CN117624326A - 一种人血清天然bicc1蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白提取技术领域，具体涉及一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法。本发明所述提取方法是将BICC1蛋白的结构域作为免疫片段制备抗原，再利用所述的抗原制备多克隆抗体，通过抗原和抗体之间的亲和作用，从血清中纯化获取了全长天然的BICC1蛋白。本发明解决了现有技术中无法获取全长BICC1的技术难题，助力了BICC1测定方法学的标准化研究以及生物学功能研究，同时也为其他类似无法获取的天然蛋白的提取提供了一种借鉴方案。
Description
技术领域
本发明属于蛋白提取技术领域，具体涉及一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法。
背景技术
1995年，研究人员在果蝇中发现了一种基因(称为双尾-C基因)，其功能丧失会导致果蝇头部缺失和双尾结构的形成(Michele M,Emma ES,Paul FL.Localized Bic audal–C RNAencodes a protein containing a KH domain,the RNAbinding motif ofFMR1.EMBO,1995,14(9):2043-2055)。根据序列分析，该基因翻译后的蛋白(BI CC1)结构中含有N端若干KH结构域和C端SAM结构域(Leettola C N,Knight MJ,Cascio D,etal.Characterization of the SAM domain of the PKD-related protein ANKS6 andits interaction with ANKS3.BMC structural biology,2014,14(1):1-15；RothéB,Leettola C N,Leal-Esteban L,et al.Crystal structure of Bicc1 SAM poly mer andmapping of interactions between the ciliopathy-associated proteins Bicc1,ANKS3,and ANKS6.Structure,2018,26(2):209-224.e6)。根据序列比对，在包含人类以内的多种物种中，均有双尾-C的同源基因。来源于人的BICC1基因是一种广泛表达于大脑和周围组织编码RNA结合蛋白的基因。不仅和抑郁症发病有关，同时也与癌症和胰腺癌密切相关。多篇文献报道了人类的双尾-C基因(称为BICC1基因)参与了抑郁症的发病(Ota KT,AndresW,Lewis DA,Stockmeier CA,Duman RS.BICC1 exp ression is elevated in depressedsubjects and contributes to depressive behavior in rod ents.Neuropsychopharmacology.2015.40(3):711-718)。正常人血清中的BICC1含量为533.24±43.08pg/mL，而单相抑郁症病人(MDD)含量为636.30±41.33pg/mL，双相抑郁症病人(MDD)含量为784.44±36.54pg/mL。因此BICC1可以作为标志物来区分单(MDD)/双相(BD)抑郁症(Chen S,JiangH,Xu Z,et al.Serum BICC1 lev els are significantly different in various mooddisorders.Neuropsychiatric Disease and Treatment,2019:259-265；Ota K T,AndresW,Lewis D A,et al.BICC1 expressio n is elevated in depressed subjects andcontributes to depressive behavior in rodents[J].Neuropsychopharmacology,2015,40(3):711-718)。
生物信息学分析表明，全长的BICC1蛋白含有974个氨基酸，分子量为104.8kDa。结构预测表明N端含有三个类似的KH结构域，C端具有一个SAM结构域，其余序列对应的是无序的结构(附图1)。KH和SAM结构域均是该蛋白发挥生物功能的关键结构域，同时也可以作为免疫原性较强的抗原片段。目前，人血清BICC1测定方法是酶联免疫吸附法，测定过程中，需要一定纯度和浓度的BICC1作为校准品建立标准曲线使用。此外，研究BICC1分离纯化的方法，可为BICC1的生物学功能，以及开发其检测方法奠定基础。
因BICC1无序结构序列较多，可溶性重组表达困难，需要分离天然的BICC1蛋白作为标准品。然而目前还没有天然BICC1蛋白纯化方法报道。所以迫切需要开发天然BICC1蛋白的分离方法，助力BICC1测定方法学的标准化研究以及生物学功能研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中无法获取全长BICC1可溶性重组蛋白，以及无法从人血清中分离天然BICC1的缺陷，本发明提供了一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法。
