JP2013136586A - 血液脳関門を通したポリペプチドの非侵襲的な送達およびエンドサイトーシスリガンドの生体内選択 - Google Patents

血液脳関門を通したポリペプチドの非侵襲的な送達およびエンドサイトーシスリガンドの生体内選択 Download PDF

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Abstract

【課題】頭脳または脊髄を処置するために、血液脳関門(BBB)を通してポリペプチドを非侵襲的に送達するための処置方法および遺伝子ベクターの提供。
【解決手段】該遺伝子ベクターを、BBBの外側に伸びる神経投射に接触するように投与して、BBBにまたがる神経細胞、例えば感覚神経細胞、侵害受容神経細胞または下位運動神経細胞にトランスフェクションする。適当な遺伝子ベクターは、少なくとも１つの望ましい「運送物遺伝子」を含むDNA配列、あるいはマーカー遺伝子（研究における検出および分析を簡易化するため）及び／又は運搬物遺伝子(治療上その他の望ましい有用なポリペプチドをコードする）を含むDNA配列を保有する。この種のベクターを用いて、血液脳関門をまたぐ一つ以上の特定種類の神経細胞（例えば嗅受容体神経細胞、下部運動神経細胞）にトランスフェクトする。
【選択図】なし

Description

本発明は血液脳関門(BBB)の存在するヒトや他のほ乳類、又は他の動物への頭脳そして
脊髄組織にポリペプチドを送達する方法に関する。更に、頭脳または脊髄内にその全体が
存在する特定の神経細胞及び細胞集団にポリペプチドを送達する方法に関する。また更に
、通常BBB を通過することができないポリペプチドを使用した、ヒトの神経障害の治療方
法、及び家畜や他の動物の処置方法(受精率、成熟率、生育速度等の制御)に関する。
高等動物の血液脳関門(BBB)は、頭脳および脊髄の神経細胞が、BBBを通過すると神経機
能を妨害する血液内分子にさらされないよう保証する。BBBは単一の膜ではない。その代
り、頭脳および脊髄内の毛管は、密着結合を形成する内皮細胞によって形成される。対照
的に、頭脳および脊髄外の毛管壁には隣接細胞間に「間隙管孔」があり、それらの毛管の
透過性を大いに上げる。BBB系は多くの教科書および論文にすでに説明されている(例：Go
ldstein et al 1986; Pardridge 1998; Rubin et al 1999; Banks 1999; Kniesel et al
2000; Kniesel et al 2000)。BBB通過を調査する為の動物モデルはBonate et al 1995に
記載され、細胞培養モデルを開発するための早期研究はde Boer et al 1999に記載されて
いる。
BBB は頭脳および脊髄を保護するが、神経系に影響を与える傷害や病気を治療するため
の多くの薬剤も排除する。特に、蛋白質及びペプチドは、ほんの少数の例外を除いて、実
質的な量でBBB を通過することができない(例Langer 1990)。少数の例外は、限られた輸
送系及びある種の神経受容体、例えばトランスフェリン受容体に関与する(例、Kastin et
al 1999、及びGranholm et al 1998) 。但し、それらの限られた例外は、種々のポリペ
プチドを使用して中枢神経疾患を治療するのに適さない。治療用ポリペプチド(および他
の型の有用な薬剤)をBBB通過させるよりよい方法の必要性が周知であり、多くの総論に出
版されている（Zlokovic 1995、Cloughesy et al 1995、Ｄａｖｉｓ et al 1995、Abbott
et al 1996、Begley 1996、Kroll et al 1998、Pardridge et al 1998、Rochat et al 1
999およびRapoport 2000）。
本発明はBBB によって保護される頭脳または脊髄組織内にポリペプチドを送達する方法
に関する。ここに記載される「ポリペプチド」は、遺伝子発現によって生体細胞内で形成
された(アミノ酸をつなぐことによって形成された) あらゆるペプチド分子を指す。細胞
内の遺伝子発現は下記に関与する：(i)DNA 遺伝子配列から転写して、メッセンジャーRNA
(mRNA)鎖を形成し、続き、(ii)正確な配列でmRNA鎖を翻訳してアミノ酸から成るポリペ
プチド鎖を形成する。遺伝子配列の発現によって形成されたそのよう分子は、翻訳後に切
断、細胞分泌、糖鎖形成、システイン架橋結合などで処理されるかどうかにかかわらず、
全てポリペプチドと参照される。
学者によっては完成した機能的なポリペプチドを「蛋白質」と記載する（ポリペプチド
の断片、または活性化するのに必要な処理をされていないポリペプチド前駆体とは異なる
）。本発明では、ポリペプチドは意図した機能を遂行することができなければ対象とはな
らず、従って、「ポリペプチド」及び「蛋白質」の用語は交換可能に使用される。
ここで対象となる(特許請求の範囲内にある)ポリペプチドは、3 つの特性を必要とする
。第一に、ポリペプチドは、ここに記載される介入方法などを使用して、一つ以上の種類
の神経細胞に挿入された外来性遺伝子（「外因性」遺伝子とも呼ばれる）によって発現さ
れなければならない。但し、ベクターによって運ばれる外来性(外因性)遺伝子は、中枢神
経内に普通発現される「天然の」または「自然な」遺伝子と同じ配列を有するものでもよ
い。これは、例えば、ポリペプチドがもはや適量では生成されていないため病気に苦しん
でいる人にそのポリペプチドのレベルを増加する処置で起こりうる。
第二に、ポリペプチドは、血液脳関門によって通常保護される頭脳または脊髄組織内に
ポリペプチドを放出する一つ以上の種類の神経細胞により発現されなければならない。こ
こに使用される 「血液脳関門を通してポリペプチドを送達する」、または「頭脳または
脊髄組織内（または中）にポリペプチドを放出する」という表現は、外来性ポリペプチド
がBBB内に完全に存在する少なくとも１つの細胞または細胞種類に接触しなければならな
いことを意味し、かつ必要とする。この条件は、BBB をまたぐ神経細胞が、ポリペプチド
を、そのポリペプチドとBBBをまたぐ他の神経細胞とが接触する位置でのみ分泌する場合
は満されない。その代り、大抵の場合、この条件は、神経細胞が、外来性ポリペプチドを
BBB内の場所にて、脳脊髄液(CSF)及び/またはシナプス液に分泌するときだけ満たされる
。
第三に、外来性ポリペプチドは、治療上および/または別の用途上有用である、望まし
い有用な(むしろ病原性が無く)神経活性があるときだけ対象となる。これは、ウイルス感
染や他の有用でない感染、検査、そして頭脳または脊髄組織を侵襲または攻撃する方法を
除く。多くの検査が、実験動物で神経細胞またはグリア細胞に感染するウイルスを使用し
て行われた。これは、抗ウィルス薬候補を検査するために、また狂犬病ウイルスなどのウ
イルスを動物に感染させ、数時間後に動物を殺し、そしてどの神経細胞がウイルスによっ
て感染したか見るため頭脳組織のサンプルを分析することによって、神経網及び神経接続
を分析する「トレーサー」研究を行うために行われた。これらの実験では、外来性ポリペ
プチドをBBBによって保護された頭脳または脊髄組織に導入するのにウイルスを使用した
が、そのような感染を実験動物に与えることは、治療的よりもむしろ病原的であることが
明らかである(殆どの動物は実験の一環として屠殺された)。従って、本発明はそのような
トレーサーおよび他の病原体テストとは大幅に異なり、BBBにより保護された組織に治療
上または別の用途上有用及び有益なポリペプチドを導入する、人間の医学治療、及び家畜
や絶滅の危機に瀕した動物の育種などの分野において用いられる方法を提供するように設
計されている。
また「神経活性」は上述した第三要素に必要な部分である。ここに記載される「神経活
性」ポリペプチドは、BBB によって保護された頭脳または脊髄組織内の所望の意図した領
域に適切に送達された場合に、治療上または別の用途上有用な、および/または望ましい
結果または効果を出すことができるポリペプチドである。様々な例が以下に、そして表に
記載されている。
有用な神経活性ポリペプチドとは、神経細胞に対する直接効果なしに、グリア細胞に対
する直接効果のみを出すポリペプチドを含む場合もあることが注意されるべきであり、そ
の場合処理されたグリア細胞と液体により連絡している神経細胞間に治療効果または他の
有利な結果をもたらす反応を発生させることが必要とされる。
さらに、用語「ポリペプチド」は、天然ポリペプチドまたは遺伝子工学により形成され
たポリペプチドの変形体、誘導体および断片を含む。この例として下記のものを含む:(i)
ある遺伝子に由来する神経活性部分、および(安定性、輸送、分泌、または他の有用な特
性または活性を高めるため)他の遺伝子に由来する「リーダー」配列を有するキメラポリ
ペプチドまたは融合ポリペプチド；および(ii)望ましい神経活性を有するポリペプチドの
断片または一部（例えば単クローン抗体の可変領域から単離された単鎖結合断片）。
次のセクションは神経障害に苦しんでいる人または動物に治療上の利点を提供できる神
経活性ポリペプチドの概観を4 つの分類に分け記載する。
神経栄養因子
ニューロトロフィックファクター（神経栄養因子）の接尾語「トロフ」はギリシャ語の
「栄養」又は「食物」に由来する。「トロフィック」とは、ある分子がある系の刺激、成
長、滋養、維持、または支持にかかわることを意味する。「神経栄養因子」とは、神経の
成長を促進するか、神経細胞間の新しいシナプス接続の形成を引き起こすか、または他の
神経活動を刺激または支援する因子である。但し、この用語は次を除く:(i)(酸素、ブド
ウ糖、アミノ酸、およびヌクレオチドなどの)すべての細胞に必要とされる栄養素、及び(
ii)(グルタミン酸塩、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンなどの)神経細胞間の神
経インパルスを直接制御する神経伝達物質。
殆どの神経栄養因子はホルモンと同様に作用する。まずこれは１つの種類の細胞によっ
て分泌され、続いて他の細胞と相互作用する。但し、分泌後に、典型的に近隣の細胞とだ
けしか相互作用しないところが、ホルモンとは異なる。これはある点では「傍分泌」因子
と同様に作用する。傍分泌とは、局所的にだけ作用するホルモン様分子を示し、他方「内
分泌」因子とは全身系で作用し、分泌細胞から遠い細胞に影響を与えることができる。
神経栄養因子はLindsay 1994、Snider et al 1994、Bothwell et al 1995、Lewin et a
l 1996およびSkaper et al 1998などの論文と多数の米国特許に記載されている。神経細
胞の成長を刺激することで発見された最初の神経栄養因子は神経成長因子(NGF)と呼ばれ
た。後に、他の神経栄養因子も発見され、、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来
神経栄養因子(GDNF)、繊毛様神経栄養因子のような手の込んだ名称、およびニューロトロ
フィン３、ニューロトロフィン４のような連続番号を用いる名称を必要とした。
多くの神経栄養因子はポリペプチドであり、下記を含む多くの中枢神経障害の有望な治
療法を提供する：(1)自動車事故、震盪症等のような物理的傷害によって引き起こされた
脳障害；(2)虚血（不十分な血の流れ）または低酸素症（不十分な酸素の供給）を含む脳
卒中、心拍停止、溺水、窒息、血液損失または他の問題によって引き起こされる脳障害；
及び(3)アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症
のような神経変性病。これらの可能性はHefti 1994、Thoenen et al 1994、Ibanez et al
1995、McMahon and Priestley 1995およびYuen and Mobley 1996などの論文に記載され
る。
便宜上、障害、損傷および傷害のような用語は、一つ以上の治療ポリペプチドが頭脳ま
たは脊髄の適切な局所に輸送されると、該ポリペプチドにより抑制または治療されるあら
ゆる中枢神経系障害（外傷、疾病等に由来する)を示す。
視床下部放出因子
視床下部放出因子は視床下部の神経細胞によって産生され分泌される短いポリペプチド
である。これらのポリペプチドは、脳下垂体を刺激して、成長、新陳代謝、血液中の水と
塩分のバランス、生殖等にかかわる多数の重要な身体機能を制御し、影響を与える様々な
ホルモンを分泌させるものであり、多くの研究の課題となっている。視床下部放出因子を
記載する論文はTurnbull et al 1999、Phelps et al 1999およびSawchenko et al 2000を
含む。
ペプチド神経伝達物質
多数のペプチド神経伝達物質、例えばサブスタンスP、エンケファリン、エンドルフィ
ン、血管作用性小腸ペプチド(VIP)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、ガラニン
、ソマトスタチンが記載されている。多くの場合、ペプチド神経伝達物質はグルタミン酸
またはアセチルコリンのような古典的な神経伝達物質と同様に作用する。それらはシナプ
スで神経細胞によって放出され、シナプスで他の神経細胞の特定の受容体と結合して、神
経信号の伝達を刺激または抑制する（これらは神経インパルス、発火、または脱分極とも
呼ばれる)。他の場合、ペプチド神経伝達物質とシナプス受容体との結合は、他の神経伝
達物質に対する標的神経細胞の感受性を高める、または減らすような、より長期の効果を
出す。疼痛の認識では、例えば、サブスタンスP は脊髄の侵害受容性（疼痛送信）神経線
維によって放出され、興奮性であり、他方、エンケファリン及びエンドルフィンは反対の
効果をもたらし疼痛情報の伝達を抑制する。モルヒネによる疼痛軽減はエンドルフィン受
容体との結合に起因する。但し、疼痛処置のためのエンドルフィンの使用はそのようなペ
プチドを安全に頭脳内へ輸送することが難しいために、現在可能ではない。
サイトカイン及び他の成長因子
あるサイトカインおよび他の成長因子は、神経栄養因子として局所的に作用して神経の
成長を刺激する機能を持つ。但し、サイトカインは、神経系に関する様々な非神経の分裂
細胞の成長及び有糸分裂を刺激する機能の点で、神経栄養因子と区別される。例として、
酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子(aFGF及びbFGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、血小板由
来成長因子(PDGF)、インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ(IGF-I及びIGF-II)、腫瘍壊死因
子B(TGF-B)、白血病抑制要因子(LIF)、及び様々なインターロイキン等が含まれる。
これらの分子は中枢神経組織の成長、損傷後の再構築及び修復、及び中枢神経系内の免
疫反応などの正常な生理的な過程に関わっている。それらは、神経中枢系の損傷または感
染を治療するのに使用される可能性がある一方で、特に神経中枢系を通して全身的に投与
される場合に、癌細胞を刺激する危険がある。それにもかかわらず、それらは神経学研究
者の興味を大いにひき、個別の限られた神経中枢領域にサイトカインや類似分子を輸送す
る方法の開発は大きな関心を集め、潜在的に有益である。
表１に一般に知られている神経中枢系活動性のポリペプチドの部分的なリストを提供す
る。適用の一分野をもう少し詳しく説明するため、表２にはいくつかの神経中枢系障害例
、及びこれらの神経中枢系障害を治療するのに現在大変有望と考えられるポリペプチドを
記載する。表１及び表２は部分的なリストしか含んでおらず、（ヒト、マウス、及びラッ
トゲノム配列プロジェクトを含む）多数の研究の試みから他の様々な神経活性ポリペプチ
ドが急速に同定されている。
神経活性ポリペプチドの評価、及び治療を要する患者における該療法の使用を妨げてい
る最も大きな、また最も困難な障害は、頭脳および脊髄の特定領域に神経活性ポリペプチ
ドを実際に送達する大変な難しさであり、その領域で治療効果、予防効果または他の利点
を提供するため、該ポリペプチドが特定の標的神経細胞群またはグリア細胞群に接触する
必要がある。従って、本発明の目的及び目標は次のとおりである：(i)血液脳関門によっ
て保護される頭脳及び脊髄組織の領域に外来性ポリペプチドを送達する方法を提供するこ
と、及び(ii)外来性ポリペプチドを、頭脳及び脊髄組織の標的の、特定の、および限られ
た領域に、および/または神経中枢系内の標的の、特定の、および限られた種類または分
類の細胞に送達する方法を提供すること。
中枢神経系薬物送達法の従来技術
薬物送達の文献調査（例えば、Langer et al 1989; Langer 1990; Madrid et al 1991;
Thoenen et al 1994; Zlokovic 1995、Cloughesy et al 1995、Davis et al 1995、Abbo
tt et al 1996、Begley 1996、Kroll et al 1998、Pardridge et al 1998、Rochat et al
1999及びRapoport 2000）によると、ポリペプチドを血液脳関門を通して送達する為に現
在利用でき、有効であり、そして臨床上実用的である代替法は、少数同定されるだけであ
る。血液脳関門を通して薬物を送達する為の様々な方法の試みは大した成功が無く、Zlok
ovic 1995及びRapoport 2000などの論文に概説される。これらの試みは次の通りに分類さ
れ、要約することができる。
１．細胞及び膜に穴をあける手術、または少くとも皮下針の使用等の物理的侵入を要求
する侵襲的な方法。その例は、脳室内への注射又は注入であり、そのために、神経外科医
が、脊髄液の生産部位又は集積結節として機能する「脳室」の一つに接近して、薬物を、
脳室に集積する液体に注入することが必要である。これらの脳室のほとんどは頭脳の奥深
くにある（ヒトの第４脳室は幾分接近しやすいが、頭脳を去る液体の出口である為、頭脳
大半に薬物を送達するのに有用でない）。脳室への薬物注入は、針を使うだけとしても、
困難及び危険である。刃または針によるどの貫通でも毛管を途中で傷つけることになり、
血液が、破損した毛管から漏れれば、血液脳関門によって血液から保護されなければなら
ない神経細胞に接触する事になる。血液の漏出を最小に抑えるために焼灼法を使用する場
合は、焼灼された毛管、小動脈および静脈はもはや血液を運ばなくなり、それらの血管に
よって供給されていた神経細胞は死滅するかもしれない。
別の侵襲的な方法は、頭脳の目標領域に高率に神経栄養因子を分泌できる、遺伝的に選
択及び/または作製された細胞の移植を含む（例えば、米国特許5,082,670 Hefti et al 1
992)。頭脳の目標部分へのそのような細胞の挿入は刃または針を使用する侵襲的な接近を
必要とし、深刻な問題および危険が生じる。このような問題のために、これらの侵襲的な
方法は非常に限られた臨床試験、末期の病気に苦しんでいる患者、及びどの処置によって
も助けることができないとても重症で衰弱した病気の患者以外は、人間に利用することが
できない。
２．化学的、細胞的、担体輸送的、又は他の非外科的な方法で神経栄養因子又は類似分
子を血液脳関門を通して送達する非侵襲性な方法。これらの方法は通常かなり大量の小胞
、複合体、または他の高分子を血流に注入することを必要とし、注入された「運送物」分
子が小量でも頭脳に入り、血液脳関門を渡って頭脳組織に送達されるよう期待される。こ
れらの方法の例は米国特許5,154,924 (Friden 1992)、Racagni et al 1994中のThoenen e
t alによる章、及びZlokovic 1995などに記載されている。
これらの方法を用いる上重要な問題1 つは、ある化合物が有意な量でBBBを通過するこ
とができれば、その同じ化合物はまたより速くそしてより多量に身体の残りのより透過性
のある毛管を通過することである。これにより、二つの深刻な問題をもたらす。第１は、
多量の神経活性化合物が非中枢神経系の組織に送達されるときに起こる副作用であり、そ
のような化合物は末梢神経系、又は他の種類の細胞や組織を破壊しうる。第２の問題は、
ヒトに注射する前に、多量の複雑な薬剤を注意深く合成し、精製し、品質検査しなければ
ならないときに起こる非常に高い費用である。さらに、そのような注射または注入は通常
、頻繁に多数回繰り返されなければならないし、また多量の神経活性化合物の注射または
注入の後、患者に副作用があった場合緊急手段がすぐ取られるように、通常自宅よりもむ
しろ病院または医院で、少なくとも１日以上患者の監視を必要とする。
また、従来の方法では選択した神経細胞、神経細胞類、又は頭脳領域だけに外来ポリペ
プチドを投与することができない。対照的に、本発明は、制御可能かつ選択的な（または
少なくとも濃縮された）態様で、標的神経細胞に外来ポリペプチドを投与するいくつかの
有望な方法を提供する。中枢神経系内のある部位または領域だけ、および/またはある種
類又は集団の神経細胞だけを標的とすることによって、副作用の危険性及び重症度を最小
に抑えることができる。
遺伝子治療
中枢神経系障害を治療する可能性がある１つの方法は遺伝子療法である。遺伝的に頭脳
及び脊髄神経細胞を修飾する従来の研究で２つの主要な方法が使用された。１つの方法で
は、細胞を身体の外で遺伝的に改変し、次に中枢神経系内のどこか、通常BBB内の領域に
移植する。もう１つの方法では、遺伝子「ベクター」を中枢神経系の一つ以上の領域に、
BBBによって普通保護される細胞を遺伝的に改変するために、注射する。身体の他の部分
で上手く働く方法を、頭脳または脊髄組織の治療に応用するとき深刻な問題が起こるので
、この２種類の方法を以下により詳しく記載する。
遺伝子改変細胞の移植
従来の組織では、細胞移植は、通常一群の細胞を単離し、それらの細胞を細胞培養（試
験管内(in vitro)）条件で処理し、そして動物または患者に処理細胞を移植することを伴
う。いくつかの場合、細胞を宿主に移植した後の潜在的な拒絶問題を最小にするために、
細胞を宿主から得る。他の場合では、細胞を他から得る（不死細胞株、胎児又は幹細胞、
等）。遺伝子操作は、精密な制御技法を含み、又は「ショットガン」方法とその後の選択
試験を含みうる。
この一般的な方法を中枢神経系組織で使用することは、以下に簡単に列挙するものを含
むいくつかの理由のため、通常は実用的でない。第一に、中枢神経系は非常に不均質であ
り、ある領域からの神経組織は別の領域からの神経組織の代わりにできない。第二に、成
体の中枢神経系の神経細胞は有糸分裂後であり、欠失が生じても再び分裂再生することは
無い。第三に、神経細胞の突起または軸索は、いったん切断されると、容易に再成長して
シナプスその他の接続を再構築することができない。第四に、中枢神経系の組織の外科的
または類似の抽出は、手術が最高レベルの技術と注意を用いてなされても、患者に大変な
危険を与える。
これら及び他の理由のために、大半の場合、患者から中枢神経系の一群の神経細胞を取
り出し、神経細胞を遺伝的に処理し、そして患者の頭脳または脊髄に戻すことは簡単に実
行可能ではなく、または実用的でない。従って、中枢神経系組織に遺伝子改変細胞を移植
する殆どの試験では、同じ患者から採取された細胞を使用する試みは行われていない。そ
の代り、初期の実験では所望のタンパク質（例えばアルツハイマー病患者の頭脳に移植す
る場合、神経成長因子）を異常に多量に分泌するように改変された遺伝子改変細胞（必ず
しも神経細胞ではない）が使用された。このような試験及び治療の試みはBlesch and Tus
zynski 1996、Karpati et al 1996、Fick and Israel 1994、Fisher and Ray 1994及びFr
iedman 1994などの論文及び米国特許5,082,670 (Hefti et al 1992)などの特許に記載さ
れている。この様な研究は興味深く、いつか有用になるかもしれないが、外来細胞を中枢
神経系組織に移植することが必要なかぎり、大きなリスクおよび危険性は不可避である。
そのよう移植では頭脳または脊髄組織に穴をあけ、または切断しなければならず、移植の
過程は、侵入または置換されなければならない頭脳又は脊髄組織を必ず傷つける。
対照的に、細胞を動かさずに行う中枢神経系細胞の遺伝子操作（インサイチュ(in situ
)処理と呼ぶ） は、頭脳または脊髄の組織に侵略的な損傷を加えないで問題を訂正するよ
り良い希望を提供する。
中枢神経系細胞のインサイチュ遺伝子改変
この方法は中枢神経系内の細胞を動かさずに遺伝的改変することによって中枢神経系に
所望のポリペプチド源を導入することを目指す。従来技術では、これは頭脳または脊髄組
織に外来遺伝子を有する遺伝子ベクターを直接数回注入することによって達成された。但
し、この方法は侵襲的であり、頭脳または脊髄組織を針や刃物によって貫通又は切断しな
ければならない。その代りに必要なものは、BBBによって保護された組織に穴をあけ、切
断し、または別の方法で侵入し、あるいは貫通することなく、BBB内に位置する細胞を遺
伝的にトランスフェクションし、または形質転換する非侵襲的な方法である。
用語「トランスフェクション」及び「形質転換」は交換可能に使用される。両用語は、
外来遺伝子からポリペプチドが生成発現される様に、一つ以上の既存の細胞へ外来性（外
因性）遺伝子を導入する方法を示す。科学者によっては、「トランスフェクション」は、
しばらくだけ持続し、結局は停止する感染に類似して、外来遺伝子を一時的にだけ発現す
ることを意味する。対照的に、「形質転換」は、通常は外来遺伝子が一つ以上の細胞の染
色体に組み込まれるために、任意の及び全ての細胞子孫に受け渡される永久的な遺伝子変
化を意味する。但し、それらの用語の境界ははっきりせず、それらの用語の使用の区別は
全科学者によって統一されていない。その為、「トランスフェクション」及び「形質転換
」は、標的細胞に侵入した後に外来性遺伝子がどのくらい長く発現され続けるかに関わら
ず、ここでは交換可能に使用される。
遺伝子ベクター
遺伝ベクターには２つの大きな分類がある。ウイルスベクターはウイルスに由来し、ウ
イルスの脂質外被または殻表面（キャプシドとして周知）を利用する。これらのベクター
は、ウイルスがある種の細胞の一つ以上の特定の表面蛋白質に結合し、次に細胞にウイル
スのDNAまたはRNA を注入するという性質を利用する。これらはヒトの遺伝子療法の試み
で使用されたベクターの主要的な種類になっており、多数の公開論文に記載されている。
単純ヘルペスウイルス（例えば欧州特許453242、Breakfield et al 1996)、アデノウィル
ス(La Salle et al 1993)及びアデノ随伴ウイルス(Kaplitt et al 1997)に由来するベク
ターを使用した中枢神経系神経細胞への遺伝子導入が報告されている。
他の全ての遺伝子ベクターは非ウイルスベクターの広い種類に一般に分けられる。これ
らのベクターは通常、当業者によって理解される「遺伝子発現構成体(gene expression c
onstruct)」を含んでいる。説明上、該構成体はプラスミドであってよく、通常次のもの
を含む：(i)大腸菌のような宿主細胞ですぐに増殖するための複製開始点；(ii)プラスミ
ドを有する宿主細胞が、抗生物質を不活性化するため、他の炭素源を全く必要とせずラク
トース上で成育するため、又はある化合物が存在する場合に発色するための、少なくとも
１つの選択可能なマーカー遺伝子、及び(iii)遺伝子発現構成体が標的哺乳類細胞に注入
された後に所望のポリペプチドを発現するコード配列及び適当なプロモーターを含む、少
なくとも１つの運送物遺伝子。
非ウイルス遺伝子ベクターは、遺伝子発現構成体に、標的細胞への遺伝子構成体(gene
construct)の侵入を可能にし、促進する薬剤を加える事によって作製される。一般的に使
用される薬剤のいくつかは、カチオン性脂質、陽性荷電分子、例えばポリリジンまたはポ
リエチレンイミン、及び/又は標的細胞の表面に発現される受容体に結合するリガンド（
場合によっては、ウイルスから元々取得されたウイルスリガンド等）である。非ウイルス
遺伝子ベクターの主要な分類は下記のとおりである。
１．カチオン性遺伝子ベクター。DNA鎖及び細胞表面は双方陰荷電である。従って陽性
荷電薬剤はDNA鎖の電気的反発を解消し、標的細胞への侵入を援助する。例として、ポリ
リジンまたはポリエチレンイミン(PEI)、および様々なカチオン脂質がある。このような
薬剤はSahenk et al 1993、Nabel et al 1997及びLi et al 2000等の論文に記載されてい
る。
２．細胞表面の受容体分子を通して通常ある種類の細胞に侵入する分子にDNA鎖を結合
した、受容体ターゲティング遺伝子ベクター。この方法は肝臓細胞を用いて米国特許5,16
6,320 (Wu et al 1992)にて実証された。この方法の使用により、特定の種類の細胞によ
って選択的に取り込まれる分子にDNAを結合することにより、DNA送達をある種類の標的細
胞に向けることができる。この方法は、細胞の受容体に依存し、該受容体は通常細胞外膜
をまたぐ蛋白質であり、その一部は細胞外に露出され、かつその一部は細胞質内に固定さ
れる。この種類の取り込みに適するためには、受容体は「エンドサイトーシス」と呼ばれ
る過程を経なければならず、これは、適当なリガンドが受容体に結合すると、受容体とそ
れに結合したリガンド両方が細胞内に引き込まれる過程が誘発されることを意味する。
エンドサイトーシスは、本発明の一面（エンドサイトーシスを活性化および促進させる
リガンドを同定する為に神経線維を使用する新規な生体内選別法）において相当な重要な
ので、以下により詳しく説明する。
３．他の非ウイルス遺伝子ベクター。ウイルスベクターには問題点及び制約があるので
、そしてカチオン化合物及び受容体ターゲティングリガンドベクターは、現在、標的細胞
による外来遺伝子の発現を誘導する点でウイルスベクター程に有効ではないので、研究者
は、細胞への遺伝子送達を高める方法を開発しようと試みている。１つのそのような試み
では、エンドサイトーシスを介して外来分子または粒子を細胞外膜を通して引き込まれる
ときに形成される「エンドサイトーシス小胞」を破裂できるウイルスのキャプシド蛋白質
を使用する。外来DNAは、遺伝子として機能し始める前に、エンドサイトーシス小胞から
脱出しなければならず、ある種のウイルス（例えばアデノウィルス）は、エンドサイトー
シス小胞を破裂させる進化したキャプシド分子を有し、これにより細胞質内で外来DNAを
放出させる。この種の研究例はCuriel 1997に記載されている。
他の分野でも他の様々な研究がなされているが、それらのどの試みも未だ遺伝子ベクタ
ー研究の主流には達していない。
ウイルスの中枢神経系への感染及びトレーサー研究
いくつかのウイルス（例えば狂犬病及びポリオウイルス）は中枢神経系組織内で神経細
胞から神経細胞に伝染するという特性があり、研究者が、ウイルス伝染を利用し、「神経
間追跡」を使用し、神経系および神経経路を追跡することを可能にした。
ポリオウイルスによる運動神経細胞の伝染パターンと、筋萎縮性側索硬化症患者の運動
神経細胞の退化パターンとの間には重要な類似性がある。同様に、アルツハイマー病の初
期特徴である前脳基底核のコリン作動性神経細胞の退化は、嗅上皮に狂犬病ウイルスを投
与した後の神経細胞損傷に対して重要な類似性を示す。これらの以前に発表されていない
観察がここに開示される。なぜなら、中枢神経系組織のウイルス伝染パターンと、ある中
枢神経系障害の神経変性パターンとが類似していることから、ここに開示される方法（す
なわちある神経細胞から、担体神経細胞と接点を共有する他の神経細胞に、ポリペプチド
を輸送し送達するために、治療ポリペプチドを頭脳又は脊髄へ非侵害的に送達する方法）
は、次の２つの見込みを提供するからである：（i）強力な治療上の処置；及び(ii)研究
者によって、例えば、頭脳又は脊髄組織内の遺伝子発現パターン及び／又は神経細胞機能
を選択的に変えるために、及び／又は中枢神経系組織内の様々なネットワーク及び原理、
例えばウイルス感染から神経変性疾患までに及ぶ攻撃に対する中枢神経系組織の反応を支
配する因子を研究するために、使用される強力な実験方法。
エンドサイトーシス表面分子
本発明の一面は、エンドサイトーシス過程（すなわち、細胞内部への外来分子の輸送)
を活性化させ、促進させるのに使用することができる「リガンド」分子の生体内(in vivo
)スクリーニングおよび同定のための新規な方法の発見および開示である。これらの種類
のリガンド分子は、特定の目標とされた種類の細胞へ有用な「運送物」又は「運搬物」分
子を引き込み、または運ぶのに使用することができる媒体、担体または輸送系とみなすこ
とができる。目的が、頭脳または脊髄組織、あるいは他の標的細胞にポリペプチドを送達
するという遺伝子療法または同様の遺伝子操作である場合、該運送物分子は、外来遺伝子
を有するDNAの一部分でも良い。但し、この種類のエンドサイトーシス送達は遺伝子療法
に限られず、特定の標的細胞種類に治療薬剤、診断化合物、または他の有用な薬剤を送達
するのに使用することができる。
この種類のエンドサイトーシス送達（取り込みとも互換的に言われる）は主に、細胞表
面にある「受容体」として知られる種類の蛋白質に関与する。但し、少なくともある種の
他の表面分子もエンドサイトーシス過程を誘発すると知られている（例えば、コレラ及び
破傷風毒素は、特定の表面炭水化物分子と特異的に結合して、それによって生じたリガン
ドと炭水化物の複合体の取り込みを活性化させ、促進すると知られている）。従って、こ
こでの参照のほとんどは、本発明の説明に用いられる典型的な分類としてエンドサイトー
シス受容体蛋白質に関するものであるが、他の種類のエンドサイトーシス表面分子もまた
、ここに論議されるエンドサイトーシスリガンドの標的として使用することができる。
細胞膜及びエンドサイトーシス受容体蛋白質の構造、またエンドサイトーシスの過程及
び機構は、Alberts et al, Molecular Biology of the Cellなど、様々な参考論文に記載
される。上記の第３版(1994)では、関連ページは478-488、618-625および731-744（細胞
膜及び受容体蛋白質）、618-626及び636-641（エンドサイトーシスにかかわる蛋白質およ
び過程）である。またエンドサイトーシスは、ピノサイトーシス（細胞内に取り込まれる
リガンドが比較的小さい場合）またはファゴサイトーシス（細胞全部またはウイルス粒子
などのより大きな物が細胞に取り込まれる場合）を含む。
エンドサイトーシス受容体蛋白質に結合する候補リガンドの全てが、エンドサイトーシ
スを促進して完了できるわけではない。例として、p75受容体として知られている重要な
種類の「低親和性」神経成長因子受容体がほ乳類で同定され、該受容体に結合できる単ク
ローン性抗体が多数の研究チームによって作製された。但し、それらの単クローン性抗体
系統の殆どはp75受容体に結合した後エンドサイトーシスを促進して完了することはでき
ない。ほんの少数の特定の単クローン性抗体のみがp75受容体によって取り込まれる。こ
れはChandler and Shooter 1984に最初に開示され、MC192抗体として知られている特定の
抗体系統を含み、その後p75受容体を有している細胞によって取り込まれるとYan et al 1
988によって報告された。
哺乳類細胞にエンドサイトーシス輸送をすることができるリガンドを同定するために相
当な研究がなされている。その研究の多くは、ファージおよびファージディスプレーライ
ブラリーと呼ばれる遺伝研究ツールを用いる。非常に簡潔には、ファージ（この単語はバ
クテリオファージの短縮語である）とは細菌に感染して、繁殖できるウイルスである。「
線維状ファージ」（「Ff」 と短縮される）として知られている長形の、ある種類のファ
ージが遺伝子研究者により研究開発された。なぜなら、生存可能で伝染的であるファージ
粒子の表面に、アクセス可能な（表示される）外来蛋白質を発現するよう設計ができるか
らである。
一系統の線維状ファージは、バクテリア複製開始点が含まれるよう処理され「ファージ
ミド」に変換された。そのDNAは、大腸菌細胞内で環状プラスミドとして二本鎖形態で、
または宿主細胞を殺さずに新しい伝染性ファージ粒子として分泌されるためにファージ被
膜蛋白質内に梱包される一本鎖形態で、多量に増殖することができる。このファージ系統
はまたカナマイシン耐性遺伝子を選択可能マーカーとして与えられ、これによりファージ
を保有する大腸菌は、非耐性細胞を殺す抗生物質であるカナマイシンを含んでいる培養液
中で増殖することができる。M13系統と呼ばれるこのファージ系統は市販されており、遺
伝研究に広く使用されている。
様々な研究者及び会社が、ファージ（例えばM13ファージ）の多数個体群が様々な異な
った外来蛋白質を表示するように処理されている完全な「ファージディスプレーライブラ
リー」を作製した。血液脳関門外に伸展する神経線維の表面の標的エンドサイトーシス受
容体に結合できるエンドサイトーシスリガンドを同定する生体内スクリーニング方法を作
製して試験する為に、本出願人は二つのファージディスプレーライブラリーを使用した。
該ファージディスプレーライブラリーの一つは、scFvライブラリーとして知られており、
約130億個のファージミドを含み、それぞれがヒト抗体の抗原結合性「可変断片」領域に
通常存在する外来ポリペプチド配列を含む。もう１つのファージディスプレーライブラリ
ーは、PhDC7Cライブラリーとして知られており、それぞれ「コンビナトリアルケミストリ
ー」と呼ばれる方法を使用してランダムに配列さた７アミノ酸を含む小さい外来ポリペプ
チド配列を含む。両ファージディスプレーライブラリーは下記の「詳しい説明」および「
実施例」に詳しく記載されている。
ファージディスプレーライブラリーは膨大な数の異なる「リガンド候補」又はその他の
ポリペプチド配列を選別する為の強力で有用な手段を提供する。それらを用いることによ
って、研究者は、特定の結合活性または細胞活性があるために対象となる外来ポリペプチ
ド配列を偶然に有する少数のファージを、膨大なライブラリーから同定し、単離し、次に
増殖させることができる。
但し、いくつかの細胞的及び生理学的な要因の為に、ファージディスプレーライブラリ
ーを生体内で（すなわち生きている動物体内で）スクリーニングすることは（従来技術の
下では）非常に困難又は完全に不可能であった。その代り、そのようなスクリーニングは
ほぼ全て、（固定化した抗原または抗体、または同様な結合性試薬を有する）アフィニテ
ィーカラム、又は（培養細胞を使用する）試験管内条件に限られた。
その結果、エンドサイト−シスを活性化し促進できるリガンド分子を同定し単離する試
みでは、本発明前には、癌細胞及び自己免疫病気に関わる細胞へ送達可能なリガンドの同
定において現実的及び実質的な進歩があり、それはそれらの２種類の細胞が試験管内細胞
培養で容易に育成及び試験することができる為であった。そのような研究の例は、米国特
許5,977,322 (Marks et al 1999), 6,113,898 (Anderson et al 2000), 6,376,170 (Burt
on et al 2002)及びPCT出願WO 2000-29004 (Plaksin), 2000-38515 (Ferrone)及び2000-3
9580 (Christopherson et al)である。神経細胞など他の種類の組織細胞へのエンドサイ
トーシス送達を促進するリガンドを同定する為にファージディスプレーライブラリーをス
クリーニングする場合、同様な成功的な進歩は認められなかった。
本明細者は神経細胞（特に血液脳関門をまたぎ、その外に伸展する線維を有する神経細
胞）を遺伝的に形質転換させる方法を捜していた。さらに、本明細者は、ウイルスベクタ
ーの医学的利用を阻止妨害する問題及び制限を知っていたので、細胞（特に、BBBをまた
ぎ、その外に伸展する線維を有する神経細胞）に外来DNA鎖を取り込ませることができる
他の種類の輸送及び送達系を捜していた。
これらの研究の全てが統一され、本発明をもたらした。近年の分子生物学及び神経科学
の大きな進歩にも関わらず、本発明前には、頭脳及び脊髄の神経細胞に治療効果を提供す
るために、侵襲的な損傷なしに血液脳関門を通して有用なポリペプチドを輸送するよりよ
い方法が依然として強く求められていた。
従って、本発明の一つの目的はBBB内の標的細胞にポリペプチドを送達する為の改良さ
れた非侵襲性方法を開示することである。
本発明のもう一つの目的は、BBBを「またぐ」感覚神経細胞又は運動神経細胞にトラン
スフェクションする新規方法を開示することであり、その方法でBBBをまたぐ神経細胞が
血液脳関門内に完全に位置する神経細胞に治療ポリペプチドを送達する。
本発明のもう一つの目的は、血液脳関門内に完全に位置する標的とする部分、領域又は
分類の神経細胞に選択的に影響を与えるように、遺伝子工学方法及び化合物を使用して、
中枢神経系組織にポリペプチドを輸送する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、選択した、標的とする、限られた種類及び分類の神経線維
、及び他の選択した標的とする分類の動物細胞内に効果的に「運送物」又は「運搬物」分
子（外来蛋白質をコードするDNA鎖を含むが、これに限定されない）を送達するのに使用
できるリガンド分子を同定し、単離する為の新しく、実用的な生体内方法を開示すること
である。
本発明のもう一つの目的は、選択した、標的とする、限られた種類及び分類の動物細胞
へ、治療薬剤、診断用もしくは分析用化合物、又はDNA配列を効率的に送達するのに使用
できるリガンド分子を同定し、単離する為の新規方法を開示することである。
本発明のもう一つの目的は、コンビナトリアルケミストリーによって作製された複数の
候補ポリペプチド又は他の化合物を含んでいるライブラリー、レパートリー、または他の
組合わせから、細胞内にエンドサイトーシス輸送を起こす特定の候補を同定し単離する新
規な生体内スクリーニング方法を開示することである。
下記の概要、図面、及び好適な実施形態の記載により、上記の及び他の本発明の目的が
より明白になる。
BBB内に完全に位置する細胞に外来ポリペプチドが接触するように、ほ乳類または他の
高等動物の血液脳関門(BBB)を通して、及び中枢神経系(CNS)内へポリペプチドを非侵襲的
に輸送及び送達する方法および化合物が開示される。この方法は、従来不可能であった人
間及び動物の治療方法を実現し、また家畜などにおいて商業目的に使用することができる
。
この方法は、血液脳関門を「またぐ」特定の種類の神経細胞に遺伝子ベクターをトラン
スフェクトする事によって達成される。そのようなBBBをまたぐ神経細胞の例は、感覚神
経細胞（例えば嗅覚受容体神経細胞および侵害受容神経細胞）及び運動神経細胞である。
自律神経系の節前神経細胞もまたある治療に有用かもしれない。BBB外に伸展する神経「
投射(projections)」にベクターを接触させトランスフェクションする為に、複数の遺伝
子ベクターを患者または動物に導入及び投与する。ベクターがBBBをまたぐ神経細胞の末
梢投射に導入された後、中枢神経活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する
ベクターが主細胞体へ逆行輸送によって運ばれ、そこでトランスフェクトされた神経細胞
により発現され、治療上または他の用途上有用なポリペプチド分子が生成する。これらの
ポリペプチドは通常細胞によって分泌される種類のものであり、又はそれらに分泌を促進
するリーダー配列を与えることもできる。従って、それらはトランスフェクトされた神経
細胞内で輸送され、BBBによって保護された中枢神経系組織内の一つ以上の部位で分泌さ
れる。BBB内のそのような位置で分泌されたポリペプチドは、血液脳関門内に完全に位置
する（従って保護された）標的神経細胞と接触できる。
この方法を使用して、神経栄養因子のようなポリペプチドをBBB内に完全に位置する標
的とした種類及び分類の神経細胞に非侵襲的に送達することができる。これは、老化、病
気、又は他の障害のために退化している又は損傷した頭脳及び脊髄神経細胞を治療する新
規方法を可能にする。あるいは、この新規方法により、神経活動を抑制できるポリペプチ
ドをBBBを通して輸送して、神経因性疼痛のような不必要な過剰の神経活動による障害を
抑制することができる。またこの方法は、中枢神経系内に内分泌機能を調節できるポリペ
プチドを送達する新規方法を可能にし、これにより、ヒトの様々な健康上の問題の治療法
を改善し、また家畜及び絶滅危ぐ種を含む動物などの成長、成熟、生殖または他の内分泌
に関連した機能を改善することができる。
さらに、神経線維内に取り込まれ、その中で送達されるエンドサイトーシスリガンドを
同定及び単離する為の新規な生体内のスクリーニング方法を開示する。このリガンドを用
いて、特定のBBBをまたぐ細胞にベクターを送達することができる遺伝子ベクターを調製
することができる。簡潔に述べると、このスクリーニング法は次の工程を使用する。(1)
複数の候補リガンドを、生存動物の体内において、候補リガンドが神経線維（ラット脚の
坐骨神経束など）に直接接触できるような第一部位に投与すること；(2)エンドサイトー
シスを活性化させ促進できる特定リガンドを神経線維が取り込むために必要な十分な時間
