記 1 . に記載した方法で取得し た発現プラスミ ドから PR0TEI0Sのプロトコールに従い mRNAを作製した。 取得し た mRNAを 20 μ g使用し、 96穴マイクロタイタ一プレートの 2穴分で PR0TEI0Sの プロトコールに従いタンパク質を合成させた。 合成したタンパク質は、 高速遠心 分離処理により沈殿を除去し、取得した可溶性の画分を抗 FLAGタグ抗体を固定化 した ANTI- FLAG M2 Affinity Gel (SIGMA社）を用い、 プロトコールに従い精製を 行い、 精製タンパク質を得た。
[参考例 2 ] ビアコアを用いたヒ トタンパク質-医薬品相互作用における結合解 離定数の決定方法
ビアコア社市販の S51用 CM5センサーチップを 1M EDC、 1. 33M NHS及び 16mg/m 1 AB-NTA (pH 9. 2)を用いてセンサーチップ表面の NTA化を施し、 S51用 NTAセン サーチップとした。 これに小麦胚芽系で発現させ、 FLAG tagで精製した蛋白質を 固定化した。 固定化は、 0. 5M NiCl2、 0. 4M EDC、 0. 1M EDCS リガンド溶液 （蛋白 質）、 1M Ethanolamine, pH8. 5を順次、 Biacore S51の流路系にインジェクション して行った。 固定化の際の Running Bufferは PBS (pH7. 4) を用いた。 リガンド が固定化されたセンサーチップを用いて以下の Assayを行った。 Running Buffer として HBS (10mM HEPES、 150mM NaCl、 pH7. 6)、 0. 005% P20、 100 mineral ion cocktail (Ca (0Ac) 2、 Zn (0Ac) 2 - 2H20、 Cu (OAc) 2■ H20、 Co (0Ac) 2 , 4H20、 Mn (OAc) 2■ 4H20、 Mg (0Ac) 2■ 4H20、 FeCl3 · 6H20)に DMS0を final 5%になるように加えて調製 したものを用いた。 測定化合物は 62. 5 μ Μ〜0· 244 μ Mまで 1/2希釈ずつ 9point 調製した。 溶媒の組成が Running Bufferと同様になるように調製し、 0濃度測定 として化合物の含まれていない溶媒だけのものを調製した。 また、化合物溶液、 R unning Buffer中に含まれる DMS0の効果の補正 (solvent correction) として、 3. 8- 5. 1%の DMSO (8point) を含む Running Bufferと同様の溶液を調製し、 これ らの測定結果をもとにして補正を行った。 Biacore S51の Compound Character iz ation Assay プログラムを実施し、 固定化されたリガンド （蛋白質） とアナライ ト （化合物； 62. 5 /ζ Μ〜0. 244/z M) の相互作用を測定し、専用ソフトウェアにて解 析を行った。
[実施例 1 ] F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質とチアベンダゾール （Thiabend asole) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 0 3 6 8よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってチアベンダゾールと F L J 1 0 3 6 8から発現精製した タンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 チアベンダゾールの用量に依存し て結合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 チアベンダ ゾールは F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認さ れた。 BiaCOreS51専用ソフトウェアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd = 8. 605 X 10"7 Mであった。
以上より、 チアベンダゾールと F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質とが相互作用 することが明らかとなった。 したがって、 F L J 1 0 3 6 8由来タンパク質はチ ァベンダゾールの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 10368由来タンパク質とスクリーユング候補物質とを作用させることで、 新 規医薬品のスクリーユングを行うことができる。 すなわち、 FL J 10368由 来タンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するよう な系を構築することによって、新規医薬品のスクリ一ユングを行うことができる。
[実施例 2] F L J 10368由来タンパク質とレセルピン（Reserpine)の相 互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 036 8よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってレセルピンと F L J 10368から発現精製したタンパ ク質の相互作用を解析した。 その結果、 レセルピンの用量に依存して結合量が増 大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 レセルピンは F L J 1 0 368由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 BiacoreS51専 用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 2.958X10— 5 Mであ つた。
以上より、 レセルピンと F L J 1 036 8由来タンパク質とが相互作用するこ とが明らかとなった。 したがって、 F L J 10368由来タンパク質はレセルピ ンの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 10368由 来タンパク質とスクリーニング候補物質とを作用させることで、 新規医薬品のス クリーニングを行うことができる。 すなわち、 F L J 10368由来タンパク質 と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系を構築す ることによって、 新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 3] F L J 1 2389由来タンパク質とチアベンダゾール （Thiabend asole) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 238 9よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってチアベンダゾールと F L J 1 2389から発現精製した タンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 チアベンダゾールの用量に依存し て結合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 チアベンダ ゾールは F L J 1 2389由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認さ れた。 BiaCOreS51専用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd = 9.347X10-6 Mであった。