本发明的发明思路为：首先使用BICC1蛋白的关键结构域作为免疫片段，制备抗原，通过免疫动物制备多克隆抗体；多克隆抗体经过亲和柱纯化后，偶联到预活化的填料中；将人血清样本经过偶联后的填料吸附，洗脱，可以获取纯度高的天然BICC1蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将BICC1蛋白的结构域作为免疫片段，制备抗原；
(2)利用所述的抗原，通过免疫动物制备BICC1多克隆抗体；
(3)将所述的BICC1多克隆抗体经亲和纯化后，偶联至预活化填料中进行偶联反应，得到多克隆抗体亲和填料；
(4)将人血清样本上样到装有所述的多克隆抗体亲和填料的柱中，经过平衡、洗脱和中和，获得纯化后的人血清中的天然BICC1蛋白。
其中，步骤(1)中，所述的BICC1蛋白的结构域包括BICC1 N端KH结构域或BICC1 C端SAM结构域；优选BICC1 N端KH结构域。
其中，步骤(1)中，所述的抗原含有助溶标签；具体的，所述的助溶标签包括：GST、MBP、SUMO中的任意一种；优选GST标签。
其中，步骤(2)中，所述的免疫动物包括兔子、绵羊中的任意一种；优选的动物类型为绵羊。
其中，所述的BICC1多克隆抗体为血清提取的抗体，包括N端KH结构域多克隆抗体、BICC1 C端SAM结构域多克隆抗体中的任意一种；优选N端KH结构域多克隆抗体。
其中，步骤(3)中，所述的亲和纯化，其亲和填料包括protein A、Protein G、protein A/G和protein L中的任意一种，优选Protein G，在本发明的一些实施例中，所述的Protein G亲和填料为Protein G Sanarose 4FF；所述的亲和纯化，其洗脱缓冲液为：0.1-0.3M Glycine，pH 2.5-3.5，优选0.1M Glycine，pH 3.0。
其中，步骤(3)中，所述的预活化填料包括：环氧预活化填料(Epoxy Purose 4FF)、NHS预活化填料(NHS-Activated Beads 4FF)、CNBr预活化填料(CNBr-ActivatedCrystarose 4FF)中的任意一种。优选环氧预活化填料(Epoxy Purose 4FF)。
其中，步骤(3)中，所述的偶联，其偶联缓冲液为：0.1-0.3M NaHCO3，0.3-0.6MNaCl，pH 8.0-8.6，优选0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3；所述的偶联反应，其反应条件为：25-40℃下反应约10-16h。
其中，步骤(3)中，当偶联反应结束后，用5-10倍体积的去离子水或中性缓冲液清洗，再依次交替使用5-10倍体积的缓冲液A和5-10倍体积的缓冲液B进行清洗，静置15-30min后，用5-10倍体积的中性缓冲液平衡pH，最终得到所述的多克隆抗体亲和填料；优选，当偶联反应结束后，用10倍体积的去离子水或中性缓冲液清洗，再依次交替使用10倍体积的缓冲液A和10倍体积的缓冲液B进行清洗，静置15-30min后，用10倍体积的中性缓冲液平衡pH，最终得到所述的多克隆抗体亲和填料。
具体的，所述的中性缓冲液为：1×PBS，pH 7.4；所述的缓冲液A为：0.3-0.6M乙醇胺，0.3-0.6M NaCl，pH 7.8-8.3，优选0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH 8.0；所述的缓冲液B为：0.1-0.3M乙酸盐，0.3-0.6M NaCl，pH 3.5-4.5，优选0.1M乙酸盐，0.5M NaCl，pH 4.0。
其中，步骤(4)中，所述的平衡，其平衡缓冲液为：10-50mM Na2HPO4，pH 6.8-7.5，NaCl浓度为150mM；所述的洗脱，其洗脱缓冲液为：0.1-0.3M甘氨酸，pH 3.0-3.6，优选0.1M甘氨酸，pH 3.0-3.6；所述的中和，其中和缓冲液为：0.5-2M Tris-HCl，pH 8.0-9.0，优选1mM Tris-HCl，pH 8.0-9.0。
具体的，所述的中和，是直接向洗脱产物中加中和缓冲液，其中和体积为洗脱体积的1/5-1/10。
上述中和后得到的BICC1蛋白，经过超滤浓缩提高蛋白浓度至0.5mg/mL，即为最终的BICC1蛋白。具体操作为：使用50kDa超滤管，3500rpm转速，每次离心20min，直至蛋白浓度达到0.5mg/mL。
有益效果：
(1)本申请利用免疫片段制备多克隆抗体，通过抗原和抗体之间的亲和作用，从血清中纯化获取了全长天然的BICC1蛋白。解决了现有技术中无法获取全长BICC1的技术难题，助力BICC1测定方法学的标准化研究以及生物学功能研究。
(2)本申请获取天然BICC1的方法，为其他类似无法获取的天然蛋白的提取提供一种借鉴方案。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
附图1是Alphafold2预测的BICC1结构图；
附图2是BICC1的KH和SAM结构域融合蛋白的SDS-PAGE结果；
附图3是BICC1的KH结构域多克隆抗体纯化后的SDS-PAGE结果；