を与えること；(3)神経によって取り込まれなかった又は送達されなかったリガンド候補
を収集することを避けるために、リガンドのの投与位置から十分に遠い位置（ラット臀部
の坐骨神経の結紮部位の下流など）で神経線維の一領域を収集すること；及び(4)収集し
た神経領域から取り込まれたリガンドを取り出すこと。
この方法は、（ポリペプチドリガンドの）ファージディスプレーライブラリー、又はコ
ンビナトリアルケミストリー合成によって作製された他のリガンドレパートリーを使用し
て遂行できる。この方法は本発明の好適な実施態様であるので、これを開示及び特許請求
する。
発明の詳細な説明
上記概略に示されたように、本発明は４つの明瞭な要素又は成分を有する。この４つは
全て、本発明を首尾よく遂行するために、協調的かつ連続的な方法で共同的に機能しなけ
ればならない。それらの４要素は、下記に番号順に概説したとおりである。
(1)適当な遺伝子ベクターは、少なくとも１つの望ましい「運送物遺伝子」を含むDNA配
列、あるいはマーカー遺伝子（研究における検出および分析を簡易化するため）及び／又
は運搬物遺伝子(治療上その他の望ましい有用なポリペプチドをコードする）を含むDNA配
列を保有する。この種のベクターを用いて、(2)血液脳関門をまたぐ一つ以上の特定種類
の神経細胞（例えば嗅受容体神経細胞、下部運動神経細胞）にトランスフェクトする。運
送物遺伝子は、BBBをまたぐ神経細胞に入った後、神経細胞により逆行輸送と呼ばれる自
然な過程により神経細胞の細胞体に運ばれる。主要細胞体に達した後、遺伝子が発現され
、それにより(3)BBBをまたぐトランスフェクトされた神経細胞内で「外来性」または「外
因性」ポリペプチド分子が形成される。このような外来性分子（場合により、患者内で十
分に生産されない「内在性」または「天然性」ポリペプチドと同一であってもよい）は、
トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に位置する分泌部位に輸送され
る。次にポリペプチド分子は、トランスフェクトされたBBB をまたぐ神経細胞によりBBB
内に位置する分泌部位で分泌される。この分泌により、外来性ポリペプチドは、(4) BBB
内に完全に位置するその他の「標的」中枢神経系神経細胞又は他の細胞に接触する（そし
て治療上またはその他の有用な方法で治療、調節または影響を与える）。
以下では、ウイルス由来ベクターを用いて、この治療方法を説明する。但し、後に説明
するように非ウイルスベクターもまた使用可能である。
該治療方法を説明する最初の例が、三図面すべてに共通の指示番号を用いて、図１〜３
に説明される。図１は「巨視的」に該治療を示す。遺伝子ベクター100を多数含んでいる
液体を患者80の鼻洞に導入する。該ベクターは嗅受容体神経細胞200の露出された「末梢
投射」212（図３参照）に接触する。これらの神経投射は鼻洞内の表面でアクセス可能で
あり、臭感覚にかかわる生化学的な過程の１つとして様々な空気中の化合物と直接接触す
る。
図3 に別スケール（微視的、細胞レベル）で示されるように、遺伝子ベクター100 によ
って運ばれたDNA が神経投射212に入ると、逆行輸送（後述する）によって主細胞体224に
運ばれる。この例の遺伝子ベクターは、鼻受容体細胞を十分に感染する種類のウイルスに
由来するので、該ベクターDNA（不活性だが感染性であるウイルスゲノム内に挿入された
単なる１成分として図２に示される運送物遺伝子160を保有する）はこの過程を促進する
。従って、感染性ウイルスを用いてベクター送達系を作製することにより、図３に示され
るように、少なくともいくつかのトランスフェクトされた神経細胞において、確実に運送
物遺伝子160からメッセンジャーRNA 鎖299が転写される。
トランスフェクトされた神経細胞200内において、リボゾーム226 が関与する正常な細
胞機構によって、運送物遺伝子160から転写されたmRNA 鎖は、複数個の外来ポリペプチド
分子300に翻訳される。
自然な輸送及び分泌機構のため（所望ならば、遺伝子工学技術によりポリペプチド鎖の
末端に一つ以上特別な輸送配列又は分泌配列を追加することにより実現または増強するこ
とができる）、外来ポリペプチド分子300の少なくともいくつかは（順行輸送と呼ばれる
過程によって）BBBをまたぐ神経細胞200の様々なシナプス末端242（又は他のペプチド分
泌部位）に輸送される。
BBB により保護された中枢神経系組織内に完全に位置する上記部位で、BBBをまたぐ神
経細胞200により、外来ポリペプチド分子300 が放出される。この分泌過程により、分泌
された外来ポリペプチド分子300 は、「標的」神経細胞と称するその他の分類の神経細胞
に直接に接触する（そして治療効果またはその他の調節効果を与える）ことができる。こ
れらの「標的」神経細胞はBBB 内に完全に位置する。図１及び３の模式図の説明では、後
述するように、ポリペプチドは、種々の「標的」神経構造を含む「糸球体」910と呼ばれ
るほぼ球状の構造体内で、トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞200により分泌され
る。
この過程を簡単に述べると、上記概説及び図１〜３は、どのようにして、(1)運送物遺
伝子を運ぶ遺伝子ベクたーを用いて(2) BBBをまたぐ神経細胞をトランスフェクトし、(3)
外来ポリペプチドが発現され、次にBBB内の中枢神経系組織内に分泌され、そこで(4) BBB
内に完全に位置する「標的」中枢神経系神経細胞に接触するかを示す。
この４つの要素はそれぞれ以下により詳しく記載される。遺伝子ベクターの最適設計は
、トランスフェクトされる特定の種類のBBBをまたぐ神経細胞に依存するので、最初に、B
BBをまたぐ神経細胞を説明する。
BBBをまたぐ神経細胞の種類
BBB をまたぐ神経細胞は大きく３種類に分けることができる。感覚神経細胞、運動神経
細胞、および自律神経節前細胞である。ここに考察されるこれらの種類のBBB をまたぐ神
経細胞のすべては広く研究され、これらの種類の神経細胞それぞれをトランスフェクトす
る為に使用することができる遺伝子ベクターは知られている。
最初に記載されるBBBをまたぐ神経細胞の主な分類は感覚神経細胞であり、それは、視
覚、嗅覚、味覚、および接触、疼痛、肢の位置などの様々な感覚に直接かかわる「前線」
の細胞である。
感覚神経細胞は、BBB外にある表面または組織領域（またはその極近傍)に伸びる特別の
部分（「末梢投射」と称する）を有する。「末梢投射」は、遺伝子ベクターが最も直接に
アクセス可能である、BBBをまたぐ神経細胞の一部である。末梢投射に接触するために遺
伝子ベクターはBBB を通過する必要はない。
逆に、用語「中枢投射」は、主細胞体から離れて伸展する神経細胞の線維状の部分を指
し、これはさらに、(i)多くの種類の感覚神経細胞のように主細胞体がBBB外にあれば、Ｂ
ＢＢ内まで；又は(ii)運動神経細胞及び自律神経節前細胞のように主細胞体がBBB内にあ
れば、頭脳中心又は脊髄上部近くまで、伸展する。
中枢又は末梢投射に関連して、用語「軸索」に注意されたい。殆どの場合、「軸索」と
は主神経細胞体から出現する単一の最も大きく、最も長い投射を指す。但し、多くの感覚
神経細胞は２本の軸索を有し、一方は末梢に伸展し、もう一方は頭脳中央部に伸展する。
殆どのBBBをまたぐ神経細胞の主要な役割の一つは末梢神経系と中枢神経系との間で神経
インパルスを往復することであるので、実際にBBB を通過するBBB をまたぐ神経細胞の当
該部分は、殆どの場合適切に軸索と分類することができる。
BBBをまたぐ４分類の神経細胞が、本明細書に開示した使用方法において考慮に値する
。そのうち２分類は、感覚神経細胞である(i)嗅受容体神経細胞と(ii)侵害受容性（疼痛
信号伝達性）神経細胞である。３番目の分類は、主に筋骨格制御にかかわる運動神経細胞
であり、細胞体が脳幹にあるために特別な関心がある舌の運動神経細胞と呼ばれる亜分類
を含んでいる。４番目の分類は、「自律神経節前細胞」と呼ばれ、これらの神経細胞の遺
伝子変化は自律神経系に影響を与える可能性があるので、ほとんどの人間医学的利用のた
めには大して有望な候補ではない。但し、ある種の病状の治療や種々の研究のために有用
でありうるので認識すべきものである。これら４分類それぞれを次に別々に考察する。
嗅受容体神経細胞
本使用に好適なBBBをまたぐ神経細胞の分類の1つは嗅受容体神経細胞である。嗅覚の役
割のため、それらの末梢投射は鼻洞の内部表面に露出され、アクセス可能であり、鼻を通
して吸引される様々な空気中化合物により直接に接触および活性化される。
これらの神経細胞は様々な生理学の教科書、例えばGuyton and Hall著、Textbook of M
edical Physiology第９版(1996)、ページ678-681に、またページ681-682の引用文献に記
載されている。非常に簡潔に説明すると、人間の嗅覚膜には約2.5平方センチの表面積が
あり、通常約１億個の受容体神経細胞がある。各嗅受容体神経細胞の露出された先端には
、繊毛と呼ばれる通常約６〜12本の極小の毛があり、これは数ミクロン下方の粘液層に伸
展する。臭気の認識を誘発するほとんどの分子は、繊毛及び／又は受容体神経細胞の露出
された表面膜をまたぐ受容体蛋白質と相互作用すると推定される。臭いの感覚を誘発する
殆どの分子は神経細胞本体に侵入しないが、少数の特定の種類の分子（例えばほとんどの
糖蛋白質に非特異的に結合するコムギ胚芽凝集素など）は、おそらくある種のエンドサイ
トーシスによって嗅受容体神経細胞内に取り込まれ、輸送される。また、いくつかの公開
報告によると、アデノウイルスベクターを、嗅覚膜への接触を介して、嗅受容体神経細胞
にトランスフェクトする（外来遺伝物質を挿入する）ことできる。これは、トランスフェ
クトされた神経細胞によるマーカー遺伝子の発現によって示された。
図３に模式的に説明するとおり、嗅容体神経細胞200はいくつかの細胞部分から成り、
それらが一つ以上の遺伝子ベクター100と相互作用する。鼻洞膜90は明確な層として模式
的に示されており、嗅上皮の嗅支持細胞の露出された頂上表面から構成される。神経投射
210は鼻洞膜90を通過し、露出された末端212（粘膜先端、終端、またはノブともいう）を
形成する。この露出された神経先端212は鼻腔洞内に存在するので、液体の鼻へのスプレ
ーによって運ばれる本遺伝子ベクターは神経先端212に接触することができる。
嗅受容体神経細胞200は、細胞質220、主細胞体224内に位置する核222、mRNAをポリペプ
チドに翻訳するリボゾーム226、および血液脳関門(BBB)を通過する軸索240から成る。
背景技術で注記したように、BBBは単一の膜構造でなく、その代り、毛管壁を形成する
内皮細胞間に非常に密な接着を有する毛管壁ネットワークである。何人かの学者は、嗅上
皮（鼻洞中の、嗅受容体神経細胞の投射を有する粘性膜表面）は頭脳の延長とみなすこと
ができ、従ってそこはBBBが存在しない中枢神経系組織の一領域であると主張しているが
、生理学的な研究から、嗅糸球体がBBB内に完全に位置しており、そして誤った不要な神
経インパルスを誘発するかもしれない不要な分子から、BBB によって保護されていること
が明らかである。その事実を示すために、図１では二重破線900を用いてBBBを模式的に示
す。嗅受容体神経細胞200の末梢投射210及び主細胞体224はBBB外に位置するが、軸索240
はそれを通過して、BBBにより保護された中枢神経系組織内に位置する多数のシナプス末
端242に分岐する。従って、嗅受容体神経細胞200 はBBB をまたいでいる。
嗅受容体神経細胞200 のシナプス末端242 は、図３で「糸球体」910と示されたほぼ球
形の構造体に位置する。ヒトには数千の糸球体があり、各糸球体は嗅受容体神経細胞から
のほぼ25,000本の軸索のシナプス末端を含んでいる。各糸球体910 は、大きな「僧帽」細
胞及び小さな「房飾」細胞からの数千の樹状突起及び投射920 の末端でもある。僧帽及び
房飾細胞の細胞体および樹状突起は糸球体に位置するように表示されるが、それらの主細
胞体は糸球体の上にある球根構造に位置する。さらに、各糸球体（又は糸球体に密接する
周囲領域）は、神経細胞930（これは、前脳基底核に位置し、興奮性神経伝達物質のアセ
チルコリンによって主に活性化されるために「前脳基底核コリン作動性神経細胞」と呼ば
れる）から下に伸展する（突起と呼ばれる）長い線維932の先端に位置する末端934 もま
た含んでいる。
図３の模式図は選択的な説明図であり、標的神経細胞構造全てを説明するものではない
。例えば、糸球体内又は近辺には次の線維からの末端が見つかる：(i) 主細胞体が中脳部
分にある縫線核と呼ばれる脳領域の「セロトニン作動性」神経細胞から伸びる線維；及び
(ii)青班核と呼ばれる頭脳部分に主細胞体が位置する「ノルアドレナリン作動性」神経細
胞から伸びる線維。送達される治療ポリペプチドに応じて、BBB内に完全に位置する上記
又は他の神経細胞が、ここに開示する治療の標的とされる。
一般的には、トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞200から放出されたポリペプチ
ドは、いわゆる「トランスシナプストレーサー研究」（例えばLafay et al 1991; Barnet
t et al 1993)により、ウイルス感染した嗅受容体神経細胞から放出されたウイルス粒子
によって感染されることが判明したあらゆる（又はほぼあらゆる）種類の神経細胞に接触
して、調節効果を発揮することが予想される。そのような神経細胞は、例えば、僧帽細胞
及び房飾細胞（これらは非常に多数の末端 が糸球体にあるので多数が感染する）、並び
に少なくともいくつかの前脳基底核コリン作動性神経細胞、縫線核セロトニン作動性神経
細胞、及び青班核ノルアドレナリン作動性神経細胞（これらはトレーサー研究で感染が示
された）である。
種々の「グリア細胞」もまた、嗅受容体神経細胞200から分泌されるポリペプチド分子3
00と接触しうる。以下に詳述するように、グリア細胞（ニューログリア細胞とも呼ばれる
）は、神経信号を受信または送信することができず、代りにBBBにより保護される中枢神
経系組織内に位置する神経細胞を支持および支援する種々の細胞を含んでいる。
従って、ここでは用語「標的細胞」は、BBB により保護された中枢神経系細胞内に完全
に位置し、そして遺伝子ベクター100の運送物遺伝子によってコードされる外来ポリペプ
チド分子300の所望の「標的」である細胞を参照するの使用される。実際に遺伝子ベクタ
ーによって接触されトランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞は、ここでは標的細胞
とみなされない。その代り、そのようなBBBをまたぐ神経細胞は送達機序の一部として見
なされるべきであり、「送達細胞」、「トランスフェクション経路」、またはトランスフ
ェクトされた「一次」神経細胞として参照される。
嗅受容体神経細胞が送達経路として使用される場合、もう一つの生理学的な要因が重要
になる可能性があり、認識されるべきである。嗅受容体神経細胞は次第に死滅し、新しく
生成した神経細胞によって絶えず置換されている。マウスでは、嗅受容体神経細胞の「半
減期」は約３か月であり、ヒトの半減期とほぼ同等であると推定される。
従って、嗅受容体神経細胞が遺伝子ベクターによって安定に形質転換されても（すなわ
ち遺伝子ベクターにより一つ以上の外来遺伝子が嗅受容体細胞の染色体に挿入されても）
、それにかかわらず形質転換された細胞は次の数週および数月にわたって次第に死滅する
。その結果、使用したポリペプチド及びベクターの種類、及び特定の患者に望まれる効果
に応じて、数週間ごとに患者に追加ベクターを再投与する必要があるかもしれない。
侵害受容性神経細胞
BBBをまたぐ感覚神経細胞の別の分類は、身体及び皮膚から脊髄に疼痛信号を送信する
。これらの神経細胞は侵害物質、信号、または環境事象に応じて神経インパルスを発生さ
せる。従って、これらは、皮膚が切断され、擦られ、打撃され、または非常な高温か低温
にさらされた場合に、疼痛感又は不快感を発生させる過程を始める神経細胞である。これ
らの疼痛信号を送る神経細胞は、通常「侵害受容体」または「侵害受容性」神経細胞と呼
ばれ、時によって、ノーシセプター又はノーシオセプターと呼ばれる。侵害受容性神経細
胞は、背根神経節の一部分である、異なる機能を有する数種類のBBB をまたぐ感覚神経細
胞の1 つである。
図4 は、非常に模式的に侵害受容体神経細胞400を表示する。殆どの他の感覚神経細胞
のように、この神経細胞400は、その主細胞体402を、BBB外の、BBBにより保護されない組
織領域に有する。侵害受容体神経細胞400の場合、主体402は脊髄480に比較的近い背根神
経節内に位置する。この神経細胞は、脊髄480から外へ皮膚まで伸展する末梢投射410を有
する（他の投射は身体内のより深い別の領域に伸展する）。この末梢投射410 は、皮膚表
面405直下の浅い組織層に、多数の「表面近辺末端」412を分岐する。
反対方向には、侵害受容体神経細胞400は、血液脳関門を通過する軸索420を有する。図
4Bに示すように、軸索420は、脊髄480 のBBBにより保護された中枢神経系内で、突起422
、424及び426（図4Bに示す)に分岐する。各突起は、脊髄480内で侵害受容体神経細胞が「
二次」神経細胞に疼痛信号を送信するように、一つ以上のシナプス接続で終わる 。
横断面として示される脊髄480 の表面には、(i)患者の前方に位置する腹側正中裂482(
または前正中裂と呼ばれる）；および(ii) 2 つのより小さい後外側溝（又は後中間溝）
に挟まれた背側正中溝484(また後正中溝と呼ばれる）がある。脊髄480 の本体は「灰質」
490 を囲む「白質」486から成る。灰質490 は左右の前角492 、及び左右の後角494 から
成る。この4 つの角はすべて灰質交連 と呼ばれる中央部分に接続される。図4及び5 に示
されるように、脊髄から側方に出る神経線維の大束は通常、後根（又は背根）及び前根（
又は腹根）と呼ばれる。用語「神経節」は、一般に中枢神経系の外にある神経細胞体の集
合を指し、これらの神経束を参照するのにも使用される。
皮膚表面405 が切られるか、または擦られると、神経信号が、侵害受容体神経細胞400
の表面付近の末端412から始まり、末梢投射410 を通り、細胞体402 を通り、BBB を通過
する軸索420を通り、脊髄480 の後角494内部 の分岐した樹状突起422-426に到る。樹状突
起422-436の先端シナプスから神経伝達物質が放出され、それが脊髄神経細胞の神経イン
パルスを誘発する。その神経インパルスは脊髄の上に移動し、頭脳内の処理センターに至
り、到着した神経信号は、頭が疼痛として解釈するように処理される。
様々な医学的な問題が「神経因性疼痛」として分類されている。名前が示すように、神
経因性疼痛は、不必要で過剰な疼痛信号を発生させる様に神経細胞に影響を与える病理学
的状態に関わる。これは、しばしば、慢性及び不適当な疼痛反応を生ずるBBB内神経接続
の解剖学的再構成に関わる。用語「痛覚過敏」もまた「過剰な疼痛」の同義語として用い
られ、「異痛症」もまたこの症状に使用される。
神経因性疼痛は、有名な医学的な問題の集合体であり、この広い分類には、糖尿病性神
経障害、切断された肢または指からの「幻肢痛」、くも膜炎 、三叉神経疼痛、伝染後疼
痛（例えばヘルペスゾスターウイルスにより引き起こされる「帯状疱疹」の発生）、そし
て外傷性傷害及び手術後に起こる、通常の回復期間の後でも退かず長引く慢性疼痛が含ま
れる。灼熱痛（カウザルギー）はもう一つの種類であり、焼けるような感覚に関わる（根
単語の「カウザ」は 「焼灼」と同じ根源に起因し、カウゼーション（原因）とは全く関
係ない）。他の種類の神経因性疼痛もまた知られており、神経因性疼痛には広範囲の強さ
があり、迷惑程度から始まり、衰弱的、耐え難い、又は非常に激しい痛みまで及ぶ。実際
、神経因性疼痛は多くの自殺の重要な要因であり、慢性及び不治の疼痛はとても強く、無
情であり、多くの患者が自殺する。
多くの種類の神経因性疼痛に広く関わると信じられる細胞的機序が図4Bで説明される。
この模式図では、軸索420NPは、神経病理学的な問題に関与して、あまりに多くの樹状突
起422、424、426を発芽し、脊髄480NP の後角にある脊髄神経細胞432、434、及び436と相
互作用を始める（そのいくつかが不適当かもしれない）。単一の侵害受容体軸索からのあ
まりに多くの樹状突起の発芽及び慢性活性化は、疼痛に侵された脊髄480NP 内へ及びそれ
を通過して、あまりに多くの疼痛信号の伝達を引き起こし、または悪化させる。疼痛送信
性の神経細胞が関与するあまりに多くの神経接続状態は、図4Bで示されており、「過剰神
経支配」と呼ばれる。
図4A〜4Cおよび以下に説明されるように、本発明は、患部またはその近傍に、侵害受容
性神経細胞をトランスフェクトする遺伝子ベクターを投与することによって、神経因性疼
痛を制御および軽減する方法を提供する。図4Aにベクター100NPCとして示されるこの種類
のベクター（「NPC」は「神経因性疼痛制御」を意味する）は、後述するように、神経活
動を（増加よりもむしろ）抑制するように設計された「NPC」運送物遺伝子を有する。
侵害受容性受容体は皮膚下の浅い領域に位置するので、皮下、筋肉内、又はその他の比
較的浅い注入が好ましい投与経路である。あるいは、局所的及び他の投与方法もまた評価
することができ、例えば(i)ジメチルスルホキシド、メシルサリサイレート等のような組
織浸透促進剤を含んでもよい、ベクターを含む軟膏、クリーム、その他の溶液または懸濁
液の局所的適用；(ii)荒らされた、すり減らされた、または別の方法で物理的処理された
皮膚領域への、ベクターを含む製剤の局所的適用；及び/又は(iii)「皮はがし」処理に使
用される化学薬品等により化学的に処置された皮膚への、ベクターを含む製剤の局所的適
用である。
さらに考察のために、神経因性疼痛制御のために遺伝子ベクター100NPCを含んでいる液
体を、皮下の浅い部分で、患者によって最も強く神経因性疼痛を感知する明白な「焦点」
（位置、座位、ホットスポットとも呼ばれる）の皮膚に、またはその近辺に注入すること
を考える。上記のように、ベクター100NPCは神経活性を（増加よりもむしろ）抑制するよ
うに設計されている遺伝子を含む。そのような抑制遺伝子は例えば次のものをコードする
：(i)一つ以上の種類の神経栄養性又は他の神経刺激性ペプチド又は化合物に結合して不
活性化する単クローン抗体（または抗体断片）；又は(ii)神経刺激に関わる一つ以上の種
類の神経細胞受容体に競合的に結合し、占有し、そして遮断するペプチド断片。NPC遺伝
子は（逆行輸送を介して）侵害受容性神経細胞の細胞体402に送達され、そこでその遺伝
子から上記複数のNPCポリペプチドが発現される。次にNPCポリペプチドは、神経軸索420
により（順行輸送を介して）BBBを通過して、過剰神経支配状態（脊髄内の成分を有する
）により誘発または悪化され疼痛に侵されている脊髄480NP内に送達される（図4B参照）
。
NPC ポリペプチドは、脊髄内の過剰神経支配状態部位又はその近辺で、BBBにより保護
された脊髄組織内に放出される。抑制効果を出すことによって（高神経活性を刺激または
維持する細胞作用剤又はその過程を結合、阻止、競合または抑制することによって）、NP
C ポリペプチドは、処置の種類に応じて永久に、あるいは数日間または数週間、神経因性
疼痛の病状を減少および軽減することを促す。
運動神経細胞
BBBをまたぐ神経細胞の別の分類は、運動神経細胞と通常呼ばれる。これらはに主に中
枢神経系から身体の筋肉に指示を送信し、骨格筋系を「神経支配」し、筋肉を中枢神経系
の制御下に置く。通常「脊髄運動神経細胞」と呼ばれる運動神経細胞の１つの主要な亜分
類は、その細胞体を脊髄内に置き、BBBを通して伸展して末梢神経細胞および筋肉に接触
する投射を持つ。
図５（図5A〜5C）は、「トランスフェクション経路」としての脊髄神経細胞の使用を模
式的に示す。この経路を介して、BBB内に完全に位置する上位運動神経細胞に治療ポリペ
プチドを送達することによって、脳卒中発作、外傷性傷害、神経変性疾患または同じよう
な原因のために衰弱した肢を持つ患者の筋肉の神経制御を刺激し高める。図5Aは脊髄520
のBBBにより保護された組織に細胞体502を有する脊髄神経細胞500 を示す。脊髄520 には
図4Aで示されているのと同じ構造があり、運動神経細胞の細胞体502 は前角522 の灰質内
に位置する。脊髄運動神経細胞500 の軸索はBBB を通過する長い「突起」504を形成し、
筋線維束550 まで伸展する。筋線維束550 内で、神経軸索又は突起504は樹状突起及び末
端506に分岐し、（健康な人では）筋肉組織と相互作用して必要時に筋肉収縮を誘発し、
そのため腕、足等の「随意運動制御」を提供する。
図5Bは脳卒中発作、又は頭脳もしくは脊髄の損傷、又は神経変性疾患（筋萎縮性側索硬
化症など）、又は腕もしくは足の随意的運動制御を損なった同じような病気等に苦しむ患
者の3 つの別個の脊髄神経細胞の細胞体（512、514、516と示される）を模式的に示す。
この機能障害状態は、少なくとも3 つの運動神経細胞の細胞体の上位に位置する頭脳又は
脳幹内の上位運動神経細胞の死滅又は損傷が少なくとも一因である。脊髄神経細胞細胞体
512-516の上に位置する頭脳または脳幹内の死滅又は損傷した上位運動神経細胞のいくつ
かは、脊髄神経細胞512 及び516 に神経インパルスを供給していた。図5Bに図示するよう
に、様々な上部運動神経細胞が損傷又は死滅すると、突起532 及び536（図5B の点線）は
静止し、退化を開始し、その結果、3 つの脊髄運動神経細胞のうち1 つだけ（中心突起53
4）が、上位運動神経細胞から来る神経信号の活動的な供給を受ける細胞として残る。2
つの運動神経細胞512 及び516 はもはや神経インパルスを受信しないので、静止及び不動
化し、長期間にわたり萎縮し、変質し、そして死滅する危険にさらされる。
図5Cは、もはや普通に作動しない筋肉束550 に、複数の遺伝子ベクター100 を含んでい
る液体を注入した後のこの症状治療結果を模式的に示す。ベクター100 は、神経栄養性因
子又は神経活動もしくは細胞分裂を刺激する他のポリペプチドをコードする治療遺伝子を
含む。ベクターに含まれる遺伝子は細胞体512-516に輸送され、その遺伝子から神経刺激
性ポリペプチド分子が発現する。次に、これらのポリペプチドは3 つの運動神経細胞によ
って分泌され、信号として機能して、近辺のまだ生存可能で活性である神経細胞、例えば
活動的な突起534 を持つ上部運動神経細胞、の付加的な樹状突起の成長及び/又は活性化
を刺激し誘引する。これにより、活動的な突起534は付加的な突起534a及び534cを発芽し
、他の神経細胞とシナプスを形成することができる。付加的な新しく発生したシナプス接
続は、その後、脊髄運動神経細胞512 及び516 からの突起を再び活性化させ始める。理学
療法及び運動療法と組み合わせると、これは、患者の腕もしくは足のより良い自発的な制
御の回復につながる。
舌運動神経細胞
本発明に非常に有用かもしれない運動神経細胞の１つの亜分類は、BBB を通して伸展し
て舌筋肉を支配する投射を持つ。これらの「舌運動神経細胞」は、摂食、会話の為の舌の
動きを制御する。細胞体は脳幹の中にある。従って、それらは中枢神経系 の脳幹部分に
外来ポリペプチドを送達する為の有望な経路を提供する。
図6は舌運動神経細胞600 を示す。これは、細胞体602を脳幹950 内に有し、さらに患者
60のBBB を通過し、舌62の中で終わる長い末梢投射604を持つ。神経投射604 のアクセス
可能な先端は、舌62に注入される担体液体を介して遺伝子ベクター100Aと接触する。
そのベクターDNA は、神経投射604 を通して細胞体602 に逆行輸送される。運送物遺伝子
から治療ポリペプチドが発現し、脳幹内の領域に舌運動神経細胞600 から分泌される。こ
れらの分泌されたポリペプチドは脳幹950 に位置する他の様々な神経細胞952 及び954 に
接触し効果を出す。
自律神経節前細胞
BBBをまたぐ神経細胞の最後の主要な分類は、自律神経節前細胞と通常呼ばれる。運動
神経細胞と同様に、細胞体はBBB内に位置する。軸索はBBB を通過して伸展し、交感神経
及び副交感神経細胞と接続する。「自律」系の一部として、これらの神経細胞は意識制御
下にない様々な機能の制御にかかわる（例えば血圧、消化、排泄、発汗）。
用語「節」は神経細胞の集まりを意味する。従って、「節前」神経細胞とは、細胞体が
中枢神経系内に塊（また核と呼ばれる）として存在し、その軸索がBBB通過して投射されB
BB外にある神経節に存在する神経細胞を神経支配し接触する細胞を含む。
本発明の方法および遺伝子ベクターは、自律神経節前細胞を遺伝的にトランスフェクト
する為に、適宜、適用および使用する事ができると考えられる。少なくともある場合では
、そのようなトランスフェクトされた自律神経節前細胞は、脳幹及び/又は脊髄に、更に
おそらく他のBBB 内に完全に位置する中枢神経系神経細胞に、外来ポリペプチドを輸送し
送達すると考えられる（一般的支持データにつき、例えばPickard et al 2002参照）。
但し、感覚神経細胞及び運動神経細胞は、少なくとも本発明の開発初期には、操作及び
分析が幾分し易いことが認識されるべきである。これは複数の要因のためである。一方で
は、感覚及運動神経細胞の投射は、露出したアクセス可能な表面部位（又はその近傍に）
（嗅覚神経細胞の場合）、また、比較的浅い筋肉及び皮下領域（又はその近傍）に実際に
達する（疼痛送信性及び運動神経細胞の場合）。対照的に、自律神経節前細胞末端は、自
律神経節内の皮膚表面下の奥深くに達する。従って、自律神経節前細胞を、BBBをまたぐ
「トランスフェクション経路」として使用する場合、正確なベクター送達を行うことは、
感覚又は運動神経細胞よりもいくらか技術的に困難である（またいくらか危険である）。
その為、実施例及び本文の殆どは、本発明を説明するために、遺伝子ベクターによって
トランスフェクトされるBBB をまたぐ神経細胞として、感覚神経細胞又は運動神経細胞を
使用することに集中する。当該種類のBBB をまたぐ神経細胞は、一般に本発明の初期開発
および試験の好適な候補であると考えられる。しかし、自律神経節前細胞は、BBBをまた
ぐ「トランスフェクション経路」として利用可能であり、最終的に種々の治療又は他の処
置に非常に有用となるかもしれない。
遺伝子ベクター
上に要約した様に、一つ以上の有用な「運送物」遺伝子（マーカー遺伝子及び/又は運
搬物遺伝子を含みうる）を運ぶ遺伝子ベクター（例えばウイルスベクター、リポゾーム、
そしてBBBをまたぐ神経細胞上のエンドサイトーシス受容体を標的とするリガンドベクタ
ーなど）は、一つ以上のBBB をまたぐ神経細胞へのベクターDNA(有用な運送物遺伝子を含
む)のトランスフェクションを促進するように、BBBをまたぐ神経細胞の末梢投射に接触す
る。そのような神経細胞内に入ると、少なくとも複数の運送物遺伝子は、自然な逆行輸送
過程によって、投射を通して主細胞体に送達される。細胞体内に入ると、正常な細胞内機
構によって、運送物遺伝子から、遺伝子にコードされたポリペプチドが発現される。
注目する殆どのポリペプチド（神経成長因子など）は、ホルモンもしくは成長因子とし
て機能するものであり、必要な機能を遂行するために通常自然に細胞から分泌されなけれ
ばならないので、そのようなポリペプチドは、トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経
細胞により発現される場合、そのトランスフェクトされた神経細胞からの分泌に適するも
のであろう。
従って、本発明は、BBBをまたぐある種類の特定中枢神経系神経細胞をトランスフェク
トすることができる遺伝子ベクター類を開示し、それにより、トランスフェクトされた神
経細胞は有用な治療ポリペプチドを発現し、そして通常は血液脳関門により外来ポリペプ
チドから保護された中枢神経系組織内に分泌する。
図2 はウイルスベクター100 を模式的に示す。このベクターは3 つの主要成分を持つ：
外殻部分110 、結合リガンド蛋白質120、及びゲノム150（図2では二重鎖DNA 又はdsDNAと
示される）。
脂質性「外被」が無いウイルスベクター（アデノウィルス由来ベクターなど）では、外
殻部分110 は、相互に半連結式にかみ合うキャプシド蛋白質112 から成る。そのようなベ
クターの蛋白質「殻」は通常キャプシドと呼ばれ、結合リガンド蛋白質120 は通常各ウイ
ルス粒子の外面に露出したキャプシド蛋白質のドメインに過ぎない。
他のウイルスベクター（ヘルペスウイルス由来ベクターなど）では、外殻部分（通常「
外被」と呼ばれる）は脂質から成り、通常は、殆どの哺乳類細胞の外膜を構成する脂質二
重層に匹敵する二重層として形成される。そのようなベクターでは、結合リガンド蛋白質
120 は通常外被層をまたぎ、各蛋白質の外部突出は外側へ伸展し、そのため細胞表面蛋白
質に接触し結合できる。
脂質外被があるかどうかにかかわらず、ウイルスの結合リガンド120 は、その種のウイ
ルスが感染できる細胞の表面の相補的な蛋白質に付着する（抗体抗原間の結合反応と同等
な非共有結合様式で）。ある種のウイルス（及びそれらから得られるベクター）は、非常
に特異的な結合リガンドを有する。これらの種類のウイルスは、相補的な表面蛋白質を有
する種類の細胞にのみ感染する。別の種類のウイルス（及びそれらから得られるベクター
）は、より特異性の低い結合リガンドを有し、より広い種類の細胞と結合し感染する。
図2 に示すベクター100 によって運ばれるベクターゲノムは、二重鎖DNA (dsDNA)から
成る。別の種類のウイルスベクターは、一本鎖DNA または二重鎖RNA を運ぶことができる
。様々な遺伝子ベクターには4 つの分類のゲノムが知られ、そのようなベクターはどれで
も、ここに開示されるように使用できる。dsDNAを運ぶ一般的なウイルスベクターのゲノ
ムは、本発明の早期評価のための望ましい候補である。実験室での合成遺伝子又は単離遺
伝子の処理では、ssDNA（相互の固有の塩基誘引ため「粘着的」である）又はRNA（DNA よ
り幾分不安定である）よりdsDNA が使いやすい。従って、今までに開発されたウイルスベ
クターの殆ど（ヘルペスウイルスもしくはアデノウィルスから得られるベクターなど）は
dsDNA ゲノムを含んでいる。
ウイルスベクターの使用のために開発された慣用的な専門用語を使用すると、ウイルス
ベクター（また他の種々の遺伝子ベクター）によって運ばれるゲノム150は、いくつかの
「ドメイン」から成る。一つ以上の「運送物遺伝子」160 は、一般にはウイルスゲノムの
中に挿入され、これによりウイルスゲノムがトランスフェクトされた細胞内に入った後、
ウイルスゲノムの両端が適正に作用することができる。従って、ウイルスゲノム中への運
送物遺伝子160 の挿入は、2つの「挟み込み配列(flanking sequence)」155及び157を形成
し、これらは、運送物遺伝子の両端を挟み込む天然もしくは改変ウイルスDNA配列を含ん
でいる。挟み込み配列155 及び157 の先端は、ウイルスポリペプチド158 及び159 にしば
しばつながれる。一般に、このようなポリペプチド「キャップ」構造は、ウイルスDNA が
細胞に侵入した後、ウイルスDNA を通常破壊又は分解しようとする細胞内において比較的
安定であり、防御機構に対して耐性であるように進化したものである。必要であれば、こ
れらのポリペプチド「キャップ」の一方又は両方は、様々な細胞過程（細胞核へのウイル
スDNA の逆行輸送、能動輸送など）を促進および加速ように、選択及び／又は改変される
。
「運送物遺伝子」160 は3 つの別個のドメインを持つ。プロモーター領域162 は、「転
写酵素」に対してすぐに二重螺旋DNA鎖からメッセンジャーRNA鎖を転写し始めるよう指示
する信号配列を含む。このプロモーター領域は通常「TATA」ボックス又は類似信号を含み
、これは、TATA ボックスから通常約25塩基下流に位置するDNA 配列からmRNAを転写し始
めるように該酵素に指示する。説明を簡単にするために、TATA ボックスとmRNAに転写さ
れる第一塩基との間にある約25塩基の配列は、遺伝子プロモーターの一部と見なす。ある
いは、好ましければ、それは「非転写リーダー配列」の一部として参照され、実際の遺伝
子プロモーターの一部として見なされる必要はない。
遺伝子プロモーターは、その遺伝子から転写されるmRNA 鎖の塩基配列を規定する「コ
ード」領域164へと続く。この領域は、mRNA 鎖のAUG「開始」コドン（ポリペプチドのＮ
末端の最初のアミノ酸のメチオニン残基を規定する）及び「終了」コドン（リボゾームに
よるmRNA鎖の翻訳を切断する）を規定するDNA 配列を含んでいる。いくつかのベクターで
は、運送物遺伝子のコード領域は、宿主細胞内の「編集」過程によって最終的なmRNA鎖か
ら削除されるイントロンをも含む。
コード領域は、「非翻訳」配列166へと続く。このドメインは宿主細胞内で転写され、m
RNA鎖の一部となる。これらのドメインが、mRNA鎖上にある場合、宿主細胞内のmRNA鎖を
安定化し、酵素による急速な分解に対して保護する。但し、この非翻訳配列は、リボゾー
ムによってポリペプチド配列に翻訳されない。
この一般的な遺伝子構造の変異体が可能であり、それも本発明で使用できる。一例とし
て、一つのポリペプチドコード領域164 の後に、そして非翻訳配列166の前に、「配列内
リボソーム再進入部位」（IRES）（例えば脳心筋炎ウイルスなどのRNAウイルスに由来す
る）を、第2 コード配列と共に挿入して、第2 ポリペプチドの同時発現を実現することが
できる。（例：Wong et al 2000）。ＩＲＥＳの指示により、リボゾームはmRNAの第2 位
置に結合して、第2 ポリペプチドを第1ポリペプチドと平行して発現し始める。
ウイルスは、そのDNA (又はRNA)を細胞内に導入する様々な異なった方法を進化させた
。従って、遺伝子工学により作製されたウイルスベクターは、感受性細胞にDNA 「運搬物
」を送達するために、同様の感染過程を利用できる。
一例として、脂質外被がないウイルス間にほぼ共通する過程では、ウイルスのキャプシ
ド蛋白質は宿主細胞外膜に表示される蛋白質分子に付着する。この付着過程は、「陥入」
と呼ばれる過程を開始させ、その結果、ウイルスは、細胞膜脂質から形成される脂質二重
層外被又は小胞内に引き込まれ、充填され、この小胞は細胞内の細胞質液に分散する。続
いて、この泡様の小胞（しばしば「エンドソーム」呼ばれる）は、ウイルスのキャプシド
蛋白質の援助により、あるいは細胞質内の消化過程又は消化器官により破裂する。エンド
ソームの破裂により、細胞質内にウイルスDNA を遊離する。
別の例では、脂質二重層外被を有するヘルペスウイルス及び他のウイルス間にほぼ共通
する過程では、ウイルスおよび細胞を包囲する異なる脂質二重膜が融合して合体する。そ
の結果、細胞質内にウイルス脂質外被の内容物全てが移転する。
特定のウイルスベクターによりいずれの感染様式が使用されるかに関わらず、結果とし
て、有効なウイルスベクターは、その遺伝子物質の一部又は全部を細胞質液内に移転させ
る。図1の例に戻るが、ウイルスベクター100はそのDNA150を嗅受容体神経細胞200 の露出
粘膜先端212 に挿入する。
場合によっては、運送物遺伝子を含む遺伝子ベクターをBBB をまたぐ神経細胞にトラン
スフェクトした後、使用したベクター系の複製及び移動特性に応じて、複数の結果及び効
果を生む。ほとんどの場合、ベクター及び運送物遺伝子は、トランスフェクトされたBBB
をまたぐ神経細胞内に残り、そしてそのトランスフェクトされた神経細胞内で運送物遺伝
子から発現されたポリペプチドは、そのトランスフェクトされた神経細胞から単に分泌さ
れると考えられる。但し、ある種のベクター（「トランス神経性」ベクターと言われる）
はBBB をまたぐ神経細胞により、それ自身BBB 内に分泌されうる。これにより、そのよう
なトランス神経性ベクター（すなわちその遺伝子物質）は、BBB内に完全に位置する他の
神経細胞と接触してトランスフェクトすることができる。
遺伝子ベクター及び遺伝子構成体を、本使用方法のために開発する場合、コードポリペ
プチドを多量に発現する為の周知の様々な技術及びDNA 配列を使用できる。そのような技
術および配列は、下記「遺伝子及びベクター構成体；発現、送達、及び分泌促進因子」で
考察される。
「マーカー遺伝子」（「レポーター遺伝子」とも呼ばれる）は、形質転換細胞およびそ
の細胞系譜や運命をより簡単に、より速く、より安く、より確かに、より高く、検出、定
量、同定することを可能にするものであり、本遺伝子ベクターによって運ぶことができる
運送物遺伝子の１つの重要な種類である。遺伝子工学では周知の上記遺伝子は、企業、商
業、医学などの様々な分野で、当業者に容易に明白である様々な方法で、その研究、評価
、開発を促進および改善することができる。
種々の遺伝子ベクターの追加コメントは下記実施例に示す。
治療ポリペプチド候補
本遺伝子ベクターは基本的に担体、運搬体、または送達系とみなされるべきである。そ
のため、担体によって送達および輸送する運送物及び運搬体は、特定な使用を意図する使
用者が選択する。
一般に、本遺伝子ベクターは、トランスフェクトされた神経細胞により対応ポリペプチ
ドが発現されるように、任意の核酸配列を有する任意の選択された遺伝子を本質的に輸送
および送達することができる。そのため、医者及び研究者が関心をよせる殆どのポリペプ
チドは、トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に分泌することができ
る。但し、医者及び研究者が関心をよせる殆どの場合、分泌の必要性は、２つの理由から
厳しい制約ではない。第一に、ほぼ全ての種類の「神経活性」ポリペプチドは本来分泌さ
れる。一般に、そのような神経活性は、該ポリペプチドがある中枢神経細胞から分泌され
、他の中枢神経系細胞に作用することから、発見および同定された。第二に、関心のある
特定の候補ポリペプチドが通常自然に分泌されなければ、そのポリペプチド配列に、細胞
分泌を引き起こすことが知られる多数の「リーダー」ポリペプチド配列を結合することが
できる。
ここに開示するエンドサイトーシスリガンドは、トランスフェクトされた神経細胞によ
るポリペプチドその他の化合物の分泌を取り扱うものではなく、また直接関わっていない
。その代り、これらのリガンドは、特定のBBBをまたぐ神経細胞に遺伝子ベクターを標的
送達する事を可能にするように設計および意図されている。これらのエンドサイトーシス
リガンドは、治療薬剤、診断用化合物、その他の化合物などの運送物分子を、該リガンド
が特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を持つBBB をまたぐ神経細胞（他の標的
細胞）に輸送及び送達するための系として利用できる。
従って、時として、BBB をまたぐ神経細胞内に輸送できる薬剤または他の非DNA化合物
は、BBB 外でアクセス可能な末梢投射を介して侵入し、BBB内にある中枢投射で同神経細
胞から分泌される（これは、コムギ胚芽凝集素のようなトランスシナプス性トレーサー分
子により示された）。
運送物成分とエンドサイトーシスリガンドとを連結する連結成分を用いることにより、
リガンド運送物複合体がBBB をまたぐ神経細胞に侵入した後に、運送物がリガンドから解
離することができるのであれば、薬剤その他の化合物の当該送達経路は特に有望かもしれ
ない。そのような連結成分はしばしば「不安定」剤と言われ、特に密着性や耐久性が無く
、様々な条件下で遊離できることを意味する。種々の不安定な連結成分が周知である（例
えば、酸感受性スペーサー分子が、Shen et alによる米国特許4,631,190及び5,144,011に
記載される）。必要であれば、下記のような分子複合体を形成するために、特定のエンド
サイトーシスリガンド（又はリガンド類）と、特定の治療薬剤、分析用化合物、その他の
関心のある運送物成分と共に、どのような不安定連結成分を用いることができるか決定す
ることができる。このような分子複合体は、(1)アクセス可能な末梢投射を介してBBB を
またぐ神経細胞に運送物成分を送達することができ；そして(2)該複合体がBBBをまたぐ神
経細胞に侵入した後、運送物成分はエンドサイトーシスリガンドから解離することができ
；そして(3)解離した運送物成分が、BBBをまたぐ神経細胞により、BBB内の分泌場所で分
泌されることが可能である。
再び、遺伝子ベクターを用いてBBBをまたぐ神経細胞に外来遺伝子を導入することによ
り、中枢神経組織内に導入することができるポリペプチドの範囲と種類に関して、表1 及
び2 に、１つの用途（ヒトの様々な神経変性又は神経因性疾患の治療）で利用できる選択
肢のいくつかを列記する。表には説明がないので、列記した項目に関する付加的な情報を
提供するため、下記概説により、ヒトの医学治療に使用することができる種々のポリペプ
チド、及びそのようなポリペプチドにより調節できる特定の疾患群をいくらか広く列記す
る。この説明は完全ではなく、本発明の方法が公知になれば、神経学または神経薬理学の
専門家は、他の潜在的な使用法及び治療法を認識すると思われる。
１．表1 に列記するような様々な神経栄養因子、成長因子、または神経突起抑制因子は
、神経変性疾患のような中枢神経系障害、または脳卒中発作、心拍停止、窒息、血液損失