以上より、 チアベンダゾールと F L J 1 2389由来タンパク質とが相互作用 することが明らかとなった。 したがって、 FL J 1 238 9由来タンパク質はチ ァベンダゾールの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 1 238 9由来タンパク質とスクリーユング候補物質とを作用させることで、 新 規医薬品のスクリーユングを行うことができる。 すなわち、 F L J 1 2 38 9由 来タンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するよう な系を構築することによって、新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 4] F L J 1 2435由来タンパク質とイミぺネム （Imipenem) の相 互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 243 5よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってイミぺネムと F L J 1 2435から発現精製したタンパ ク質の相互作用を解析した。 その結果、 イミぺネムの用量に依存して結合量が増 大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 イミぺネムは F L J 1 2 435由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 BiacoreS51専 用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 1.924X10— 5 Mであ つた。
以上より、 イミぺネムと F L J 1 243 5由来タンパク質とが相互作用するこ とが明らかとなった。 したがって、 F L J 1 243 5由来タンパク質はイミぺネ ムの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 FL J 1 2435由 来タンパク質とスクリーニング候補物質とを作用させることで、 新規医薬品のス クリーユングを行うことができる。 すなわち、 FL J 1 2435由来タンパク質 と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系を構築す ることによって、 新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 5] FL J 1 2502由来タンパク質とセファレキシン（Cephalexin) の相互作用解析 参考例 1の方法に従って F L J 1 2502よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってセファレキシンと F L J 1 2502から発現精製したタ ンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 セファレキシンの用量に依存して結 合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 セファレキシン は FL J 1 2502由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 B iacoreS51 専用ソフトウェアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 5.98 X10'6 Mであった。
以上より、 セファレキシンと FL J 1 2502由来タンパク質とが相互作用す ることが明らかとなった。 したがって、 F L J 1 2 502由来タンパク質はセフ ァレキシンの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 1 2 502由来タンパク質とスクリーユング候捕物質とを作用させることで、 新規医 薬品のスクリ一二ングを行うことができる。 すなわち、 FL J 1 2502由来タ ンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系 を構築することによって、 新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 6] F L J 1 25 14由来タンパク質とアクラルビシン （Aclarubici n) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 25 14よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってァクラルビシンと F L J 1 25 14から発現精製したタ ンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 アクラルビシンの用量に依存して結 合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 アクラルビシン は FL J 1 25 14由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 B iacoreS51専用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 6.115 ■ X10— 6 Mであった。