附图4是血清中天然BICC1纯化后的SDS-PAGE结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例阐述本申请中的天然BICC1蛋白的提取方法。从免疫原片段的制备，多克隆抗体制备和纯化，亲和填料的制备，到使用该填料提取血清样本中BICC1蛋白来说明本申请的可行性，所给出的实例只用于说明目的，并不能限制本申请的范畴。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：BICC1 N端KH结构域和C端SAM结构域的构建、表达和纯化。
(1)N端KH结构域的构建、表达和纯化：
因N端KH结构域分子量～9.5kDa，会造成免疫逃逸，不适合直接用做免疫用的抗原。所以需要额外添加助溶标签。本实施例中选用的助溶标签为GST。
将通过基因全合成(由上海生工生物工程股份有限公司完成)获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码(His tag)-GST-(BICC1 KH domain)的重组质粒转化到E.coli.BL21(DE3)中获得重组大肠杆菌，在固体LB平板(含有终浓度为0.03mg/L卡那抗生素)上37℃培养12-18小时后，挑取单菌落在液体LB培养基中37℃、200rpm(0.03mg/L卡那抗生素)培养15-20小时后送测序确定序列。
将测序正确的重组大肠杆菌在LB培养基中37℃、200rpm(含有终浓度为0.03mg/L卡那抗生素)培养15-20小时后，以1％v/v接种量转接到1L液体LB培养基中(含有终浓度为0.03mg/L卡那抗生素)培养，当OD600为0.5-0.6时，使用0.2mM IPTG在20℃下诱导表达18h，使用高速离心机8000rpm离心20min收集菌体。
使用30mL缓冲液(缓冲液为10mM Tris-HCl,pH 7.4,100mM NaCl,0.1mM PMSF,10％glycerol)重悬并超声裂解(超声裂解仪器设置参数设定为：功率500-600W，超声5s停顿5s，大约30min直至菌液澄清)1L菌液收集的菌体，使用高速离心机4℃，12000rpm离心裂解液，使用0.45μm的滤膜过滤上清，然后上样到5mL的镍柱上，10％缓冲液B平衡后，使用10％-100％缓冲液B洗脱5个柱体积。收集洗脱下来的样品即为GST-KH。这里使用的缓冲液A为：10mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH 8.0；缓冲液B为：缓冲液A+500mM imidazole，pH 8.0。附图2中电泳条带1显示了该蛋白样品的纯度。
(2)C端SAM结构域的构建、表达和纯化：
因C端SAM结构域分子量～9.0kDa，同样会造成免疫逃逸，不适合直接用做免疫用的抗原。所以需要额外添加助溶标签。本实施例中选用的助溶标签为GST。
将通过基因全合成获得的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码(His tag)-GST-(BICC1 SAM domain)采用步骤(1)中同样的方式进行表达和纯化，最终获得GST-SAM。附图2中电泳条带2显示了该蛋白样品的纯度。
实施例2：N端KH结构域多克隆抗体制备和纯化。
为了能够纯化天然BICC1蛋白，本申请所用的方法为抗原抗体相互作用的方法。所以需要制备BICC1特异性抗体。因单克隆抗体制备时间较长，所以选择制备绵羊多克隆抗体并选用N端KH结构域作为抗原。首先将含有N端KH结构域20mg/mL的抗原0.1ml，无菌PBS1.9mL，弗氏佐剂2mL混合并乳化，得到免疫原乳剂；然后绵羊免疫第一针，在绵羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，然后间隔二十天注射第二针，再每次间隔10天分别注射3、4针，再间隔五天对免疫的绵阳动脉采血，血液放入水箱中1小时温度40℃，待血清充分析出，经离心沉淀分离出羊抗血清。该步骤委托南京汇标生物公司完成，并交付抗N端KH结构域的羊抗血清。将50mL羊抗血清使用等体积的1×PBS(pH 7.4)稀释后，上样至装填protein G填料的预装柱中(三翼科技有限公司，Protein G Sanarose 4FF)，使用50mL 1×PBS(pH 7.4)平衡，然后使用50mL 0.1M Glycine(pH 3.0)洗脱，并加入5mL 1mMTris-HCl(pH 8.0)中和，将洗脱下来的多克隆抗体使用1×PBS(pH 7.4)稀释成终浓度为20mg/mL，并保存在-20℃备用。附图3显示了N端KH结构域多克隆抗体的纯度。
实施例3：多克隆抗体亲和填料的制备。
为了制备抗体亲和填料，需要将多克隆抗体偶联至预活化的填料中。本实施例中选用的是环氧预活化填料(Epoxy Purose 4FF，千纯生物科技有限公司)，使用以下步骤将多克隆抗体偶联至填料中。
用偶联缓冲液(0.2M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)配置精确浓度的多克隆抗体溶液(10mg/mL的多克隆抗体)。用10倍体积偶联缓冲液将预活化填料中的乙醇洗净，迅速将活化介质(洗净乙醇的预活化填料)与配体溶液(10mg/mL的多克隆抗体)混合，缓慢搅拌。反应条件为：30℃，15h。偶联结束后，用10倍左右的去离子水或中性缓冲液(中性缓冲液配方：1×PBS，pH 7.4)洗去配体溶液，本实施例中使用的是去离子水。然后使用以下步骤钝化和清洗没有偶联到活化基团的配体：依次用10倍体积的缓冲液A(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.0)、10倍体积的缓冲液B(0.1M乙酸盐，0.5M NaCl，pH 4.0)、10倍体积的缓冲液A进行交替清洗2-3次，室温下放置15-30min。最后，再用10倍体积的中性缓冲液平衡pH，得到偶联后的多克隆抗体亲和填料。