などの虚血性もしくは低酸素性発作、または他の物理的な傷害もしくは外傷に起因する様
々な形の神経損傷を防止又は修復する。
２．様々な神経栄養因子ホルモン、成長因子、または神経突起抑制因子は、既存の神経
細胞間の新しいシナプス接続の形成を刺激し、及び／又は神経突起の成長を誘導して、シ
ナプス接続を一方で促進し、他方で抑制することができる。患者により、この種の治療は
老化もしくは様々な病気による神経機能損失の回復を促進する。またそれは、脳卒中発作
、頭部外傷、又は他の虚血性、低酸素、興奮毒性等の発作後に、患者が筋肉、会話、及び
他の機能を取り戻すのに役立つ。
３．種々の内分泌性、傍分泌性、及び関連する類似ポリペプチドは、様々な腺性、成長
関係、成熟関係、性的、その他の障害の治療に役立つ。
４．BBB 内のある神経伝達物質分子の量を増加できるポリペプチドは、様々な神経変性
疾病を治療できる。例えば、脳内のドーパミンレベルを増加できるポリペプチドは、（酵
素、ホルモン、分泌因子、または他の様々な機序により）パーキンソン病の治療に使用で
きる。また、アセチルコリンレベルを増加できるポリペプチドはアルツハイマー病の治療
に有用である。
５．細胞毒素又は成長抑制ポリペプチドは、BBB 内で、ある種の癌または他の疾病の治
療に使用できる。
６．種々の受容体拮抗剤、抗体、または一つ以上の神経活性を抑制及び阻害することが
できる他のポリペプチドは、神経性疼痛、痛覚過敏症、及び類似症状を制御および軽減す
るのに使用することができる。
７．中枢神経系の特定ポリペプチドの欠乏に起因するリソソーム蓄積症は、中枢神経系
内にそのポリペプチドを送達する事によって治療できる。
８．ウイルス、プリオン、または細菌による中枢神経系の感染は、感染の伝播を制御ま
たは低減するものを中枢神経系に送達することによって治療できる。例えば、受容体に結
合してウイルス結合を阻害するポリペプチドの送達は、中枢神経系内のHIVなどのウイル
スの伝播を減らせることができる。
９．中枢神経系内の抗原に組換え抗体を送達することによって、有益または有用な方法
で生理学的な過程を制御することができる。例えば、No-Goのような神経突起抑制分子が
結合したミエリンへの組換え抗体の送達は、脊髄傷害および他の外傷性傷害の後に、中枢
神経系神経の再成長および再生を可能する。
標的の中枢神経系神経細胞またはグリア細胞
用語「標的細胞」は、（i）中枢神経系の一部であり、BBB内に完全に位置し；そして（
ii）本方法及び本ベクターによってBBBにより保護された頭脳または脊髄組織に送達され
た外因性のポリペプチドと接触する、または接触するように意図した神経細胞又はグリア
細胞を指す。
この用語は意図的にBBBをまたぐ神経細胞を除外する。しかし、そのような神経細胞は
、接触およびトランスフェクトするのに使用される遺伝子ベクターの「一次」又は「開始
」標的であり、そのような用語によって参照される。本発明の全過程では、複数過程方法
において、その後に、BBB により保護された中枢神経系組織内へのベクターコードポリペ
プチドの送達に続く限りにおいて、BBB をまたぐ「開始標的」のトランスフェクションは
価値があり、有用である。従って、本発明の真の「標的」はBBB内に完全に位置し、BBBに
より保護された神経細胞またはグリア細胞であり、送達機構で使用されるBBBをまたぐ神
経細胞は、真の標的細胞というよりもむしろ経路及び通路とみなされるべきである。
本明細書では「グリア」細胞が参照される。BBBにより保護された頭脳および脊髄組織
内の細胞は、神経細胞およびグリア細胞（いくつかの医学テキストでは「ニューログリア
細胞」 とも呼ばれる）と言われる２つの部門に分けられるためである。定義により、用
語「神経細胞」は神経信号を受け取り、送信できる細胞に限られる。用語「グリア細胞」
はより広い意味があり、神経信号を受け取り、送信することができない全ての種類の中枢
神経系細胞を含んでいる。これらのグリア細胞は、中枢神経系内で、支持機能、ハウスキ
ーピング機能、および「養育」機能とみなすことができる様々な活動を実施す。これは神
経細胞が、必要な機能を実行するために役立つ。「グリア」とは「グルー（接着剤）」と
同じ根単語に由来する。グリア細胞は中枢神経系細胞同士を付着させる「グルー」として
当初考えられた。グリア細胞は様々な分類に分けられ、オリゴデンドログリア細胞、アス
トロサイト、上衣細胞、およびミクログリア細胞を含む。これらは中枢神経系の重要な部
分であり、神経学のほぼあらゆる教科書に記載される。
いくつかの理由のため、本発明の初期の研究は、グリア細胞よりも神経細胞に接触して
、それを調節する外因性ポリペプチドの使用に集中する。その傾向を生む一つの大きな理
由は、まずグリア細胞に関わり、次に二次効果としてのみ神経細胞に影響する反応及び効
果と比べて、直接神経細胞が関与する中枢神経系の反応を確認し、定量化することは大い
に簡単であるからである。
従って、研究者によってはBBB内に完全に位置する「標的」神経細胞に焦点を合わせ本
発明を評価することを好むが、次が認識されるべきである：(1)本発明の方法およびベク
ターは、外因性ポリペプチドをグリア細胞に接触させ、それを処置することによって、中
枢神経系組織を処置する方法を提供する為にも有用となりうること；および(2)グリア細
胞が関与する特定の症状は、ある種のグリア細胞癌（例えばグリア芽細胞腫および星細胞
腫）の治療法、及び外傷性傷害、低酸素症、虚血症のような侵襲に対するグリア細胞の反
応を制御する方法などの、比較的初期の研究および評価において有利であること。
用語「標的」が意味するように、BBB内に完全に位置する神経細胞又は細胞全てが、必
ずしも本発明を使用して送達されたポリペプチドに接触する必要はない。遺伝子ベクター
によってBBB をまたぐ神経細胞（又は神経細胞塊）をトランスフェクトする場合、BBB内
に完全に位置する神経細胞又はグリア細胞は：(i)トランスフェクトされた神経細胞の、B
BB内に位置するシナプスまたは他の末端の近傍に位置するか；又は(ii)トランスフェクト
された神経細胞の、BBB内に位置するシナプスまたは他の末端の近傍に位置する細胞突起
または細胞伸張(例えば樹状突起、軸索、または末端）を有する。「トランス神経細胞性
」ベクターを使用する場合（すなわち、遺伝子ベクター自体が、BBB をまたぐ「一次」神
経細胞を通して、BBB内に位置する二次または三次神経細胞へ移動し、そこでそれらの細
胞をトランスフェクトして、コードポリペプチドを発現する場合）、「標的」神経細胞又
はグリア細胞は、ベクターに含まれる外来遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現
して分泌するトランスフェクトされた二次または三次神経細胞の近辺に位置してもよい。
頭脳内の一つ以上の神経細胞がどうやってBBB内の「標的」神経細胞になることができ
るかの例として、前脳基底核コリン作動性神経細胞、セロトニン作動性縫線神経細胞、及
びノルアドレナリン作動性青班神経細胞は、BBB をまたぐ嗅受容体神経細胞に直接にシナ
プス接続していない。それにもかかわらず、嗅神経細胞が、本遺伝子ベクターによってト
ランスフェクトされれば、これらのBBB内のコリン作動性、セロトニン作動性、ノルアド
レナリン作動性神経細胞は、標的神経細胞となることができる。なぜなら、それらは、ト
ランスフェクトされた嗅受容体神経細胞によって分泌されたポリペプチドを取り込むこと
ができるからである。このことは、BBB 内のコリン作動性、セロトニン作動性、ノルアド
レナリン作動性神経細胞が、ウイルス感染した嗅受容体神経細胞から放出される狂犬病ウ
イルスまたは単純ヘルペスウイルスによって感染するという事実から証明された(Lafay e
t al 1991, Barnett et al 1993)。
もし中枢神経系の神経細胞またはグリア細胞が、BBB内で、BBB をまたぐ細胞の中枢投
射の隣りに、又はその極近傍に位置すれば、それらを、外因性ポリペプチドによる接触及
び治療の「標的」にすることができる。この原理は、トランスフェクトされた細胞と標的
細胞との解剖学的関係に間する最新情報から支持されれば、最も有利に利用することがで
きる。この種の解剖学的知識は、ウイルス又は他の「トランス神経細胞性の標識分子」を
使用した技術文献内で見つけることができる。例えば、トランス神経細胞ウイルスを実験
動物のBBB をまたぐ神経細胞に投与した後、中枢神経系の神経細胞またはグリア細胞の特
定な種類が、そのウイルスにより感染されたならば、その後に感染された中枢神経系神経
細胞又はグリア細胞の種類は、本発明の目的のために標的神経細胞又は標的グリア細胞と
して使用できる。このような神経地図作製は様々な研究者によってある程度に既に遂行さ
れており、Loewy 1998及びNorgren et al 1998などの文献に記載されている。さらに、こ
のような研究は現在も続けられ、神経回路の情報をより多く提供し続けている。本発明を
実行する者は、その新しい情報を考慮することができる。
感覚又は運動神経細胞の末梢投射に遺伝子ベクターを接触させる好ましい方法は、標的
の末梢投射の構造と位置に左右される。例えば、嗅受容体感覚神経細胞への投与は、鼻へ
の点滴注入によって、例えば、鼻スプレーまたは鼻洞内に置くことができる液体充填材を
用いて、一定期間（例えば30〜90分間）、嗅投射を含む鼻表面に直接に接触させる。
必要であれば、遺伝子ベクターと嗅神経細胞投射との間の直接かつ持続的維持な接触は
、次の過程により更に促進される：(i)鼻用鬱血除去薬を使用して、鼻洞表面を覆う粘液
を最小にすること；(ii)希イソプロピルアルコール、アセトンのような洗浄剤または類似
薬剤を使用して、接触表面を洗浄し準備すること；及び/又は(iii)耳鼻科医によって一般
に患者の再発性鼻洞感染の治療に使われる機械的摩擦方法を使用すること。一般的に、中
程度の炎症に至った表面の神経投射は、静止または休息状態の細胞よりも、細胞内への外
来分子の取り込みの感受性が高くなりがちである。また更に、「電気穿孔法」という試験
管内細胞トランスフェクション法のようにして、鼻腔表面を電荷又は電場を与えて、遺伝
子ベクターの侵入を促進することも可能であろう。必要があれば、これらの方法のうちの
いずれかまたは全ては、全身麻酔又は局所麻酔下に遂行できる。
必要であれば、神経への接触および取り込みは、「粘液被着剤」と呼ばれる化合物によ
って更に促進され、高めることができる。このような化合物は、鼻スプレーなどの膜透過
的方法で血流内に様々な薬剤をより多量に送達するために開発された。粘液被着剤の例は
、キトサン(Janes et al 2001)及び様々な多糖類コロイド(Schipper et al 1999)である
。粘液被着剤の詳細につき、Rillosi et al 1995及びLim 2000も参照されたい。
侵害受容性神経細胞の一部である投射への投与は、皮膚及び皮下注入を介して、様々な
調節皮膚剥削術を用いて、そして十分な浸透を達成することができれば局所適用によって
も行われる（皮膚浸透はジメチルスルフォキシドのような薬剤によって必要であれば促進
することができる）。運動神経細胞投射をアクセス経路として使用する場合、通常皮下ま
たは筋肉内注入により投与する。例えば、舌下神経核の下位運動神経細胞の一部である投
射は、舌の筋肉に遺伝子ベクターを注入することによってアクセス可能である。場合によ
り、遺伝子ベクターを静脈内に投与する（特に特定神経を指向する成分を含む場合）。但
し、一般的には、遺伝子ベクターの投与は、所望の標的部位に高濃度のベクターを確立し
維持する筋肉内注射又は類似の注射によることが望ましい。
このことは、この方法（特定神経細胞への標的トランスフェクション）と、脳脊髄液へ
の注入による遺伝子、ポリペプチドまたは他の化合物の送達との間の重要な相違を指摘す
る。脳脊髄液体系への物理的な送達（頭脳室または脊髄のくも膜下腔内へのカテーテルに
よる注入）では、神経作用剤は、中枢神経系の多数な及び多種類な細胞に分配される。対
照的に、本発明では、BBBを またぐトランスフェクトされた神経細胞に密接する（又はシ
ナプス接続する）限られた数の細胞または神経突起に、望ましい治療ポリペプチドを、い
かに標的的に送達することができるか、または制御下に優先的に送達することができるか
を記載する。
必要ならば、ヒト以外のほ乳類の頭脳及び脊髄に、さらにハ虫類や鳥などの血液脳関門
がある他類の動物に、ポリペプチドを導入するために、ここに開示する方法及び遺伝子ベ
クターを用いることができると考えられる。そのため、本発明は、家畜、ペット、および
他の動物の成長速度及び／又は生殖状態を制御調節する為に有用となろう。この目的及び
他の目的では、下垂体腺からの強力なホルモンの分泌を調節するために、嗅受容体神経細
胞を通して視床下部放出因子を送達できる。例えば、動物の成長速度を加速させるために
、成長ホルモン分泌を刺激するようにGHRHを送達する。また可逆的避妊などの避妊を達成
または促進するために、LH及び/又はFSHの正常分泌を抑制するように、過最大投与量のGn
RH を継続的に送達しうる。ここに開示する方法を、他の哺乳類、または鳥類やハ虫類の
ような他類の動物に用いる場合、次の主な変更が必要である：(i)選択した種類の動物に
おいて、BBBをまたぐ神経細胞の投射をトランスフェクトする為に十分に適する遺伝子ベ
クターの選択と使用、また(ii)特定種類の動物において望ましい活性を示すポリペプチド
の選択と使用。
上記及びその他の潜在的な適用を軽視するのではないが、遺伝子ベクターに関する残り
の説明は、本発明の方法および手順を証明するための動物実験、及び医学目的のヒト治療
にのみ関する。
ウイルスベクター
種々の哺乳類ウイルスベクターを記載する論文は、Karpati et al 1996およびKaplitt
and Makimura 1997を含む。神経細胞のトランスフェクションに、少なくとも４種類のウ
イルスベクターが使用された。それらのウイルスは次の通りである。
A.アデノウイルス
これらは、頻繁に様々な腺組織に見つかる二重鎖DNAウイルスである。野生型ウイルス
は呼吸器感染、結膜炎、および他の様々な障害を起こす。複製ができない様に（ただし特
種な細胞および／または実験室条件の培養基を除く）遺伝的改変されたアデノウィルスは
、ヒト遺伝子治療などのほ乳類の生体内研究に使用されるウイルスベクターの主要な種類
となった。アデノウィルスベクターは、Smith and Romero 1999で論説されるように、種
々の神経細胞のトランスフェクションに使用された。
B.アデノ随伴ウイルス（ディペンドウイルス、アデノサテライトウイルス）
これらは、複製にアデノウィルスが必要な単一鎖DNA ウイルスである。アデノ随伴ウイ
ルスベクターを調製する方法はRobbins(編集)1997年のBartlett and Samulskiによる章に
記載されている。
C.単純ヘルペスウイルス（HSV）
これらは、脂質外被によって囲まれるキャプシドを持つ二重鎖DNAウイルスである。神
経細胞をトランスフェクトするための遺伝子改変されたHSVベクターの使用がStaecher et
al 1998に解説されている。
D.レンチウイルスを含むレトロウイルス
これらのウイルスは、DNAではなくRNA を含んでいる。マウスの下位運動神経細胞にGDN
F遺伝子を送達し発現するレンチウイルスベクターの使用がHottinger et al 2000に記載
されている。
この4 つの分類のウイルスは、細胞をトランスフェクトして、しかし標的細胞に侵入し
た後も非病原性である（通常複製に必要な蛋白質をコードする一つ以上の遺伝子の削除ま
たは欠陥のため）ウイルスベクターの作製において、現在最も研究され、そして関心を集
めている。
但し、既知の他の分類の向神経性ウイルス（例えばウイルス性脳炎を引き起こす種々の
ウイルス、例えばRNAウイルス）は、神経細胞を選択的（または少なくとも優先的）にト
ランスフェクトできるベクターの有望な候補を提供する。上記分類ウイルスのいずれかは
、他のウイルスのベクターを非病原性にするのに使用された方法と同等の遺伝子処理によ
って、安全及び非病原性にすることができれば、本使用のために十分に適する。
あるいは、もしくはその上、遺伝子工学技術を使用して、神経細胞への親和性が強くな
い種々のウイルスベクターに、嗅神経細胞、運動神経細胞、又は他の種類のBBBをまたぐ
神経細胞の投射の表面蛋白質に優先的に結合する選択した及び／又は改変した表面蛋白質
（キメラ表面蛋白質を含む）を与えることができる。神経細胞結合親和性が高められた改
変ウイルス表面蛋白質が適切に開発され使用されるならば、ここに開示されるように使用
された場合に、ウイルスベクターの速度、効力、および他の利点を高めることができる。
非ウイルスベクター
背景技術にて簡潔に要約したように、また様々な下記実施例や多数の出版論文に詳しく
記載されるように、複数の種類の非ウイルス遺伝子ベクターが周知であり、本使用に関し
て評価される。神経投射をトランスフェクトできる非ウイルスベクター分類の主要な候補
は次を含む；(1)陽イオン性物質、例えば陽イオン性リポソーム、及び(2)エンドサイトー
シス受容体に結合するポリペプチドリガンドを含む蛋白質・DNA複合体。
神経細胞のエンドサイトーシス受容体に結合できるリガンドに関して、本出願人によっ
て、BBB外にある神経線維の表面のエンドサイトーシス受容体に結合できるリガンドを同
定および単離する為に非常に有用かつ非常に強力な生体内スクリーニング方法が開発され
た。簡潔に説明すると、この新規な生体内スクリーニング方法は次の過程を使用する：
(1)生きている動物体内で、候補リガンドが直接神経線維と接触できる第１の部位（例
えばラット脚の坐骨神経束）に多数の候補リガンドを投与する；
(2)エンドサイトーシス取り込み及び逆行性輸送を活性化および促進する特定リガンド
が神経線維内に取り込まれるために十分な時間を与える；
(3)神経線維に取り込まれなかった、または逆行性輸送で送達されなかったリガンド候
補を回収することを避けるために、リガンド投与部位から十分に遠い位置で、神経線維の
一部を収集する；そして
(4)リガンドを複製して、さらに処理するため、収集された神経線維の部分からリガン
ドを取り出す。
この新規な生体内スクリーニング方法は、任意の特定のエンドサイトーシス受容体また
は他のエンドサイトーシス促進性表面分子に特異的に結合できる改善された非ウイルスベ
クター(および標的ウイルスベクター)を開発する為の強力な手段を提供する。従って、そ
れは本発明の好適な実施態様を提供するので、以下の個別の章に、そして種々の実施例に
詳しく記載される。
非ウイルスベクターを用いて所望の結果を達成する可能性を高める為に多数の方法およ
び技術が専門家に知られている。一例として、神経細胞を標的とする非ウイルスベクター
は、黒質線条体及び中脳辺縁系のドーパミン作動性神経細胞に対して標的指向的にプラス
ミドを送達するためにニューロテンシンを使用できることが報告される(Martinez-Fong e
t al 1999)。他の様々な例は次項で考察される。
一般には、陽イオン性又はエンドサイトーシス性の送達機構に使用するために作製され
たプラスミドベクターは次の両方を含む：(i)大腸菌などの宿主細胞でプラスミドの複製
を可能にする配列、及び(ii)標的細胞で治療ポリペプチド遺伝子の発現を可能にする配列
。複製のために、ベクターは、通常、複製開始点及び形質転換細胞の簡単な選択を可能に
するマーカー遺伝子を含む。例えば、大腸菌での複製のために、プラスミドpBR322 (Boli
var et al 1977)はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従ってそれら
の抗生物質の使用により形質転換細胞の急速かつ簡単な同定が可能になる。
標的細胞内で治療ポリペプチドの遺伝子発現を可能にする配列は、通常、複製開始点（
必要な場合）、発現遺伝子前のプロモーター、必要なリボゾーム結合部位及び/又はRNAス
プライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含んでいる。
遺伝子及びベクター構成体；発現、輸送及び分泌促進因子
様々な周知の遺伝子工学技術およびDNA配列又はポリペプチド配列を用いて、次のこと
を改良し、増加することができる：(i)この方法が、首尾よく特定動物または患者におい
て希望及び意図した結果を、認識可能なレベルで達成する可能性；(ii)治療した動物また
は患者において処置の効力、効果、持続期間、または他の望ましい点；および(iii)治療
の状態、進行および結果、並びに外因性遺伝子及び／又はポリペプチドの位置および濃度
を追跡し、監視する研究者及び医者の活動。
この項は、そのような周知技術および配列の様々な例と共に、それらを本発明の方法と
ベクターにどう適用するかを簡潔に記載する。この説明例の一覧は完全なものでも排他的
なものでもなく、本使用のために他の様々な遺伝子工学技術、試薬、遺伝子及びペプチド
配列及び断片を使用できる事を専門家は認識するだろう。
さらにここに開示した技術や配列を様々な方法で互いに組み合わせうることは当業者に
は明白である。一例として、BBBをまたぐ神経細胞において成熟形ニューロトローフィン
をコードする遺伝子を発現するために、次の２つを含むポリペプチドをコードする遺伝子
構成体を開発することができる：(i)成熟形ニューロトローフィンをコードする配列のＮ
末端のプレプロBDNF リーダー配列、および(ii)成熟形ニューロトローフィンをコードす
る配列の他の位置に置かれる「エピトープタグ」。同様に、現在周知である、または将来
発見される他の付加的な遺伝子工学技術または配列が本使用のために適応できる。
遺伝子ベクターに含まれる運送物ポリペプチドの発現を高める為の技術の一例として、
ポリペプチドのコード配列を強力な「遺伝子プロモーター」の制御下に置くことができ、
それによってコード配列を含んでいるmRNA鎖の転写を大いに促進する。ヒト細胞(ヒト神
経細胞を含む)で強いプロモーターとして機能する様々なプロモーター配列が知られ、そ
れは例として次を含む；サイトメガロウイルスの(CMV)プロモーター、ロウス肉腫ウイル
ス(RSV)の末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、およびシミアンウイルス40(SV-40)の「早
期」プロモーターなどの、種々の病原性ウイルスに由来するプロモーター配列。
あるいは、場合により、ある条件下またはある化合物の存在下でしか活性でない、いわ
ゆる「誘発性」プロモーターの制御下に一つ以上の遺伝子(例えば、標識ポリペプチドを
コードする遺伝子など)を置くことが望まれる。
また通常「組織特異的」プロモーターと言われる遺伝子プロモーターも注目されている
。これらの種類のプロモーターは、特定の種類の組織または細胞においてのみポリペプチ
ドコード配列を効率的にmRNAに発現する。組織特異的プロモーターを含んでいる遺伝子構
成体が間違った細胞または組織に送達されても、それらの「意図してない」細胞には通常
その組織特異的プロモーターを認識できる転写因子または酵素が無いので、遺伝子構成体
はそれらの「意図されない」細胞には発現されない(または低い率でしか発現されない)。
従って、組織特異的プロモーターは、ここに記載される評価のために非常に有用な候補と
なる。
遺伝子組み換え動物研究の報告によると、いくつかの組織特異的プロモーターは既に同
定され公開されており、ほかの遺伝子組み換え動物研究が報告されると共に、さらにその
数は増えている。以下のリストは、完全なものでも排他的なものでもなく、本発明に有用
であろう組織特異的プロモーターの複数の例を含む。
(i)他の種類の神経細胞より嗅受容体神経細胞で大いに高活性である組織特異的プロモ
ーターとして、Servenius et al 1994に記載されている嗅マーカー蛋白質プロモーター、
およびQasba and Reed 1998に記載されているM4嗅受容体蛋白質プロモーターがある。
(ii)交感神経細胞より侵害受容性感覚神経細胞で大いに高活性であるWatson et al 199
5に記載されている組織特異的プロモーター。最小「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」(
CGRP)を発現するこの遺伝子は、神経成長因子(NGF)が存在すると大いに高活性になるので
、化合物誘発性遺伝子プロモーターを提供しうる。従って、CGRP遺伝子プロモーターを使
用すると、交感神経細胞での遺伝子発現を最小に制限でき、望ましくない副作用を最小に
制限できる。侵害受容性感覚神経細胞及び交感神経細胞は受容体仲介性エンドサイトーシ
スによりNGFを取り込むことが知られているため、この種類の遺伝子プロモーターは特に
有用となりうる。侵害受容性及び交感神経細胞種類両方が多分トランスフェクトされるの
で、アクセス可能な神経細胞に標的指向的に遺伝子を送達するために、NGF受容体仲介性
エンドサイトーシスを利用する非ウイルスベクターを末梢投与する場合、CGRPプロモータ
ーなどの遺伝子プロモーターによってトランスフェクトされた交感神経細胞内で実質的に
は発現しない遺伝子構成体は、非常に有効となりうる。
(iii) Bechade et al 1994、Rajendra et al 1997およびZafra et al 1997などの論文
に記載されている、侵害受容性神経細胞または他の感覚神経細胞より脊髄運動神経細胞で
大いに高活性であり、グリシン受容体のアルファ1サブユニットの発現を促進する組織特
異的プロモーター。
一般に、遺伝子組み換え動物系において、導入遺伝子構成体が、所定の遺伝子発現を特
定の分類のニューロンに制限することが示された場合に、適切に調製した遺伝子構成体(
同じプロモーターおよび関連遺伝子発現要素を含んでいる)をウイルスまたは非ウイルス
ベクターによりインビボに送達すると、同じパターンの遺伝子発現制限を期待することが
できる。従って、遺伝子発現構成体を設計する場合、遺伝子組み換え動物の技術(例:Caus
ing and Miller 2000)を参照するべきである。
関連した類似方法では、また更に様々な方法で外来遺伝子の発現を刺激、抑制または制
御する天然または合成プロモーター及び/又は促進因子を使用することも可能で好適であ
ろう。例えば、通常は沈黙であるが神経損傷後に活性化される遺伝子プロモーター（Funa
koshi et al 1998参照）の使用によって、他の神経細胞に実質的に影響することなく、損
傷した神経細胞で外来遺伝子発現を確立するか、または大幅に高めることが可能である。
あるいは、ストレス反応の結果としてグルココルチコイド副腎ストレスステロイド量が高
くなる場合(例：Ozawa et al 2000)、グルココルチコイド応答性プロモーターが神経損傷
後の遺伝子発現を促進するのに使用されうる。あるいは、単純ヘルペスウイルス(Lachman
n et al 1997)に由来する潜伏関連転写プロモーターは、他の様々なプロモーターよりも
更に長い期間、遺伝子発現を促進しうる。
蛋白質発現を高める技術の別例として、トランスフェクト用遺伝子を作製するために、
しばしば一つ以上「非好適」コドンを削除し「好適」コドンに取り替える。その非好適コ
ドンと好適コドンの区別は、ほとんどの種（およびある種内の多くの異なる細胞型）が、
(i)リボゾーム内の翻訳系を遅れず迅速に通過する好適コドンと、(ii)リボゾーム内で翻
訳過程を遅らせる非好適コドンとの両方を含んで進化したという事実に由来する。好適、
非好適コドンのこの方式は、単一細胞内で正しいバランス量の多数の異なる蛋白質がすべ
て適した濃度で存在できるようにするように、遺伝子発現制御に非常に有用な細胞機構を
提供する。但し、遺伝子工学では、非好適コドンを除き、好適コドンと取り替えることに
よって、遺伝子ベクターは正常な制御機構を迂回することができ、外来蛋白質の通常以上
に高い生産を促進する。この種類の方法は米国特許5,795,737 (Seed et al 1998)及びそ
こに引用される様々な論文などの多数の研究報告に記載されている。
別の周知の遺伝子工学技術は「システイン枯渇」ポリペプチド変異体を含む。周知のよ
うに、ポリペプチド鎖のシステイン残基(高反応性であるスルフヒドリルグループ-SHが付
いているアミノ酸)は他のシステイン残基と反応しがちである。二つのシステイン残基が
互いに反応すると、二硫化物結合を形成する。二硫化物結合は、細胞内でポリペプチドが
合成され「翻訳後加工」 にて適切な三次元構造に折り畳まれることを保障するために非
常に重要である。但し、蛋白質を作製するのに遺伝子工学が使用されるとき、二硫化物結
合に関与しないシステイン残基は問題を発生させ、望ましい結果を妨害するかもしれない
。そのような問題は、ポリペプチド配列のある位置の一つ以上のシステイン残基を、他の
残基と取り替えることによって大抵避けられ克服できる。これは、ある遺伝子の特定位置
のシステイン残基を指定するコドンを、他のシステイン以外のアミノ酸残基を指定するコ
ドンと取り替えることによってできる。これらの種類のシステイン枯渇「変異蛋白質」は
米国特許4,737,462などの様々な特許に記載されている。
また、遺伝子工学技術を利用して「リーダー配列」及び/又は「シグナル配列」を、本
遺伝子ベクターによってコードされる外来ポリペプチドに加えることができる。用語「リ
ーダー配列」は必ずしも一貫してまたは正確には使用されないが、一般に次の特性の一方
もしくは両方を有するポリペプチド配列を示す：(i)通常輸送または分泌を受けない外来
ポリペプチドにリーダー配列を加えたときに示されるように、細胞内の特定位置にリーダ
ー＋ポリペプチド分子を輸送する、またはその過程を促進させる、又は宿主細胞によって
リーダー＋ポリペプチド分子の分泌を引き起こすこと；及び/又は、(ii)より短い最終的(
成熟形)ポリペプチドから自然な「翻訳後加工」によって切り離される初期ポリペプチド
の一部であること。ほぼすべての場合は、リーダー配列はポリペプチドのN末端に位置し
、最初に作製される末端であり（しばしば「頭部」とも呼ばれる）、ポリペプチドの作製
と同時にリボゾームから最初に現れる。
同様に、用語「シグナル配列」は必ずしも一貫してまたは正確には使用されていない。
一般に、それは、通常その結果または過程に至らない他のペプチド配列に、その結果また
は過程を与える配列によって示されるように、特定の結果、効果または過程を導くポリペ
プチド配列を指す。例として、シグナル配列は下記を誘導する：(i) ポリペプチドを小胞
または他のコンパートメントへ封入、貯留、または他の処理によって「封緘」すること；
(ii)細胞の特定の部分または領域へのポリペプチドの輸送；又は(iii) 宿主細胞によるポ
リペプチドの分泌。従って、「シグナル配列」は「リーダー配列」より広く使用され、そ
して一般にリーダー配列を含んでいる。さらに、ポリペプチドの成熟した最終的な形を作
製するために、シグナル配列が初期ポリペプチドから切り離される必要はない。シグナル
配列は頻繁に成熟形ポリプチドに保たれる。
本発明に非常に有用である2 つの過程の一方または両方を高めると信じられる様々な神
経性リーダー及び/又はシグナル配列が周知である。それらの2 つの過程は次のとおりで
ある：(i)合成された細胞内に存在するポリペプチドを、神経細胞の主体から「中枢系投
射」を通過し、血液脳関門を通過し、及び/又は頭脳の望ましい標的領域の近辺へ送達す
るポリペプチドの順行性輸送; 及び/又は、(ii) 神経細胞による、神経細胞のシナプス末
端または他の末端からの分泌。
様々な状況で非常に有用となりうるそのような種類のリーダー配列の一つは、「プリプ
ロBDNF」と呼ばれる初期ポリペプチドに存在するリーダー配列である。BDNFは脳由来神経
栄養因子の略称である。BDNFは神経成長因子(NGF)の相同体であるが、NGFとは違いプリプ
ロBDNFは侵害受容性神経細胞によって効率的に順行輸送されることが既知である。それは
動物実験によって確認され、侵害受容性神経細胞内で発現されたそのBDNFは後に脊髄組織
で検出されることが示されている。より短い最終形(または「成熟形」)BDNFは、より長い
初期ポリペプチドからリーダー配列が切断されて作製される。BDNFポリペプチドおよびプ
リプロBDNFリーダー配列はConner et al 1998、Altar et al 1999及びTonra 1999を含む
いくつかの出版論文に記載されている。BDNFポリペプチドおよびプリプロBDNFリーダー配
列を分析する専門家ならだれでも、このリーダー配列、および神経細胞内の順行性輸送及
び/又は分泌を実行または促進すると知られている他のどのペプチドリーダー配列も、本
発明の成功率そして効率の増加に非常に有用であることを認識するであろう。
エピトープタグ配列
接頭辞の「エピ」は露出されたアクセス可能な表面を指す。例として、表皮（エピダー
ミス）は一番外の真皮(皮膚)表面であり、上皮（エピセリウム）は粘膜の露出表面である
。
同様に、用語「エピトープ」（抗原決定基）は、抗体によって強く結合される蛋白質の
表面露出された領域を指すのに使用される。抗体は、抗原蛋白質の表面全体を覆わず、そ
の代り、抗体の一部である局在した結合ドメインは、抗原の一部である局在した結合ドメ
インに結合する。これは、各ピースの一つ(一つだけの)縁に沿ってフィットする２枚のジ
グソーパズルピースと似ている。
極小ビーズに単クローン抗体を固定したカラムに抗原蛋白質の消化（切断）断片を通す
試験によって、特定株の単クローン抗体に関して、抗原蛋白質のエピトープ領域を同定す
ることは困難ではない。但し、異なった単クローン抗体は、抗原蛋白質の異なった表面に
結合するので、蛋白質には一般にいくつかの異なったエピトープ領域があり、どの領域が
エピトープであるかを定める共通要因は、その領域が蛋白質表面に露出され、抗体にとっ
てアクセスしやすいかどうかである。この理由のため、複雑な蛋白質の三次元構造を定め
る為に、研究者によって頻繁にエピトープ分析が使用されている。一般に、蛋白質のエピ
トープ部位として示されるアミノ酸配列は、蛋白質表面に露出された抗体にとってアクセ
スしやすいアミノ酸配列である。
遺伝子工学でのエピトープ「タグ」配列の使用は次の事実に基づく：既知エピトープ配
列と非常に高い選択性で結合する単クローン抗体を作製して同定することは比較的容易で
あること。いくつかのそのような単クローン抗体株（およびこれらが結合する高親和性の
対応抗原アミノ酸配列）が周知である。例として、c-myc及びインフルエンザウイルス由
来の赤血球凝集素蛋白質などのポリペプチドの既知アミノ酸配列と結合する単クローン抗
体株が含まれる。
細胞のポリペプチド発現はN(アミノ)末端に始まり、C(カルボキシ)末端で終わるので、
一般にC末端の、またはその近辺のアミノ酸区域が蛋白質表面に露出される確率が高い。
これは、最終的な三次元ポリペプチドを形成する折り畳み及び形成過程が、鎖の形成およ
び伸張と同時に起こるという事実に基づく。なぜなら、鎖の形成と同時に、鎖の特定位置
の様々なアミノ酸残基またはドメインは相互に引き付けるか反発し始めるからである。こ
の説明は非常に簡潔で、蛋白質の折り畳みの詳細を十分に説明しないが、鎖の最初の部分
は、ポリペプチドの「核」の形成としてリボゾームから現れ、残りの鎖は、普通は最初の
核を包むか、または別の方法で最初の核に加わることが想像できる。
この要因のため、ポリペプチド「尾部」(カルボキシ末端)またはその近辺にあるアミノ
酸配列は、ポリペプチド表面にエピトープ領域として露出されアクセスしやすい可能性が
比較的に高い。中央ドメインへのエピトープ領域の挿入がポリペプチドの重要な活性また
は特性を破壊または低下させるという危険性を下げるために、この要因を利用して、一般
的には、エピトープタグを含むように修飾しようとするポリペプチドの尾部(カルボキシ
末端)またはその近辺に、エピトープタグ配列を置くべきである。一般にこれは、エピト
ープタグを使用する初期実験では最もよい方法であり、必要に応じて、この方法を使用し
て得られた実験データを用いて次の研究を最適にすることができる。
または、もしくはその上、ポリペプチド分子の完全な三次元構造が既知であり、触媒活
性又は受容体結合に不可欠なポリペプチドの「活性」部位が既知であれば、ポリペプチド
分子の反対側の表面に、アクセスしやすいエピトープ領域を挿入することが可能である。
比較的簡単な試験管内スクリーニング試験により、そのように修飾された「タグ付き」
蛋白質がまだ好適な活性を有するか検査され、それらの最初の検査を通過したタグ付き蛋
白質は、生体内動物実験でさらに広範に検査される。
従って、ここに開示する遺伝子ベクター系では、特有な、または少なくとも非常に珍し
い、検出可能な「エピトープタグ配列」を、ほぼあらゆる種類の周知蛋白質(例えば神経
成長因子)に追加(または挿入)するように遺伝子構成体を作製することが可能である。周
知の遺伝子工学技術を使用し、遺伝子ベクターに含まれる遺伝子構成体のコード配列を変
更するのは簡単であり、それによって「天然」コード配列に比較的少数の付加的なコドン
を加え、または、天然コード配列中の少数のコドンを天然蛋白質に通常存在しない他のコ
ドンに置き換える。
ここに開示される様々な研究および治療では、エピトープタグを付加されたポリペプチ
ドを発現する遺伝子構成体を含む遺伝子ベクターは非常に有用であり、研究者及び医者が
、ここに開示される遺伝子療法の結果および効果を監視し測量することをより容易にさせ
ることができる(また場合によっては、それを可能にするのに必要とされる)。天然ポリペ
プチドの分析中に起こる問題の一例として、現在技術では天然の神経成長因子(NGF)は、
組織固定法によって分解される傾向にある。さらに、熟練研究者でもNGFは正確に測定し
にくく、ラット及びヒトのような広く異なる動物に見つかるNGFの近縁形にも、高い相同
性及び抗体交差反応性がある。従って、NGF（及び他の様々な神経活性ポリペプチド）の
エピトープタグ付加形を使用する事によって、 そのような困難を避け、または少なくと
も最小にすることができる。
エピトープタグ付加されたポリペプチドは、ヒト臨床治療よりは研究ではるかに頻繁に
広く使用されている。一般的に、エピトープタグ付加されたポリペプチドは、細胞培養実
験及び動物実験で、ある治療方法の効果及び効力の開発、最適化、及び証明をする為に使
用される。さらに、それらは時々米国の「治験薬」適用の下に、および類似の公式検討や
その他の認可の下に承認された小規模「第一相」又は「第二相」ヒト臨床試験で使用され
る。治療がより大きな複数の場所での第三相臨床試験で検証できるようになると、エピト
ープ配列を認識し攻撃する抗体による免疫反応を発生させる危険を減らすために、通常全
てのエピトープまたは他の「外因性」配列は除かれる。
ファージライブラリーおよびコンビナトリアル化学由来のエンドサイトーシスリガンドの
生体内同定
要旨に述べた通り、本出願人は、神経線維内に取り込まれて輸送されるエンドサイトー
シスリガンドを同定および単離するための新規な生体内スクリーニング方法を作製した。
この新規な方法は、本発明を実行する好適な態様であり、本明細書に詳述する通り、当業
者は、この方法を用いて、BBBにより保護されたCNS組織内にポリペプチドを送達するため
に用いることができる改良された遺伝子ベクターを作製することができる。
当該生体内スクリーニング方法および、このスクリーニング方法から得られるエンドサ
イトーシスリガンドを十分に理解するために、エンドサイトーシスリガンド受容体蛋白質
に関する背景情報が提供される必要がある。ほとんど全ての細胞表面受容体と同じく、エ
ンドサイトーシス受容体は細胞外側の膜にまたがっている。従って、これらは３つの異な
るドメインを有する：(i) 細胞を取り囲み接触している水性液により運ばれる分子に露出
し、アクセス可能である細胞外部分；(ii)細胞を取り囲む脂質二重膜に埋め込まれた内部
部分；および(iii)細胞内側の水性細胞質に露出された細胞内部分。
一般に、リガンド受容体は、他の種々の非リガンド受容体とは異なる２つの特性を有す
る。第一の特性は、特定種類のエンドサイトーシスリガンド受容体がそれぞれ、単一種の
細胞外分子（または、場合により、極少数の限られた構造上類似した細胞外分子）と相互
作用し、それにより誘発および活性化されることである。この結合機構は、「鍵と錠」の
関係に匹敵すると考えられる。ある正確かつ特定の大きさと形の少数の鍵だけがある錠に
適する。この特性から、リガンド受容体は、例えば、細胞の外側を浮遊している栄養素を
捕獲し、それらを細胞内部に運ぶ種々の輸送蛋白質から区別される。
第二の異なる特性は、リガンドとエンドサイトーシスリガンド受容体蛋白質とが結合す
る場合、この２つの分子はより長い期間互いに結合していることである。このことから、
リガンド受容体は、アセチルコリン、グルタミン酸、およびその他の古典的な神経伝達物
質により刺激される神経伝達物質受容体から区別される。（大部分の神経伝達物質受容体
で見られるように）ミリ秒単位で測定される代わりに、リガンド結合反応は通常、分や時
間単位で、または日にち単位でも測定される。
エンドサイトーシスリガンド結合反応では、リガンドがリガンド受容体に結合し、リガ
ンド−受容体複合体を形成し、これが細胞内に取り込まれ、そこで典型的にはリガンドお
よび受容体が共に最終的に消化され、それらの構成ブロックがリサイクルされる。これが
どのようにして起きるかを理解するために、動物の大きさ、健康、神経または生殖系、ま
たは他の特性や器官に永続的な変化を誘発するポリペプチドホルモン、例えば成長ホルモ
ン、神経成長因子などを考えるべきであろう。もしこのような種類のホルモンが受容体か
ら遊離されれば、細胞外液中に戻って浮遊し、次には他の細胞上の別の受容体に接触して
それを活性化し、その結果、制御されなかった、そして潜在的に調節されえない効果が生
じるだろう。
本明細書では、用語「エンドサイトーシス」および「取り込み」は互換的に用いられ、
細胞表面上の分子に特異的に結合した（通常は「親和的結合」という）細胞外分子（栄養
素や酸素以外）が細胞内に引き込まれるという細胞によるプロセスを指す。このプロセス
は、リガンドと受容体蛋白質との結合が関与する、受容体の仲介によるエンドサイトーシ
スを含む。またこれは、リガンドが他の種類の細胞表面分子（表面糖質を含む）に特異的
に結合し、他の種類のリガンド複合体を形成し、それが細胞内に取り込まれるというプロ
セスも含む。用語「エンドサイトーシス」および「取り込み」は、リガンド分子と細胞表
面分子が特異的に結合して複合体を形成し、それが次に細胞により取り込まれることに関
与するのであれば、飲作用（非常に小さな粒子や可溶性分子の摂取に関与する）および食
作用（ウイルス粒子や細菌細胞などの大きい粒子の摂取に関与する）というプロセスもま
た含む。
エンドサイトーシスに関連するプロセスはよく知られており、多くの文献、例えばAlbe
rts et al, Molecular Biology of the Cell（第3版、1994）のページ618-626（エンドサ
イトーシスの説明）、636-641（エンドサイトーシスを補助促進するクラスリン蛋白質お
よびトリスケリオン(triskelions)の説明）および731-734（リガンドが膜蛋白質に結合し
た場合の内部構造変化の説明）で検討されている。
ほとんどの種類の動物細胞では、一般的な直径が約10ミクロンすなわち1/100ミリメー
ターの範囲であるので、リガンド−受容体複合体のエンドサイトーシスは、非常に短い距
離間の脂質小胞輸送に関与する。
しかし、神経細胞のリガンド−受容体複合体は、はるかに長い距離を移動しうる。頭脳
および脊髄の多くの神経細胞は、複数センチメーター伸びる長い線維（例えば軸索、樹状
突起、「突起(processes)」）を有し、人間では手足から脊髄まで（またはその逆）神経
信号を運ぶいくつかの種類の神経細胞は１メーターを超える線維を有する。従って、この
ような長い線維内で起こるエンドサイトーシスにより、リガンド−受容体複合体は、いく
つかのリガンド−受容体複合体が最初に神経細胞内に入る所である神経線維の最先端から
、神経細胞の主要な細胞体まで、いかに長くても全ての行程を運ばれなければならない。
前述した通り、分子が、神経細胞の先端（または末端）から、核が存在する細胞の主体
まで軸索または樹状突起に沿って輸送される場合に、「逆行」輸送が起きる。その反対方
向の輸送は「順行」輸送と呼ばれる。さらに「軸索輸送」という用語も認識理解されるべ
きである。多くの種類の神経細胞は、その主細胞体から伸びる最長線維である単一の主線
維を有する。この最長の線維を通常軸索と呼ぶ。用語「軸索輸送」は、分子が移動する方
向とは関係なく（すなわち細胞体へ、または細胞体から）軸索内の分子輸送の任意の形態
を指し、また含む。従って、軸索内で起きる逆行輸送は軸索輸送の一種である。しかし、
本明細書では、移動方向も指摘するので「逆行輸送」という用語の方が好ましい。
エンドサイトーシスリガンド受容体に結合することができる候補リガンドの全てが、取
り込みプロセスを完全に活性化および誘導することができるのではない。一例として、既
知の受容体に実際に結合するモノクローナル抗体をかなり容易に作ることができるが、そ
のような抗体調製品が、受容体を介したエンドサイトーシスの全プロセスをうまく誘発し
て完了することができるという報告はわずかしかない。ラット神経細胞において受容体を
介したエンドサイトーシスのプロセスを誘導して完了することができると報告された抗体
の一例は、最初にIgG-192と命名され、次にMC192と呼ばれたモノクローナル抗体である（
Chandler and Shooter 1984）。この抗体MC192は、1980年代中頃に「低親和性神経成長因