以上より、 アクラルビシンと FL J 1 25 14由来タンパク質とが相互作用す ることが明らかとなった。 したがって、 F L J 1 2 5 14由来タンパク質はァク ラルビシンの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 1 2 5 14由来タンパク質とスクリーユング候補物質とを作甩させることで、 新規医 薬品のスクリーニングを行うことができる。 すなわち、 F L J 1 25 14由来タ ンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系 を構築することによって、 新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 7] F L J 1 25 14由来タンパク質とチアベンダゾール （Thiabend asole) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1 25 14よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってチアベンダゾールと F L J 1 25 14から発現精製した タンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 チアベンダゾールの用量に依存し て結合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 チアベンダ ゾールは FL J 1 25 14由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認さ れた。 BiacoreS 専用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd = 2.318X10-6 Mであった。
以上より、 チアベンダゾールと F L J 1 25 14由来タンパク質とが相互作用 することが明らかとなった。 したがって、 F L J 1 25 14由来タンパク質はチ ァベンダゾールの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 1 2514由来タンパク質とスクリ一ユング候補物質とを作用させることで、 新 規医薬品のスクリ一ユングを行うことができる。 すなわち、 FL J 1 25 14由 来タンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するよう な系を構築するととによって、新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 8] F L J 1458 3由来タンパク質とセファレキシン（Cephalexin) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1458 3よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってセファレキシンと F L J 1458 3から発現精製したタ ンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 セファレキシンの用量に依存して結 合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 セファレキシン は F L J 14583由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 B iacoreS51専用ソフトウェアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 8.364 X10-6 Mであった。
以上より、 セファレキシンと F L J 14583由来タンパク質とが相互作用す ることが明らかとなった。 したがって、 F L J 14583由来タンパク質はセフ ァレキシンの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 14 583由来タンパク質とスクリーニング候補物質とを作用させることで、 新規医 薬品のスクリーユングを行うことができる。 すなわち、 F L J 1458 3由来タ ンパク質と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系 を構築することによって、 新規医薬品のスクリーニングを行うことができる。
[実施例 9] F L J 1458 3由来タンパク質とイミぺネム （Imipenera) の相 互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 1458 3よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってイミぺネムと F L J 14583から発現精製したタンパ ク質の相互作用を解析した。 その結果、 イミぺネムの用量に依存して結合量が増 大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 イミぺネムは F L J 14 583由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 BiacoreS51専 用ソフトウエアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 3.019X10"5 Mであ つた。
以上より、 イミぺネムと F L J 1458 3由来タンパク質とが相互作用するこ とが明らかとなった。 したがって、 F L J 1458 3由来タンパク質はイミぺネ ムの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 14583由 来タンパク質とスクリーユング候補物質とを作用させることで、 新規医薬品のス クリーニングを行うことができる。 すなわち、 FL J 14583由来タンパク質 と候補物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系を構築す ることによって、 新規医薬品のスクリーユングを行うことができる。
[実施例 1 0] F L J 3 1 146由来タンパク質とセファレキシン （Cephalexi n) の相互作用解析
参考例 1の方法に従って F L J 3 1 146よりタンパク質の発現精製を行い、 参考例 2の方法に従ってセファレキシンと F L J 3 1 146から発現精製したタ ンパク質の相互作用を解析した。 その結果、 セファレキシンの用量に依存して結 合量が増大し、 かつ高用量では結合の飽和がみられたことから、 セファレキシン は F L J 3 1 146由来タンパク質と特異的に相互作用することが確認された。 B iacoreS51専用ソフトウェアを用いて結合解離定数を算出したところ、 Kd= 6.604 X10— 6 Mであった。
以上より、 セファレキシンと F L J 3 1 146由来タンパク質とが相互作用す ることが明らかとなった。 したがって、 F L J 3 1 146由来タンパク質はセフ ァレキシンの標的タンパク質であることが判明した。 このことより、 F L J 3 1 146由来タンパク質とスクリーニング候捕物質とを作用させることで、 新規医 薬品のスクリーユングを行うことができる。 すなわち、 F L J 3 1 146由来タ ンパク質と侯捕物質との相互作用を、 例えば参考例 2の方法で検出するような系 を構築することによって、 新規医薬品のスクリーユングを行うことがでぎる。 本実施例で確認された薬物とタンパク質との特異的相互作用に関する結合強度 (Kd値） を表 9に示す。
(表 9)
FLJ番号 結合する薬物 Kd値
FLJ10368 チアベンダゾール 8.605 X 107 M
レセルピン 2.958 X If)-5 M
FIJI 2389 チアベンダゾール 9.347 X10"6 M