将偶联后的多克隆抗体亲和填料装填至中压层析柱空柱中(型号：XH-ZCXZ，昕沪)如果不立即使用，可以保存在含2-8℃冰箱中。
实施例4：血清天然BICC1蛋白的纯化。
将200mL人血清样本经过50mL 1×PBS(pH 7.4)缓冲液中和，上样到实施例3制备得到的多克隆抗体亲和填料柱中(柱体积：CV＝5mL)。使用平衡缓冲液(10-50mM Na2HPO4,pH6.8-7.5,NaCl浓度为150mM)，设置流速5mL/min，平衡4个柱体积后，使用洗脱缓冲液(0.1MGlycine，pH 3.0)，设置流速5mL/min，洗脱4个柱体积，再使用5mL中和缓冲液(1mM Tris-HCl,pH 8.0)中和，最终获取含有天然BICC1蛋白的组分。
根据BICC1蛋白的分子量(104.8kDa)和消光系数(ε＝54620)，使用Nano Drop微量紫外分光光度计，获取在280nm处的吸收值，根据计算公式：C＝(A280×104800)/54620＝1.92×A280，计算得到最终洗脱的BICC1蛋白浓度为0.02mg/mL，使用50kDa超滤管(购于Millpore)，3500rpm转速，每次离心20min，直至蛋白浓度达到0.5mg/mL，并使用SDS-PAGE验证蛋白的纯度(附图4)，从图4可以看出，最终得到的天然BICC1蛋白中杂质含量很少，目的蛋白纯度较高。
本发明提供了一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种人血清天然BICC1蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将BICC1蛋白的结构域作为免疫片段，制备抗原；
(2)利用所述的抗原，通过免疫动物制备BICC1多克隆抗体；
(3)将所述的BICC1多克隆抗体经亲和纯化后，偶联至预活化填料中进行偶联反应，得到多克隆抗体亲和填料；
(4)将人血清样本上样到装有所述的多克隆抗体亲和填料的柱中，经过平衡、洗脱和中和，获得纯化后的人血清中的天然BICC1蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的BICC1蛋白的结构域包括BICC1 N端KH结构域或BICC1 C端SAM结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的抗原含有助溶标签；其中，所述的助溶标签包括：GST、MBP、SUMO中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的免疫动物包括兔子、绵羊中的任意一种；所述的BICC1多克隆抗体包括N端KH结构域多克隆抗体、BICC1 C端SAM结构域多克隆抗体中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的亲和纯化，其亲和填料包括protein A、Protein G、protein A/G和protein L中的任意一种，其洗脱缓冲液为：0.1-0.3M Glycine，pH 2.5-3.5。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的预活化填料包括：环氧预活化填料、NHS预活化填料、CNBr预活化填料中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的偶联，其偶联缓冲液为：0.1-0.3M NaHCO3，0.3-0.6M NaCl，pH 8.0-8.6；所述的偶联反应，其反应条件为：25-40℃下反应约10-16h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，当偶联反应结束后，用5-10倍体积的去离子水或中性缓冲液清洗，再依次交替使用5-10倍体积的缓冲液A和5-10倍体积的缓冲液B进行清洗，静置15-30min后，用5-10倍体积的中性缓冲液平衡pH，最终得到所述的多克隆抗体亲和填料。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的中性缓冲液为：1×PBS，pH 7.4；所述的缓冲液A为：0.3-0.6M乙醇胺，0.3-0.6M NaCl，pH 7.8-8.3；所述的缓冲液B为：0.1-0.3M乙酸盐，0.3-0.6M NaCl，pH 3.5-4.5。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的平衡，其平衡缓冲液为：10-50mM Na2HPO4，pH 6.8-7.5，NaCl浓度为150mM；所述的洗脱，其洗脱缓冲液为：0.1-0.3M甘氨酸，pH 3.0-3.6；所述的中和，其中和缓冲液为：0.5-2M Tris-HCl，pH 8.0-9.0。
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