子受容体」として知られ、続いてp75受容体と呼ばれたラット神経細胞受容体に特異的に
結合する。モノクローナル抗体MC192が作られた数年後、他の研究者により、それを放射
性標識してラットに注射したところ、それが取り込まれ、表面にp75受容体を発現した神
経細胞の細胞体に逆行輸送されると報告された（Yan et al 1988）。
この例から、リガンド−受容体エンドサイトーシスを誘導して完了することができる抗
体を理論的には開発することができることが示された。しかし、このような研究成果を人
間の医学に用いる前に、大きな障害が依然残っており、２つの重要な問題点が即座に生じ
る。
第一の問題点は、上記の事実を人間の医学にまで拡張する困難性に関する。明らかに、
抗原またはみ実証されていない抗体断片を人間に注射することは非常に問題であり、多く
の場合不適法である。さらに大事なことに、動物試験においてうまく機能する特定の抗体
が人間においてもうまく機能することを証明するために実行する必要があるスクリーニン
グ試験は、人間の研究において現在認められていない方法で行わないならば、非常に困難
であり、潜在的には不可能である。このような研究試験に直面する障害を真面目に考え始
めるならば（おそらく脊髄組織のサンプルを除去し、分析して、放射性標識されたトレー
サー分子が実際に脊髄に到達するかどうか決定する必要がある）、数日以内に死刑執行さ
れる判決を受けた殺人者、または数日以内に癌または他の末期症状により死亡するであろ
う人間に対して試験を行うことを考えざるをえない。しかし、組織を分析するために人間
の脊髄から固体組織を除去する試験は、現代医学を用いる産業国では認められていない。
第二の困難な問題点は、もし抗体断片自体が、所望のとおりエンドサイトーシス誘発剤
として機能するならば、「エンドサイトーシス受容体抗体断片」は、どのような種類の分
子を一緒に細胞内部に運ぶのかという問題に関する。明らかに、抗体断片は、何も結合さ
れず何も神経細胞内部に引っ張り込めないならば、治療上の価値はない。その代わり、そ
のような抗体断片は、単なる担体（または列車を引っ張る機関車）として見なされるしか
ない。それらは、ある種の「運送物」または「運搬物」分子を、入り込もうとする神経細
胞内に運び込み、または引っ張り込むことができないならば、有用ではない。
しかし、任意の付加的な分子断片をエンドサイトーシス抗体断片に結合すると、生成し
た複合体は必ず大きくなることが、最初から認識されなければならない。複合体の増大に
より、その大きさに応じて、複合体における抗体断片単独と同じ効率で細胞内に引き込ま
れる性質は実質的に低下しうる。このような抗体断片に関して必要とされる研究において
、初期の段階ではこのような問題に答える良い方法はない。その代わり、その輸送担体を
評価し、それ自体で機能することが証明されなければならず、その後に、その担体が「運
送物」または「運搬」成分を運ぶ（または引っ張る）という性質を試験する価値が生じる
。
従って、今日までに公開された報告によれば、エンドサイトーシス受容体に対して作ら
れた抗体のうち少数の組しか、受容体を介したエンドサイトーシスのプロセスを誘導して
完了するという天然リガンドの性質を模倣することができないので、まれに生じる取り込
み抗体を同定するためには、数十または数百のモノクローナル抗体候補をそれぞれ試験す
るので、上記の問題はさらに困難になり費用もかかるようになる。
さらに注意すべきことに、細胞培養条件を用いて候補エンドサイトーシスリガンドを評
価する生体外(in vitro)スクリーニング方法には２つの大きな問題がある。この２つの問
題は、癌細胞および自己免疫疾患に関与する血液細胞に関する研究分野において有効に一
定の進展を示した。
この２つの問題を理解するために、まず注意すべきことに、エンドサイトーシスを活性
化および誘導することができる稀な「干草の中の針である」リガンドを同定および単離す
るためには、候補リガンドの「ライブラリー」または「レパートリー」のほとんどの評価
は、通常、(i) ファージディスプレイライブラリーまたは(ii)「コンビナトリアル化学」
により作製された調製品のいずれかから始まる。ファージ（細菌細胞に感染することがで
きるウイルス）およびファージディスプレイライブラリーは、Koivunen et al 1999, Cab
illy 1999, Shusta et al 1999, Larocca et al 1999, 2001, 2002, Rader 2001およびMa
noutcharian et al 2002などの文献に記載されている。コンビナトリアル化学は、Lockho
ff et al 2002, Flynn et al 2002, Edwards et al 2002, Ramstrom et al 2002, Ley et
al 2002, Lepre et al 2002, Liu et al 2003, Edwards 2003およびGeysen et al 2003
などの文献に記載されている。
ファージディスプレイライブラリーを選別してエンドサイトーシスポリペプチドリガン
ドを同定するために、研究者が生体外細胞培養調製品を使用しようとした場合、２つの大
きな問題にぶつかる：(i) 細胞内に取り込まれることなく、複数の異なるファージが、通
常、細胞表面上の複数の異なる蛋白質やその他の分子に結合すること；および(ii)細胞を
殺して溶解することなく、あるいは細胞および／または取り込まれたファージのその他の
所望のプロセシングを妨害する重大な問題を生じることなく、細胞表面に接着していて、
かつ細胞内に取り込まれなかった任意および全てのファージをリンスし、洗浄し、または
確実に除去することが非常に難しいこと。このような２つの要因から、「偽陽性」の選択
を抑制することが非常に難しい。従って、ファージライブラリーからのエンドサイトーシ
スリガンドの生体外スクリーニングは、細胞培養液中で容易に増殖することができる癌細
胞または血液細胞を用いた研究においてのみ有意義な程度に成功を収めた。これに対して
、凝集性組織を形成する足場依存性の細胞が関与する細胞培養においては、ファージライ
ブラリーからのエンドサイトーシスリガンドの生体外スクリーニングは、実質的な程度に
は成功していない。
上に要約した問題点は、全ての細胞がクローン複製したものであり、全く同一受容体を
有する最も単純な組織培養系にも当てはまる。正常に生存している動物（そこでは、各々
自分自身の特定のセットとして受容体その他の表面分子を有する複数の異なる組織および
細胞が互いに密接に共存しており、そのような異なる組織領域および細胞の間を血液およ
びリンパ液が常時循環している）においてファージライブラリースクリーニング試験を簡
単に実行しようという考えは、ファージライブラリーのスクリーニング技術に精通してい
る技術者および最も簡単な細胞培養条件でさえもこれをうまく実行するのはかなり難しい
ことだと理解する技術者には見られない。
従って、癌および自己免疫疾患を遺伝的に形質転換して治療するために用いることがで
きる改良した遺伝子工学方法およびベクターを開発するために、ファージディスプレイラ
イブラリーを用いる場合、多くの研究が行われ、多くの成果が得られた。しかし、その他
の疾患を治療するために、あるいは身体の中で凝集性組織に存在する神経細胞やその他の
細胞の形質転換を実現する遺伝子ベクターを作るために、ファージディスプレイライブラ
リーを用いる場合には、ほとんど研究されず、ほんの微々たる限られた成果しか得られな
かった。従来技術の下では、正常な動物において生体内試験によりファージディスプレイ
ライブラリーから神経細胞およびその他の凝集性組織の細胞内にエンドサイトーシスを介
して取り込まれるものをスクリーニングする際に偽陽性を排除する試みおよびその困難性
は、非常に大変で厄介なので、この研究分野における実質的な進展は事実上抑制されてい
る。本発明前には、誰も、本発明の生体内スクリーニング方法により今や達成することが
できる結果のために、どのようにファージディスプレイライブラリーを使用するべきか理
解していなかった。
従って、以下において図７〜９を参照して、この新たに開発した生体内スクリーニング
方法を説明することができる。更なる情報は実施例22〜31にある。
好ましい態様では、この生体内スクリーニング方法は、ラットやマウスなどのげっ歯類
の坐骨神経を用いる。双方の種は安価であり、交配および生育しやすく、小型哺乳動物の
ほとんどの遺伝子研究において標準的な動物モデルとして用いられている。膨大な基礎情
報、種特異的バイオ分子（例えば遺伝子プロモーター配列、遺伝子コード配列、モノクロ
ーナル抗体など）および特別な動物家系が、マウスを用いた遺伝子研究のために開発され
てきた。これらの情報は、インターネットサイト、例えばwww.informatics.jax.orgおよ
びwww.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmHome.htmlから自由に得ることができる。ラット
遺伝学のための対応する情報、試薬および家系はいくらか少ないが、それでも膨大で、か
つ非常に有用であり、例えばhttp://rgd.mcw.edu, http://ratmap.gen.gu.seおよびwww.h
gsc.bcm.tmc.edu/projects/ratなどのインターネットサイトから得ることができる。
ラットは、マウスより大きいので、坐骨神経（動物の両側にあり、脊髄から腰および脚
を通って足先まで伸びる）の研究がやりやすい。これは、下記にしめすような周知の方法
により行うことができる。
しかし、マウスでも、坐骨神経は、本明細書に開示した方法により必要な手術操作がで
きるほど十分に長く、かつ十分に識別可能である（このような研究を依然にしたことのあ
る研究者が操作する場合には特に）。さらに、眼科外科医および神経外科医により一般に
用いられる双眼顕微鏡や手術道具を用いて、マウスにおける手術操作を行うことができる
。手術方法に関する追加の説明は実施例25にある。
また必要ならば、その他の種類の実験動物（霊長類、哺乳類以外の脊椎動物、またはあ
る種の無脊椎動物）について、この生体内スクリーニング方法に用いることができるかど
うかを評価することができる。特に、いくつかの動物は、格別に大きな神経軸索を有する
ことが知られている。一例として、ある種のイカは、推進力を生む筋肉を制御する「巨大
軸索」を有する。同様に、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞は、異常に大きい細
胞成分を有するので、研究所では広く用いられている。異常に大きい神経線維または神経
束を有するイカやその他の動物を、必要ならば、本明細書に開示した通りに用いることが
できる。
図７に模式的に示すように、候補リガンドを坐骨神経束に接触するように配置すること
ができる。このことを実施例25および26で詳細に説明する。簡単に述べると、誘導性受容
体（例えば低親和性p75神経成長因子受容体）を標的にする場合、最初の結紮1102を、坐
骨神経束1090の周りに配置して締め付ける。この結紮1102は、神経束の周りに縫合糸を巻
き、それから締め付けて縛ることによって作る。このようにして作った結紮は止血帯とし
て機能し、神経線維内の液体および分子の正常な流れを妨害する。
図７に示す通り、結紮1102は、坐骨神経束1090が、脚と足の異なる部分に作用する２つ
の主要な分枝に分かれる所である「脛骨神経二分岐」1092に隣接するように配置すること
ができる。結紮1102は、好ましくは脛骨神経二分岐1092の上流で、かつその極近くに配置
するべきである。背景のところで述べた通り、用語「上流」および「近位」は、動物の脊
髄により近い位置（図７の右側方向）を指す。反対に、用語「下流」および「遠位」は、
脊髄から離れて、より脚および足に近い位置（図７の左側方向）を指す。
結紮1102の目的は、坐骨神経束の表面に発現しているp75受容体の数を増やすことであ
る。p75受容体は、神経細胞にホルモン様効果を示すポリペプチドである神経栄養因子類
（神経成長因子類ともいう）と相互作用する。かなり早くに発見されて最も知られている
このような分子は神経成長因子と呼ばれた。さらにこのような分子が発見され、例えば、
脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4/5などと命名
された。神経栄養因子類は神経細胞を効果的に刺激して、通常、代謝活性の増加、他の神
経細胞とのシナプス接続の追加形成などを誘導する。運動神経細胞の神経線維が損傷また
は障害を受けた場合、その運動神経細胞が応答する方法の一つは、神経線維上のp75受容
体数を増やして、周囲の細胞外液に存在しうる任意の神経成長因子分子類を捕捉および結
合する機会を増やすことによる。神経線維表面上のある種の神経受容体を「上方制御(upr
egulating)」するという当該プロセスが見出され、この発生は、ある種の神経変性疾患、
特に筋萎縮性側索硬化症（ALS、ルー・ゲーリック病、および運動神経疾患ともいう）に
おいて認められた。また種々の外傷後にも発生する。
従って、結紮1102は、このような神経応答を利用するために設計されている。神経線維
の周りに縫合糸を巻いて締め付け、線維内の液体の流れを止めるように結紮を作ることに
より、脊髄と結紮部位との間の神経線維の全長に沿ってp75受容体を増加させることがで
きる。種々の検査、例えばp75受容体に結合するモノクローナル抗体を用いた染色検査に
基づき、p75受容体の増加は約10〜15倍と推定される。
このような神経線維による結紮に対する受容体発現応答は約１週間にわたって起きる。
従って、結紮1102を坐骨神経束の周囲に配置し締め付けた後、その傷を閉じて縫合し、次
の手術を行う前に、その動物に少なくとも数日間、好ましくは約１週間、回復時間を与え
るべきである。
第二の工程では、互いに約２〜３cm離して２つの異なる部位を外科的に開く。一つの部
位は、結紮1102を配置した部位に近接したところであり、実際、前と同じ部位を外科的に
開いてもよい。この部位で、メスまたははさみを用いて２つの端（直角、斜めなどでよい
）を生じるように坐骨神経束を切断する。これらの切断は、結紮1102の直ぐ上流と下流で
行われ、該結紮を含む神経束の小さな部分を切り出し、捨て去ることができる。これらの
切断により神経束に２つの端、遠位端1094（これはもはや活性でなくなる）および近位端
1130（脊髄方向側）が生じる。
坐骨神経束1090を切断した部位に一塊の物質1150を配置する。この塊1150は、多数のフ
ァージ粒子（好ましくは数百万または数十億の「コロニー形成単位(cfu)」）を含む多孔
性かつ透過性の物質（例えばコラーゲンゲル発泡体）から成る。この塊1150をこの位置に
、(i) 塊1150に含まれるファージ粒子と(ii)坐骨神経束1090の切断端1130とが持続的に密
接するように配置して固定するべきである。
このような配置と固定を、例えば下記の通りに行うことができる。
(a) 縫合糸1132を用いて、坐骨神経束1090の２つの切断端1094（遠位切断端）および1130
（近位切断端）を結びつける；および
(b) 塊1150の周り、および坐骨神経1090の２つの切断端1094および1130の周りにシリコー
ンゴムなどの防水材からできた小さなスリーブ(sleeve)またはカフ1136を巻きつけて固定
し、その塊および２つの神経端を小量の防水円筒内に包含する。必要ならば、スリーブ11
36を、その周りに１本以上の縫合糸を巻いて縛ることにより、スリーブの外側表面に接着
材の小滴またはビーズを配置することにより、あるいはその他の適当な手段により固定す
ることができる。
従って、ファージ粒子を含む物質塊を配置する当該部位を、ファージ配置部位またはフ
ァージ接触部位と称する。この部位は、ファージ粒子のライブラリーまたはレパートリー
が坐骨神経の切断端に接触する部位である。エンドサイトーシスを（例えば神経線維表面
のp75受容体を介して）誘発するポリペプチド配列を表面に出現させたファージ粒子は、
この部位で神経線維によって取り込まれる。
別個の部位で、好ましくはファージ配置部位から約１ｃｍ以上離れた部位で、第二の部
位を外科的に開き、第二の結紮1202（縫合糸の輪によって作る）を坐骨神経束の周りに配
置し、締め付けて縛る。ラット臀部は、坐骨神経線維の外側に接着したファージによって
起こる偽陽性の大きな危険を排除するのに十分にファージ配置部位から離れた都合の良い
位置であるので、当該部位は、好ましくは臀部領域にあるべきであり、本明細書ではそこ
を臀部結紮部位と呼ぶ。臀部結紮1202は、坐骨神経束1090の周りの狭窄または止血帯とし
て作用し、神経線維内でその閉塞点を超えて液体や分子が実質的に流れることを抑えるた
めに十分にきつくなければならない。従って、この結紮は、神経束の内側に、かつ臀部結
紮1202の下流側にファージ蓄積領域を形成する。
そのラットの傷を閉じて縫合し、適当な時間（例えば約18時間）放置することによって
、エンドサイトーシスのプロセスを効果的に活性化および誘導することができるリガンド
を保持しているファージ粒子が、神経線維内に入り、続いてかなりの長さの神経線維を脊
髄に向かって逆行輸送されるために十分な時間を与える。
この放置時間後に、ラットを苦痛なく殺し、臀部結紮部位を開き、その臀部結紮の直ぐ
下流の隣接する坐骨神経束の領域を取り出す（回収する）。次に、この短い神経線維束を
小片に分け、ファージ粒子を損傷させることなく細胞膜（脂質二重層から成る）を部分消
化する化学物質により処理する。この処理により、神経線維内に取り込まれた生きたファ
ージ粒子を回収および単離することができる。
上述した一連の生体内スクリーニングを行うことによって選択されたファージ粒子を、
所望の方法により増殖させ、および／または操作することができる。一例として、本明細
書に開示した生体内スクリーニング方法により選択したファージ群を用いて、下記方法の
いずれかまたは全てを行うことができる。
（１）ファージが「ファージミド」（ファージが単に細菌の複製起点を有することが必
要である）である場合、それをヘルパーファージなしに大腸菌を用いて増幅して、プラス
ミド形状の二重鎖DNAを作製することができる。様々な有用な技術、例えば所望量の環状
プラスミドDNAの合成など、が可能となるので、現代のファージディスプレイライブラリ
ーのほぼ全てがファージミドを使用している。
（２）選択したファージを、ヘルパーファージと共に大腸菌を用いて増幅して、ssDNA
を含有する新しい完全に感染性のファージ粒子を作製することができる。これらのファー
ジ粒子を、別の生体内スクリーニングサイクルにおいて開始材料として用いることができ
、（初期のサイクルにおいて）それを用いて、エンドサイトーシスファージの「濃縮群」
を、エンドサイトーシス誘導効率がさらにより高いリガンドを含むであろう「精鋭群」に
精製することができる。
（３）ファージ分析に適当であることが示唆されるまで十分な回数のスクリーニングサ
イクルを行った後（多くの場合、少なくとも１回から約３回までのスクリーニングサイク
ル後、いくつかの場合、おそらくより多くの回数後）、生体内スクリーニングの最終回に
より（実際には任意回の生体内スクリーニングにより）選択されたファージを用いて、下
記の一方または両方を作製することができる。(i) 特定のエンドサイトーシスリガンドを
コードする遺伝子の正確な配列を決定するためにヌクレオチド配列決定法を行うために、
所望量の二本鎖または一本鎖DNA；および／または(ii)特定コート蛋白質中のリガンドド
メインのアミノ酸配列を決定するために処理および配列決定法を行うために、エンドサイ
トーシスリガンドを有する所望量の可溶形状のコート蛋白質。
生体内スクリーニングの結果の写真確認
本明細書に開示した生体内スクリーニング方法の有効性および成功が、図８の写真によ
り視覚的に示される。この写真は、当該生体内選択方法の実際の試験において、蛍光試薬
を用いて撮られたもので、坐骨神経束内に取り込まれたファージの位置と濃度を示す（こ
の試験に用いたファージの調製と染色試薬は、下記実施例27に記載する）。図８の写真の
左側は、図７に示すファージ蓄積領域1204に相当する神経部分におけるかなり高濃度の蛍
光標識されたファージを示す。写真中央部の詰まった狭いゾーンは、腰部の結紮1202によ
り作られた。写真の右側は、腰部結紮に近い側の坐骨神経（すなわち脊髄方向のもの）を
示す。腰部結紮1202をぎりぎり通過して、坐骨神経のその部分に達することができたファ
ージはほとんどまたは全くないので、その部分に蛍光標識はほとんど示されない。
生体内スクリーニングとコンビナトリアルケミストリーの併用
エンドサイトーシスリガンドの生体内スクリーニングおよび同定のための、本明細書に
開示した一般的な方法は、「コンビナトリアル」化学合成によって作られた候補リガンド
分子と共に用いることができる。過去20年間にわたって、この方面の化学合成とスクリー
ニングが著しく活発になった。2003年4月における国立医学図書館のデータベース検索か
ら、この研究分野には900を超える総説記事が判明した。最近の総説には、Lockhoff et a
l 2002, Flynn et al 2002, Edwards et al 2002, Ramstrom et al 2002, Ley et al 200
2, Lepre et al 2002, Liu et al 2003, Edwards 2003およびGeysen et al 2003がある。
これらの総説に記載された合成方法および手法を用いて、幅広く、非常に多様なコンビナ
トリアルライブラリーを提供することができる。
このようなコンビナトリアルライブラリーの本質的な特徴の一つは、当該ライブラリー
を、少なくとも１種類以上のスクリーニング試験に適用する必要があることである。そう
でなければ、数十万、数百万の異なる候補の混合物は全く無価値であろう。なぜなら、誰
も、数千万、数百万の候補の混合物のうち、どの化合物が、なんらかの目的のために有用
であるか予想できないからである。
従って、任意の種類のコンビナトリアルライブラリーは、１または複数の有用な方法で
候補化合物を同定または操作するために用いることができる（すなわち、反応やスクリー
ニング法によって修飾、単離、あるいは識別される特定の化合物を同定または操作するこ
とができる）一種の「ハンドル」を有する候補化合物を提供するように、作られる。
かなり多様な当該「ハンドル」が知られており、種々の周知の方法により、少なくとも
１つの、通常は複数の当該「ハンドル」を、本明細書に開示する神経線維の操作を用いた
コンビナトリアルライブラリーの生体内スクリーニングに適用することができる。例えば
、コンビナトリアルケミストリーの全項目を処理および調節するために用いることができ
る周知の部類の「ハンドル」方法には、下記のものが含まれる。
１．通常プラスチック、デンプンまたは類似化合物から製造される微小なビーズ、チュ
ーブまたはその他の固体表面。これらのビーズやその他の固体表面は、通常、基材または
「アンカー」として作用し、化学鎖の結合部位となる反応性基を（その表面上に）有し、
その反応性基に化学鎖が付加される。必要ならば、哺乳類細胞により貪食摂取されるのに
十分に適する直径を有する当該微小ビーズを作ることができる。
２．コンビナトリアルライブラリー中の各候補化合物において１回だけ生じる特別な反
応部分。このような独特の反応部分を用いて、結合、化学反応、またはそのほかの操作を
行うことができ、これを用いて、スクリーニング方法のいずれの段階でも、またはその実
行後でも、目標位置に輸送された特定の化合物、注目する化学反応または細胞反応に関与
した特定の化合物、あるいは、スクリーニング試験中に、成功しなかった候補とは異なっ
て作用した特定の候補化合物を、沈殿、濃縮、またはそのほか集積、単離、結合、標識、
あるいは操作することができる。
３．ある波長の光によって励起した場合に別の波長の光を放射する非毒性の蛍光「標識
」または「タグ」。これにより、「フローサイトメーター」という（セルソーターなどと
もいう）装置を用いて、蛍光活性を有する細胞または粒子を分離することができる。分類
機能を有する典型的なフローサイトメーターでは、何百万の細胞または粒子が、一度に、
既知の、または調節した速度で細いチューブを通過することができる。この経路の一箇所
で、各細胞または粒子は、励起波長光の中を通過する。蛍光標識またはタグを含む、また
はそれに結合した各細胞または粒子は、異なる波長の光を放射することにより応答する。
ナノ秒間で生じるこの蛍光を、蛍光波長に合わせた光学センサーが検出する。蛍光センサ
ーが、ある細胞または粒子により放射された蛍光を検出すると、細胞または粒子の流路の
少し下流の位置で、少量の気体または液体の噴射の引き金をひく。この気体または液体の
噴射は、蛍光細胞または粒子が経路中の連結点を通過する時点に合わす。気体または液体
の噴射により蛍光細胞または粒子は、流路中の片側に押し出され、分離収集チューブ内に
入り、収集容器まで運ばれる。このように、フローサイトメーターは、数時間または数分
間でも何百万の細胞または粒子を処理し、そして何百万の集団の中から単一の蛍光細胞ま
たは粒子でさえ単離することができる。
４．その他の種類の標識またはタグ。例えば放射性同位体、または磁気共鳴映像法、ラ
マン散乱などの最新の分析方法によって位置確認および追跡することができる特別な分子
構造を含む化合物。
５．一分類の候補化合物がポリペプチドを含むか、またはそれに関連する場合には、フ
ァージディスプレイライブラリーは、このようなポリペプチドを処理するために非常に強
力で、柔軟で、かつ適合する「ハンドル」系を提供する。高度に効果的で、かつ潜在的に
有用なリガンドポリペプチドを有する単一のファージ粒子を単離しさえすれば、その単一
ファージ粒子を、急速に完全なコロニー株に増殖させることができ、これから、本明細書
に記載の方法や当業者に周知の方法を用いて、ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコ
ードする遺伝子を無制限に供給することができる。
実際、PhD-C7Cファージディスプレイライブラリーは、ポリペプチドとの使用に適合し
たコンビナトリアル法の一例を提供する。このライブラリーでは、本質的にランダムな７
アミノ酸長の短ポリペプチドを、コンビナトリアルケミストリーによって作った。これら
のランダムに作られた短ポリペプチド配列をファージ粒子内に組み込んだ。これらのファ
ージ粒子は、PhD-C7Cライブラリー中のコンビナトリアルな分類群のポリペプチドを操作
、増殖および選別するために用いることができる「ハンドル」を提供する。
上記のとおり、コンビナトリアルライブラリーは、必ず、研究者がそのライブラリー中
の候補化合物を処理および操作することができる少なくとも１種のシステムまたは機構を
受け付けるように作られなければならない。そのほか、効果的かつ論理的な方法により選
別することができなければ、このようなライブラリーを作ることは無意味であろう。従っ
て、コンビナトリアルライブラリーを選別するために過去20年間に開発された広範かつ多
様な方法は、非常に洗練されており、かつ強力である。従って、本明細書に開示された生
体内スクリーニング方法は、コンビナトリアルケミストリーによって作られた候補化合物
を選別するための１つのより新しい（そして潜在的に強力で有用な）方法を単に提供する
ものとみなすことができる。
生体内スクリーニングを、他の受容体、他の種、そして他の神経細胞類に拡大する遺伝子
工学方法
関連技術分野の研究者に明らかな種々の方法により、最初にラットの坐骨神経の運動神
経細胞を用いて開発および試験された本発明を、研究者、医者、その他の者にとって興味
のあるいくつかの方向に拡大拡張することができる。
一例として、神経解剖学および神経追跡研究分野の研究者に明らかな方法により、本発
明を、坐骨運動神経細胞以外に広げて、(i) ファージライブラリーを前眼房内へ注射した
後に、上頚神経節から伸びる交感神経突起および三叉神経節の感覚神経から伸びる感覚神
経突起と共に；(ii)試験ライブラリーを鼻腔内に投与した後に、嗅覚受容感覚神経細胞（
収集性嗅球組織）、三叉神経節の感覚神経、および上頚神経節の交感神経と共に；(iii)
後眼房内に注射した後に、網膜神経節の感覚神経細胞と共に；そして(iv)側脳室やそのほ
かの脳室内に注射した後に、中枢神経系の種々の神経細胞と共に用いることができる。こ
のような方法により、上記の特定の分類群の神経細胞が関与する疾患を診断および治療す
る際に用いるために、上記の特定神経細胞群によって天然に発現されたエンドサイトーシ
ス受容体を標的とするリガンドを同定および単離することができる。
同様に、細胞工学および分子生物学の研究者に明らかな方法により、最初にラットのp7
5受容体を用いて開発および試験された本発明を拡大拡張して、(i) p75受容体以外のエン
ドサイトーシス受容体と共に；(ii)受容体以外のエンドサイトーシス表面分子と共に；(i
ii)ラット以外の種に存在するエンドサイトーシス受容体、例えばヒトの受容体と共に；
そして(iv)神経細胞以外の特定の種類の細胞および組織に存在するエンドサイトーシス受
容体（例えば、腎臓、肝臓、肺、心臓などの細胞の表面にのみ通常かなりの数で存在する
受容体）と共に用いることができる。
この種の研究は、多数の事例で行われてきた。なぜなら、特定の種類のヒト受容体蛋白
質をコードするヒト遺伝子配列が一旦判明すると、そのヒト遺伝子配列（またはその一部
分）を用いて、マウスやラットなどの異なる種類の動物を形質転換することができるから
である。そして遺伝的に形質転換された動物は、ヒトアミノ酸配列と全く同じ配列を有す
るヒト受容体蛋白質を発現する。ほんの一例として、ヒトやそのほかの霊長類においてあ
る種の運動神経細胞にポリオウイルスを感染させることができるヒト受容体蛋白質を用い
て、マウスを形質転換した。従って、この形質転換マウスを安価な動物モデルとしてポリ
オおよびポリオウイルスの研究のために用いることができた。
同様にして、どのようにして、この種の遺伝子工学を、本明細書に開示した生体内スク
リーニングを実行するために適合させることができるのかということを示す例として、当
分野に周知で利用可能なDNA配列、試薬および方法を用いて、当業者は、下記の一連の工
程を実行することができる。
１．完全に配列決定されたp75遺伝子のヒト相同体（Johnson et al 1986）を、マウス
またはラットに通常見出されるp75遺伝子プロモーターの支配下に、キメラ遺伝子として
組み込むことができる；
２．このp75遺伝子のキメラ体（マウスまたはラットプロモーター／ヒトコード配列）
を用いて、選択した種類のマウスまたはラット、例えばp75受容体の発現を適当に抑制し
たノックアウト変異を有するマウス系統を遺伝的に形質転換することができ、このような
家系は、Jackson Laboratories社（www.jax.orgまたはwww.jaxmice.jax.org）からストッ
ク番号002213（家系名B6.12954-Ngfrtm1Jae）として入手できる；
３．この形質転換マウスまたはラットは、ヒト型p75受容体蛋白質を発現し、ヒトp75受
容体は、ラットp75受容体蛋白質が通常存在するのと同じ所、例えば血液脳関門の外側に
伸びる坐骨神経線維の表面に出現する；
４．次にリガンドライブラリー（例えばscFvまたはPhD-C7Cファージディスプレイライ
ブラリー）を、本明細書に開示したのと同じ方法によりスクリーニングして、ファージ粒
子のリガンドドメインとヒト型p75受容体との結合を介してエンドサイトーシスにより取
り込まれ、逆行輸送される候補ファージを同定する；
５．代替または追加として、ラットp75受容体蛋白質を介して細胞内に入ることが見出
されたリガンドを、生体外で試験して、該リガンドが、ヒトp75細胞受容体を有する細胞
（例えば懸濁培養中で容易に増殖し、天然型ヒトp75を発現するヒト神経芽細胞腫細胞株
）にも入ることができるかどうか決定することができる；
６．代替または追加として、ラットp75受容体を介してラット神経線維内に容易に入る
リガンドのエンドサイトーシスの効率が、非常に高くはないがかなり高く、そのリガンド
がヒトp75受容体と相互作用する場合、そのリガンドを開始化合物にして、(i) 部位特異
的またはランダム突然変異誘発法を用いて、ラットp75結合リガンドの種々の類似体を作
り、そして(ii)生体内スクリーニングを用いて、ヒトp75受容体を介して容易に細胞内に
入ることができる有望な類似体を同定および評価することができる。
これらは、どのようにして、本明細書に開示した生体内スクリーニング方法を、ヒトの
治療、診断、分析および研究に用いるために、ヒト細胞内に運送物(passenger)分子また
は運搬物(payload)分子を効率的に輸送することができるリガンドを発見、単離および分
析するための使用に適合させることができるのかということを示すほんの少数例である。
本発明により実現される分子複合体および方法
本明細書に開示したスクリーニング方法の真の価値は、エンドサイトーシス取り込みを
活性化および実行することができる特定のリガンドを同定する行為ではなく、続いて、こ
のような選択したリガンドを、治療、診断および類似の目的に用いることができる「分子
複合体」に組み込んで用いる能力に由来する。
本明細書中、用語「分子複合体」とは、少なくとも２つの異なる成分、すなわち少なく
とも１つのリガンド成分および少なくとも１つの運送物または運搬物成分を含む分子集合
体を指す。
該リガンドまたは該リガンドを含む分子複合体に言及するクレーム内に包含されるため
には、リガンド成分は下記の２つの判定基準を満たさなければならない。
第１に、該リガンド成分は、本明細書に開示した生体内選別方法により同定されたもの
である必要がある（すなわちクレーム１などのクレームにより保護されるために、該リガ
ンド成分は、このような選別をするために少なくとも神経線維内へのエンドサイトーシス
取り込みが必要である生体内選別方法により同定されたものである必要がある）。この種
の同定は、本発明のスクリーニング方法において、そして実際にこの方法により同定され
たリガンドを用いた分子複合体の形成において必須の工程である。この事実を説明するた
めに、何十億の候補リガンドポリペプチドを含むファージライブラリー（例えば実施例28
および29において用いて選別されたscFvライブラリーなど）は、表面にp75受容体を有す
る細胞内に運送物成分を運搬するために用いることができる有能で、特異的で、効果的な
エンドサイトーシスリガンドとして完全に機能することができる候補リガンド配列を実際
に有する何百の、何千の、または何百万ものファージ粒子を実際に含有すると推定するこ
とができる。しかし、このように巨大なライブラリーでは、理論的に有能な何百の、何千
の、または何百万ものファージ粒子は、当該目的には全く無用であり、運送物分子と結合
して、治療を要する動物または人間に注射すると望ましくない全ての反応を招くであろう
他の何十億のファージ粒子により取り囲まれている。
明らかに、既知の有用なエンドサイトーシス活性を有するリガンド配列を有する当該フ
ァージを同定および単離するために必要とされるスクリーニングおよび処理工程は、所望
の有用な治療上、分析上または類似の結果を実際に達成することができる分子複合体の作
成において絶対に重要な工程である。
本明細書または特許請求の範囲に記載のとおりに分子複合体中の運送物または運搬物成
分を輸送するために用いられるリガンド成分に適用される第２の条件は、本明細書に開示
した生体内スクリーニング方法によって最初に同定されたリガンド成分を含む分子複合体
が、そのリガンドが結合するエンドサイトーシス表面分子を有する標的種類または分類群
の細胞内に実際に入ることができる必要があることである。このような分子複合体が、少
なくとも１つの上記分類群の細胞内に入ることができないとすれば、その分子複合体は、
特許請求の範囲により保護されず、かつ保護されることを意図しない。
しかし、明白なことに、特定かつ標的の種類のエンドサイトーシス表面分子を介して細
胞内に入ることができる特定リガンドがいったん同定されたならば（そしてその特定リガ
ンドがポリペプチドである場合、そのアミノ酸配列がいったん判明したならば）、その特
定リガンドを所望量で合成することができ、それをエンドサイトーシス輸送系として用い
て、広範な有用な「運送物」または「運搬物」分子を標的細胞に運ぶことができる。従っ
て、本明細書に開示した新規で強力な生体内スクリーニング方法によってこのようなリガ
ンド成分が同定された後には、そのようなリガンドをエンドサイトーシス輸送成分として
用いる場合、「運送物」または「運搬物」分子をも含む分子複合体において、それらは特
別な種類または分類群の運送物または運搬物分子に限定されない。
本明細書では、用語「運送物(passenger)分子」と「運搬物(payload)分子」は相互に交
換可能であり、その運送物分子が、リガンド成分が結合するエンドサイトーシス表面分子
を有する標的細胞内に入った後に、１または複数の有用な機能または効果を発揮するとい
う複合分子（上記リガンドを含む）中の一部分を指す。当該用語は広義に解釈されるもの
であり、一般的には、運送物または運搬物分子とは、当該用語が他の輸送様式においてど
のように使用されているかということを認識して解釈されなければならない。車、バス、
列車、航空機および自転車は全て、他の輸送手段では実際上簡単には達成することができ
ない速度および距離にて乗客を運ぶことができるので、有用である。同様に、貨物列車、
トレーラー車、タンク車および船は、貨物（これは目的地に輸送する場合には有料貨物と
みなしうる）を運ぶことができるので、有用である。車、バス、列車、航空機、自転車お
よび船は非常に有用かつ有益な輸送様式であり、これは単に１人の特定人を１つの特定地
に運ぶことができるからだけではなく、多数の様々な人または貨物を、多数の選択した目
的地に運ぶことができるからである。
従って、本明細書で記載および考慮される運送物または運搬物は広義に解釈されるべき
であり、下記の主要な分類を含むが、それらには限定されない：
(1) 動物を遺伝的に形質転換するため、または遺伝子治療を必要とする人間を医学的に治
療するためのものである遺伝子ベクターの一部分であるDNAセグメント。実際、本研究の
第一の目的の一つは、望ましくない副作用の危険および程度を大きく増やすように他の種
類の細胞の状態または活性を壊すことなく、特定の種類の細胞だけを特異的に標的として
形質転換させることができる新しい種類の遺伝子ベクターを作るために用いることができ
る細胞標的化成分を同定および作成することであった；
(2) 人間の医学または獣医学に用いるための治療用および／または診断用化合物（例えば
医薬、画像化用化合物など）；
(3) 標的種類の細胞に効率よく輸送することができると、産業上の研究や開発などにおい
てより有用となる分析化合物、試薬およびその他の物質。
最後に、同様に注意すべきことに、リガンド成分および運送物または運搬物成分の両者
を含む分子複合体は、当該２つの成分を結合および団結する何らかの有効な手段を有し、
少なくとも運送物または運搬物成分が標的細胞内に確かに取り込まれるまでは団結してい
る複合体を形成する必要がある。場合により、運送物または運搬物成分に応じて、直接的
な共有結合により、または「配位」結合（この用語は、共有結合とイオン結合との中間の
強度および／または安定度を有する種類の分子結合を指す）により、運送物または運搬物
成分をリガンド成分に直接に連結することができる。しかし、運送物成分をリガンド成分
に直接に連結した場合、この種の分子複合体は、少なくともいくつかの目的用途には適さ
ないだろう。なぜなら、分子複合体が標的細胞内に入った後、しばしば運送物成分はリガ
ンド成分から遊離される必要があり、従って運送物成分は、リガンド成分が連結したまま
ではその目的機能を発揮できないからである。同様に、このことは、車、トラックまたは
バスは、目的地に到着したならば乗客を降ろすことができるドアを備えているので、実質
的により有用であるということに匹敵する。
従って、本明細書に開示したリガンド成分と運送物成分を有する分子複合体のほとんど
の種類は、適当な「連結成分」をさらに含むべきであり、この連結成分は、下記の２つの
異なる要件を調整する適当な手段によりリガンド成分と運送物成分とを連結するものであ
る：(i) 連結手段は、リガンド成分はその機能を果たして、運送物成分を細胞内部に入り
込ませる一方で、分子複合体を完全に維持することができるほどに十分に強くかつ安定で
ある必要があり、および(ii)多くの場合で、運送物成分が、リガンド成分と連結している
間は、その所望の効果が発揮できないならば、連結手段は、分子複合体が確かに細胞内に
入った後に、運送物成分が、最終的に分子複合体から遊離または分離することができる種
類の構造または機構を有する必要がある。
本特許出願は、上記の２つの拮抗する要件を達成および／または調整することができる
連結成分の候補を包括的に記載するのには適していない。多種類の連結成分候補が、薬物
送達分野の技術者には周知であり、従ってリガンド成分、運送物成分および標的細胞種の
全てが完璧に詳細に判明した後に、本明細書に開示した所定の分子複合体での使用に関し
て、任意の連結成分候補を評価することができる。
特定の種類の分子複合体を、既知のリガンド、既知の運送物成分、および既知の標的細
胞種を最適に組み合わせるように設計する場合に、利用できる選択肢の範囲を概括し、実
務上紹介するために、広範な連結成分の種類のいくつかを簡単に述べる。
１．比較的に非特異的な反応基により共有結合を形成する架橋剤、例えばグルタルアル
デヒド、および調節可能な長さのスペーサー鎖の両端に２つのアルデヒドまたはそのほか
の非特異的反応基を有する化合物。
２．特異的な分子基によってのみ共有結合を形成する架橋剤。例えば、実施例24に記載
した「スルホ−SMCC」であり、これは、遺伝子ベクターや親和的精製などの用途のために
、DNA鎖の末端をポリペプチドのリジン残基に架橋するために用いられる。
３．非常に高いレベルの接着性および親和性を有する親和性結合剤（実施例27に記載の
ようにビオチンとアビジンという２つのポリペプチド間で起きるようなもの）、および所
望のより低い、しかし実質的なレベルの接着性および親和性を実際に有する親和性結合剤
（親和的精製法において溶離条件を調節するなどの種々の手段により調節することができ
るもの）。
４．２つの成分を結合させるためにイオン引力および／または水素結合を用いる結合剤
。イオン引力および水素結合は特に強くはないので、典型的には、この種の結合剤は、か
なり狭い範囲に一緒に集まった全て同一極性の多数のイオン電荷を有する化合物である。
例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、およびDNA鎖およびRNA鎖の骨格中の陰性荷電
リン酸基と引き合って結合するほかの陽性荷電化合物がある。
５．分子複合体を酸性に晒すと（例えば、細胞内の酸性の消化器官であるリソソーム内
で起きる）、弱くなり壊れるように設計された特別な種類の接続分子。このような種類の
接続分子は、米国特許4,631,190 (Shen et al 1986)および5,144,011 (Shen et al 1992)
に記載されている。
上記のことは単なる簡単な概説であり、他の種類の接続分子もまた当業者に知られてい
る。しかし、運送物成分をリガンド成分に連結するために、広範な種々の強度、安定性お
よびその他の特性を備えた多様な周知の選択肢が利用できることは明らかである。
実施例22〜32の概括（生体内スクリーニング法）
実施例22〜31に記載の方法は複雑であり、それらの試験では特別なタイプのファージお
よび細胞を試薬として用い、そしていくつかの試験方法は、本出願人が成功しなかった以
前の方法を分析した後に選択して最終的に解決したものである。従って、このセクション
では、これらの実施例および得られた情報の構成に関して概括し、簡単な説明を行う。
実施例22は、使用した３種類のバクテリオファージを記載する。これらは、（１）エン
ドサイトーシスリガンドを保有しないM13KO7ヘルパーファージ；（２）約130億種のファ
ージミドを有するscFvライブラリーと称されるファージディスプレイライブラリー、ここ
で各ファージミドはヒト抗体に通常現れる候補リガンドを有する；および（３）「コンビ
ナトリアルケミストリー」により相互にランダムな配列である７アミノ酸残基を有する小
さな外来ポリペプチド配列を保有する、PhD-C7Cライブラリーと称するファージディスプ
レーライブラリー、である。
実施例23は、使用した宿主細胞（主に大腸菌TG1株）、および様々なファージ群におい
てそれらの特定ファージ群を増幅し、その力価を測定するために用いたいくつかの技術を
記載する。
M13KO7ヘルパーファージは、リガンドポリペプチドを保有していないが、抗体−ファー
ジ結合体を作成するために用いられるので、実施例22に最初に記載される。これらの結合
体は、このヘルパーファージの表面に架橋された、ラットp75受容体によって取り込まれ
ることが知られている複数のMC192モノクローナル抗体を表示するために調製される。
これらの抗体−ファージ結合体が最初に試され、坐骨神経線維によって取り込まれること
が示された。従って、これらのことから確立された一組のツール（プローブ薬剤に匹敵す
る）を用いて、本出願人は、ラットにおいて坐骨神経線維を操作することによって生体内
でエンドサイトーシスをスクリーニングすることが可能となる効果的な方法のコンセプト