FLJ12435 ィミぺネム 1.924X10—5 M
FLJ12502 セファレキシン 5.98X10
FLJ12514 アクラノレビシン 6.115 X10"6
チアベンダゾール 2.318 X10-6 M
FLJ 14583 セファレキシン 8.364 X10"6 M
イミぺネム 3.019X10 M
FLJ31146 セファレキシン 6.604 X10"6 産業上の利用可能性
本発明の標的タンパク質および標的遺伝子は、 生理活性物質の開発、 例えば 創薬などに有用である。 本発明のスクリーニング方法およぴ本発明の誘導体の製 造方法は、 種々の疾患または状態の予防■治療剤、 並びに該疾患または該状態の 研究用試薬の開発などに有用である。 本発明の調節剤および誘導体は、 種々の疾 患または状態の予防 ·治療に、 並びに該疾患または該状態の研究用試薬などとし て有用である。 本発明の複合体おょぴキットは、 本発明のスクリーニング方法、 本発明の誘導体の製造方法などに有用である。 本発明の判定方法およぴ判定用キ ットは、 動物における種々の疾患または状態の発症または発症可能性の評価、 並 びに生理活性物質に対する感受性の評価などに有用である。
本発明の標的タンパク質および標的遺伝子は、 生理活性物質の開発、 例えば創 薬などを可能とする。 本発明のスクリーニング方法および本発明の誘導体の製造 方法は、 種々の疾患または状態の予防■治療剤、 並びに該疾患または該状態の研 究用試薬の開発などを可能とする。 本発明の調節剤および誘導体は、 種々の疾患 または状態の予防■治療に、 並びに該疾患または該状態の研究用試薬などを可能 とする。 本発明の複合体およびキットは、 本発明のスクリーニング方法の実行、 本発明の誘導体の製造などを可能とする。 本発明の判定方法および判定用キット は、 動物における種々の疾患または状態の発症または発症可能性の評価、 並びに 生理活性物質に対する感受性の評価などを可能とする。
本出願は、 日本で出願された特願特願 2 0 0 5— 2 5 5 4 7 1 (出願 0 : 2 0 0 5年 9月 2日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるもの である。

Claims

請求の範囲
1. 生理活性物質 Xに関連する作用を調節し得る物質のスクリーユング方法であ つて、
被験物質が標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能 を調節し得るか否かを評価することを含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが以下 （a 1) 〜 （a 5) のい ずれかである、 方法：
(a 1) チアベンダゾールと、 FL J 10 368、 F L J 1 2389または F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ；
(a 2) レセルピンと、 F L J 10368由来タンパク質との組合せ；
(a 3) イミぺネムと、 F L J 1 2435または F L J 1458 3由来タンパク 質との組合せ；
(a 4) セファレキシンと、 FL J 1 2502、 F L J 1458 3または F L J 3 1 146由来タンパク質との組合せ；
(a 5) アクラルビシンと、 F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ。
2. 以下の工程 （a) 〜 (c) を含む、 請求の範囲 1記載の方法：
(a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の存在下における該タンパク質の機能レベルを測定し、 該機能レ ベルを被験物質の非存在下における該タンパク質の機能レベルと比較する工程； (c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 該タンパク質の機能レベルの変化をも たらす被験物質を選択する工程。
3. 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 請求の範囲 1記載の方法：
(a) 被験物質と標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現を測定 可能な細胞とを接触させる工程；
(b) 被験物質を接触させた細胞における該遺伝子の発現量を測定し、 該発現量 を被験物質を接触させない対照細胞における該遺伝子の発現量と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 該遺伝子の発現量を調節する被験物質 を選択する工程。
4. 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 請求の範囲 1記載の方法：
- (a) 被験物質を標的タンパク質 Yに接触させる工程；
(b) 被験物質の該タンパク質に対する結合能を測定する工程；
(c) 上記 （b) の結果に基づいて、 該タンパク質に結合能を有する被験物質を 選択する工程。
5. 以下の工程 （a) 〜 （c) を含む、 請求の範囲 1記載の方法：
(a) 被験物質、 標的タンパク質 Y結合性物質を標的タンパク質 Yに接触させる 工程；
(b) 被験物質の存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に 対する結合能を測定し、 該結合能を被験物質の非存在下における標的タンパク質 Y結合性物質の該タンパク質に対する結合能と比較する工程；
(c) 上記 （b) の比較結果に基づいて、 標的タンパク質 Y結合性物質の該タン パク質に対する結合能の変化をもたらす被験物質を選択する工程。
6. 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物質のスクリーニング方法で あって、
標的タンパク質 Yに対する被験物質の結合能またはそれに関連する作用を、 標 的タンパク質 Yに対する生理活性物質 Xの結合能またはそれに関連する作用と比 較することを含み、
標的タンパク質 Yと生理活性物質 Xとの組合せが以下 （b l) 〜 （b 7) のい ずれかである、 方法：
(b l) F L J 10368由来タンパク質と、 チアベンダゾール、 レセルピンま たは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 2) F L J 1 2389由来タンパク質と、 チアベンダゾールまたは該タンパ ク質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 3) F L J 1 2435由来タンパク質と、 イミぺネムまたは該タンパク質に 結合能を有するその誘導体との組合せ； (b 4) F L J 12502由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 5) F L J 1 25 14由来タンパク質と、 アクラルビシン、 チアベンダゾー ルまたは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 6) F L J 14583由来タンパク質と、 セファレキシン、 ィミぺネムまた は該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 7) F L J 3 1 146由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ。