と詳細を考え出すことができた。実施例24には、抗体をヘルパーファージに架橋する方法
が記載される。実施例25および26には、最終的に坐骨神経において抗体−ファージ結合体
のエンドサイトーシスおよび逆行輸送を達成した方法が記載される。実施例27には、図８
に示すように、抗体−ファージ結合体のエンドサイトーシスおよび逆行輸送を証明する写
真を撮るための方法および試薬が記載される。
抗体−ファージ結合体を用いて、p75を介してファージ粒子を信頼性よく取り込むため
の一組の一貫した方法を開発した後、本出願人は、scFvライブラリーと称するファージデ
ィスプレイライブラリーの試験を開始した。実施例22には、このライブラリーの主な特性
が記載される。非常に簡単に述べると、このライブラリーは、もともとヒトＢ細胞から得
られた莫大な数（おおよそ130億）の外来遺伝子インサートを有する。これらの遺伝子イ
ンサートは、種々の祖先のヒトからの広範なヒト抗体の「可変断片」をコードする。この
ライブラリーを用いて行われた最初の生体内スクリーニング試験から、一貫した結果は得
られなかった。従って、本出願人は、これらの問題点に取り組み、最終的に、実施例28に
記載の「バイオパニング」と称する技術によってscFvライブラリーを生体外で事前にスク
リーニングする方法により解決した。非常に簡単に述べると、このプレスクリーニングは
、硬質プラスチック表面に固定したp75ポリペプチドを用いる。これらの固定化p75ポリペ
プチドに結合するファージ粒子を、この工程により選択して、これを用いて次の生体内ス
クリーニングを行うことによって、理解解釈することができるより一貫した結果が得られ
た。実施例29には、これらの方法および得られた結果が記載される。
続いて、本出願人は、PhD-C7Cライブラリーと称する別のファージディスプレイライブ
ラリー上で生体内スクリーニング法を試験した。実施例22に要約するように、このライブ
ラリーはコンビナトリアルケミストリーにより作られ、ランダムに作られた、ファージの
pIIIコート蛋白質内に挿入された短いポリペプチド断片（７アミノ酸残基である）を有す
る。実施例30には、これらの試験および結果が記載される。
これらの全てのスクリーニング試験の結果、神経線維によって取り込まれ、かつ輸送さ
れる特定のファージを選択するための、ファージライブラリーの生体内スクリーニングは
、巨大なディスプレイライブラリーから、神経線維内へのエンドサイトーシス工程を活性
化および実行することができるリガンド成分を偶然にも保有する特定のファージを、同定
および単離する実用的かつ効率的な方法であることが確認される。
これらの結果を総合すると、確率、および非常に特化された一組の試験により試される
集団の大きさに依存する確率的工程が関与することも確認される。本発明の主張および請
求は、この種の選択方法が、各スクリーニング試験すべてにおいて成功することではない
。そうではなく、本発明にて主張および請求することは、以前には知られておらず、また
は不可能であった方法で、生きた動物に対して生体内試験を行うこの選択方法を用いて（
所望ならば繰り返し用いて）、確かに神経線維内に入り込み、逆行輸送される少数のディ
スプレイファージクローンを、潜在的に大きい、および／またはランダムな開始ライブラ
リーまたはレパートリーの中から、同定、選択、および単離することができるという事実
である。
力価の測定および写真データからもまた、当該方法により生体内スクリーニング方法が
実行され、たとえ巨大分子複合体に結合されていてもエンドサイトーシス工程を活性化お
よび実行することができるリガンド分子およびリガンド断片を効率的に同定することがで
きることが明白に証明される。これらの結果に基づき、この種の生体内スクリーニング方
法により、研究者は、このような分子（エンドサイトーシスリガンドと称する）を同定し
、そしてそれを「運送物」または「運搬物」成分を細胞内に輸送するための分子輸送シス
テム（担体とも称する）の一部として用いることができる。このような運送物成分として
、細胞内に効率よく輸送されるものであるならば、例えば、遺伝子ベクターの一部である
DNA断片、治療上、診断上、またはほかの医療上効果を供することができる薬物または診
断用分子、並びに産業上の研究および同様の努力においてより有用である分析用化合物が
挙げられる。
また、本特許出願にて記載および提出されたとおり、生体内スクリーニング試験におい
て十分に機能するポリペプチドリガンドをコードするヌクレオチド遺伝子配列も、このよ
うなポリペプチドリガンドのアミノ酸配列も知られていない。本出願人の研究所（オース
トラリア）は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列情報を決定する機器を保有していな
い。従って、このようなデータを決定することができる外部の契約研究所に、生体内スク
リーニング試験にて十分に機能するいくつかの選択されたファージを送付した。しかし、
結果データを未だに受け取っておらず、本特許出願日にはこのようなデータは知られてい
ない。
BBB内への薬物投与／送達のための遺伝子ベクターの使用
本発明を用いて、BBBによって保護されていない組織内または組織上に、BBBにまたがる
１または複数の種類の神経細胞にトランスフェクションすることができる１または複数コ
ピーの遺伝子ベクターを投与することができる。明らかに、好適かつ可能な投与方法は、
ベクターをトランスフェクションするBBBにまたがる神経細胞の種類、およびベクターが
接触する末梢投射の種類と位置に依存する。上記および実施例のとおり、嗅覚受容体神経
細胞への投与は、鼻内滴下により行うことができ；侵害受容神経細胞への投与は、皮内注
射、皮下注射、または筋肉内注射により、および局所投与により行うことができ（これは
、上記の通り、表皮通過および組織浸透を高める１または複数の薬剤または技術を伴って
よく）；骨格筋を神経支配している下位運動神経への投与は、筋肉内注射により行うこと
ができ；そして、舌下神経核の下位運動神経への投与は、舌の筋肉内への注射により行う
ことができる。
医学または神経科学分野の専門家には明らかなことに、末梢に投射している神経細胞に
遺伝子ベクターを投与するために別の方法が存在する。また、該専門家に明らかなことに
、(i) BBBにまたがる他の種類の神経細胞（様々な種類の感覚神経細胞および運動神経細
胞、並びに、交感および副交感神経系の節前神経細胞を含む）が、潜在的に有用なトラン
スフェクションの標的であり；および(ii)そのような種類の神経細胞の解剖上および構造
上の周知の特徴および特性から、神経学者または研究者は、遺伝子ベクターを該神経細胞
に投与する種々の方法を開発することができる。
内分泌および傍分泌ホルモン系の調節
また、明らかなことに、本発明は、従来利用されなかった新規な方法として、特定の遺
伝子によりコードされたポリペプチドを脳内の細胞、系および領域に非侵襲的に送達する
ことによって、例えば、保護された脳組織であるCNS（例えば下垂体および松果体など）
、または体内の他の部位（例えば甲状腺、胸腺、副腎、その他の分泌腺、または膵臓、生
殖器官など）のいずれかにおいて、種々の腺または器官からの種々の内分泌および／また
は傍分泌ホルモンの放出を増加または抑制させることによって、種々の「下流」の効果ま
たは活性を調節する方法を提供することができる。
本特許出願は、内分泌または傍分泌を詳しく分析するのに相応しい場所ではなく、以下
の記載は単に非常に簡単な紹介および概括である。内分泌および傍分泌系に関して、より
多くの情報が、ほとんどの良好な生理学の教科書に適切な要約として記載されており、ま
た数々の完全な教科書、例えばWilson & Foster 1992, Barrow & Sleman 1992, Brown 19
93, DeGroot 1994などに記載されている。最近の総説記事は、内分泌系または傍分泌系の
作業上の知識を満足させるために特に有用なわけではない。なぜなら、それらの焦点は、
主に問題点（例えば腺管腫瘍、殺虫剤などのホルモン破壊剤）、治療（外科手術や薬剤）
、またはホルモン系と、ほかの系、例えば免疫応答系との相互作用であるからである。し
かし、総説記事は、内分泌系または傍分泌系の作業知識を超えて、ヒトの疾患または先天
性以上の治療、または家畜の繁殖などの目的のために潜在的な治療を目指す場合には、良
い基礎情報を提供する。
内分泌系の重要な成分の一つは下垂体であり、これは、脳の基底に位置し、視床下部と
いう脳組織の一領域からぶら下がっている。下垂体前葉は、少なくとも６種類のホルモン
を放出することが知られており、これらの各ホルモンの放出は、視床下部ホルモンといわ
れる「上流」のホルモンによって刺激または抑制されている。これらのホルモン系（すな
わち対形成、関連）は以下の通りである。
１．チロトロピン放出ホルモン（TRHと略される；正式には甲状腺刺激ホルモン放出ホ
ルモン）といわれる視床下部ホルモンは、下垂体からチロトロピンといわれるホルモン（
正式には甲状腺刺激ホルモン、TSHといわれる）を放出させる；
２．コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体から
アドレノコルチコトロピンを放出させる；
３．成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体から成長
ホルモン（ソマトトロピンともいわれ、ヒト成長ホルモンの場合、しばしばhGHまたはHGH
と称される）を放出させる；
４．成長ホルモン抑制ホルモン（GHIH、またソマトスタチン）といわれる視床下部ホル
モンは、下垂体からの成長ホルモン（ソマトトロピン）の放出を抑制する；
５．ゴナドトロピン放出ホルモン（GRHまたはGnRH）といわれる視床下部ホルモンは、
下垂体から、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンといわれる２種類の「性腺刺激」
ホルモンを放出させる；
６．プロラクチン抑制ホルモン(PIH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体からのプ
ロラクチンといわれるホルモンの放出を抑制する。
BBBにより保護されている脳組織内で、上記の視床下部ホルモンの一つの濃度を増加さ
せる遺伝子ベクターを投与することによって（本明細書に開示された方法によって、永続
的というよりもむしろ一過的な増加を起こすことができ、そして一過的な増加は、通常、
ヒトの医学的または発生学的疾患の治療に好ましいと思われる）、調節可能な方法で「下
流の」または「依存的な」下垂体ホルモンの放出を刺激または抑制することができる可能
性が高い。従って、このように遺伝子ベクターによって下垂体の刺激または抑制を誘発し
、および／または目標とした結果、下垂体ホルモンの放出または抑制によって起こされる
のと同タイプの生理学的効果を刺激、抑制、または調節することが可能である。
代わりの方法として、「上流の」視床下部ホルモンではなく、下垂体ホルモンを直接コ
ードする遺伝子ベクターを投与することによって、目標とした内分泌または傍分泌系を刺
激または抑制することが、少なくともいくつかの系において可能であろう。この方向に沿
って、放射標識トレーサーの研究から、脳室内に直接に注射することによってCNS内に送
達した少なくともいくつかの種類の蛋白質は、CNSから血液循環内にかなり急速に排除さ
れることが示された（例えばFerguson 1991）。従って、ホルモンタイプのポリペプチド
を、BBBにより保護されたCNS組織内に送達する速度が十分に高い場合には、これらのホル
モンポリペプチド分子のいくつかは循環血液内に拡散し、そして全身性に分配される。
ホルモンやその他のポリペプチドを脳内に送達して、脳内の特定の領域、細胞または構
造に接触させることに関し、本発明は、少なくともいくつかの場合に、以前には利用でき
なかったやり方で標的へ送達を行う方法を提供することができる。神経活性分子（例えば
神経栄養因子）をCNS内に送達する従来技術方法のほとんどは、該分子の送達方法として
薬剤送達の内分泌モデルが適していることを前提としている。この前提が普及している証
拠が、数々の動物実験、および、組換え神経栄養因子を脳脊髄液内に（典型的には側室内
に）注射または注入する制限ヒト臨床研究において認められる。これらの薬剤投与方法は
、脳および脊髄内の脳脊髄液の流れが、末梢内の血液循環と同じく、CNS内部の循環であ
るという前提に基づいている。
しかし、この前提は保証されない。なぜなら、CNS内のCSFの流れは、血液循環よりも、
末梢のリンパ系により類似しているからである。リンパ液の流れと同じく、CSFの流れは
、液体の再循環というよりもむしろ一方向の排出により近い。
従って、神経活性分子（例えば神経栄養因子）が、内分泌的（全身的）ではなく、むし
ろ傍分泌的（局所的）に生理学的効果を発揮する場合、適当な薬剤送達方法は、好ましく
は、例えば静脈内点滴または注射などの全身投与によるべきではない。なぜなら、(i) 非
常に高価な薬剤化合物の浪費量が多く；そして(ii)全身性に注射された分子が所望の標的
以外の種々の細胞や器官と反応した場合、望ましくない悪影響が起きる可能性があるから
である。その代わり、利用できるならば、より狭い範囲に集中する系、および標的を目指
す系が用いられるべきである。
本発明は、いくつかの観点から傍分泌送達を模倣した、実質的に改善された薬物送達法
を提供する。この方法は、BBBにまたがる神経細胞のうち特定の選択された集団にのみト
ランスフェクションして、続いてその細胞が、所望の限られた「分泌域」にポリペプチド
を放出することによって、標的細胞または標的領域への薬剤の限定的および集中的送達を
実行し、または少なくとも促進することができる（特に静脈注射などのほかの方法と比べ
た場合）。
特定の組換え分子、例えば神経栄養因子を分泌するように遺伝子的に加工した細胞をCN
S内に移植する多くの研究によって示されるように、当技術分野において、継続した薬剤
送達を達成するために遺伝子治療を利用できることが知られている。しかし、そのような
研究のほとんどは、その目的が、移植した細胞により薬剤が、全身性に分配されるように
分泌され、そして内分泌様の薬剤送達が達成されることであると説明または示唆している
。これに対して、本発明は、全く異なった形の遺伝子治療を開示し、BBBにまたがる細胞
のうち限られた数の隣接細胞にトランスフェクションすることによって、BBB内の神経細
胞の特定の集団および／または特定の種類に、治療用ポリペプチドを、傍分泌様に、限定
的に送達することができる。
神経系の選択的な調節
本発明により、神経系の疾患を治療する全く新しい方法の開発が可能となる。開示され
た傍分泌様薬剤送達方法により、CNS内の特定の神経系の機能を選択的に調節するための
新しい方法の開発が可能となる。
生理学的には、中枢神経系内の神経細胞系の機能は、BBBを貫通する神経細胞の機能変
化に応答して変化しうる。例えば、BBBを貫通する侵害受容神経細胞の電気的活動の変化
は、痛みの知覚およびその痛みへの応答に関係する二次感覚神経細胞および関連するCNS
神経細胞系の電気的活動に変化をもたらす。BBBを通して投射する神経細胞と、BBB内に全
体が存在する神経細胞との間の解剖学的な接続は、固定されておらず、静的ではない。そ
の代わり、これらの接続の性質、数、および分布は、経時的に、かつ種々の事象に応答し
て変化しうる（その結果、しばしばCNS内のさらにほかの神経細胞系において下流の変化
をもたらす）。すなわち、CNS内の神経細胞系は、可塑的であり、変化可能であり、そし
て血液脳関門を貫通する神経細胞の機能変化に対して応答する。
このような生理学的事実に基づいて、少なくともいくつかの場合に、本発明は、トラン
スフェクション可能な末梢投射する神経細胞系とCNS内の標的神経細胞系とのシナプス接
続による神経支配パターンを変更することによって、CNS内の少なくとも数種の神経細胞
系の構造と機能を選択的に調節および変更することができる。
一例として、当技術分野では、神経栄養因子は、CNS系において、末梢近くに位置する
ほかの神経細胞から来る電気的活動、例えば神経パルスの数および頻度の変化に応答した
シナプス密度および神経支配パターンの可塑的変化に関与していることがよく知られてい
る。生理学的には、これらの神経栄養因子は、上記において傍分泌様に作用する。従って
、ここに開示した傍分泌的薬剤送達方法を用いて、１または複数の末梢投射する神経細胞
と、それが相互作用するCNSの神経細胞または神経細胞系との接続の性質および程度を選
択的に調節することができる。すなわち、遺伝子ベクターをBBBにまたがる神経細胞にト
ランスフェクションすることによって、これらのBBBにまたがる神経細胞と、BBB内に全体
が存在するCNSの神経細胞との接続の性質および程度を改変することができる（少なくと
もいくつかの場合）。
例えば、この原理を、以下の２つの好ましい実施態様により説明することができる：
(i) BBBにまたがる侵害受容神経細胞のトランスフェクションを介して、組換え抗NGFを投
与することにより、痛みの知覚に関与するBBBにより保護されている神経細胞系を調節す
ることができること；および
(ii)BBBにまたがる脊髄の運動神経細胞のトランスフェクションを介して、組換えNT-3ま
たはGDNFを投与することにより、運動機能の随意制御に関与するCNSの神経細胞系を調節
することができること。
神経疾患の治療
本発明は、神経栄養因子または神経保護因子を、変性の危険性がある神経細胞に送達す
る方法により、CNSの神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）の治療において有用とな
るだろう。例えば、アルツハイマー病は、神経栄養因子（例えば神経成長因子）をCNS内
に投与することによって、おそらく有効に治療することができると考えられる。この目的
に沿って、本発明により、アルツハイマー病患者において変性の危険性がある前脳基底部
のコリン作動性神経細胞に、比較的に集中的かつ標的指向的に神経栄養因子を送達するこ
とができる。少なくとも数人の患者において、この種の治療により、この神経変性を遅く
し、潜在的には停止することができるだろう。
また本発明は、損傷を受け、生き残った神経細胞に、神経細胞の成長因子（例えば神経
栄養因子）を送達することにより、CNSの外傷または損傷（例えば頭部損傷）の治療にお
いて有用となるだろう。ほんの一例として、皮質の運動神経（しばしば脳梗塞において、
ときに頭部外傷において損傷を受ける）に作用するGDNFを、ここに開示した方法によりそ
れらの神経細胞に送達することができる。このような潜在的な有効性が多くの記事、例え
ばSchacht et al. 1996に記載されている。
また本発明は、学習障害や記憶障害の症例、例えば老化、痴呆にて、頭部の外傷または
損傷後に、種々の大手術後に、特に心肺バイパス装置を用いた手術後に起きる学習または
記憶障害の治療において有用となるだろう。このような外傷および損傷はしばしば１また
は複数のCNSの領域内の機能を喪失させる。可能であるならば、機能の回復には、CNSの構
成の補償的変化、例えば典型的には、影響を受けた神経細胞の発芽および成長、並びにほ
かの神経細胞との機能的シナプスの形成が必要であり、関与する。このような「神経可塑
的」な過程が、指や四肢が切断された動物の研究および人間の症例において示された。そ
こでは、脳梗塞の被害者が、治療を受けることによって、麻痺した手足を再び実際に使え
るようになった。この治療では、患者は、１または２本の健康な手足を包帯で体に固定し
、脳梗塞後に四肢に残った動作と制御の範囲に応じて、これを広げるように、機能しない
手足を再び動かし、使いはじめるように積極的に働きかける運動を繰り返した。
神経栄養因子は、上記のような過程において重要な機能を発揮することができ（例：Lo
1995）、また脳内へのNGFの投与が、種々のCNSの活性と機能、例えば記憶と学習を高め
ることが示されている（例：Fischer et al. 1987および1991）。
従って、本発明は、改良された送達系を用いて、NGFやそのほかの神経栄養性因子およ
び神経刺激性因子をCNS内に、そして脳内に送達することにより、この種の非常に有用な
治療法をさらに詳しく説明することができる。
さらに本発明は、神経細胞の興奮毒性損傷に起因する障害、あるいは虚血（脳梗塞や心
停止の際に起きるような血流低下）、低酸素症（溺れ、一酸化炭素中毒の際に起きるよう
な酸素供給低下）または頭部外傷が関与する疾患や損傷に起因する障害の治療において有
用となるだろう。動物実験では、NGFの注入により、コリン作動性神経の細胞体および線
維網の逆行性萎縮、並びに梗塞によって誘発され、梗塞の大きさや重症度によって検出さ
れるコリン作動系のほかの変化を、抑制または回復させることができた（例Cuello et al
1992）。NGFの投与（またはクレンブテロールによるNGF合成の生体内誘導）により、中
大脳動脈永久閉塞ラットモデルにおいて梗塞の大きさが減少することが示された（Semkov
a et al 1999）。ほかの動物データからも、NGFは、脳損傷後に作用して、神経損傷の進
行を抑えることが示唆されている（例Guegan et al 1998）。本発明は、脳梗塞やほかの
脳損傷後にNGFを投与するために有用であろうから、続いて起きる神経欠損の程度と重傷
度を低下させることができるであろう。
本発明はさらに、感覚神経細胞および／または該細胞とシナプス接続するCNS内の神経
細胞の機能を調節することによって感覚機能障害を治療する方法に関する。例えば、継続
的な大きな痛みは、侵害受容神経およびCNS（脊髄または頭脳）の変化に関係しており、
抗NGFの鞘内投与により、このような変化を回復させ、痛みを和らげることが報告されて
いる（例Christensen et al 1996および1997）。本発明により、感覚系の１または複数の
成分に作用するポリペプチド（例えばNGFと結合し失活させる抗体、NGF受容体を占有し妨
害する抗体）を送達し、その生理学的機能を変更することによって、感覚系の機能を調節
することができる。
また本発明は、神経ペプチド遺伝子、例えば、痛みをブロックし抑えることができるポ
リペプチド（いわゆる「エンドルフィン」など）を発現する遺伝子；成長因子を発現する
遺伝子；細胞を再生または延命させるポリペプチドを発現する遺伝子；および毒性ポリペ
プチド、例えば腫瘍細胞を殺す毒性ポリペプチドを発現する遺伝子、を送達して発現させ
ることによって神経の生理機能を調節するために用いることができる。
そのほか、本発明は、いくつかの特定のポリペプチドの過少または過多のいずれかに相
関する種々のCNS関連神経疾患または欠乏症の治療に用いることができる方法を提供する
。これを実行するために、本方法を用いて、下記のいずれかのポリペプチドを、BBBによ
り保護されているCNS組織内に送達することができる：(i) 欠乏症を軽減除去するために
追加量のポリペプチドを供給するポリペプチド；または(ii)特定分子の過多により誘発さ
れる、すなわち特徴付けられるCNSの疾患を調節することを助けるための、特定の分子、
受容体または反応を阻害、拮抗またはそのほか抑制するポリペプチド。
以下の実施例は次の通りに構成されている。
実施例１〜８は、完全に血液脳関門内に位置する神経細胞に神経細胞刺激ポリペプチド
を、このようなポリペプチドをコードする遺伝子を保有するベクターを用いて、嗅覚受容
体神経細胞をトランスフェクションすることにより、送達することに関する。例示目的の
ため、ヒトNGFを模範のポリペプチドとして用いる。当業者に認知されている通り、他の
形態のNGF（医薬または研究の興味の対象となり得る、マウス、他の齧歯動物、若しくは
サルのNGF、または任意の突然変異したNGF、エピトープタグ付きNGF、断片化されたNGF、
若しくはその他の形態のNGFなど）をコードする遺伝子を代替として用いることができる
。
実施例１〜７は、如何にしてＮＦＧ（またはその他の神経栄養ポリペプチドまたは類似
のポリペプチド）をラットなどの実験動物の前脳基底核中のコリン作動性神経細胞に送達
することができるかについて記載している。実施例１〜４は、種々の連続工程に分けられ
た完全な実施形態を含む。実施例１は、ベクターの組立について記載し；実施例２は、そ
れらのベクターの副鼻腔への投与について記載し；実施例３は、血液脳関門を通してポリ
ペプチドの送達をモニタリングする方法について記載し；実施例４は、実験動物に対する
このような治療の生理学的及び行動の効果を測定する方法について記載する。
その「始めから終わりまで」の記載に続いて、実施例５〜８は、異なるタイプのベクタ
ーを用いた、NGFをコードする遺伝子または類似の遺伝子の嗅覚受容体神経細胞への送達
について記載している。実施例５は、ヘルペスウイルス由来のベクターについて記載し；
実施例６は、リポソームベクターについて記載し；実施例７は、神経細胞表面上のエンド
サイトーシス受容体に結合するリガンドを有するベクターについて記載し；実施例８は、
ある神経細胞から別の神経細胞へと完全なベクターを輸送することを促進することができ
る「経ニューロン性（transneuronal）」ポリペプチドを用いるベクターについて記載す
る。
実施例９〜13は、神経抑制（刺激ではない）因子をコードする遺伝子ベクターを用いた
異なるアプローチを伴い、NGFに結合しこれを不活性化する「抗NGF」と呼ばれるポリペプ
チドを例示として用いる。これらのベクターは、望んではない過剰の疼痛信号（しばしば
神経因性疼痛または異痛と呼ばれる）を患う領域で、痛覚(疼痛信号伝達)神経細胞をトラ
ンスフェクションするために、皮膚または筋肉部位に注入される。過度な活性の疼痛信号
伝達回路を抑制することにより、このアプローチは神経因性疼痛を減少させ制御するのを
助けることができる。
実施例14〜20は、神経刺激因子をコードする遺伝子を保有する遺伝子ベクターを発作、
脊髄損傷などゆえに障害を負った筋肉組織へ注入する、３番目の主なアプローチ方針につ
いて記載する。これらのタイプの障害を負った筋肉はしばしば、上位運動神経細胞（完全
に血液脳関門内に位置する）及び下位運動神経細胞（血液脳関門にまたがる）間の接触を
正しく機能させることを損うことによって起こるまたは悪化する自発的制御の欠如（また
は障害）を患う。神経刺激因子をコードする遺伝子を用いてこのような障害を負った筋肉
中で下位運動神経細胞をトランスフェクションすることは、下位及び上位運動神経細胞間
で新しい追加の接続を形成し及び／またはそれらの神経細胞クラスの間のシナプス活性レ
ベルを増加し、それによってこのような筋肉系に対する正しい神経支配及び中枢神経系制
御を再構築するなどの手段によって、損傷した運動制御ネットワークを拡大し、修復し、
再接続させるのを助けることができる。
実施例21は、舌の内部に位置するあるタイプの運動神経細胞のトランスフェクションに
ついて記載する。この投与経路は、脳幹のある部分にポリペプチドを送達する経路を提供
するので、特別の注意に値する。
NGFを前脳基底核中のコリン作動性神経細胞に送達するため、嗅覚受容体をNGF遺伝子でト
ランスフェクションするためのアデノウイルスベクターの構築
実験室でのみ存在する遺伝子組み換え宿主細胞以外では複製することができないアデノ
ウイルス由来の非病原性ベクターを調製する方法が、Graham and Prevec 1995などの論文
に公表されている。アデノウイルスベクターにより保有され送達されるのに十分な小さく
、トランスフェクションされたヒト神経細胞内部において有意レベルでNGF（またはGDNF
、NT-3、CNTF、またはBDNFなどの他のいくつかの中枢神経系活性ポリペプチド、または表
１に列記されているような他の多数のポリペプチドのいずれも）を発現する、遺伝子構成
体を作る方法が、Romero et al 2000、Baumgartner and Shine 1998、Dijkhuizen et al
1997、及びGravel et al 1997などの論文に記載されている。そのような遺伝子構成体を
保有するアデノウイルスベクターを増殖させ、精製し、濃縮し、力価測定する方法は、「
Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997）のEn
gelhardtによる章（169〜184頁）などの出版物で見ることができる。
NGFポリペプチド（またはその他の選択された中枢神経系活性ポリペプチド）の発現を
実行する遺伝子構成体は、遺伝子関連部位すべての正確な選択を必要とする。本明細書中
で用いられる「遺伝子」または「遺伝子構成体」などの用語は、通常、既知方法を用いて
実験室条件下で操作することができ、血液脳関門をまたいだ神経細胞にトランスフェクシ
ョンした場合に(i)遺伝子によってコードされるポリペプチドを合成するため神経細胞体
内部で正常な転写及び翻訳機構を引き起こすこと、及び(ii)血液脳関門内部に位置する樹
状突起、突起(processes)、シナプス、またはその他の末端から成熟ポリペプチドを適当
にプロセシングし、分泌するように細胞に指示を出すことが可能である、完全かつ機能的
な転写単位のことを指す。
「発明の詳細な説明」で記載されている多数の変異体及び強化体(enhancements)を含む
、単なる「簡素な基本」タイプの遺伝子構成体の変異体及び強化体の多数が当業者に既知
である。そのような変異体または強化体のいずれも、本明細書中で用いられる「遺伝子」
または「遺伝子構成体」の用語の中に含まれる。
ヒトNGF、マウスNGF、及び他のタイプのNGFの配列（イントロンなし）をコードする完
全なアミノ酸は公開されて知られており、簡単な操作を施されたプラスミドの形態で様々
な研究者から入手することができる。あるいは、それらは既知技術または公開された情報
を用いて作ることができる。
さらに、特異な「エピトープタグ」配列（c-mycなど）を有するポリペプチドを所望す
る場合、遺伝子構成体のコード部分は「エピトープタグ」配列をコードするDNA配列を含
まなければならない。エピトープタグを含むことは、研究者が遺伝子ベクターによってコ
ードされる外因性ポリペプチド分子と試験動物または患者の血液脳関門内に生来存在する
内因性（天然）ポリペプチドとを区別するのをエピトープタグ配列が手助けすることがで
きる状況において、本発明を例証し、洗練し、その他増強するのに役立つであろう。
その他の非常に重要な遺伝子構成体部分は遺伝子プロモーターであり、嗅覚受容体神経
細胞中での遺伝子発現を実行することができる多くの既知遺伝子プロモーターが知られ、
入手できる。嗅覚受容体神経細胞中での特異的な遺伝子発現を実行することが知られてい
る「選択的」遺伝子プロモーターの具体例には、嗅覚マーカータンパク質遺伝子(Serveni
us et al 1994)及びM4嗅覚受容体遺伝子(Qasba and Reed 1998)で同定されたプロモータ
ーが含まれる。このような選択性プロモーターの使用は、望まないまたは制御不能な外部
遺伝子の発現が周囲の細胞または組織で起こる機会を最小にすることに役立つ。
あるいは、所望する場合には、哺乳動物細胞中で異常に強いプロモーターであることが
知られている種々のタイプのウイルス及びその他のプロモーターを、トランスフェクショ
ンした細胞中でNGF（または他の中枢神経系活性)ポリペプチドを最も実際的なレベルで発
現させることを含むような目的のために使用することができる。そのような強力なプロモ
ーターの具体例には、サイトメガロウイルス由来の初期遺伝子プロモーター及びシミアン
ウイルス40由来の後期遺伝子プロモーターが含まれる。所望する場合には、選択されたプ
ロモーターを活性化する誘導因子が十分な量のトランスフェクションした神経細胞中に輸
送されることが保証される方法で投与することができる限り、誘導可能な遺伝子プロモー
ターも用いることができる。
上記の通り、本明細書での議論を簡明にするため、本明細書で用いられる「遺伝子プロ
モーター」という用語には、いわゆる「TATAボックス」及びTATAボックスと実際の転写開
始点との間の約25塩基の配列が含まれる。
いったんプロモーター及び遺伝子構成体のコード配列が選択されれば、ベクターにコー
ドされたポリペプチドの発現、パッケージング、輸送、分泌、及び／または性能を増進す
るために、その他の種々の遺伝子構成体部分を選択することができる。これらの遺伝子部
分には、例えば、(i)ベクターにコードされたポリペプチド（またはリーダー配列または
シグナル配列を取り除くことができる「成熟」体）を適切にプロセシングし分泌すること
をトランスフェクションされた神経細胞に指示する「リーダー」または「シグナル」ペプ
チド配列をコードするDNA配列、(ii)リボソームによる翻訳及び放出を容易にするため、m
RNA中の「停止」コドンに続く「テイル」非翻訳領域として働くmRNA配列に転写されるDNA
配列、及び(iii)DNA配列がmRNA中に転写されているとき、RNAポリメラーゼにmRNA鎖を切
断するように指示する転写ターミネーター配列が含まれる。これらのタイプの機能配列は
既知で、クローニングされた遺伝子がトランスフェクションされた哺乳動物細胞によって
高レベルで発現することを可能にするほぼすべての哺乳動物遺伝子クローニングベクター
から取得または改作することができる。成熟NGF配列に先行するプレプロNGF配列に代えて
、成熟BDNFポリペプチドに先行するプレプロBDNF配列を利用することにより、少なくとも
いくつかのタイプの神経細胞では、血液脳関門内での感覚神経細胞末端からの順行性輸送
及び放出を容易にすることができる。
前脳基底核中のコリン作動性神経細胞にNGFを送達するためのアデノウイルスNGFベクター
の嗅覚上皮への投与
適当な力価濃度でのべクター懸濁水溶液を点鼻することにより、NGF（または他のいく
つかの中枢神経系活性ポリペプチド）をコードする遺伝子構成体を保有するアデノウイル
ス由来（またはその他のウイルス由来）のベクターを、ヒト患者（医療目的のため）また
は試験動物（試験またはその他研究目的のため）のいずれかの嗅覚上皮へ投与することが
できる。
担体水溶液はアデノウイルス及び活性嗅覚上皮と相溶でなければならない。生理生理食
塩水（所望する場合、緩衝剤）を用いることができ、低張液若しくは高張液またはより高
レベルのウイルストランスフェクションを誘導することができるその他の任意の構成要素
を含む溶液も日常的実験を用いて試験することができる。Holtmaat et al 1996などの論
文にはマウスでの点鼻を介してアデノウイルスベクターを効率的に投与するための投与量
及び投与技術についての情報が提供され、このような方法は、当業者に知られた方法を用
いて、ラットまたはウサギなどのより大きな齧歯動物またはその他の哺乳動物での使用に
適合させることができる。
所望する場合、(i)遺伝子ベクターを含む液と嗅覚神経細胞との接触の程度及び／また
は保有期間、及び(ii)このような遺伝子ベクターを取り込むための神経細胞の受容性を増
加するための工程を取ることができる。このことは、例えば、遺伝子ベクター投与の数時
間前に試験動物（またはヒト患者）に鼻鬱血除去薬を投与することにより行うことができ
、ベクター投与前に副鼻腔を直ちにリンス及び／または洗浄するための水溶液（及び、場
合によっては、粘液質の、油質の、または他の粘性の皮膜のいずれをも取り除くのに役立
つことができるイソプロピルアルコールまたはアセトンなどの希釈溶液を用いたスワビン
グ(swabbing)工程）を用いることにより行うことができる。嗅覚神経細胞の受容性は、小
さな針金ループ、丸いへらの先端、または類似の道具を使用して穏やかな機械的摩擦を用
いることにより増加させることもできる。一般に、穏やかな炎症の時点まで刺激した表面
領域内の神経投射は、休止または休息状態であると認められる細胞よりも、外部分子の細
胞取り込みに対してより受容的である傾向がある。
遺伝子発現に十分な時間をとった後（通常約24時間から72時間）、いくつかの試験動物
を犠牲死させ、嗅覚上皮、嗅球、及び前脳基底核を取り除き、各組織をタイプ別に処理し
、そのタイプの組織内におけるベクターにコードされるポリペプチドの位置及び濃度を測
定することにより、遺伝子ベクターの送達効率を評価することができる。
ベクターにコードされるポリペプチドが内因性（おそらく齧歯動物の）ポリペプチドと
顕著に異なる場合、測定及びモニタリングの労力を比較的簡単なものとすることができる
。これらのタイプの分析は、(i)Xian and Zhou 2000などの論文に記載されるような方法
を用いて、内因性mRNA配列ではなくベクターmRNA配列に相補的なDNAプローブで細胞のmRN
Aをハイブリダイゼーションすること、(ii)Chie et al 2000などの論文に記載されている
ような、「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）試薬を用いた技術及びベクターからDNAまたは
mRNA配列を検出するための方法、及び(iii)用いられたベクターによってコードされるポ
リペプチドまたはエピトープタグに選択的に結合し、試験種の内因性ポリペプチドに結合
しないモノクローナル抗体を用いる免疫染色法または類似方法などの方法を用いることが
できる（これらの抗体は市販により入手でき、所望する場合にはConner 2000、Rush et a
l 2000、及びZhang et al 2000などの論文に開示されている方法を用いて調製することも
できる）。
所望する場合、トランスフェクションされた嗅覚受容体による外因性mRNA及び／または
ポリペプチドの発現の時間依存レベルを、遺伝子ベクター投与後のある時間範囲にわたっ
て１回以上の試験を繰り返すことによって測定することができる。
所望する場合、データ分析の目的で細胞及び動物の対照個体群を提供するため、ヒト（
またはエピトープタグ付加された動物）のポリペプチド遺伝子構成体を保有する遺伝子ベ
クターを、試験動物の副鼻腔の片側にある嗅覚上皮に投与することができ、他のいくつか
の遺伝子（簡単に検出されるポリペプチドをコードするマーカー遺伝子など）を保有する
制御ベクターを動物の副鼻腔のもう一方の側にある嗅覚上皮に投与することができる。動
物を犠牲死させた後、左右の嗅覚受容体、嗅球、及び前脳基底核領域の組織学的及び免疫
学的な検査を用いて、(i)トランスフェクションされた嗅覚受容体によるポリペプチド発
現、及び(ii)血液脳関門にまたがる受容体細胞による、血液脳関門内部に位置する他の部
類の神経細胞へのポリペプチド輸送及び送達を評価することができる。
前脳基底核中のコリン作動性神経細胞へのNGFポリペプチド送達のモニタリング
完全に血液脳関門内にある中枢神経系領域にトランスフェクションされた嗅覚受容体神
経細胞（または血液脳関門にまたがり、かつ遺伝子ベクターによってトランスフェクショ
ンされた他のタイプの感覚神経細胞）を介して送達されるNGFポリペプチド（またはベク
ターにコードされている他の中枢神経系活性ポリペプチド）の量を、犠牲死させた試験動
物から得た細胞及び組織の組織学的及び免疫学的な分析を用いて、注目する特定の種類ま
たは部域の神経細胞でモニタリングすることができる。
嗅覚受容体神経細胞またはその他のタイプの感覚神経細胞への遺伝子ベクターの投与後
、中枢神経系内における任意の対象位置でのヒトNGF（または動物に投与された遺伝子ベ
クターによってコードされている他の任意の中枢神経系活性ポリペプチド）の生産、放出
及び分布をモニタリングし定量化するために、免疫組織化学及び「酵素免疫測定法」(ELI
SA)試験などの十分に確立された免疫方法を用いることができる。ヒトNGFがベクターにコ
ードされるポリペプチドである場合、マウス、ラット、またはその他の齧歯動物のNGFで
はなくヒトNGFを認識しこれに結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体の調製品
は市販により入手でき、あるいは文献（例えばConner 2000；Rush and Zhou 2000）で良
く解説された方法を用いて生成することができる。免疫組織化学を用いてNGFレベルを測
定する方法はConner et al 1992などの論文に記載され、ELISAを用いてNGFレベルの測定
する方法はZhang et al 2000などの論文や、商業的供給源から購入できるNGF-ELISA検出
キットに含まれている製造指示書に記載されている。
上記で簡単に説明した通り、ベクターが発現する（おそらくヒト）ポリペプチドを認識
しこれに結合するが、同種のマウスまたはラットのポリペプチドには結合しないモノクロ
ーナル抗体を用いた場合には、マウスまたはラットなどの実験動物でのベクターにコード
されるヒトポリペプチドのモニタリングをより簡潔かつより確実にすることができる。マ
ウスまたはラットNGFではなくヒトNGFに選択的に結合するモノクローナル抗体を発現する
ハイブリドーマ細胞株は作り出されており、そのようなモノクローナル抗体調製品を入手
することができる。齧歯動物ではなくヒトの他の中枢神経系活性ポリペプチドに選択的に
結合するモノクローナル抗体を発現する類似のハイブリドーマ細胞株も当業者に知られた
方法を用いて作製または構築することができる。
あるいは、またはさらに、上記の通り、Moller et al 1998などの論文に記載された方
法を用い、神経栄養遺伝子構成体の配列中にエピトープタグ（c-mycなど）を組み込んで
、トランスフェクションされた神経細胞中でのその遺伝子構成体によって発現されたポリ
ペプチドの免疫学的検出を容易にすることができる。このようなアプローチを用いた場合
、ベクター構築物によって発現されたポリペプチドは、そのポリペプチドによる治療のた
めの標的とされている神経細胞へ正確に送達するのに必要なすべての工程を行うことがで
きることを確認することが重要である。
例えば、特定方法の目的が治療用ポリペプチドを前脳基底核コリン作動性神経細胞の主
要な細胞体に送達することであり、ポリペプチドのモニタリングを容易にするために「エ
ピトープタグ」配列を用いる場合、標的の前脳基底核コリン作動性神経細胞が、トランス
フェクションされた血液脳関門にまたがる神経細胞によって分泌されたベクターにコード
されかつエピトープタグ付加されたポリペプチドの取り込み（受容体仲介エンドサイトー
シスなど）及び逆行性輸送を行ったことを保証するように、該標的の前脳基底核コリン作
動性神経細胞を評価することができる。これらのタイプの確認試験は、ベクターにコード
されるポリペプチドが標的の前脳基底核コリン作動性神経細胞によって取り込まれたこと
を実証するために、エピトープタグ配列に（及び／またはタグ配列とともに天然アミノ酸
配列の一部分を含む融合ポリペプチド中のドメインに）特異的に結合するモノクローナル
抗体などの試薬を用いる、Altar & Bakhit 1991、Ferguson et al 1991、DiStephano et
al 1992、及びvon Bartheld 2000などの論文で記載されている方法を用いて行うことがで
きる。
ベクター由来のNGFが抗原またはエピトープタグを保有している場合、タグ付きポリペ
プチドに選択的に結合するモノクローナル抗体は既知の方法を用いて作り出すことができ
、その後の免疫組織化学的測定またはELISA測定のいずれにも用いることができる。所望
する場合、NGFまたは他のいくつかの中枢神経系活性ポリペプチドの送達（及び血液脳関
門内部の組織に対するその後の神経学的及び生理学的効果）が嗅覚受容体神経細胞への遺
伝子ベクターの投与によって実際に仲介されていたことの確認は、Horowitz et al 1991
によって記載されているような硫酸亜鉛溶液などの化合物を用いた治療によってコントロ
ール動物でこれらの神経細胞を除去することにより行うことができる。
経シナプス追跡研究(例えばLafay et al 1991、Barnett et al 1993）に基づいて、NGF
などのベクターが発現するポリペプチドは、嗅覚受容体神経細胞での遺伝子発現に十分な
時間（おおよそ24時間から72時間の時間範囲が必要である）を与えた後に前脳基底核コリ
ン作動性受容体神経細胞で検出できることが一般に予測される。この期間には、嗅糸球体
中での受容体神経細胞のシナプス末端へのポリペプチド（該ポリペプチド発現後）の逆行
性輸送、該嗅糸球体内でのポリペプチドの分泌（約８時間から24時間）、及び前脳基底核
コリン作動性神経細胞へのポリペプチドの輸送（約８時間から24時間）が含まれることが
予測される。
実施例８で議論するように、あるタイプの「経ニューロン性」ベクターも本明細書中に
開示されている。その部類のベクターは、受容側の神経細胞を外部遺伝子でトランスフェ
クションして、完全に血液脳関門内に位置している１つまたは複数の部類の「下流の」神
経細胞に治療用外部ポリペプチドを発現させるように、感覚神経細胞によって血液脳関門
内部の他のタイプの神経細胞へ移すことができるであろう。
しかしながら、神経細胞間の「経ニューロン性」輸送を付与する特定の工程を取らない
限り、(i)本明細書に開示されているような遺伝子ベクターによる初期または「一次」神
経細胞（血液脳関門にまたがる神経細胞）のトランスフェクションによって、血液脳関門
内部の他の非一次神経細胞へのベクターの輸送が起きることはなく、(ii)永久的な遺伝子
形質転換というよりはむしろ一過性の遺伝子発現が結果として起こることが考えられる。
嗅覚受容体神経細胞などの感覚神経細胞がトランスフェクションの標的として用いられる
場合、そのような細胞でのベクター媒介遺伝子の発現は、最高ピークまたはプラトーレベ
ルのポリペプチド発現後の数日から数週間中に、実質的に減少し、完全に停止するであろ
うことが予期される。所望する場合、同じまたは類似した遺伝子ベクターを嗅覚受容体神
経細胞に再度与えることにより、血液脳関門により保護された中枢神経系組織中にNGFの
追加供給を送達することができる。
前脳基底核中におけるコリン作動性神経細胞へのNGF送達の生理学的効果のモニタリング
本明細書中に記載された遺伝子ベクター方法を用いて血液脳関門により保護された中枢
神経系組織に中枢神経系活性ポリペプチドを送達した際の実際の生理学的、行動的、及び
その他の効果の分析を可能にし及び向上するために、実験動物（またはこのタイプの治療
の臨床試験に志願するヒト）を(i)NGFまたは他のいくつかの選択された神経栄養性または
中枢神経系活性ポリペプチドをコードする遺伝子ベクターを受容する試験群；(ii)プラセ
ボ治療を受けるコントロール群の２つの群に分けることができる。プラセボ治療は、注入
部位の同一処理（鼻内壁の鬱血除去、リンス、スワビング、引っかき、及び／またはその
他の刺激を伴う同一の治療）に続き、(a)遺伝子ベクターが無い純粋な生理食塩水の点鼻
、あるいは(b)例えば、無害及び／または非機能性の遺伝子、いかなるポリペプチドをも
コードしないナンセンスDNA配列、または哺乳動物細胞で発現する場合には簡単に検出さ
れることができるが有意な生理学的効果がないポリペプチドをコードするマーカー遺伝子
を保有し得る遺伝子ベクターを含む溶液の点鼻のいずれかを用いなければならない。
動物試験をする場合、中枢神経系活性ポリペプチド（NGFまたは他のいくつかの神経栄
養因子など）を血液脳関門を通して保護された脳組織に導入することにより、少なくとも
２つのカテゴリーの観察可能な相違の一方または双方をもたらすであろう：(i)犠牲死さ
せた動物から除去された脳組織部位の組織学的、免疫学的、または他の生物学的分析によ
って評価することができる脳の神経解剖学に対する効果、及び(ii)動物の行動に対する観
察可能かつ測定可能な効果。
観察可能かつ測定可能な行動形態（迷路、水迷路などを含む事前の試みで直面したこと
を覚えている治療マウスまたはラットの能力など）に基づいて、実験動物の中枢神経系の
内部で起こったと思われることを評価するために多くの試験が開発された。さらに、その
ような他の試験を開発中であり、現在知られているか以後に発見されるそのような試験の
いずれも、完全に血液脳関門内に位置する標的神経細胞に対するポリペプチドの生理学的
効果の評価が適切であるとの条件で、用いることができる。
これらの試験の多くは、損傷、発作、神経変性疾患、またはその他の中枢神経系障害を
モデル化するために、動物の中枢神経系にいくつかのタイプの損傷を負わせる外科的また
は薬物介入を伴うことに注意すべきである。次いで、その後の試験では、ある治療がその
ような動物が負った損傷または疾患から回復するのに役立つかを評価することを追及する
。
そのような試験の一例は、海馬に投射した前脳基底核コリン作動性神経細胞軸索を「軸
索切断」した多用されるモデルである「海馬采脳弓損傷モデル」である（すなわち、神経
細胞の主要な軸索が外科的に切断される。治療しない場合、これは、典型的には、ほとん
どの種で約２週間以下の期間で神経細胞を萎縮させ死に至らしめる）。これは、前脳基底
核コリン作動性神経細胞の萎縮及び変性を誘導する(例えばHefti 1994）。しかしながら
、これは、海馬采脳弓まで投射している前脳基底核コリン作動性神経細胞が嗅球に投射し
ていないので、本明細書で開示された発明を評価する好ましい損傷モデルではないであろ
う。
代わりに、本明細書で使用するための好ましい損傷モデルは、本明細書で開示されるタ
イプの治療に直接関与するか、または影響を受ける神経経路の１つを破壊しなければなら
ない。例えば、（嗅球及び皮質の双方に投射している）ブローカ後肢の神経細胞の皮質投
射を外科的に切断する一方で、（嗅球からのNGFの逆行性軸索フローが遮断されないよう
に）嗅球への投射をそのままにしておくことにより、研究者が本明細書に開示された治療
の効果を評価することが可能となるより良い試みの形態を提供するであろう。
軸索路を切断する動物モデルの代替的アプローチは、前脳基底核コリン作動性神経細胞
から内因性NGFを取り除き、それによって前脳基底核コリン作動性神経細胞の萎縮及び変
性を誘導するように、特定の適切な標的組織を取り除くことである。このアプローチは、
一般に、発作に関連する興奮毒性損傷の効果をモデル化することができる。公開されてい
る例には、海馬組織の除去について記載しているSofroniew et al 1993が含まれる。ブロ
ーカ後肢からの神経支配を受ける嗅内皮質組織を除去して(Wenk et al 1980)ブローカ後
肢の前脳基底核コリン作動性神経細胞の萎縮を誘導するように、この方法を改変すること
ができる。
Sofroniew et al 1993に記載されている一般的方法を用いて、前脳基底核コリン作動性
神経細胞体の大きさに対するNGF送達（嗅覚受容体神経細胞のトランスフェクションなど
、本明細書で開示された遺伝子ベクターを用いる）の効果をモニタリングすることができ
る。および／またはNGFの存在または量によって直接影響を受ける１つまたは複数の酵素
またはその他のポリペプチドのレベルを評価することによってモニタリングすることがで
きる。そのような酵素またはポリペプチドは、したがって指標ポリペプチドとして用いる
ことができる（そのような測定に有用であろう候補酵素の一例は、アセチルコリン合成に
必要であるコリンアセチルトランスフェラーゼ、すなわちChATである）。除去された、軸
索切断された、またはその他の攻撃を受けた皮質中枢神経系組織の選択領域を有する動物
を試験するために、NGFを（脳室内への注射または注入などによって）中枢神経系に投与
したときに観察および測定することができる別の神経解剖学的効果は、損傷によって誘導
される生存皮質中のChAT免疫反応性線維の密度低下を防止または減少させるNGF投与の能
力によって示される（例えばGarofalo et al 1992)。したがって、１つまたは複数の皮質
中の選択領域を除去するか、または損傷を与える外科的介入または他の介入の後、生存す
る皮質中のChAT免疫反応性線維密度に対するNGF送達の効果（本明細書で開示される遺伝
子ベクターから生じる）をモニタリングするために、Garofalo et al 1992などの論文に
記載される方法を用いることができる。
神経解剖学的変化に加えて、皮質の除去により、ある種の測定可能な行動が低下し、試
験動物において学習及び記憶を必要とする種々の試験に対する正常な行動と悪化した行動
とを区別することができる。具体例には、「モリス水迷路」、受動的回避試験、反応試験
、及びGarofalo and Cuello 1994などの論文に記載されているような他の種々の動物モデ
ルを含む。このような試験動物における外因性NGFの中枢神経系組織への投与（脳室内へ
の注射または注入など）により、損傷によって誘導される動物の行動欠陥が有意に軽減さ
れ得ることが示されている。したがって、そのような行動、記憶及び／または学習の試験
は、血液脳関門にまたがる神経細胞の遺伝子ベクター処理を介して前脳領域へのNGF送達
の効果をモニタリングすることに適用及び使用され得る。
モリス水迷路などの試験によって測定されている通り(Fischer et al 1987及び1991）
、加齢も記憶及び学習性能を低下させる結果となるが、記憶及び学習性能の老化関連的な
衰退は、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー病のヒト患者及び種々の動物モデル
の双方）で起こる記憶及び学習の損失を測定及び定量化するために用いられてきた。外因
性NGFの中枢神経系組織への投与（脳室内への注射または注入など）によって、記憶及び
学習における少なくともいくつかのタイプの老化関連的な衰退を有意に軽減することがで
きることが示されている。したがって、そのような動物モデルで用いられる学習及び記憶
試験のタイプは、本明細書で開示された方法及び遺伝子ベクターによる中枢神経系へのNG
F送達の効果をモニタリングするのに用いることができる（Fischer et al 1987及び1991
）。
本明細書の実施例３及び４で言及されるモニタリング及び測定方法は、網羅的でも排他
的でもなく、当業者に知られているか以後に発見された他のモニタリング及び測定方法に
よって補足することができる。
NGFの非侵襲性送達用の単純ヘルペスウイルス由来ベクターの構築及び使用
上記の実施例は、血液脳関門により保護された中枢神経系組織へのNGFの非侵襲性送達
の経路及び方法として、血液脳関門にまたがる嗅覚受容体神経細胞について遺伝子をトラ
スフェクションをするためのアデノウイルス由来ベクターの使用及び評価について記載す
る。しかしながら、アデノウイルスベクターは、血液脳関門で保護された中枢神経系組織
へのポリペプチドの非侵襲性送達に用いることができる唯一のタイプの遺伝子ベクターで
はないと認知しておくべきである。したがって、実施例５〜８には、その他のいくつかの
部類の遺伝子ベクターの使用について記載している。
ヘルペスウイルスから得られ、かつ中枢神経系活性ポリペプチドをコードする１つまた
は複数の「運送物」遺伝子を保有する、本明細書に開示される遺伝子ベクターを構築する
ために、Goins et al 1999またはFederoff et al 1992などの論文に記載される方法を用
いることができる。HSV由来ベクターは、嗅覚受容体神経細胞を含む広範な種々のヒト細
胞をトランスフェクションすることができ、トランスフェクションされた血液脳関門にま
たがる神経細胞に運送物遺伝子を発現させ、かつ、そのようなポリペプチドを有意レベル
に分泌することを誘導することができる。
したがって、HSV由来ベクターは、所望する場合、実施例１〜４で記載されたアデノウ
イルス由来ベクターの使用と直接比較できる形式で用いることができる。実施例２〜４に
記載される方法（適宜、当業者に知られたその他または別の方法によって補足される）は
、HSV由来ベクターの点鼻及び転写後のモニタリング及び評価のために用いることができ
る。
NGFの非侵襲性送達のための脂質ベースのベクターの構築及び使用
哺乳動物細胞をトランスフェクションするために設計されたDNAプラスミド−脂質複合
体を調製する方法が、「Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.
Robbins出版1997)のNabelによる章（127〜133頁）などの多数の出版物に記載されている
。遺伝子導入に使用するために設計された種々のリポソーム調製キットは市販入手が可能
であるし、あるいは公開された方法を用いて熟練技術者は設計し作製することもできる。
特定の大きさ、タイプまたは濃度のプラスミドDNAまたは他のDNA調製物とともに使用され
る脂質配合物及び調製物のパラメーター（調製混合物中の脂質及びDNAの濃度及び比率、
温度などを含む）の好ましい選択は、多数の論文及び市販入手が可能であるほとんどのキ
ットに付いている説明書で論じられているパラメーターの範囲及び確認試験を用いて、種
々の調製混合物を日常的に試験して決定することができる。
生理食塩水溶液またはその他の担体液中に懸濁している脂質−遺伝子複合体の点鼻によ
る脂質ベース遺伝子ベクターの嗅上皮への投与は、実施例２に記載されたのと同じ一般的
方法を用いることができ、当業者に知られた手段によってそのような使用に適合させる。
実施例３及び４に記載される方法（適宜、当業者に知られたその他または別の方法によっ
て補足される）は、トランスフェクション後のモニタリング及び評価に用いることができ
る。
エンドサイトーシス受容体を標的とするDNAベクターの構築及び使用；サイクル式リガン
ド選択方法
「受容体標的性の遺伝子ベクター」を調製するために用いることができる一般的な原理
及び方法は、「Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins
出版1997）のFindeisの章(135〜152頁)などの種々の出版物に記載されている。上述した
通り、これらのベクターは、神経細胞表面上に曝されているある種の受容体に結合するリ
ガンドを含む。
「背景技術」で言及した通り、多くの既知タイプの神経細胞表面受容体は、リガンド分
子が受容体に結合した後、「エンドサイトーシス」と呼ばれる行程を受ける。名前に示唆
されている通り、エンドサイトーシス受容体は、リガンド分子がそれに結合した後、細胞
内部に取り込まれる。このような活性は放射標識したリガンドを用いた試験によって示す
ことができる。
エンドサイトーシス受容体の一例は、種々の感覚神経細胞（嗅覚受容体神経細胞を含む
）の表面上でアクセス可能な「p75」受容体である。該受容体はヒト及びラットの両方に
存在することが示されており、種々の研究に非常に有用である。これは、p75-NGFR受容体
（ここでNGFRは「神経成長因子受容体」を表す）としても知られ、危機またはストレス状
態を受けた種々の神経細胞で「上方制御(up-regulated)される」（すなわち、受容体をコ
ードするmRNAの発現が増加し、神経細胞表面上に現れる受容体の数が増加する）ことが示
されているので、本明細書に記載の使用において特別関心が高い。具体例として、末梢神
経損傷後にラット運動神経細胞でp75発現が増加し(Yan et al 1998）、筋萎縮性側索硬化
を患ったヒト患者の運動神経細胞でもp75の発現が増加した(Seeburger et al 1993）。
（理想的には試験または治療される種における）標的種類の神経細胞上のエンドサイト
ーシス受容体に結合する適切なリガンドの選択及び／または作製は、このような効果的な
受容体標的性の遺伝子ベクターの構築が鍵である。種々のそのようなリガンドはすでに既
知であり、その他のリガンドは上記に簡潔にまとめたような方法を用いて作製することが
できる。
エンドサイトーシス受容体はタンパク質であるので、通常、モノクローナル抗体の作製
中に抗原として受容体由来のポリペプチド配列を用いることによって、任意の当該受容体
に結合する相補的なポリペプチドを作製することが可能である。既知技術を用いて、受容
体由来の抗原配列をマウス、ラットまたはウサギなどの動物に注射し、次いで得られた抗
体産生細胞を不死化細胞株と融合し、得られた「ハイブリドーマ」細胞をスクリーニング
して、興味対象の受容体に対して高親和性で結合するモノクローナル抗体を分泌するクロ
ーン細胞株を同定し単離する。いったん所望のモノクローナル抗体株が作製され同定され
ると、通常、そのモノクローナル抗体の可変結合部分(しばしば頭文字「scFv」断片など
により参照され、ここで、「sc」は「単鎖」を指し、「Fv」は結合ドメインを含む可変断
片を指す）から、より小さいドメインまたは断片を単離することができる。次いで、その
結合断片をコードする遺伝子配列をプラスミドまたはその他のベクターに組み込んで、限
られた量の受容体リガンド断片を宿主細胞の発酵によって合成することができる。
その一般的なアプローチにより、１つまたは複数の末梢投射を有する任意の感覚神経細
胞上の任意の既知エンドサイトーシス受容体に本質的に結合するモノクローナル抗体を作
製することができる。
p75受容体の具体例の続きとして、192-IgGとして知られるモノクローナル抗体(Chandle
r et al 1984に記載）は、ラットのp75受容体に対して高親和性で結合することが示され
ている。192-IgGモノクローナル抗体（及び該抗体由来の種々の断片）は、p75受容体を発
現する末梢投射性の神経細胞でエンドサイトーシスを受け、逆行性輸送されることが示さ
れている(Yan et al 1988）。
いったん受容体結合性リガンドとして機能できるポリペプチド配列が同定されると、種
々の試薬を用いてDNA部分をリガンドポリペプチドに一時的に連結させ、それによりポリ
ペプチド−DNA複合体を作製することができる。１つの好ましい方法では、リガンドポリ
ペプチドに連結して、一連のリシン残基から成る「ポリリシン」ドメイン（または生理学
的ｐＨで正電荷を有するその他のアミノ酸残基）を有するポリペプチドを作製することが
できる。宿主細胞中でポリペプチドを発現するために用いられるポリペプチドコード遺伝
子に一連のリシンコドンを付加すること、あるいは二官能性の架橋試薬を用いてポリリシ
ンをポリペプチドに化学的に連結することなど、いつくかの方法によって、これを行うこ
とができる。化学的親和力のため（ポリリシン鎖は正電荷を有し、DNA鎖は負電荷を有す
る）、DNA部分は、ポリリシン「テイル」を有するポリペプチドに非共有的な形式で付着
する。ポリペプチドのリガンド部分がエンドサイトーシス受容体に結合すると、ポリペプ
チド−ポリリシン−DNA複合体全体（加えて、受容体たんぱく質も）が細胞内へ取り込ま
れるプロセスが開始する。複合体が細胞内に取り込まれた後、DNA分子は放出され、細胞
内で逆行性輸送されうる。
あるいは、ニューロトロフィン受容体のための通常のリガンド（NGF受容体に結合するN
GFなど）を用いることができる。放射標識されたNGFは、「trkA」と呼ばれる受容体を発
現する感覚神経細胞で、受容体仲介性に取り込まれ(internalization)、逆行性輸送され
ることが示されている(例えばBarbacid 1995）。したがって、NGFポリペプチドそれ自体
を、その受容体を有する細胞のリガンドとして用いることができる。NGFポリペプチドそ
れ自体（及び種々の他の神経細胞受容体リガンド）は、染色体に結合するDNA結合タンパ
ク質の部類であるヒストンで見出される正電荷と類似した正味の正電荷を有することに注
意しなければならない。したがって、まずポリリシンまたはその他類似の正荷電ドメイン
または共役体をNGFまたはその他の正荷電ポリペプチドに付加することは全く必要なく、
または最小限に留めることができ、ポリペプチドそれ自体が、受容体標的リガンド及びDN
A担体の双方として機能することができるであろう。
その他の種々の既知化合物もまた、１種類以上の血液脳関門にまたがる神経細胞上のエ
ンドサイトーシス受容体に結合することができるリガンドとして、及び／または遺伝子ベ
クターまたはそのある部分が神経細胞内に取り込まれた後に逆行性輸送または他のある機
能を促進することができるペプチド配列として使用される可能性について評価することが
できる良い候補となる。ほんの一例として、Wiley and Lappi 1993は、(i)p75神経細胞受
容体に結合するモノクローナル抗体192-IgGを、(ii)サポリンと呼ばれる植物由来毒素（
これは神経細胞体への細胞内輸送を促進し、そこでリボソームを不活性化すると信じられ
ている）に連結することにより形成した共役体について記載している。Wiley and Lappi
によると、この共役体は、研究目的のために特定の標的となる神経損傷を生じさせるのに
有用であると報告された。したがって、本明細書ではそれを「プローブ」化合物とみなす
。当業者に知られた方法を用いて、DNAの一部分は(i)「プローブ」化合物に非共有的に連
結され、(ii)プローブ化合物の助けで神経細胞体へと輸送され、次いで(iii)取り込み及
び輸送工程が完結した後に、プローブ化合物から細胞体に放出されることを可能とする形
式で、上記の、または類似のプローブ化合物を改変し適合させて、それらを神経細胞に対
して非致死性にすることが可能である。
さらに多様な神経毒が、クモ、ハチ、ヘビ、海洋性カタツムリ、及びその他の毒を出す
生物から得られている。より多く見られる神経毒の特徴の１つは、神経毒が、神経投射の
表面上の１または複数のタイプの受容体及び／またはイオンチャンネルに（しばしば非常
に高レベルの結合親和性で）結合することである。これは、野生生物が餌食を麻痺又は不
活動化させるために、または攻撃者に対し防衛をするために用いる重要なメカニズムの１
つである。猛毒の動物に噛まれ、または刺されたことによって通常生ずるレベルの痛みを
与えることなく医学上有用となりうる治療剤を求めて、このような神経毒の相当数が、神
経細胞受容体またはイオンチャンネルに対してより低い非毒性レベルの結合親和性を示す
アナログ、共役体、及びその他の変異体及び誘導体を形成するために、生化学研究者によ
って改変される。
さらに、病原菌由来の種々の毒（破傷風毒素、コレラ毒素などを含む）及び植物由来の
種々の化合物（レクチンまたは凝集素として知られるカテゴリーに属する化合物を含む）
が、本明細書に記載の使用のための候補となり、遺伝子ベクターが１つまたは複数の種類
の血液脳関門にまたがる神経細胞に結合し該神経細胞をトランスフェクションするのを助
ける選択的リガンドとなるかどうかを決定することについて評価することができる。
したがって、任意のそのような既知のまたは以後に発見された神経毒、微生物毒素、植
物レクチン、または血液脳関門にまたがる神経細胞の表面上に見られる１つまたは複数の
受容体、イオンチャンネル、蛋白質、糖共役体、またはその他の分子に選択的に結合する
ことができる他の機能的に類似した化合物、及びそのような神経細胞結合化合物のアナロ
グ、共役体、またはその他の変異体または誘導体のいずれもが、１つまたは複数のタイプ
の血液脳関門にまたがる神経細胞に遺伝子ベクターが選択的に結合しトランスフェクショ
ンするのを助けることができるリガンドとして、本明細書に開示された使用の可能性につ
いて評価され得る。
３番目の代替的アプローチとして、「好ましい実施形態」に記載され、図７に図示され
ている通り、ファージディスプレイライブラリーを用いる「コンビナトリアルケミストリ
ー」のアプローチを用いることができる。簡潔に言うと、このアプローチは、リガンドポ
リペプチド候補のアレイを作製するために、各ファージが単一のポリペプチド断片を発現
するファージディスプレイライブラリーを用いる。坐骨神経などの神経束上に位置する結
紮糸による閉塞を有するラットなどの生体内の神経細胞によって行われる受容体仲介性エ
ンドサイトーシス行程を用いて、すべてのアレイのファージをスクリーニングする。続い
て、（宿主細菌に感染することができる）生存ファージ粒子を、結紮糸の位置の直ぐ隣の
「遠位の」切り出した神経細胞セグメントから収集する。次いで、次の世代のファージを
成長させるために、収集したファージ粒子を大腸菌細胞に接種する。この新しい世代のフ
ァージは、結紮糸の隣の位置で神経細胞内に存在していた上記特定ファージを含む。「背
景技術」でより詳細に記載されている通り、当該ファージを実験室動物に接種し、続いて
処理した該実験室動物から回収した方法の点から、このスクリーニング方法によって選択
された特定ファージは、その特定ファージを(i)エンドサイトーシスプロセスによって神
経細胞の末梢投射内に取り込ませ、そして(ii)神経細胞軸索内で、結紮糸の隣の部位まで
逆行性輸送させるリガンドポリペプチド配列をおそらく発現しているに違いない。
このようなスクリーニング及び選択方法を数回繰り返すことにより（及び、所望する場
合には、高性能ファージ株に無作為または標的の突然変異誘発を起こすことにより）、エ
ンドサイトーシス受容体に結合してエンドサイトーシスを引き起こすリガンドとして非常
に有効であるポリペプチド配列をコードする挿入遺伝子を有するクローンファージ株を同
定することができる。それらのファージを分析し、リガンドの遺伝子配列およびアミノ酸
配列を決定し、その後非常に有効な受容体標的性トランスフェクションベクターを作製す
る際に使用する。
所望する場合、「フローサイトメトリー」と通常呼ばれる既知の機械を用いて行うこと
ができる「蛍光標示式細胞分取器」(FACS)などの種々の検査の使用により、このようなサ
イクル式スクリーニング方法をさらに改良することができる。如何にしてこの方法を用い
ることができるかの例として、プラスミド、ファージ、または「ファージミド」DNAをロ
ーダミンなどの化合物を用いて蛍光標識することができる。表面上にp75受容体を有する
ことが知られている組織培養で増殖した細胞を、種々のポリペプチド−DNA複合体ととも
にインキュベートし、次いでその細胞を、蛍光検出器を備える細胞分取機器に通す。特定
細胞から放出された蛍光が比較的強い場合、そのことは、ある細胞が標識されたポリペプ
チド−DNA複合体を大量に取得したことを示しており、同調した非常に短い気体または液
体噴流によってその特定細胞を含有する液体流は別々の回収装置に分けられる。このよう
にして、大量の「取り込まれた」DNAを含む細胞を高速自動装置を用いて早く容易に単離
することができ、続いて、高レベルのポリペプチド−DNA複合体の細胞内取り込みを引き
起こしたポリペプチドを評価または複製するために、再生産し、分析し、又は処理するこ
とができる。これは、本発明を簡素化し改良するために如何にして自動分析及び操作を用
いることができるかの単なる一例であり、その他の方法も当業者に明らかである。
今のところ、アデノウイルス由来の（または同様に作用する他の種々のウイルス由来の
）既知のキャプシドタンパク質にDNAセグメントを連結することにより、別の代替的DNA−
タンパク質複合体を調製することができる。このアデノウイルスキャプシドタンパク質は
、複合体が標的細胞に入った後にエンドサイトーシス小胞からベクター保有DNAの効率的
な放出を促進するのを助けることが知られている。このアプローチは、「Ｍethods in Mo
lecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997）のCurielによる章（
25〜40頁）に記載されている。所望する場合には、アデノウイルスキャプシドタンパク質
配列及び受容体結合リガンド配列を融合タンパク質中で結合して一体化することができる
。
このような受容体標的性トランスフェクションベクターの点鼻では、実施例２及び６に
記載されるのと同じ一般的方法を用いることができる。それらの一般的方法は、当業者に
知られた手段によって、特に受容体標的性リガンドベクターを用いた使用のために適合さ
せることができる。実施例３及び４に記載された方法及び当業者に知られたその他の方法
を、トランスフェクション後のモニタリング及び評価のために用いることができる。
脳内の二次神経細胞へのNGF遺伝子を送達するための経ニューロン性ベクターの構築及び
使用
本実施例では、血液脳関門内に完全に位置する神経細胞内に外来遺伝子（外来遺伝子に
より発現されるポリペプチドだけではない）を輸送することができる「経ニューロン性」
遺伝子ベクターを構築するための方法を説明する。言い換えれば、このような経ニューロ
ン性遺伝子ベクターの目標は、単に血液脳関門にまたがる神経細胞ではなく、トランスフ
ェクションされた血液脳関門にまたがる「一次」神経細胞とシナプス接合を共有する他の
「二次的な」または「二次」神経細胞（及び二次神経細胞とシナプス接合を共有する三次
神経細胞も同様に可能性がある）をトランスフェクションし、遺伝子的に形質転換するこ
とである。経ニューロン性ベクターは、完全に血液脳関門内に位置する神経細胞により分
泌されることができる新しいポリペプチド及び／または補充されるポリペプチドの量及び
分布を共に大きく増加することができる。この治療は、パーキンソン病やアルツハイマー
病などの、広範囲性かつ播種性の脳傷害により特徴付けられるある種の脳変性疾患を治療
するのに有効な方法となり得る。
これらの経ニューロン性ベクターは、二次（または三次またはそれ以降の）神経細胞に
侵入した後、自身のマルチコピーを複製し産生することは期待されないことを認知してお
くべきである。その代わりに、このような経ニューロン性ベクターの目標は、完全に血液
脳関門内に存在する「下流の」神経細胞に、これらのベクターを単に配置させることであ
って、血液脳関門にまたがる「一次」神経細胞に該ベクターを限局させることではない。
しかしながら、（アデノ関連ウイルス由来の末端反復配列を用いてプラスミドの転写単位
を挟むなどの工程により、下流神経細胞内の染色体への遺伝子配列の組み込みを促進する
ための追加手段をとる場合に、より起こり易く、より頻繁に起こる）いくつかのケースに
おいて、このアプローチは、完全に血液脳関門内にあって該血液脳関門内によって保護さ
れる中枢神経系神経細胞に対する非侵襲性の遺伝子治療法をもたらしうることが認められ
る。
経ニューロン性ベクターを構築するための現在期待されているアプローチは、(i)破傷
風毒素の「非毒素フラグメントＣ」（例えばKnight et al 1999)；(ii)大麦レクチン(Hor
owitz et al 1999）；及び(iii)小麦胚凝集素(Yoshihara et al.1999)など、ある種の病
原体及びポリペプチドの経ニューロン性輸送について知られる種々の事実に基づく。大麦
レクチン及び小麦胚凝集素は、嗅覚受容体神経細胞から前脳基底核コリン作動性神経細胞
へ、同様に青斑核及び縫線核の神経細胞などその他の部類の神経細胞へ、活発に経ニュー
ロン性輸送されることが示されている。実施例７に記載したのと同じタイプのコンビナト
リアル選択方法を用いて、経ニューロン性輸送能力を有するその他のポリペプチド配列を
発見および作製することもできる。ファージを二次（または三次またはそれ以降の）神経
細胞へ経ニューロン性輸送するポリペプチドをコードする遺伝子配列を有するファージを
同定するためにファージディスプレイライブラリのサイクル式試験を行うことにより、こ
れを行うことができる。
経ニューロン性輸送能力を有することが知られるポリペプチドを用いて遺伝子ベクター
を構築するために既知の方法を用いることができる。例えば、化学反応を用いるか、ポリ
ペプチド末端の多数のリシン（または他の正電荷）残基をコードする遺伝子組み換え遺伝
子を用いて、ポリリシンを輸送ポリペプチドに共有結合することができる。ポリリシンは
正電荷であるため、溶液中でポリペプチドをDNAセグメントと混合すると、（負電荷の）D
NAセグメントを引きつける。これにより、程々に強いが非共有的な、ポリペプチドとDNA
との結合がもたらされる。このタイプの調製は、Knight et al 1999に記載されている。
生理食塩水溶液またはその他の担体液中に懸濁したベクターの点鼻による嗅覚上皮への
該遺伝子ベクターの投与は、当業者に周知の手段により本使用に適合させた実施例２記載
と同じ一般的方法を用いることができる。
実施例３及び４で説明した方法（当業者に知られた他の方法または追加の方法を適宜補
足する）をトランスフェクション後のモニタリング及び評価に用いることができる。血液
脳関門内の神経細胞（例えば前脳基底核コリン作動性神経細胞）内で経ニューロン的に(t
ransneuronally)トランスフェクションされたNGF遺伝子構成体の発現を実証することが、
in situハイブリダイゼーション及び／またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの感度の良
い方法を用いて行うことができる。実施例３に記載の通り、宿主中の対応ポリペプチドと
は明確に異なるポリペプチドを発現するNGF遺伝子配列の利用によって発現の検出を容易
にすることができる。
このような経ニューロン性ベクターにより生ずる生理学的効果及び行動効果の追加モニ
タリングを実施例４に記載されたような方法で行うことができる。
抗NGFポリペプチドを脊髄後角領域内に送達するためのウイルスベクターの構築及び使用
実施例１〜８には、神経細胞の成長または修復を刺激するのを助けるために神経成長因
子(NGF)などの神経栄養性ポリペプチドの送達について記載する一方で、実施例９及びそ
の後のいつくかの実施例には、本明細書中で「抗NGF」ポリペプチドとして称される完全
に異なるタイプのポリペプチドについて記載している。このようなポリペプチドは、血液
脳関門を通って輸送され、正しく標的とされる位置に送達された場合、神経因性疼痛また
は自律神経失調症などの種々の症状を治療し低減させるのを助けることができる。このよ
うなポリペプチドは、(i)脳脊髄液(CSF)またはシナプス液中でNGF分子に結合し、該NGF分
子がNGF受容体に結合することができないようにすることでNGF分子を不活性化することに
より、及び／または(ii)神経細胞上のNGF受容体タンパク質に結合し、遊離NGF分子が受容
体に結合したときに起こる細胞反応を引き起こさない形式で、それらの受容体を占有して
NGF分子がアクセスできなくすることによる、少なくとも２つの知られた機構によって働
かせることができる。
CSFまたはシナプス液中の遊離NGF分子に結合する抗NGFポリペプチドは既知であり、Rub
erti et al（1993及び1994）などの論文に記載されている。これらの抗NGFポリペプチド
をコードする遺伝子配列も既知であり、実施例１に記載される通り、哺乳動物細胞中で遺
伝子発現を実行する適当な遺伝子プロモーターを有する完全な遺伝子構成体中に組み込む
ことができる。
このような遺伝子構成体が、嗅覚受容体神経細胞やその他のタイプの感覚神経細胞では
なく、侵害受容性神経細胞中での発現を意図する場合、遺伝子発現を実行するのに用いら
れる遺伝子プロモーターに注意を払わなければならない。侵害受容神経細胞中で機能する
遺伝子プロモーターとなり得るものの範囲は知られ、それらの候補プロモーターから、日
常的な実験により、侵害受容神経細胞中で所望の遺伝子発現レベルを実行できる適当なプ
ロモーターを選択することができる。好ましいプロモーター選択も、種々の神経細胞中で
生来起こる発現レベルによって影響を受け得る。
例えば、CGRP遺伝子の発現を実行する遺伝子プロモーター（Watson et al 1995に記載
）を用いることにより、ベクターが保有する抗NGF遺伝子の発現を、トランスフェクショ
ンされた、神経ペプチドCGRPを発現する侵害受容神経細胞に制限することができる。治療
の１つの目的が、神経因性疼痛またはその他の慢性疼痛を患う患者の脊髄中のNGFレベル
を減少することである場合、CGRPプロモーターは、そのプロモーター活性がNGFの存在に
よって増強されるので、特に有用であろう。したがって、脊髄中のNGFレベルが増加した
とき、このプロモーターは、応答して抗NGFの合成及び分泌を増加させ、それによって自
己制限、自己制御する遺伝子発現系を作り出すことができる。
抗NGFをコードする配列及び選択したプロモーターを有する遺伝子構成体を、実施例１
及びRuberti et al（1993及び1994）に記載され引用されているような方法を用いて複製
欠失アデノウイルス由来の遺伝子ベクター中に置くことができ、あるいは実施例５及び本
明細書中で引用した論文に記載されているような方法を用いて、複製欠失ヘルペスウイル
ス由来の遺伝子ベクター中に置くことができる。
この実施例は、NGFによって悪化した神経因性疼痛を減少し制御する方法に関するので
、本明細書に開示される抗NGFベクターは、嗅覚神経細胞などの感覚受容体神経細胞中に
挿入されることはない。代わりに、これらのベクターは、Sahenk et al 1993に記載され
ているような方法を用いて、あるいは特定の患者が関与する臨床試験または治療処置にお
いて最も効果的であるとされるように、(i)異痛症などの神経因性疼痛に悩まされた領域
、及び／または(ii)血液脳関門にまたがる侵害受容神経により神経支配される領域の皮下
組織または筋肉組織など、高濃度の侵害受容神経を含む領域に注入される。
侵害受容神経細胞の投射を有する領域への注入後、少なくともいくつかの抗NGF遺伝子
ベクターは、血液脳関門外の侵害受容神経細胞の投射に接触する。感染中にDNAを細胞に
注入するためにウイルスが通常用いる同じ機構を用いて、ウイルスベクター（または実施
例６〜８に記載されるような非ウイルスベクターにより用いられる類似の機構）は、それ
らの組織を神経支配する血液脳関門にまたがる侵害受容神経細胞の外部の投射内に遺伝子
修飾されたベクターDNAを注入する。逆行性輸送により、ベクターDNAは、細胞細胞質を通
って脊髄の側面に位置する後根神経節と呼ばれる神経細胞領域に運ばれる。抗NGFポリペ
プチドをコードする遺伝子は、神経節（複数形は「ganglia」とも綴られる）内に在る侵
害受容神経細胞内で発現され、それにより血液脳関門にまたがる神経細胞内で抗NGFポリ
ペプチド分子が生成する。
少なくともいくつかの抗NGFポリペプチドは、血液脳関門内で囲まれて該血液脳関門に
より保護される組織において、脊髄の「後角」領域（及びその他の領域の可能性もある）
に位置するシナプス末端または類似の出口点に到達するまで、通常の順行性輸送により、
血液脳関門にまたがる神経細胞の軸索を通って輸送される。血液脳関門内に位置するシナ
プスに順行性輸送され放出される神経伝達ペプチドを含有する小胞中にポリペプチドがパ
ッケージングされるように、トランスフェクションされた細胞に指示するリーダーまたは
シグナルペプチドを、分泌または成熟ポリペプチドの開始点に追加することにより、この
順行性輸送工程の効率を増強することができる。侵害受容神経細胞中での使用に適するリ
ーダー配列の具体例はプレプロBDNF配列であり、これは、脊髄中の後角領域中に成熟BDNF
を順行性輸送するように侵害受容神経細胞に指示する（これらの神経細胞が通常合成する
）。
これらの位置で侵害受容神経細胞末端によって放出されたとき、抗NGF分子はNGF分子と
結合し、それによってその位置における脊髄組織中の遊離NGFの量を減少させることがで
きる。NGF結合の減少によって成熟侵害受容神経細胞が死滅することはないが、Christens
en et al 1996などの論文に記載されている通り、実験動物中への抗NGFの直接投与によっ
て実証されている侵害受容機能及び活性の可逆的な抑制（しばしば「ダウン・レギュレー
ション」と呼ばれる）がもたらされる。
後根神経節中の遺伝子発現（約24時間から72時間と予想される）及び脊髄の後角領域中
への抗NGFの順行性輸送及び放出（約８時間から24時間と予想される）のための十分な時
間を与えた後、脊髄中に抗NGFを検出することができる。
犠牲死させた実験動物において、電子顕微鏡検査法、免疫学的染色、及びベクター由来
の抗NGFを標識する種々の方法、例えばベクター遺伝子によってコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列中に適当な抗原性タグを追加するなどの適当な方法で、脊髄中の抗NGF
ポリペプチドの放出を直接モニタリングすることができる。遊離NGFの濃度を測定するこ
とによって抗NGFの濃度及び／または効果をモニタリングすることも可能である。抗NGFは
放出されると、脊髄中の内因性NGFに結合しこれを中和する。したがって、脊髄中のNGFの
レベルの変化は、実施例３で概説したものなど種々の免疫学的方法を用いて、またこれら
の方法を、トランスフェクションされた感覚神経細胞からの神経支配を受けた脊髄組織の
検査に適用することにより、モニタリングすることができる。脊髄中のNGFのレベルの変
化は、実施例10でより詳細に概説する通り、固有の神経解剖学的変化及び行動変化から推
測することもできる。
脊髄中の後角領域への抗NGFの送達の生理学的効果及び行動効果のモニタリング
試験結果の統計的な比較を可能にするため、実験動物を２つの群に分ける。一方の群（
試験動物）は、上記の通り、抗NGF遺伝子ベクターを享受し、もう一方の群（コントロー
ル群）は中枢神経系組織に対して既知の神経活性効果がない非コードDNA、無害の遺伝子
、またはマーカー遺伝子を含むベクターを享受する。脊髄への抗NGFの投与の生理学的効
果には、Christensen et al 1996及び1997などの論文で議論されているような脳の神経解
剖学に対する効果及び動物の行動に対する効果が含まれる。
動物モデルの適切な選択は、脊髄への抗NGF送達の生理学的効果を評価するのに重要で
ある。炎症性疼痛の動物モデルに加え、末梢神経に損傷または攻撃を与えることにより、
痛覚過敏及び「異痛症」（中枢神経系が穏やかな刺激を激痛と解する慢性及び／または神
経因性疼痛）の種々のモデルを作ることができる。
神経因性疼痛をモデル化するため、及び神経因性疼痛の治療可能性を試験するために、
一般的方法の単なる一例として、縫合糸（「結紮糸」）の環をラットなどの動物の後肢の
一方の坐骨神経の半分から３分の２の周囲に外科的に配置し、固く締めることができる。
数日から１週間内に、肢は、穏やかな刺激に対して過敏となり、深刻な痛みを受ける。次
いで、このように処置したラットを、自動センサーを有する特別の箱中に入れ、その底板
を温かくし始めてから、ラットがその温めた表面から過敏な脚を持ち上げて離すまで何秒
経過したかを測定し記録することができる。候補の治療によって、神経結紮された脚を上
げるまでに経過した平均秒数を、未治療対照動物の比較時間にまで延ばすことができた場
合、そのことは、その治療が神経因性疼痛を減少するのに効果的であり、大型動物でのよ
り詳細な試験及び／またはヒト患者での臨床試験に値するであろうことを示している。
しかしながら、末梢神経の結紮またはその他の攻撃または損傷は、注入部位から後根神
経節へのベクターDNAの逆行性輸送を妨害し、本明細書に記載された治療を評価するのに
用いられる当該試験の設計及び解釈を複雑にするであろうことを認知するべきである。し
たがって、脊髄に直接的に影響を及ぼし関与する攻撃は、少なくともいつくかの状況で好
ましいであろう。脊髄損傷に起因する慢性または神経因性の疼痛はしばしば臨床で見られ
、脊髄内でのNGFの過剰生産が、脊髄損傷にしばしば付随する「一次求心性出芽（primary
afferent sprouting）」として知られる状態に関与している(例えばKrenz et al 2000)
。したがって、痛覚過敏性または慢性の疼痛を再現可能に引き起こす脊髄損傷モデルを用
いて、痛覚過敏性または慢性の疼痛に対する脊髄への抗NGF送達の効果をモニタリングす
ることができる。具体例は、Krenz et al 1999に記載された脊髄損傷モデルであり、この
モデルは、本明細書に記載された方法を用いた脊髄への抗NGF送達の生理学的効果を評価
するのに適当であると信じられる。
痛覚過敏性または慢性の疼痛に関連する後角の感覚神経支配パターンの神経解剖学的変
化には、後角の層IIへの「Ａ」線維及び侵害受容CGRP含有線維の異常な発芽が含まれる（
例えばBennet et al 1996)。Bennet et al 1996またはChristensen et al 1997に記載さ
れた方法を用いる一方で、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの薬剤を用いてＡ線維を神経節
経由的に(transganglionically)標識すること、及びCGRP免疫組織化学を用いて後角の侵
害受容性（NGF応答性）線維を視覚化することにより、そのような神経解剖学的変化に対
する抗NGF遺伝子ベクターの投与の効果をモニタリングすることができる。
あるいは、脊髄中の末梢投射している感覚神経細胞と二次神経細胞とのシナプス接続の
数及び程度に対する抗NGF送達の効果は、Blessing et al 1994に記載されるような方法な
どを用いて経ニューロン性追跡方法などにより評価することができる。
動物モデルでの疼痛反応の確立した機能的モニタリング方法には、(i)上記で簡単に概
説し、Romero et al 2000などの論文に詳細に記載されている通り、温度刺激に応答して
脚を引っ込める保持時間を測定すること、(ii)Deng et al 2000などの論文に記載されて
いる通り、von Frey毛髪刺激剤の適用に対する応答を測定することが含まれる。
抗NGFまたは相当ポリペプチドによる治療が効きうるその他の症状は、しばしば「自律
神経失調症」と称される。この症状は、上位胸部または頚部の領域に脊髄損傷を有する患
者で最もよく起こり、上位脊髄中の節前交感神経細胞での正常な接続が破壊されている。
その結果、自律神経系での正常なフィードバック制御機構が破壊され、通常の刺激（例え
ば腸の充満を示す大腸の膨張など）が、生死に関わることがある他の反射結果を引き起こ
すことがある（心臓麻痺や心発作などの深刻な心血管症の危険性が大いに高まるレベルへ
の心拍数及び血圧の増加など）。
動物モデルの研究（例えばKrenz et al 1999)で示される通り、この状態の動物モデル
の脊髄中への抗NGFの直接注入は、そのような脊髄損傷後に起こり得る侵害受容神経細胞
による後角の異常かつ不要な神経支配を抑制することにより、この不要な反射応答を妨げ
あるいは制御することができる。
したがって、露出されたアクセス可能な侵害受容神経細胞（及び運動神経細胞などその
他の脊髄神経細胞も可能性がある）の投射に遺伝子ベクターをトランスフェクションして
、血液脳関門によって保護される脊髄領域中に抗NGFポリペプチドを導入する本発明の使
用方法は、自律神経失調症の治療に相当有望である。
脊髄中の後角領域中へ抗NGFポリペプチドを送達するための脂質ベースの遺伝子ベクター
の構築及び使用
実施例９及び本明細書で引用される論文に記載された方法を用いて、１つまたは複数の
標的とする部類の侵害受容神経細胞で発現する抗NGF遺伝子構成体を作ることができる。
既知の方法を用いて、得られた遺伝子構成体をプラスミドまたはその他の安定体などのDN
Aベクター内に置くことができる。次いで「Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Ther
apy Protocols」(P.Robbins出版1997）のNabelの章(127〜133頁)および実施例６で記載さ
れているような方法を用いて、DNAベクターを脂質小胞（リポソーム）内部に置くことが