7. 請求の範囲 1〜 6のいずれか 1項記載の方法により得られる物質。
8. 請求の範囲 1〜6のいずれか 1項記載の方法により得られる物質を含有して なる、 生理活性の調節剤。
9. 生理活性物質 Xに関連する作用の調節剤であって、
標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調節する 物質を含有してなり、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが以下 （a 1) 〜 （a 5) のい ずれかである、 剤：
(a 1) チアベンダゾールと、 F L J 10368、 F L J 1 2389または F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ；
(a 2) レセルピンと、 F L J 1 0368由来タンパク質との組合せ；
(a 3) ィミぺネムと、 F L J 1 2435または F L J 1458 3由来タンパク 質との組合せ；
(a 4) セファレキシンと、 F L J 1 2502、 F L J 1458 3または F L J 3 1 146由来タンパク質との組合せ；
(a 5) アクラルビシンと、 F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ。
10. 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調節 する物質が、 該遺伝子の発現または機能を抑制する物雩である、 請求の範囲 9記 載の剤。
1 1. 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を抑制 する物質が、 アンチセンス核酸、 リポザィム、 デコイ核酸、 s i RNA、 抗体ま たはドミナントネガティブ変異体、 あるいはそれらの発現ベクターである、 請求 の範囲 1 0記載の剤。
1 2. 標的タンパク質 Y、 または該タンパク質をコードする核酸を含む発現べク ターを含有してなる、 請求の範囲 9記載の剤。
1 3. 標的タンパク質 Υに関連する機能の調節剤であって、
生理活性物質 Xを含有してなり、
標的タンパク質 Υと生理活性物質 Xとの組合せが以下 （b l) 〜 （b 7) のい ずれかである、 剤：
(b l) F L J 10368由来タンパク質と、 チアベンダゾール、 レセルピンま たは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 2) F L J 1 2389由来タンパク質と、 チアベンダゾールまたは該タンパ ク質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 3) F L J 1 2435由来タンパク質と、 イミぺネムまたは該タンパク質に 結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 4) F L J 1 2502由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 5) F L J 1 25 14由来タンパク質と、 アクラルビシン、 チアベンダゾー ルまたは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 6) F L J 1458 3由来タンパク質と、 セファレキシン、 ィミぺネムまた は該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 7) F L J 3 1 146由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ。
14. 生理活性物質 Xの誘導体の製造方法であって、
標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現または機能を調節し得 るように生理活性物質 Xを誘導体化することを含み、 生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが以下 （a 1) 〜 （a 5) のい ずれかである、 方法：
(a 1) チアベンダゾールと、 FL J 10368、 F L J 1 2389または F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ；
(a 2) レセルピンと、 F L J 10368由来タンパク質との組合せ；
(a 3) イミぺネムと、 F L J 1 2435または F L J 1458 3由来タンパク 質との組合せ；
(a 4) セファレキシンと、 FL J 1 2502、 F L J 1458 3または FL J 31 146由来タンパク質との組合せ；
(a 5) アクラルビシンと、 F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ。
1 5. 標的タンパク質 Yに関連する機能を調節し得る物質の誘導体の製造方法で あって、
標的タンパク質 Yに対する結合能を調節し得るように生理活性物質 Xを誘導体 化することを含み、
標的タンパク質 Yと生理活性物質 Xとの組合せが以下 （b l) 〜 （b 7) のい ずれかである、 方法：
(b l) F L J 10368由来タンパク質と、 チアベンダゾール、 レセルピンま たは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 2) F L J 1 2389由来タンパク質と、 チアベンダゾールまたは該タンパ ク質に結合能を有するその誘導体との組合せ； '
(b 3) F L J 1 2435由来タンパク質と、 ィミぺネムまたは該タンパク質に 結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 4) F L J 1 2502由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 5) F L J 1 25 14由来タンパク質と、 アクラルビシン、 チアベンダゾー ルまたは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 6) F L J 14583由来タンパク質と、 セファレキシン、 ィミぺネムまた は該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 7) FL J 3 1 146由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ。