できる。
Sahenk et al 1993によって記載されるような方法を用いて、あるいは特定の患者が関
与する臨床試験または治療処置において最も効果的であるとされるように、神経因性疼痛
またはその他の慢性痛を患う領域で、皮下組織または筋肉組織などの高濃度の侵害受容神
経を含む領域に生理食塩水中のリポソーム懸濁液を注入するなどの手段により、得られた
リポソームベクターを侵害受容神経細胞の末梢投射に投与することができる。少なくとも
いくつかのリポソームベクターは、筋肉組織で血液脳関門外に位置する侵害受容神経細胞
の投射に付着して融合し、その結果、リポソームが運ぶ抗NGFコードDNAが神経投射内に供
給される。DNAセグメントの逆行性輸送により、少なくともいくつかの抗NGFのDNAが神経
細胞体に運搬され、そこで抗NGF遺伝子から抗NGFポリペプチドが発現される。
その後の脊髄中への抗NGFポリペプチドの送達及び脊髄組織中の抗NGFポリペプチドの生
理学上及び行動上の効果は、実施例９及び10で記載されているような方法を用いて測定し
、モニタリングすることができる。
脊髄の後角領域中へ抗NGFポリペプチドを送達するための侵害受容神経細胞上のエンドサ
イトーシス受容体を標的とするDNAベクターの構築及び使用
実施例９で記載される方法などの種々の既知の方法を用いて、侵害受容神経細胞で発現
する抗NGF遺伝子構成体を作ることができる。実施例11で記載される方法のようなその他
の既知の方法を用いて、リポソームなどの非ウイルスベクターによって侵害受容神経細胞
内に輸送することができるプラスミド体やその他の安定体中に、抗NGF遺伝子構成体を置
くことができる。
次いで、これらの安定なDNA体を用いて、実施例７に記載されるような方法を用いて、
タンパク質−DNA複合体を形成することができる。この複合体は、エンドサイトーシスを
誘発する侵害受容神経細胞の受容体に特異的に結合するリガンドとしてのポリペプチドセ
グメントを組み込んでいる。このような種々の受容体特異的ポリペプチドセグメントは既
に知られ、その他のものは実施例７に記載されるファージライブラリのアプローチを用い
て同定および開発することができる。
したがって、これらの工程が正しい順番で編成されると、血液脳関門内に取り囲まれて
いない、したがって末梢投射への比較的簡単なアクセスを提供する領域で、侵害受容神経
細胞の末梢投射上のエンドサイトーシス受容体を特異的に標的とすることができる遺伝子
ベクターが作製される。このような受容体特異的エンドサイトーシス遺伝子ベクターを用
いて、上記神経細胞内で発現する抗NGF遺伝子を、上記神経細胞にトランスフェクション
することができる。次いで、神経因性疼痛やその他の疼痛疾患を制御および軽減するよう
に、神経細胞自体が脊髄の後角領域中で抗NGFポリペプチドを送達し分泌する。
そのような抗NGFポリペプチドの脊髄組織内への送達は、実施例９に記載されるような
方法を用いてモニタリングすることができ、そのような脊髄組織内での抗NGFポリペプチ
ドの生理学的効果及び行動効果は実施例10に記載されるような方法を用いて評価すること
ができる。
脊髄中の二次神経細胞に抗NGF遺伝子を輸送する経ニューロン性抗NGFベクター
侵害受容神経細胞内で抗NGFポリペプチドを発現することができる遺伝子構成体（適当
な遺伝子プロモーターを含む）を実施例９に記載されるようにして作ることができる。既
知の方法を用いて、これらの遺伝子構成体をプラスミドまたはその他の安定体中に置くこ
とができる。
次いで、このような抗NGFプラスミドまたはその他のDNAベクターを、一つの神経細胞か
ら別の神経細胞へのタンパク質−DNA複合体の輸送を実現および促進することができる「
経ニューロン性ポリペプチド」と連結することができる。種々のこのような「経ニューロ
ン性ポリペプチド」は知られ、例えば、破傷風毒素の「非毒素フラグメントＣ」(例えばK
night et al 1999）、大麦レクチン(Horowitz et al 1999)、小麦胚凝集素(Yoshihara et
al 1999）(実施例８にも列記されている)を含む。
(i)末梢のシナプス末端で露出されており、かつ(ii)血液脳関門にまたがる神経細胞に
よって血液脳関門内のシナプスに内部輸送されるタンパク質に可逆的に結合することによ
り、このような「経ニューロン性ポリペプチド」は、トランスフェクションされた血液脳
関門にまたがる「一次」侵害受容神経細胞の細胞質を通り、血液脳関門を通り、後角中に
位置した神経細胞末端やその他の脊髄組織中の場所に、タンパク質−DNA複合体を輸送す
ることができる。次いで、経ニューロン性タンパク質の助けにより、タンパク質−DNA複
合体は、血液脳関門にまたがる侵害受容神経細胞のシナプス末端を出て、完全に血液脳関
門内に位置する近くの脊髄神経細胞内に入り、それによって血液脳関門により保護された
「二次」脊髄神経細胞にトランスフェクションされる。
血液脳関門により保護された「二次」脊髄神経細胞内へのこのような抗NGF遺伝子ベク
ター及びそのコード配列の送達は、犠牲死された実験動物から得た脊髄細胞及び組織を用
いて、インサイチュDNAプローブハイブリダイゼーション及びPCR分析など方法でモニタリ
ングすることができる。トランスフェクションされた「二次」脊髄神経細胞による抗NGF
ポリペプチドの発現は実施例９に記載されるような方法を用いてモニタリングすることが
でき、脊髄細胞中の抗NGF遺伝子及びポリペプチドの生理学的効果及び行動効果は実施例1
0に記載されるような方法を用いて評価することができる。
上位運動神経細胞内へ神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェ
クションするためのアデノウイルスベクターの使用
正常細胞中で複製することができない非病原性アデノウイルスベクターを調製する方法
がGraham and Prevec 1995などの論文に公表されている。種々の神経栄養因子をコードす
る遺伝子を含むそのようなベクターの具体例を記載した論文には、Dijkhuizen et al 199
7、Gravel et al 1997、Baumgartner et al 1998及びRomero et al 2000が含まれる。
「グリア細胞株由来神経栄養因子」(GDNF)をコードする遺伝子配列が単離され、プラス
ミドやアデノウイルスベクターなどの取り扱いやすい形にしたものが、Lindsay et al 19
96、Choi-Lundberg et al 1997、Baumgartner et al 1997などの論文及び本明細書で引用
するその他の種々の論文に記載されている。
「ニューロトロフィン-3」(NT-3)をコードする遺伝子配列が単離され、プラスミドまた
はアデノウイルスベクターなどの取り扱いやすい形にしたものが、Snider 1994及びBothw
ell 1995などの論文及び本明細書で引用するその他の種々の論文に記載されている。
GDNF及びNT-3は、従来技術で行われた試験によって示される通り、特に運動神経細胞に
投与したときに（他の既知の神経栄養因子と比較して）比較的強い活性及び効果を有して
いるので、本明細書に開示される運動神経細胞の治療での使用のための最初の試験に好ま
しい候補である。
運動神経細胞中で遺伝子発現を実行する多くの遺伝子プロモーターが知られ、入手でき
、本明細書で記載される試験において用いることができる。脊髄運動神経細胞をトランス
フェクションするための使用で特に注意に値するプロモーターの一部類には、脊髄運動神
経細胞中のグリシン受容体のいわゆるα-1サブユニットの発現を実行するプロモーターが
含まれる。グリシン受容体は侵害受容神経細胞またはその他の感覚神経細胞中で高濃度に
存在しないので、グリシン受容体（または感覚神経細胞中よりも脊髄運動神経細胞中でよ
り活性に発現するその他の遺伝子）の１つまたは複数のサブユニットを発現する遺伝子由
来の１つまたは複数の種類のプロモーターの使用は、所望の標的神経細胞におけるベクタ
ー中の神経栄養遺伝子の選択的発現の増加を助け、他方で非標的細胞における不要な発現
によって生じ得る潜在的な有害な副作用を最小限にできると予測される。
脊髄運動神経細胞のトランスフェクションに関与するいくつかの状況で有用であろう別
の部類のプロモーターは、ポリオウイルス受容体というタンパク質の発現を実行する。こ
の受容体タンパク質は感覚神経細胞中で実質的レベルで存在せず、したがってプロモータ
ーは感覚神経細胞中でサイレントであると推定される。しかしながら、種々の実験動物（
マウス及びラットを含む）はポリオウイルス受容体遺伝子またはそのプロモーターを有さ
ず、したがってポリオウイルスプロモーターを用いる場合、動物モデルで種々の研究を行
うことは幾分難しいであろうことに注意すべきである。
あるいは、所望する場合、トランスフェクションされた細胞内でのNGF（またはその他
の中枢神経系活性ポリペプチド）の可能な最高レベルの発現を誘導するなどの目的で、哺
乳動物細胞内で非常に強力なプロモーターとして知られている種々のウイルスプロモータ
ー及びその他のプロモーターを使用することができる。そのような強力なプロモーターの
具体例には、サイトメガウイルス由来の初期遺伝子プロモーター及びシミアンウイルス40
由来の後期遺伝子プロモーターが含まれる。所望する場合には、選択したプロモーターを
活性化する誘導因子を、トランスフェクションされた神経細胞内での適量の輸送が保証さ
れるように、投与することができる限り、誘導可能な遺伝子プロモーターを用いることも
できる。
したがって、GDNFまたはNT-3などの運動神経細胞内で機能する神経栄養遺伝子を保有す
るアデノウイルスベクターを、上記引用した論文に開示されているような種々の要素及び
方法を用いて組み立てることができる。
所望する場合、種々の試験動物組織内で、ベクター遺伝子によりコードされるポリペプ
チドの検出及びモニタリングを容易にするために、「エピトープタグ」配列をベクター遺
伝子のコード領域に組み込むことができる。このアプローチは、実施例１に詳細に記載さ
れ、Moller et al 1998などの論文に記載されている。そのようなアプローチを用いる場
合、Altar & Bakhit 1991、Ferguson et al 1991、DiStephano et al 1992及びvon Barth
eld 2000などの論文に記載される方法を用いて、ベクター構成体により発現されるポリペ
プチドが、そのポリペプチドによる治療のために標的とされている神経細胞に正確に送達
されるために必要なすべての工程を行うことができることを確認することが重要である。
アデノウイルス及び活性組織(tissue vigor)に適合する一定量の溶液（生理食塩水溶液
など）中に懸濁したアデノウイルスベクターを下肢に筋肉内注射することにより、所望の
遺伝子構成体を保有するアデノウイルスベクターを脊髄運動神経細胞へ投与することがで
きる。アデノウイルスベクターを含む溶液を増殖し、精製し、濃縮し、力価測定する方法
は、「Ｍethods in Molecular Medicine:Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997
）のEngelhardtの章（169〜184頁）などの出版物中に見出すことができ、Haase et al 19
98は、実験ラットの脊髄運動神経細胞への遺伝子導入のために、筋肉内注射によるアデノ
ウイルスベクターの効果的な投与における投与量及び投与技術に関する情報を提供する。
所望する場合、筋電図注入法を用いて、液が正確な所望の位置に確実に注入されることを
助けることができる。
トランスフェクションされた運動神経細胞、上位運動神経細胞、及び脳組織中のベクター
遺伝子及びポリペプチドのモニタリング
実験動物を用いる試験は、(i)ポリペプチドが接触して影響を与えうる種々の細胞及び
脊髄領域中の遺伝子ベクター及び該ベクターによりコードされたポリペプチドの動き、位
置、及び濃度を測定およびモニタリングし、そして(ii)そのような結果を正確に反映する
信用できかつ有用な統計的データを得ることに伴う作業を単純化するように設計すべきで
ある。例えば、無害な及び／または非機能的な遺伝子、ポリペプチドをコードしないナン
センスDNA配列、または哺乳動物細胞中で発現されると容易に検出することができるが有
意な生理学的効果を持たないポリペプチドをコードするマーカー遺伝子を保有するコント
ロールベクターを用いて、試験動物の片側の筋肉に遺伝子ベクターを投与し（例えば後肢
にベクター溶液を注射し）、同動物の別の側をコントロールとして処置することにより、
必要な作業を単純化し、より信頼できるものにすることができる。その後の組織学的処理
の際、脊髄（及び所望の場合には脳）の左右の領域を互いに比較して、ベクターDNA及び
／または
ベクター遺伝子によりコードされるポリペプチドの動き、濃度及び効果を評価することが
できる。
遺伝子発現に十分な時間（24時間から72時間）を与えた後、実験動物から腰髄を取り出
し、組織を処理することにより、脊髄運動神経細胞内での神経栄養因子遺伝子の発現をモ
ニタリングして、遺伝子ベクターの送達の効果を評価することができる。これらの分析に
は、(i)Xian and Zhou 2000などの論文に記載されているような方法を用いて、遺伝子ベ
クターのmRNAに相補的であるが内因性mRNA配列には相補的ではないDNAプローブを用いて
、細胞mRNAをハイブリダイゼーションする方法、(ii)Chie et al 2000などの論文に記載
されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の試薬及び方法を用いて、ウイルスベ
クター由来のDNAまたはmRNA配列を検出する方法、及び(iii)免疫染色法、ELISA、または
試験動物中でベクターのポリペプチドには選択的に結合するが内因性ポリペプチドには結
合しない抗体を用いる類似の方法などを用いることができる。多くのこのような抗体調製
品は市販入手が可能であり、あるいは、所望する場合（特定の「エピトープタグ」を有す
るポリペプチドを検出するためなど）、Conner 2000、Rush et al 2000及びZhang et al
2000などの論文に開示された方法を用いて、調製することができる。
実施例14及び15で概説される方法の目標は、トランスフェクションされた血液脳関門に
またがる脊髄運動神経細胞を用いて、完全に血液脳関門内にあり保護されている上位運動
神経細胞に治療用ポリペプチドを送達することである。このことは、(i)ベクターがコー
ドする神経栄養因子遺伝子を発現することにより、ベクターがコードする神経栄養因子ポ
リペプチドを作り出すこと、次いで(ii)血液脳関門により外部ポリペプチドから保護され
ているが上位運動神経細胞の軸索にアクセス可能である脊髄中の位置に該ポリペプチドを
輸送し送達することにより、達成することができる。
該ポリペプチドが、トランスフェクションされた脊髄運動神経細胞によって最も送達さ
れそうな脊髄内の正確な領域を同定する方法を容易にするために、適当な追跡方法及び試
薬を用いて「経ニューロン性標識」研究を行うことができる。仮性狂犬病ウイルスを利用
したこのような研究がCard et al 1990などの論文に記載されている。
経ニューロン性標識法を用いて、NT-3やGDNFなどのポリペプチドが上位運動神経細胞に
送達され、その結果、上位運動神経細胞が発芽して、トランスフェクションされた血液脳
関門にまたがる下位運動神経細胞とシナプス接続することの証拠を得ることもできる。脳
及び脳幹中の経ニューロン性標識された上位運動神経細胞の数は、上位と下位の運動神経
細胞間のシナプス接続の強さ及び数が増加することによってより多くなる。
コントロール及び試験ベクターを実験動物の両側に投与した場合、脊髄の左側及び右側
の間の妥当な相違を観察できる。他の動物の下行軸索の切断を用いて、実験動物の脳中に
検出されたNT-3またはGDNFが、トランスフェクションされた下位運動神経細胞からの逆行
性輸送に由来することを確認することができる。
上位運動神経細胞に神経栄養因子を送達することにより生ずる生理学的効果及び筋肉効果
のモニタリング
本明細書で開示される遺伝子ベクターを用いた脊髄または脳内へのNT-3またはGDNFなど
の神経栄養因子の投与の生理学的効果には、脊髄及び脳の神経解剖学に対する効果、及び
動物の生理学及び行動に対する効果が含まれる。特に、本明細書に開示される遺伝子ベク
ターを用いることにより与えられる筋力、筋肉制御、及び筋緊張（muscle tone）の改善
及び利益を種々の方法を用いて評価することができる。
これらの方法では、これまで動物モデルを用いた種々の従来試験で見られたものの基本
的な理解が必要となる。そのような試験のほとんどは、まず、動物の脊髄または運動神経
細胞系に神経細胞傷害または損傷を与え、次いで損傷がより十分に顕出するために一定期
間待ち、次いで試験治療を施し（皮下針を用いて動物の髄液中に神経栄養因子を直接に注
入するなど）、最後に、試験治療によって、コントロール動物または肢における同様の損
傷により与えられた傷害の程度を減少することができたかを決定するために動物試験を行
うことにより必ず行われることも認識されるべきである。実施例４に概説されている通り
、比較試験は、通常、次の一方または双方を伴う：(i)異なるコントロール動物、または(
ii)異なる形式で同じ動物の２つの異なる側を治療すること。
そのような試験の多くは、外科的軸索切断と称される「軸索切断術」を用いることを認
識すべきである。実施例４で言及した通り、軸索は神経細胞の機能発揮には極めて重要で
あり、神経細胞の軸索を神経細胞体に比較的近い位置で切断した場合には、数日の測定期
間にわたり、神経細胞の残りすべてが損傷していなくても神経細胞は萎縮し始め、結局は
死んでしまう。この理由は複雑であり、神経系の発達に関与する細胞因子（及び特に神経
栄養因子）が関与すると一般に信じられている。いわゆる「神経栄養説」によれば、胎児
の発達中の脳は、最初は神経細胞の供給過剰であり、次いで剪定プロセスが始まる。剪定
段階中、入ってくる神経シグナルを受信することを活発に続けない（及び／または１種類
以上の神経栄養因子が接触しない）神経細胞は、「アポトーシス」と呼ばれるプログラム
された細胞死として死に絶える。
多くの動物研究から、種々の神経栄養因子の適用（通常は髄液または脊髄組織への注射
）によって、軸索切断の損傷により上位運動神経細胞に誘導される萎縮、変性、及び死を
妨ぎうることが分かった。そのような動物試験の具体例、及び神経栄養因子が神経細胞に
適用された場合に生ずる結果は、Novikova et al 2000、Giehl and Tetzlaff 1996及びGi
ehl et al 1997などの論文に報告されている。
しかしながら、軸索切断の損傷が、外来遺伝子がトランスフェクションされた下位運動
神経細胞から遠い場合（例えば、本明細書に開示される遺伝子ベクターが実施例14のよう
に使用される場合）、軸索切断損傷は、トランスフェクションされた末梢運動神経細胞に
よる神経栄養因子の正常な逆行性軸索輸送を妨害するので、本発明のベクター及び遺伝子
が、軸索切断により誘導される萎縮や変性に対して効果を有することを実証するのは容易
ではない。トランスフェクションされた下位運動神経細胞が、上位運動神経細胞の切断端
の数ミリメートル内に在る場合、上位運動神経細胞は、トランスフェクションされた運動
神経細胞により発現され分泌される神経栄養ポリペプチドにより容易にアクセスする。し
たがって、軸索切断損傷を用いる適切な実験の設計では、軸索切断位置は、筋肉注射によ
り適度にトランスフェクションすることができる運動神経細胞の最も近くの先端に適度に
近い距離内にあることが好ましい。
神経栄養因子の投与によって、損傷した軸索の発芽及び再生が刺激されることが公に示
されている(例えばSchnell et al 1994）。したがって、本明細書に開示されている遺伝
子ベクターを用いて、損傷した上位運動神経細胞の切断端の約１〜５mm内に在る下位運動
神経細胞を介してNT-3またはGDNFなどの因子を送達する場合、運動皮質中へのビオチン化
デキストランなどの追跡化合物の注入を伴う順行性経路追跡研究(Ferguson et al 2001）
を用いて、種々の効果（発芽及び再生の刺激など）を研究し実証することができる。
下位運動神経細胞を介してNT-3またはGDNFを送達する本発明の使用では、最も高濃度の
誘引化合物が、トランスフェクションされた下位運動神経細胞の近くに集中している場合
（該分子が他の細胞中への活発な取り込みによるなどして急速に除かれまたは分散されな
い限り）、化学誘引物質勾配が確立することも期待される。損傷した運動神経細胞の再生
は、典型的には化学誘引勾配に応答して、化学誘引物質濃度が増加する方向に成長する。
Ferguson et al 2001に記載されているような順行性経路追跡方法を利用することにより
、損傷した上位運動神経細胞の再生における方向性成長に対する化学誘引物質勾配の影響
を評価し実証することができる。
トランスフェクションされた下位運動神経細胞から現れて確立した化学誘引物質勾配は
、再生中の損傷上位運動神経細胞が、GDNFまたはNT-3などの化学誘引化合物を放出してい
る神経細胞と新たにシナプス接続する速度を加速する。このシナプス接続速度の増加は、
動物モデルで経時的な研究を行い、そして追跡物質を血液脳関門外の領域に注入した場合
には上位運動神経細胞中の経ニューロン性追跡化合物の出現を経時的にモニタリングする
ことにより、実証することができる。適当な経ニューロン性追跡方法は、Ugolini 1995、
Travers et al 1995及びCard et al 1990などの論文に記載されている。
上位と下位との運動神経細胞間の機能性シナプス接続の確立は、下位運動神経細胞の電
気的性質をも変える。上位運動神経細胞活性の初期効果は、阻害性である傾向であり、し
たがってこの阻害が失われた場合、下位運動神経細胞は異常に活発な状態に入る傾向があ
る。したがって、上位運動神経細胞との回復または再生した接続によって、下位運動神経
細胞活性がより正常なレベルに回復することが期待され、これはより正常な感覚反射とし
て現れる。
電気生理学的方法は、そのような経時変化をモニタリングするのに用いることができ、
機能的なシナプス再接続が上位と下位との運動神経細胞間で起こりつつあるか否かの指標
を提供することができる。
上位と下位との運動神経細胞間の機能的再接続の確立は、筋力、筋緊張、及び協調など
運動機能の観察可能な変化ももたらす。筋力の経時変化、及び動物の細かな運動作業や協
調運動作業を行う能力（食物を得るために負荷を克服することなど）は、文献に記載され
た方法や当業者に知られた方法により試験しモニタリングすることができる。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェク
ションするためのレンチウイルス由来ベクターの使用
Hottinger et al 2000などの論文に記載された方法を用いて、(i)GDNF、NT-3またはそ
の他の神経栄養ポリペプチドをコードする配列、及び(ii)実施例14に記載されたようなト
ランスフェクションされた脊髄運動神経細胞中での遺伝子発現に適する遺伝子プロモータ
ーを有する遺伝子構成体を保有することが可能なレンチウイルスベクターを構築すること
ができる。このレンチウイルス由来の遺伝子ベクターを、実施例14に記載される方法を用
いて、筋肉内注射により脊髄運動神経細胞のアクセス可能な投射へ投与することができる
。
脊髄運動神経細胞をトランスフェクションした後、トランスフェクションされた神経細
胞中でのコードされたポリペプチドの発現、及び血液脳関門により保護された脊髄または
脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施例15に記載されたような方法により測定しモニ
タリングすることができる。神経栄養ポリペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理学的
効果、並びに軸索切断や類似の攻撃後に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペプチ
ドの能力は、実施例16に記載されたような方法により測定しモニタリングすることができ
る。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェク
ションするためのリポソームベクターの調製及び使用
実施例６で言及した通り、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのDNAプラス
ミド−脂質複合体の調製方法は、「Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Prot
ocols」(P. Robbins出版1997）のNabelによる章（127〜133頁）などの出版物に記載され
、種々の調製混合物の日常的試験を介して、細胞種または特定の使用に適合させることが
できる。
実施例14に記載されたような方法を用いて、神経栄養因子遺伝子を保有するリポソーム
ベクターを筋肉内注射により脊髄運動神経細胞のアクセス可能な投射に投与することがで
きる。脊髄運動神経細胞をトランスフェクションした後、トランスフェクションされた神
経細胞中でのコードされたポリペプチドの発現、及び血液脳関門により保護された脊髄ま
たは脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施例15に記載されたような方法により測定し
モニタリングすることができる。神経栄養ポリペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理
学的効果、並びに軸索切断や類似の攻撃後に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペ
プチドの能力は、実施例16に記載されたような方法により測定しモニタリングすることが
できる。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞上のエンドサイト
ーシス受容体を標的にするDNAベクターの構築及び使用
神経細胞上のエンドサイトーシス受容体に結合するリガンドを用いた遺伝子ベクターを
調製するための試薬及び方法は実施例７に記載されている。これらの方法には、脊髄運動
神経細胞上のエンドサイトーシス受容体に活発に結合する高親和性リガンドを同定し作製
するために、モノクローナル抗体を用いる方法、またはファージディスプレイライブラリ
の反復式の選択を用いる方法が含まれる。
実施例７で紹介した通り、p75受容体に対するリガンドを用いて脊髄運動神経細胞への
遺伝子送達を標的化することができる。脊髄運動神経細胞は通常は低レベルのp75しか発
現しないが、損傷または神経栄養因子の欠乏に応答して、また筋萎縮性側索硬化症などの
種々の疾患において、p75の発現を増加する。したがって、p75を標的とする遺伝子ベクタ
ーは、治療支援が必要な脊髄運動神経細胞への、治療用タンパク質をコードした遺伝子の
送達を増強または標的化することを可能にする。
脊髄運動神経細胞を標的とする遺伝子ベクターの効率は、注射した筋肉中の「運動終板
」に遺伝子ベクターを集積させる化合物を、ベクター構成体自体に、または遺伝子構成体
を含む注射可能な溶液に含ませることにより、増強することができる。この目的のために
、ボツリヌス毒素が有用であろう。あるいは、アセチルコリン受容体のα1サブユニット
由来の17個のアミノ酸のペプチド配列を抗原として用いることによりモノクローナル抗体
を作製することができる(Yoshikawa et al 1997)。重症筋無力症と呼ばれる疾患において
、患者はアセチルコリン受容体のエピトープに対する抗体を作り出し、これらの抗体はシ
ナプス間隙中の筋肉終板上に局在化する。
したがって、このような受容体結合リガンドやその他の強化剤を用いた「受容体標的性
」遺伝子ベクターを用いて、実施例14に記載されているように、GDNF、NT-3またはその他
の神経栄養ポリペプチドをコードする配列、及びトランスフェクションされた脊髄運動神
経細胞での遺伝子発現に適した遺伝子プロモーターを有する遺伝子構成体を運ぶことがで
きる。リガンド−DNA複合体の筋肉内注射による脊髄運動神経細胞への投与は、実施例14
に記載されたような方法を用いることができる。脊髄運動神経細胞をトランスフェクショ
ンした後、トランスフェクションされた神経細胞中でのコードされたポリペプチドの発現
、及び血液脳関門により保護される脊髄または脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施
例15に記載されたような方法により測定しモニタリングすることができる。神経栄養ポリ
ペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理学的効果、並びに軸索切断または類似の攻撃後
に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペプチドの能力は、実施例16に記載されたよ
うな方法により測定しモニタリングすることができる。
脊髄運動神経細胞と接触する中枢神経系神経細胞に神経栄養因子遺伝子を送達するための
経ニューロン性ベクターを用いる脊髄運動神経細胞のトランスフェクション
経ニューロン性輸送能力を有しうる遺伝子ベクターが実施例８に記載されている。脊髄
運動神経細胞のトランスフェクションに用いるために設計されるこのようなベクターは、
実施例８に記載された方法を用いて組み立てることができ、実施例14に記載された遺伝子
構成体を保有することができる。筋肉内注射による脊髄運動神経細胞への投与は、実施例
14に記載されたような方法を用いることができ、トランスフェクション後のモニタリング
は、実施例15及び16に記載されたような方法を用いることができる。
舌下神経核の下位運動神経細胞をトランスフェクションするために舌にベクターを注入す
ることによる脳幹内への神経栄養因子の送達
アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルス由来の遺伝子ベクターは、あ
るいはカチオン性リポソーム、エンドサイトーシス受容体に結合するリガンド、及び／ま
たは経ニューロン性ポリペプチドを用いて、上記実施例に記載されるように作製すること
ができる。このタイプのベクターは、上記の実施例に記載されるように、トランスフェク
ションされた運動神経細胞中で発現される神経栄養遺伝子構成体（または、所望する場合
、IN1またはNo-Goなどの１つまたは複数の神経突起抑制分子を阻害する組換え抗体または
類似のポリペプチドを発現する遺伝子構成体）を保有することができる。
図６に示めされる通り、そのような遺伝子ベクターを用いて、舌の血液脳関門外のアク
セス可能な投射を有する部類の下位運動神経細胞をトランスフェクションすることができ
る。「舌下神経核の運動神経細胞」として知られるこれらの神経細胞は、脳幹中の領域で
その他の神経細胞にシナプス接続されている。したがって、舌の内部の運動神経細胞末端
は、トランスフェクションされた下位運動神経細胞の近くに存在する投射を有するか、ま
たはその投射にシナプス接続している脳幹の神経細胞に神経栄養ポリペプチドを送達する
ための比較的直接的な経路を提供する。
これらの運動神経細胞への投与は、実施例14に記載されたような、しかし舌の筋肉への
注入に適合させた一般的な方法を用いて、舌への注入により行うことができる。実験動物
におけるトランスフェクション後のモニタリングは、脳幹神経細胞への外因性ペプチド（
例えばエピトープタグを付加したNGF、NT-3またはGDNFなど）の送達をモニタリングする
ために適切に適合させた実施例15及び16に記載されたような一般的な方法及びその他の当
業者に知られた方法を用いることができる。動物での使用の一例として、Ugolini 1995、
Travers et al 1995、またはCard et al 1990に記載されたような種々の経ニューロン性
追跡方法を用いて、舌下神経核中のトランスフェクションされた下位運動神経細胞と接触
する脳幹中の神経細胞を標識付けすることができる。本発明を用いて治療した動物で舌下
神経核と接触する二次神経細胞数を数え、そのようなデータをコントロール動物で見られ
た数と比較することにより、脳幹中の二次神経細胞への神経栄養因子の送達の証拠を得る
ことができる。
ヒト患者に有用なモニタリング方法の別の例として、異常興奮性の反射性まばたきはパ
ーキンソン病の１つの症状であり、疾患の重症度と臨床的に関連する。持続緊張的に活性
なセロトニン作動性の「縫線神経細胞」は通常、反射性まばたき回路に関与する脊髄三叉
神経の神経細胞を抑制し、これらのセロトニン作動性の縫線神経細胞の悪化が、異常興奮
性の反射性まばたきをもたらす(例えばBasso and Evinger 1996)。したがって、脳幹のセ
ロトニン作動性の神経細胞の変性速度を減少させる本発明の臨床的使用の効果の証拠は、
パーキンソン病患者で異常興奮性の反射性まばたきをモニタリングすることにより得るこ
とができる。
パーキンソン病ヒト患者での脳幹神経細胞の維持をモニタリングする別の方法は、患者
の嚥下反射の測定である。嚥下反射は、舌及びその他の口及び呼吸筋の協調運動に関わり
、パーキンソン病において刺激から反射嚥下までの時間は異常に延びる。嚥下反射試験は
、嚥下反射刺激としての鼻腔内カテーテルを介した喉への小量の水の送達を伴う。嚥下反
射の開始は、喉の筋肉の表面電極筋電図の記録を用いて正確に測定することができ、刺激
から反射嚥下までの時間を計算することができる(Iwasaki et al 2000)。したがって、脳
幹の神経細胞の変性速度を減少させる本発明の臨床的使用の効果の証拠は、パーキンソン
病患者で嚥下反射をモニタリングすることにより得ることができる。
生体内スクリーニング：ファージタイプ及びライブラリー
M13KO7ヘルパーファージを、New England Biolabs社(www.neb.com)及びAmersham Biosc
iences社(www4.amershambiosciences.com)などの種々の商業者から購入することができる
。このヘルパーファージ株は、pIIIコートタンパク質及びpVIIIコートタンパク質の双方
をコードする十分に機能的な遺伝子を含む。それは、細菌細胞中で低コピー数となるよう
にきちんと制御される（プラスミドp15a由来の）複製開始点をも含む。それは、ファージ
複製に不可欠なファージM13 pII遺伝子の変異(Met-40-Ile)も含む。この変異により、大
腸菌細胞による低コピー数でのファージ粒子としての分泌が可能となる。それは、M13複
製開始点内のAvaI部位に挿入されたカナマイシン耐性遺伝子をも保有する。このカナマイ
シン遺伝子は、カナマイシンに耐性でない大腸菌宿主細胞中で選択マーカーとして機能す
る。これらのヘルパーファージの使用および培養に間する追加情報は、商業者から、また
その使用について記載した種々の公開論文から入手できる。
scFvファージライブラリはCambridge Antibody Technology社(ケンブリッジ、英国 www
.cambridgeantibody.com)から供給された。該scFvファージライブラリは種々の特許（米
国特許第6，172，197号など）及び公開論文に記載されている。pIIIコートタンパク質（
線状M13ファージ粒子の一方末端に比較的少ない数で位置する）をコードする遺伝子配列
中に、Ｂリンパ球細胞（抗体を作る）由来の遺伝子配列を挿入することにより、該scFvフ
ァージライブラリを作製した。scFvライブラリ中の外来遺伝子配列の各々は、単一の遺伝
子配列中に単一の抗体の「重可変」（ＶH）及び「軽可変」（ＶL）ドメイン双方を含み、
平均分子量が約35キロダルトンである「単鎖(sc)」ポリペプチドとしてＶH及びＶLドメイ
ンを発現する。scFvライブラリは、推定13×109（すなわち130億）の異なる組変え体を有
する。最大の多様性を保証するため、これは祖先が異なる多数の人々から得た「可変断片
」(Fv)抗体ドメインを含む。該ライブラリは、異なる人種及び種族からの10の異なる群の
人々の免疫系により作製することができた広範かつ多様な異なるFv抗体ドメインをコード
すると評価される。
scFvファージはファージミドであることにも注意すべきである。該ファージは、大腸菌
細胞中で二重鎖プラスミドとして高コピー数で増殖することができる細菌複製開始点を有
する。該ファージは、ファージ粒子へと組み立てるための単鎖DNAの合成を引き起こすこ
とができるファージ複製開始点も含む。しかしながら、そのssDNA合成にはファージssDNA
転写タンパク質が存在することが必要であり、scFvファージはそのタンパク質をコードし
ていない。ファージssDNA転写タンパク質は、上述したM13KO7ヘルパーファージなどのヘ
ルパーファージによって供給しなくてはならない。
したがって、M13KO7ヘルパーファージを用いて、scFvファージミドにより既に感染され
た大腸菌細胞を同時感染する場合、多数の（scFvファージミド由来の）dsDNAプラスミド
を既に含有する細胞に、上記の（ヘルパーファージ由来の）ssDNA転写タンパク質を加え
ることにより、scFvファージミドプラスミドから多数のssDNA鎖の形成が引き起こされる
。次いで、これらの新たに形成されたssDNA鎖は、コートタンパク質（主にその宿主細胞
に感染した特定のscFv株由来のpVIIIコートタンパク質）の内部にパッケージングされる
。新たにパッケージングされたssDNAおよびそのコートタンパク質は宿主細胞から線状フ
ァージ粒子として分泌される。低コピー数のヘルパーファージDNA配列しか宿主細胞中に
存在しないので（ヘルパーファージDNA中の低コピー数性プラスミドp15a複製開始点のた
め）、これらの分泌されたファージ粒子のほとんどは、M13KO7ヘルパーファージDNAでは
なく、scFvファージミドDNAを含む。
ある特定の大腸菌宿主細胞によって分泌されるファージ粒子中のpVIIIコートタンパク
質は、ヒトＢリンパ球から得たDNA配列によりコードされる特定の抗体「可変断片」ポリ
ペプチド配列のクローン化コピーを含む。このヒト抗体DNA配列は、pVIIIコートタンパク
質をコードするファージミド遺伝子の中央近くの所定及び標的部位でscFvファージミドDN
A中に挿入した。
PhD-C7CファージディスプレイライブラリをNew England BioLabs社 ( www.neb.com、カ
タログ番号8120）から入手した。このライブラリは、推定２×109個の異なる組換え体を
含み、７個のアミノ酸のランダム配列をコードする外来性DNA挿入体が、M13ファージのpI
IIコートタンパク質のＮ末端をコードするDNA配列の近くに挿入されている。このライブ
ラリは、あるファージが坐骨神経束の神経細胞によって取り込まれて輸送されるかについ
て決定するために試験される本質的にランダムなペプチド配列のレパートリーを提供する
。
細胞のタイプ、特性、及び方法
別に言及した場合を除き、すべてのファージ増幅及び力価測定はCambridge Antibody T
echnology社の大腸菌株TG1を用いた。M13ファージと共に働くように特別に設計され開発
されたこの株は、Stratagene社(ラ・ホーヤ、カリフォルニア州；www.stratagene.com)な
どの会社によっても販売されている。この株の培養及び形質転換方法に関する追加情報は
商業者のウェブサイトから無料でダウンロードできる。
その他の特徴のうち、TG１株は、「lacIq」リプレッサー遺伝子を有する。これは、グ
ルコースによる分解産物抑制とともに、pIIIファージコートタンパク質をコードするM13
遺伝子の発現制御下に置かれた「lac」プロモーターを負に制御する。TG1細胞と共に用い
られるほとんどのタイプのM13ファージは、pIII遺伝子の開始点に挿入された「アンバー
」終止コドンを含む。後述する通り、これにより、遺伝子を再度クローニングする必要な
く、HB2151などの非抑制型大腸菌株にて、可溶性のpIIIポリペプチド（外来アミノ酸配列
を含むキメラpIIIポリペプチドを含む）の発現が可能となる。
グルコースを含まず、その代わりに細菌の唯一の炭素源としてラクトース（特定の糖分
子）を含む培地中にTG1細胞を移すことにより、効果的に「アンバー」終止コドンを不活
性化することができる。イソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）と呼ばれる化合物
も加える。これにより、宿主細胞がラクトース分子を栄養物として代謝することを可能と
する「lac」オペロンの発現が強力に誘導される。これにより、形質転換された細胞が唯
一の炭素源としてのラクトースを有する培地中で成長することを可能となることに加えて
、形質転換された細胞がX-Galと呼ばれる化学物質を明青色に変換することも可能となり
、その結果、形質転換されたコロニーが寒天プレート上で容易に同定され単離される。
特定のファージを「増幅」（再生産）するのに用いる典型的方法（生体外パニング法ま
たは本明細書で記載される生体内選択方法の後などで行われる）において、寒天プレート
上で成長したTG１細胞のコロニーを、１リットルあたりトリプトン16ｇ、酵母抽出物10ｇ
、及びNaCl 5gを含む液体培地に接種した（トリプトン及び酵母抽出物を含むこの液体培
地は2TY培地と称される）。約0.5〜0.8単位の光学濃度（600ナノメートルの波長で測定し
たOD600)まで振盪培養器中で細胞を増殖した（別に示さない限り、培養はすべて37℃で行
った）。ファージ調製物を大腸菌培地に加え、その混合物をインキュベートした。細菌細
胞へのファージの結合を容易にするため、初期培養を30分間静止状態で行った。これに続
き、細胞を新しい栄養に最大限に曝すため、200rpm運転の振盪培養器中で30分間培養を行
った。
次いで、これらの細胞を3500rpmで10分間遠心分離し、古いブロス及び代謝産物を含む
上清を捨てた。細胞ペレットを500マイクロリットル(μL)の新しい2TY培養ブロス中に再
懸濁し、その混合物をアンピシリン及びグルコースを加えた2TY寒天培地を含有する４枚
の非常に広い四角形のプレート(24.3cm×24.3cm)表面に広げた。プレートを30℃で一晩イ
ンキュベートした。アンピシリンが存在しているので、scFvファージミドまたはPhDC7Cフ
ァージを含む大腸菌細胞のみがプレート上でコロニーを形成した。
次の日、必要時まで凍結させることができる標準化ファージ溶液を調製するために、各
寒天プレートから10 mLの2TYブロス中にコロニーをすくい取り、50 mLチューブに入れた
。半分量の無菌100％グリセロールを加え、次いで、そのチューブを室温で10分間反転式
撹拌機中に置くことにより溶液を混合した。その１mL量を保存のために−70℃で凍結した
。
試験にファージのバッチが必要なとき、グリセロール含有ストックの１mL量を融解し、
融解したストック100μLを、フィルター滅菌した2％(w/v)のグルコース及び100 mg/mlの
アンピシリンを含む2TYブロス25 mLに加えた。OD600密度が約0.5〜0.8になるまで振盪培
養器中で37℃で細胞を増殖させた。次いで、最終濃度が１mLあたり５×109 cfu（コロニ
ー形成単位）となるようにM13KO7ヘルパーファージを加えた。混合物を静止状態で30分間
、次いで200rpmの振盪トレー中で30分間インキュベートした。次いで、細胞を約10分間35
00rpmで遠心分離し、細胞ペレットをカナマイシン（50μｇ/ｍL）及びアンピシリン(100
μｇ/ｍL）を含む事前に温めた（グルコースなしの）2TY培地25mL中に再懸濁した。これ
らを、高速振盪しながら一晩25℃でインキュベートし、ファージ粒子を生産した。
20％ポリエチレングリコール(PEG)及び2.5 MのNaClを用いて沈殿させることにより上清
からファージ粒子を精製した。次いで、これらの粒子を最終量1.5 mLの無菌リン酸緩衝生
理食塩水(PBS)中に４℃で再懸濁した。
ファージ粒子を含む溶液を「力価測定する」ために（すなわち、感染ファージ粒子が各
１mLの溶液中に何個存在したか評価するために）、OD600密度が約0.5〜0.8になるで、TG1
細胞を300rpmの振盪培養器中で約４時間2TY培地中で成育させる。ファージ上清試料を、
順次10倍ずつ2TY培地中により希釈した。すなわち各希釈液50μLを順次エッペンドルフチ
ューブ内のTG1細胞懸濁液450μLに加えた。そのチューブを30分間静かにインキュベート
し、続いて300rpmで30分間振盪した。感染したTG1細胞の各希釈液100μLを事前に温めた2
TY寒天プレート(アンピシリン100μｇ/ｍL、フィルター滅菌したグルコース2%(w/v)、及
び寒天1.5%(w/v)を含有する2TY培地）上に筋状に延ばした。プレートを一晩インキュベー
トし、次の日、コロニー数を数えた。TG1細胞は、ファージ由来のアンピシリン耐性遺伝
子を保有していた場合に限り、アンピシリン含有培地で成長することができた。
M13KO7ヘルパーファージへのp75受容体結合抗体(MC192)の架橋
MC192（またChandler et al 1984に最初記載されたクローン192）として知られるモノ
クローナル抗体調製物は、Cell Sciences社(www.cellsciences.com)及びChemicon社(www.