1 6. 請求の範囲 14または 1 5記載の方法により得られる、 生理活性物質の誘 導体。
1 7. 請求の範囲 14または 1 5記載の方法により得られる生理活性物質の誘導 体を含有してなる、 生理活性の調節剤。
1 8. 生理活性物質 Xとその標的タンパク質 Yとを含む複合体であって、 生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが以下 （a l) 〜 （a 5) ある いは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 複合体：
(a 1) チアベンダゾールと、 F L J 10368、 F L J 1 2389または F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ；
(a 2) レセルピンと、 F L J 10368由来タンパク質との組合せ；
(a 3) イミぺネムと、 F L J 1 2435または F L J 1458 3由来タンパク 質との組合せ；
(a 4) セファレキシンと、 FL J 1 2502、 F L J 1458 3または F L J 3 1 146由来タンパク質との組合せ；
(a 5) アクラルビシンと、 F L J 1 25 14由来タンパク質との組合せ；
(b 1) F L J 10368由来タンパク質と、 チアベンダゾール、 レセルピンま たは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 2) F L J 1 2389由来タンパク質と、 チアベンダゾールまたは該タンパ ク質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 3) F L J 1 2435由来タンパク質と、 ィミぺネムまたは該タンパク質に 結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 4) F L J 1 2502由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ；
(b 5) F L J 1 25 14由来タンパク質と、 アクラルビシン、 チアベンダゾー ルまたは該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 6) FL J 14583由来タンパク質と、 セファレキシン、 ィミぺネムまた は該タンパク質に結合能を有するそれらの誘導体との組合せ；
(b 7) FL J 3 1 146由来タンパク質と、 セファレキシンまたは該タンパク 質に結合能を有するその誘導体との組合せ。
1 9. 生理活性物質とその標的タンパク質とを接触させることを含む、 請求の範 囲 1 8記載の複合体の製造方法。
20. キットであって、 以下 （ i )、 ( i i ) ：
( i ) 生理活性物質 Xまたはその塩；
( i i ) 標的タンパク質 Y、 該タンパク質をコードする核酸、 該核酸を含む発現 ベクター、 標的タンパク質 Υまたはそれをコードする遺伝子の発現を測定可能な 細胞、 あるいは標的タンパク質 Υをコードする遺伝子の転写調節領域およぴ該領 域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む発現ベクター；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Υとの組合せが請求の範囲 1 8に記載される (a 1) 〜 （a 5) あるいは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 キット。
2 1. 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパク 質 Yの機能に関連する疾患または状態の発症または発症リスクの判定方法であつ て、 以下の工程 （a)、 (b) ：
(a) 動物から採取した生体試料において標的タンパク質 Yまたはそれをコード する遺伝子の発現量および または多型を測定する工程；
(b) 測定された発現量および または多型に基づき疾患または状態の発症また は発症可能性を評価する工程；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが請求の範囲 1 8に記載される (a 1) 〜 （a 5) あるいは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 方法。
22. 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパク 質 Yの機能に関連する疾患または状態の発症または発症リスクの判定用キットで あって、 以下 （ i )、 （ i i ) ：
( i ) 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現量おょぴ Ζまたは 多型を測定し得る手段；
( i i ) 該疾患または状態と該発現量および/または多型との関係を記録した媒 体；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが請求の範囲 1 8に記載される (a 1) 〜 （a 5) あるいは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 キット。
23. 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパク 質 Yの機能に関連する疾患または状態における生理活性物質 Xに対する感受性の 判定方法であって、 以下の工程 （a)、 (b) ：
(a) 動物から採取した生体試料において標的タンパク質 Yまたはそれをコード する遺伝子の発現量および Ζまたは多型を測定する工程；
(b) 測定された発現量および Zまたは多型に基づき生理活性物質の効果を予測 する工程；
を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが請求の範囲 1 8に記載される (a 1) 〜 （a 5) あるいは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 方法。
24. 生理活性物質 Xの作用に関連する疾患または状態、 あるいは標的タンパク 質 Yの機能に関連する疾患または状態に対する生理活性物質 Xに対する感受性の 判定用キットであって、 以下 （ i )、 （ i i ) ：
( i ) 標的タンパク質 Yまたはそれをコードする遺伝子の発現量おょぴ または 多型を測定し得る手段；
( i i ) 生理活性物質 Xの効果と該発現量および Zまたは多型との関係を記録し た媒体；を含み、
生理活性物質 Xと標的タンパク質 Yとの組合せが請求の範囲 1 8に記載される (a 1) 〜 （a 5) あるいは （b 1) 〜 （b 7) のいずれかである、 キット,
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