chemicon.com)などの会社から市販されている。これらのモノクローナル抗体はラット神
経細胞上の「低親和性」(p75)神経成長因子受容体に結合する。ヒトp75受容体に結合する
モノクローナル抗体もUnited States Biological(www.usbio.net)などの会社から入手す
ることができる。
ラットのp75受容体に結合する種々の他のモノクローナル抗体と違って、MC192抗体は、
抗体−受容体複合体のエンドサイトーシスを引き起こすことができ、その結果MC192抗体
が神経細胞内に取り込まれる。このことは、放射標識した抗体を用いた研究によって示さ
れた(Johnson et al 1987、Yan et al 1988）。
ラット神経細胞へのファージのエンドサイトーシスを実行するMC192抗体の能力を評価
するために、多工程方法を用いて、M13KO7へルパーファージに化学的に架橋したMC192抗
体を含有する調製物を作製した。まず、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル
）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCCと略す、オーストラリアのPierce社
から購入した）を、MC192抗体上の第1級アミノ基と（活性なスルホ-NHSエステル末端を介
して）反応させる。これにより抗体と各架橋基との間にアミド結合が形成され、スルホ-N
HSは副産物として放出される。未反応のスルホ-SMCCを取り除くため、活性化した抗体を
、Microcon YM-100遠心ろ過機（100キロダルトンカットオフ、カタログ番号42412、Milli
pore社、米国）を用いて精製した。
次の段階で、M13KO7ファージを2-イミノチオレーン（2-IT；別名トラウト試薬）と共に
インキュベートし、遊離スルフヒドリル基を形成した。これらの基は、ファージのpVIII
コートタンパク質中のリシン残基に結合した短鎖の末端に位置した。YM-100 kDaフィルタ
ーを用いてこれらのファージを濾過し、余分な試薬を取り除いた。
次いで、抗体調製物をファージ調製物と1:10の割合で混合し、活性化抗体のマレイミド
基と活性化ファージ上のスルフヒドリル基とからチオエステル架橋結合を形成した。反応
生成物を濾過して余分な抗体を取り除き、ヨードアセトアミド（Sigma Chemical)を加え
て残留する遊離活性スルフヒドリル基をブロックした。反応生成物をPEG/NaCl (2.5 MのN
aCl水溶液中の20％(w/v)ポリエチレングリコール（平均分子量8000））中で２回沈殿させ
て、遊離の抗体を取り除いた。
得られたファージ混合物は、ファージの全長に沿ってランダムに位置した種々の数のMC
192抗体を含んでいた。反応混合液中の抗体とファージとの比が10:1ゆえに、平均して約
２から約20の抗体がほとんどのファージ粒子に結合していたと推定及び評価された。
ラットの外科的治療及びファージの配置（emplacement）
雌のSprague-Dawleyラットを用い、外科手術をハロタン麻酔剤下に行った（酸素中２％
濃度、麻酔装置に経管接続したノーズコーンにより投与した）。あるいは、所望する場合
、ペントバルビツール酸ナトリウムなどの長期作用型の注射麻酔剤を用いることもできる
。
正しい処置方法を用いることにより成功する可能性が相当増すので、この外科手術をラ
ットにするための好ましい処置方法についていつくかのコメントを以下に示した。細胞及
びファージに非常に精通した多くの人々は本発明の生体内処置を行うのに必要な小動物の
外科手術には精通していないであろう。
このタイプの手術を初めて行うときはいつでも、処置の重要な部位及び態様への視野及
び注意を集中することを助けるため、トレーニングには20倍の倍率を付与できる双眼顕微
鏡をほぼ常に用いることに留意されたい。数分間の処置を行った後、その後の処置（また
は処置の繊細かつ困難な部分、例えば神経末端間にファージ含有ゲルフォームを置いた後
に坐骨神経の２末端を一緒に縫合する際）に顕微鏡を使用するか否かを選択することがで
きる。マウスを用いた場合、より小さいサイズゆえに、技術者が非常に高いレベルの経験
及び処置に対する慣れを身に付けるまで、すべての処置に双眼顕微鏡を使用することにな
るであろう。
ラットが６週齢のとき、最初の外科手術を行ってp75細胞受容体の発現を「上方制御」
した（増加させた）。このように坐骨神経を損傷させた場合、運動神経細胞（これは脊髄
中に細胞体を有し、そして坐骨神経を通って投射する軸索線維を有する）が刺激され、細
胞及び軸索表面上のp75受容体の発現数が増加する。予め結紮した神経細胞によるファー
ジの取り込みと結紮していない神経細胞によるファージの取り込みとの相違を比較する試
験により、予め結紮する工程は、p75受容体濃度及びファージ取り込みをおよそ13倍増加
したことが示された。これらの試験には、ファージ取り込み試験、及びラット脊髄の腰部
から得た組織断片の染色（Mc192抗体による）が含まれた。
ラットp75受容体について２つの他の要因も注意すべきである。まず、p75受容体は、脊
髄に由来し、かつ血液脳関門内に取り囲まれていない筋肉組織に軸索または他の神経線維
を送り出す運動神経細胞の表面上に相当数存在する。これには坐骨神経が含まれる。しか
し、ラットが急速に成長するラットの生後約２週間だけ、坐骨神経表面上に相当数のp75
受容体が存在する。約１週間から２週間後、坐骨神経上の受容体数は低下し、約６週齢ま
で、坐骨神経表面上に非常に少量で、しばしば検出できない量で存在する。
第２の注目要因は次のことである。３週齢以上であるラットの坐骨神経表面上にはp75
受容体は多くないので、制御された損傷を坐骨神経に与えた後でさえ、p75受容体エンド
サイトーシス系はかなり容易に飽和する。本生体内スクリーニング試験中、それは多くの
場合に明らかに飽和状態であった。しかしながら、本明細書に開示したいずれの結果も無
効になるのではなく、この要因は越えることができない「天井」値とみなすべきである。
したがって、これらの飽和制限は、p75受容体を用いた当該生体内スクリーニング試験に
おいて活性であると出願人が信じる機構及び効果を確認し有効にすると思われる方法で研
究し利用することができる。
最初の外科手術中、いずれの拘束機器の使用も必要ではない。後肢を最も高くして動物
を横にし、毛を剃り、皮膚を拭き取る。外科用ハサミまたは外科用メスを用いて、大腿骨
と平行に約１〜３cmほど大腿中央の皮膚の切開を行った。閉じた外科用ハサミ（刃長２〜
４cm）の先端を用いて、触診により大腿骨の位置を見つけ、ハサミの先を、筋層を通して
大腿骨の尾方に、動物の大きさに応じて１〜２cmの深さまで押した。次いで、ハサミを開
き、出血を最小限にして筋肉を切り離し、筋肉下にある坐骨神経を露出する１〜２cmの窓
を形成した。開創器または縫合を用いて筋肉を開いたままにし、手術窓を最大にすること
ができるが、これは熟練技術者には必要ない。
この侵入処置により、坐骨神経をはっきりと見ることができる。坐骨神経は、容易に分
離される膜により周囲組織にゆるく付着しているだけである。神経自体は強靭な神経髄鞘
により保護され、位置に応じて推定50000本の軸索が神経束内にある。交感神経やその他
の神経の軸索は有髄でないものもあるが、運動神経軸索（及びほとんどの感覚神経軸索）
は、シュワン細胞由来であり、かつ血液脳関門の外部の神経組織塊の大半を構成するミエ
リン鞘によって取り囲まれている。
坐骨神経下に曲がった鉗子を挿入することにより結紮糸を配置する。そして鉗子を用い
て神経をやさしく持ち上げ、存在する場合にはゆるく付着している膜を１〜２cmの長さで
取り除く。鉗子を開き、該鉗子を用いてある長さの6/0の絹縫合糸を掴み、該鉗子を引く
ことにより絹縫合糸を神経の下に引き込む。次いで、脛骨神経二分岐（tibial branch bi
furcation）によって坐骨神経束がより小さな２つの束に分けられる位置よりわずかに上
の部位に縫合糸を置き、神経の周りでしっかり結び、それを結紮する。絹またはナイロン
などの非吸収性の縫合糸を用いることが重要である。黒色の絹が一般的には好ましい。そ
れは弾性がより低く（結紮糸のきつい締め付けを容易にする）、黒色の結紮糸はその後の
手術中においてより容易に位置を見つけられるからである。
器具を回収し、分離した筋肉を再結合し、切開の長さに応じて１〜３本の縫合糸で皮膚
切口を閉じる。次いで、動物を麻酔から回復させる。
７日後、外科用ハサミを用いて、坐骨神経を再度露出し、結紮糸を含む２〜３mmの坐骨
神経断片を切り取った。
MC192-M13KO7抗体−ファージ結合体10μLを含む約９立方ミリメートルのコラーゲンマ
トリクスゲルフォーム（約3.3×106〜約2.1×109cfu/mLの力価を有する）を、神経束の２
つの切断端の間に挿入した。
10-0ナイロン外科用縫合糸を用いて、ファージを含むゲルフォームの両側に位置する坐
骨神経の切開端を一緒に縫合した。ゲルフォーム中の抗体−ファージ結合体が神経線維の
両端と直接接触し続けるように、シリコンゴム製の小さなフレキシブルスリーブを、神経
端及び抗体−ファージ結合体を含むゲルフォームの周囲に置いた。
切断及びファージ配置を行った同じ外科手術中に、6-0絹縫合糸を用いて、ラット臀部
近くの切断部位の約２cm上の位置で坐骨神経束を結紮した。この結紮を本明細書では臀部
結紮といい、p75受容体発現を増加させるのに用いた最初の結紮と区別する。
臀部結紮は、坐骨神経細胞内へ取り込まれた抗体−ファージ結合体が、脊髄の神経細胞
までずっと逆行輸送されるのを妨げる閉塞部位を作り出した。したがって、抗体−ファー
ジ結合体は、臀部結紮のすぐ下流の位置（遠位）の神経線維内に集積した。
エンドサイトーシス取り込み及び逆行輸送のために十分な時間を与えるために、18時間
後に、ラットをクロロホルム吸入により犠牲死させ、次の実施例に記載する通り、臀部結
紮に対して遠位の神経セグメントを採取した。
神経の採取及び取り込まれたファージの収集
前実施例で言及した通り、(i)ファージ粒子を含有するコラーゲンゲルを配置し、そし
て(ii)臀部結紮を配置した18時間後に、ラットを犠牲死させた。
臀部結紮とその結紮のすぐ遠位の神経線維セグメントとを含む神経セグメントを採取し
た。そのために、臀部結紮の下流（遠位）の約0.5 cmの位置で、さらに追加の結紮を坐骨
神経周囲に配置し固く締めて、神経束の切断端からのファージ粒子の損失を防いだ。次い
で、神経セグメントの両端周囲にしっかりと結ばれた２つの結紮環を共に含む坐骨神経束
のセグメントを切り出し、取り出した。
切除した神経束を、外側の膜が取り除かれるまで、滅菌したティッシュペーパーと共に
鉗子を用いて無菌PBSで３回こすり洗いした。次いで、神経細胞を乾燥したガラスプレー
ト上に移し、結紮糸を取り除いた。
次いで、溶解緩衝液（細胞膜を消化するがバクテリオファージ粒子を消化しない）450
μLを適用した。該溶解緩衝液は、pH８の1%トリトンX-100、10 mMトリス及び２mM EDTAを
含有し、かつ1/100容量のプロテアーゼ阻害剤混合物(Sigma Chemical)（ジメチルスルホ
キシド中の4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフロリド、ペプスタチンＡ、E64、ベ
スタチン、ロイペプチン、及びアプロチニンを含有する)を含有する。溶解緩衝液中で、
外科用メスを用いて神経線維を小片に切り、得られた懸濁物をエッペンドルフチューブに
移し、ボルテックス上で１時間室温でインキュベートした。次いで、そのチューブを４℃
で10分間10000 rpmで遠心分離し、坐骨神経砕片をペレットにした。
その上清（ファージ粒子を含む）を収集し、氷上に保存した。他方、砕片ペレットをさ
らに300μLの溶解緩衝液と共にインキュベートし、室温でさらに１時間ボルテックスした
。次いで、溶解した砕片を室温で１時間インキュベートし、試料を別のエッペンドルチュ
ーブに移し、４℃で10分間10000 rpmで遠心分離して、残っている砕片をペレットにした
。上清を収集してその前の上清に加え、20容量％のCaCl2を加えて、溶解緩衝液中のEDTA
を不活性化した。
実施例25に記載したように、得られた混合上清の一定量を力価測定して、ファージ粒子
濃度を決定した。別の一定量には50容量％のグリセロールを加え、その後の使用または分
析のために混合物を−20℃で凍結保存した。生体内選択の最終回を除くすべての回で、さ
らに別の一定量を用いて大腸菌細胞に感染させ、上記と同じ処置を用いて、増幅したファ
ージ調製物をその次の生体内選択サイクルの試薬として用いた。
神経セグメントの組織学的写真
蛍光染色技術を用いて、臀部結紮のすぐ下の坐骨神経束内に取り込まれ及び輸送された
MC192-M13KO7抗体−ファージ結合体を視覚的に確認する顕微鏡写真を撮った。
これらの写真確認を行うために、過剰量の麻酔（80 mg/kgのペントバルビタールナトリ
ウムを腹腔内に注射する）で動物を安楽死させた。次いで、２％パラホルムアルデヒド及
び0.2％パラベンゾキノリンを含有する氷冷した0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液400 mLを用
いて30分間にわたり心臓を通して該動物の潅流固定を行った。次いで、臀部結紮を含む坐
骨神経セグメントを切断し、同じ固定液中にさらに１時間置いた後、30％ショ糖リン酸ナ
トリウム緩衝液に移した。
次いで、未だ無傷の神経束をOCT化合物(TissueTek，Sakura Finetechnical社、東京、
日本）中に埋め、凍結した。ミクロトームを用いて、埋め込み凍結した神経束からクライ
オスタット縦断切片（厚さ50ミクロン）を作製した。
次いで、神経束の中心付近から作製した特定の縦断組織切片を免疫試薬で処置して、フ
ァージ粒子の存在及び濃度を明らかにした。１つの試薬は、バクテリオファージ粒子上の
pIIIキャプシドタンパク質に結合するビオチン配列付きのウサギ由来の抗体調製物（Sigm
a Chemicals社、カタログ番号B2661）であった。これらの抗体を組織切片と共に室温で１
時間インキュベートした。次いで、ファージに結合するウサギ抗体上のビオチン配列に非
常にしっかりと結合するストレプトアビジン配列を含むAlexa Fluor 488(Molecular Prob
es社、カタログ番号S-11223）を加え、室温で１時間インキュベートした。
臀部結紮の両方の側の神経線維セグメントを含む神経線維の部分をカバーする神経束の
蛍光写真を取った。白黒で複写したそれらの写真のうちの１つを図中の図２として提供す
る。
その写真は、抗体−ファージ結合体が臀部結紮の遠位側に確かに蓄積したことを明確に
示している（他の写真も非常に類似した結果を示した）。これらの写真及びその他の試験
からの類似の写真から、本明細書に記載した結合、エンドサイトーシス、及び輸送の機構
が確かに本明細書に開示したように効率的に機能したことが明確に確認される。
受容体特異的な取り込み性の抗体を架橋していないM13KO7ファージを注射したコントロ
ール処理からの同様の写真及びその他の分析試験により、結紮の遠位側の同じ位置にコン
トロールファージが無いことが示された。
ファージ粒子を付着させたモノクローナル抗体を用いた前述の試験及び結果から、本明
細書に開示した本発明のいくつかの重要な点が確認された。特に、これらの結果から、(i
)ラット神経細胞のp75受容体に結合することができる完全な線状ファージ粒子は、坐骨神
経線維によって取り込まれ、次いで逆行輸送がなされ得ること、及び(ii)上記の結紮、配
置、及び採取の行程を用いて、十分かつ効果的に、血液脳関門外部で起こるファージと線
維との接触に基づき、完全かつ生存可能な感染性のファージ粒子が神経細胞線維内に取り
込まれ、次いで該線維内で輸送されることを可能とする特定のリガンドを、生体内でスク
リーニング及び選択することができること、が確認された。
神経線維を用いた生体内スクリーニングへの一般的アプローチを確かめ、かつ、このよ
うな生体内スクリーニング試験を確実かつ効果的に行うことができる方法及び試薬の組み
合わせを考案し、開発し、最適化し、そして確認した後、本出願人は非常に多数の候補リ
ガンドを含むファージディスプレイライブラリの生体内スクリーニングを実際に試験する
ことにより、それらのアプローチの適用拡大を行った。
scFvファージライブラリの生体外バイオパニング（biopanning）
上述したように、ラット神経細胞のp75受容体はエンドサイトーシス活性を有すること
が知られている。神経細胞表面上の該受容体の数は、種々の神経細胞損傷に応答しておよ
そ10倍から15倍まで増加することも知られている。ラットでは、坐骨神経が２つの主な枝
に分かれる脛骨神経二分岐部位の若干上の位置の坐骨神経束周囲に固い結紮環を配置する
ことにより、制御され再現できる形式で、このような損傷を作り出すことができる。その
部位での結紮は、脊髄と結紮部位との間の坐骨神経線維に沿ってp75受容体の相当な数の
増加を引き起こす。また、p75受容体数が増加した患部の神経線維セグメントは十分に長
いので、ある位置でファージ含有ゲルを配置し、続いて離れた位置で取り込まれ及び輸送
されたファージを採取することが可能となる。
これらのすべての要因によって、p75受容体は、非常に多数の候補リガンドを有するフ
ァージディスプレイライブラリを用いた本明細書に開示する生体内選択方法の最初の試験
及び確認のために有用であり、調節可能な標的となった。
したがって、本出願人は、scFvファージディスプレイライブラリの最初の試験を、特に
p75受容体に特異的に結合することができる候補リガンドに限定することを選択する。本
出願人は、ディスプレイライブラリ（実施例22で記載したように、多種類の祖先に由来す
る10人の異なるヒトの免疫系に匹敵するように設計された推定130億種類の可変断片抗体
配列を含有する）中の他のリガンドが、エンドサイトーシス及び逆行性輸送を引き起こす
他の神経細胞表面受容体に必ず結合することができるであろうことを理解していたが、sc
Fvライブラリを用いたこの試験の決定及び目標は、p75受容体に結合するリガンドに試験
を限定することであった。
最初の一連の研究により一般的原理を確認し、しかしまた様々な結果データも得た後（
これらの試験及び結果は実施例30に記載され、また、あるサイクルで選択されたファージ
を次のサイクルの開始材料として用いるという生体内スクリーニング方法のサイクル反復
を評価する試みを始めるときに利用される）、本出願人は、「バイオパニング」と呼ばれ
る生体外(in vitro)方法を用いてscFvファージディスプレイライブラリを処理することに
よって、p75受容体エンドサイトーシスに焦点を当てることを決定した。
この生体外方法では、組換えヒトp75受容体ポリペプチド調製物を用いた。このポリペ
プチドは市販され、ヒト神経成長因子(NGF)受容体の細胞外ドメインの１〜250個のアミノ
酸残基をコードし、それがペプチドリンカーを介してヒトIgG1タンパク質のFc領域（
カルボキシ末端が６個のヒスチジンで標識されている）に融合されている。グリコシル化
タンパク質を得るために、Sf21(ヨトウ蛾Spodoptera frugiperda由来)として知られる昆
虫細胞株及びバキュロウイルス発現ベクターを用いて、キメラタンパク質を細菌細胞では
なく真核細胞内で発現させる。組換え成熟キメラタンパク質はジスルフィド結合ホモ二量
体として存在する。各単量体は466個のアミノ酸を含有し、51 kDaの計算重量を有する。
しかしながら、グリコシル化はタンパク質の大きさ及び重量を増加させるので、硫酸ドデ
シルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)では、各単量体は90〜100
kDaのタンパク質として移動する。
これらのポリペプチドを免疫チューブ(immunotubes)の表面上にコーティングした。こ
のために、ポリスチレン親水性表面を有する７mLのMAXISORP（商標）チューブ(カタログ
番号444474、Nalge Nunc International社、デンマーク)を用いた。リン酸緩衝生理食塩
水(PBS)0.5 ml中に懸濁した５μg/mL濃度の組換えヒトp75受容体タンパク質を免疫チュー
ブ中で４℃で一晩インキュベートした。
次の日、チューブを排水し、次いでPBSでリンスし、3% (w/v)スキムミルク含有PBSで縁
まで満たし、室温で２時間ブロックした。一方、scFvファージディスプレイライブラリ50
μLを、エッペンドルフチューブ中で室温で１時間、3%スキムミルク含有PBS 450μLで予
めブロックした。免疫チューブをPBSでリンスし、そのチューブに予めブロックしたファ
ージ溶液500μLを加え、室温で２時間インキュベートした。
0.1% Tween 20含有PBSで15回洗浄した後、新鮮な100ｍMトリエチルアミン(TEA)溶液(pH
11) 500μLにより室温で15分間インキュベーションして、残留している結合ファージを
溶出した。溶出されたファージをエッペンドルフチューブに移し、1Mトリス塩酸緩衝液（
pH7.4）250μLを加えて中和した。
溶出液の半分を用いてTG1大腸菌宿主細胞に感染させ、OD600光学密度0.5〜0.8まで培養
する。溶出液のもう一方の半分を予備として保存した。バイオパニングされたファージ調
製物をTG1細胞と共に、30分間静置下に、次の30分間300rpm振盪下に、１時間37℃でイン
キュベーションした。次いで、連続希釈した感染細胞溶液をアンピシリンを含む2TY寒天
プレートに広げて、ファージの力価を決定した。
増殖のため、残っている細胞を４枚のアンピシリンを含む2TY寒天プレート(243mm x 24
3mm)に広げた。これらのプレートを30℃で一晩インキュベーションした。コロニーをこす
り取って2TYブロス液中に入れ、OD600レベル0.5〜0.8まで成長させた。次いで、M13KO7へ
ルパーファージを加え、最終濃度を１mL当たり５×109cfu（コロニー形成単位）にした。
この混合物を静置下に30分間、次いで200rpm振盪トレー中で30分間インキュベーションし
た。次いで、細胞を3500rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレットをカナマイシン（50μｇ/
ｍL）及びアンピシリン(100μｇ/ｍL）を含む事前に温めた（グルコースなしの）2TY培地
25mL中に再懸濁した。これらを、高速振盪しながら一晩25℃でインキュベートし、ファー
ジ粒子を生産した。20％ポリエチレングリコール(PEG)及び2.5 MのNaClを用いて沈殿させ
た。次いで、これらの粒子をコラーゲンゲルと混合し、およそ500億（５×1010）cfuのフ
ァージを含むゲルの塊を、生体内スクリーニング処理中にラット脚中に配置した。
本出願人は、生体内で試験するp75結合リガンドの多様性を最大限保存したかったので
、生体内スクリーニング前に１回だけ生体外バイオパニングを行った。多くのタイプのp7
5結合抗体がp75受容体を有する細胞により取り込まれないことが知られているので、生体
外スクリーニングを連続すれば、この多様性は危なくなるであろう。懸念することは、固
く結合するリガンドは、生体内のp75受容体を封鎖及び／または変形して、それによりp75
受容体の正常なエンドサイトーシスプロセスを行う能力を妨げると思われることである。
生体外バイオパニングの追加実行は、エンドサイトーシス誘発能力とは関係なく、固く結
合するリガンドを選択する傾向にあるので、生体内で細胞内へのエンドサイトーシス輸送
を実現するのに相当に効果的である候補リガンドが除外されてしまうであろう。
それにも関わらず、scFvファージライブラリを用いて３回連続してバイオパニングを行
い、このライブラリが生体外スクリーニングの反復に対してどのように応答するかを評価
した。比較できる結果を確立するため、２回目及び３回目で用いる各ファージ溶液をPBS
で希釈し、１回目で用いた溶液の力価と一致させた。
１回目のバイオパニングではscFv力価がおよそ3000cfuという結果となった（これに対
してPBSを試験したコントロール値はおよそ1200cfu）。他方、２回目のバイオパニングで
は約8400万cfuへの非常に大きな増加という結果となった。３回目のバイオパニングでは
力価が約8500万cfuという結果となり、２回目のバイオパニングより有意な増加はなかっ
た。
scFvライブラリから取り込まれたファージの生体内（坐骨神経内）選択
前述の実施例で言及した通り、実施例29に記載されるような（ヒトp75受容体ポリペプ
チドを用いた）１回のバイオパニングにより選択されたscFvファージディスプレイライブ
ラリの「濃縮」物を、ラットにおける一連の生体内スクリーニングの開始試薬として用い
た。これらの生体内スクリーニングでは、実施例25及び26に記載されるようなMC192/M12K
O7抗体−ファージ結合体を用いて開発し、試験し、最適化した処置及び方法を用いた。
簡潔に言うと、最初の操作では、最初の結紮を坐骨神経の脛骨神経二分枝のすぐ上に置
き、結紮より上の坐骨神経線維上でp75受容体発現の増加を誘導した。１週間後、第２の
操作では、坐骨神経束を切断し、切断端でシリコンゴム製スリーブ内部に、１回のp75バ
イオパニングにより得た約500億cfuのscFvファージを含有するコラーゲンゲルを詰めた。
第２の操作中には、結紮糸を臀部領域の坐骨神経の周りに配置し、きつく締めて障壁を作
り、取り込まれ及び逆行輸送されたファージ粒子を結紮に対してすぐ遠位の神経線維内部
に蓄積させた。１８時間後、第３の操作では、ラットを犠牲死させ、臀部結紮及び結紮遠
位およそ0.5 cmの神経線維を含む神経線維セグメントを採取した。採取した神経線維を洗
浄し、小片に切り、ファージ粒子を取り出して単離した。大腸菌細胞及びヘルパーファー
ジを用いて、ファージ粒子を増幅し、力価を測定した。
切除した神経セグメントから回収したファージの絶対数は実験間で変動したが、常にコ
ントロールファージ群を試験し、その結果を試験ファージ群のデータと比較することによ
り、標準化した取り込み及び輸送の測定値を作製した。
例示するため、代表的な実験（コントロール及び試験選択の両方につきn＝3）から得た
絶対数を用いる。５×1010（すなわち500億）cfu（力価推定）のコントロールファージ（
非改変M13KO7ヘルパーファージ）をファージ接触部位に配置した。18時間後に切除した神
経セグメントから回収したコントロールファージの数値は、力価測定により14650（±297
5、平均値標準誤差(SEM)、n＝3)であった。同量（５×1010cfu）のscFvファージ（実施例
28に記載の通りp75認識のために１回バイオパニングしたもの）をファージ接触部位に配
置し、18時間後に切除した神経セグメントから回収したscFvファージの数値は、力価測定
により190400（±14415 SEM、n＝3)であった。それらの２つの結果を比較すると、切除し
た神経セグメントからコントロールファージより13倍を上回るscFvファージ（p75のため
１回バイオパニングしたもの）が回収されたと計算された。この実験を３回繰り返し、各
回同様の結果であった。
scFvファージの取り込み及び輸送のこの顕著な増加が本当にscFvのp75への結合の結果
であるかどうかを試験するため、坐骨神経を予め結紮しない（したがって、運動神経細胞
は、約２週齢超のラットで出現する非常に低くかつしばしば検出できないレベルを上回っ
てp75の発現を増加しない）別の組の動物で、この実験を繰り返した。これらの試験では
、コントロールファージ（M13KO7）及び試験ファージ（scFv）の適用量を従前と同じく５
×1010cfuとした。18時間後に切除した神経セグメントから回収したコントロールファー
ジの数値は 14815±4481 (n=3)であった。18時間後に切除した神経セグメントから回収し
たscFvファージ（p75認識のために１回バイオパニングしたもの）の数値は 16413±4541
(n=3)であった。これらのデータから、６週齢超のラットで本来見られる非常に低レベル
のp75受容体を有するラットを試験した場合、scFvファージ（p75認識のために１回バイオ
パニングしたもの）の細胞取り込み及び輸送の効率性はコントロールファージの効率性と
は本質的に異ならないことが明確に示された。これにより、p75の発現レベルと、p75受容
体認識のためにバイオパニングされたscFvファージの取り込み及び輸送の効率性との間に
明確な関係があることが確認された。この試験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
パニングを行わないscFvライブラリのサイクル試験
生体外バイオパニング処理（実施例28に記載）を決定して用いる前に行った一連の試験
で、実施例25及び26に記載されるように坐骨神経線維を用いて、一連のサイクル式の生体
内スクリーニング方法によりscFvライブラリを試験した。ある回の試験から得られたスク
リーニング選択されたファージ群を、次の試験サイクルで開始試薬として用いるので、こ
れらの試験を「サイクル式」と称する。
これらの試験は、ファージライブラリが、エンドサイトーシス取り込み及び逆行性輸送
を活性化し実行する特定のファージ媒介リガンドを含むことの明確な証拠を与えたが、こ
れらのサイクル式試験の結果は非常に変動した。データのばらつきにより、本出願人はデ
ータが次の解釈と一致するという結論に至った：
(i)神経線維表面上のp75受容体の数は限定されるゆえ、リガンド−受容体結合及び取り込
みプロセスは飽和していた；
(ii)投与ファージ群は非常に多様であり、初回では、任意のある特定のファージは１また
は少数個しか存在せず、その後の回では、数百またはさらには数千の異なるファージ候補
を含んでいるようであった；
(iii)したがって、任意のある特定のファージが、異なる動物での２つの異なる実験で選
択される可能性は極めて低いものであった（この可能性は、試験群中の任意のある特定の
ファージのコピー数を、神経束から効率的に採取した代りのファージ数によって割ったも
のとほぼ等しいとみなすことができる）。
これらの要因から、異なる動物を用いた異なる実験間で見られる非常に高い変動性を明
確に説明することができる。したがって、このような高変動性に直面し熟慮した後に、本
出願人は、投与群内での変動を減少させ、かつ、神経束から採取するのに利用されうるp7
5結合ファージ候補のコピー数を実質的に増加させるための事前スクリーニング工程（す
なわち生体外バイオパニング）と共に実験を行うことを決めた。
事前スクリーニング工程の前に行ったscFvライブラリ試験から得られたデータから、１
回目、２回目、おそらく３回目の連続的なスクリーニングサイクルはすべて細胞による取
り込み及び逆行性輸送においてより良い効率をもたらすようであることが示された。しか
し、用いた特定の条件下では、さらに多数回の生体内スクリーニングを用いた場合、それ
らの効率は下がる傾向にあった。結果として起こる低下の原因は明らかではなかった。他
方、２回目または第３回目の選択から選択されたファージのうち、有意な割合の個別コロ
ニーが、神経細胞受容体に結合して取り込み及び逆行輸送を刺激するリガンドを表示する
ことが合理的に予測されうる（それらは繰り返し選択されたので、それらが偽陽性である
可能性は低い）。
サイクル式生体内スクリーニングはまだ徹底的には評価されておらず、特に、バイオパ
ニングまたは同様の取組みにより予めスクリーニングされたファージ群では未だ試験され
ていない。それにも関わらず、これまでに行われた作業によって以下のことが明確に実証
および確認されたと信じる。
(1)少なくともいくつかのタイプのファージ群で、ある回のスクリーニングで選択され
た候補群を次回のスクリーニングで開始試薬として用いる一連のサイクル式生体内スクリ
ーニングは実際に可能であり、少なくともいくつかの場合において、細胞中へのエンドサ
イトーシス輸送を誘発および実行する際に非常に有効である候補リガンドを同定し単離す
るのを助けるようである。
(2)サイクル式方法を止めるべき時点についての有用な指標を与える数値指標の開発は
可能であり、これにより、該スクリーニング方法においてその時点までに同定された最良
の性能を与えたと思われる候補リガンドを注意深く分析及び配列決定することが可能とな
る。
(3)少なくともいくつかのファージリガンドは、エンドサイトーシスを仲介することが
従来知られていなかった表面分子に結合した後に、取り込み及び逆行性輸送を刺激したと
思われる。
最後に、これらの分析の意味合いを考慮する際、このタイプの生体内スクリーニングの
基本的かつ決定的な目標は、神経線維によって取り込まれる何千ものファージ候補を提供
することができる非常に濃縮された、すなわち「優良な」ファージ群を作製することでは
ないことを注意されたい。その代わり、この目標は、エンドサイトーシスの取り込みプロ
セスを活性化し実行するのに非常に有効であるほんの１つまたは少数の特定のリガンドを
同定し単離すること（そしてポリペプチドリガンドの場合には、そのヌクレオチド遺伝子
配列及び／またはアミノ酸配列を決定すること）である。このようなタイプのリガンドは
、いったん同定単離されると、大量複製することができ、表面上に特異的な標的エンドサ
イトーシス受容体または類似分子を有する特定の部類の細胞内へ有用な運送物または運搬
物分子を輸送する分子複合体に組み込むことができる。
scFvファージライブラリを予めスクリーニングするためにp75ポリペプチド配列を用い
る上述のバイオパニング工程では、既知または疑いのある任意のエンドサイトーシス受容
体、あるいはエンドサイトーシス活性を有すると疑われる他の表面分子に由来する既知の
ポリペプチド配列または断片を（免疫チューブの表面に接着させる「抗原」分子として）
用いうることに留意されたい。また、エンドサイトーシス活性を有すると疑われる任意の
グリコシル化細胞表面分子を用いることもできる。
PhD-C7Cファージライブラリを用いた生体内選択
実施例22に簡単に言及した通り、PhD-C7Cファージディスプレイライブラリは、M13ファ
ージのpIIIキャプシドタンパク質のＮ末端をコードするDNA配列の近くに挿入された７個
のアミノ酸のランダム配列をコードする外来DNA挿入物を有する推定20億種類のファージ
を含む。このライブラリは、あるファージが坐骨神経束の神経細胞により取り込まれ輸送
されるかどうかを決定するために試験される本質的にランダムなペプチド配列のレパート
リーを提供した。
上記の坐骨神経処理を用いたPhD-C7Cライブラリの生体内スクリーニングから、このラ
イブラリがまさに期待どおり実施されることが示された。相当数のファージが坐骨神経線
維によって取り込まれ、臀部結紮の直ぐ遠位のファージ蓄積領域に輸送された。回収した
神経セグメントから生存した形で特定ファージが取り出され、これらのp75選択生存ファ
ージを上記のいずれかの方法で複製し操作することができる。
所望する場合には、上記で示した通り（scFvライブラリのp75バイオパニングについて
上述した通り）、任意の既知かつ利用可能な受容体ポリペプチド配列をバイオパニング抗
原として用いたバイオパニング技術を用いて、PhD-C7Cライブラリを予めスクリーニング
することもできる。
このように、(i)限定された数及び種類の細胞だけの表面に存在する特定のエンドサイ
トーシス分子を介して、細胞のエンドサイトーシスプロセスを効率的に活性化し実行する
リガンドを同定するために、生体内スクリーニングを使用するための新規で有用な方法、
及び(ii)標的のエンドサイトーシス受容体または他の表面分子を有する細胞内へ有用な運
送物または運搬物分子を効率的に輸送するのに用いることができる分子複合体中へそれら
のリガンドを組み込むための新規で有用な方法が記載されている。本発明は、例示及び記
載の目的のために特定の実施形態を参照して説明されているが、例示された実施例の種々
の改変、変更、及び等価交換が可能であることは当業者に明らかである。本明細書中の教
示から直接得られ、かつ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することのないいずれの変更も
本発明の範囲に属するとみなす。
したがって、血液脳関門を通って脳及び脊髄組織内へ（特に、完全に血液脳関門内に位
置する神経細胞内へ）治療用または他の有用なポリペプチドを非侵襲的に輸送するための
新規かつ有用な手段、及び限定された数及び種類の細胞だけの表面に存在する特定のエン
ドサイトーシス分子を介して細胞のエンドサイトーシスプロセスを効率的に活性化し実行
するリガンドを同定する生体内スクリーニングを使用するための新規かつ有用な手段が示
され、記載されている。本発明は、例示及び記載の目的のために、ある特定の実施形態を
参照することにより説明されているが、例示された実施例の種々の改変、変更、及び等価
交換が可能であることは当業者に明らかである。本明細書中の教示から直接得られ、かつ
、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することのないいずれの変更も本発明の範囲に属すると
みなす。
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図１は、BBB内に完全に位置する神経細胞に治療ポリペプチドをBBBを通して送達するために、嗅受容体神経細胞の露出した投射（「粘液先端」）に遺伝子ベクターをトランスフェクトすることを示す。トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞では、ベクター内の遺伝子からポリペプチドが発現され、BBBを貫通する神経軸索を介して輸送される。次にポリペプチドは、BBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に分泌されて、前脳基底核のコリン作動性神経細胞のようなBBB内に完全に位置する中枢神経系神経細胞と接触することできる。 図２は、神経細胞にトランスフェクションするウイルスベクターを示す。このベクターは、キャプシド殻、表面結合リガンド、および有用な「運送物」又は「運搬物」遺伝子を含む遺伝的に改変されたゲノム、を含む。 図３は、嗅受容体神経細胞のトランスフェクションを示す。また、ベクター内にコードされたポリペプチドが移動して、前脳基底核内に主細胞体が存在するコリン作動性神経細胞の一部である神経突起の先端に位置する終端に到達及び接触するための、嗅球を通した経路を示す。 図４（図4A、4B及び4C）は、神経因性疼痛のような状態で見られる不必要で過剰な神経接続又は活性を抑制するために、遺伝子ベクターを用いて、BBB内に完全に位置する神経栄養性因子生産細胞に、抗神経栄養性ポリペプチドを送達することを示す。この方法では、「NPC （神経因性疼痛制御）」ベクターを、皮膚などの組織を神経支配する侵害受容性神経細胞にトランスフェクトする。侵害受容性神経細胞は、ベクター内にコードされた抗神経栄養活性を持つポリペプチドを発現し、脊髄組織にそれらのポリペプチドを放出する。図4B（治療前の異常に多数の不要な疼痛信号を送る神経接続を示す）及び図４Ｃ（治療後の減少した不要な疼痛信号を送る神経接続を示す）に示されるように、このような神経栄養性受容体又は因子の遮断又は阻害は、神経因性疼痛症状を誘発又は悪化させる過剰な神経接続の抑制又は萎縮をもたらす。 図５（図5A、5B及び5C）は、BBB内に完全に位置する種類の神経細胞（上位運動神経細胞と呼ばれる）に治療ポリペプチドを送達するために、筋肉内の「脊髄運動神経細胞」に遺伝子ベクターをトランスフェクトすることを示す。この種の治療は、例えば脳卒中発作、損傷または病気のために麻痺又は損傷した四肢を持つ患者で遂行される。図5Aに示されるように、遺伝子ベクターは筋肉組織に注入され、BBBをまたぐ脊髄運動神経細胞にトランスフェクトされ、それらの神経細胞は、ベクター内にコードされた神経栄養活性を有するポリペプチドを発現して、脊髄組織内にそれらのポリペプチドを放出し、それによりBBB内に完全に位置する上位運動神経細胞に神経栄養性ポリペプチドを送達する。図5Bは治療前の脳卒中発作障害または同様の患者の状態を示す。そこでは、上位運動神経細胞の神経「突起」の一部（しかし全てではない）が退化及び／又は萎縮し、もはや脊髄運動神経細胞と十分に相互作用できず、四肢の障害又は麻痺に至る。図5Cは神経成長因子により治療した後の改善された状態を示す。その状態では、上位運動神経細胞の１つに属するまだ機能的な神経突起が新しく付加的なシナプス接続を形成（「発芽」）し、治療前には十分に神経支配されていなかった脊髄運動神経細胞と相互作用できるようになる。 図６は、BBB内に完全に位置する神経細胞にBBBを通して治療ポリペプチドを送達するために、舌下神経核（脳幹の一部）の下位運動神経細胞の投射に遺伝子ベクターをトランスフェクトすることを示す。これらの神経投射の露出末端は舌にある。従って、この種の神経細胞は、中枢神経系の脳幹部分内に外来ポリペプチドを導入する為の比較的最短経路を提供する。 図７は、２つの結紮をラットの坐骨神経束のまわりに配置したこと、及びファージがエンドサイトーシスを介して坐骨神経線維内に取り込まれる様に、ファージを含むコラーゲンゲルを、坐骨神経束の切断端と接触させて配置したことを模式的に示す。 図８は、臀部結紮の隣の坐骨神経束内に集まった蛍光標識された抗体−ファージ結合体の写真である。結紮（縫合糸により締め付けた環） は坐骨神経線維によって取り込まれた抗体−ファージ結合体が結紮部位を越えて逆行輸送されることを防ぐ。 図９は、サイクル式の生体内リガンド選択法を模式的に示す。この方法では、明細書中に開示した生体内方法に従って、リガンド表示ファージをファージディスプレーライブラリーから、神経細胞によるエンドサイトーシス取り込みに関して選択し、そして１つのサイクルにより選択されたファージ群を、次サイクルのスクリーニングの開始材料として使用する。
本発明は血液脳関門(BBB)の存在するヒトや他のほ乳類、又は他の動物への頭脳そして
脊髄組織にポリペプチドを送達する方法に関する。更に、頭脳または脊髄内にその全体が
存在する特定の神経細胞及び細胞集団にポリペプチドを送達する方法に関する。また更に
、通常BBB を通過することができないポリペプチドを使用した、ヒトの神経障害の治療方
法、及び家畜や他の動物の処置方法(受精率、成熟率、生育速度等の制御)に関する。
高等動物の血液脳関門(BBB)は、頭脳および脊髄の神経細胞が、BBBを通過すると神経機
能を妨害する血液内分子にさらされないよう保証する。BBBは単一の膜ではない。その代
り、頭脳および脊髄内の毛管は、密着結合を形成する内皮細胞によって形成される。対照
的に、頭脳および脊髄外の毛管壁には隣接細胞間に「間隙管孔」があり、それらの毛管の
透過性を大いに上げる。BBB系は多くの教科書および論文にすでに説明されている(例：Go
ldstein et al 1986; Pardridge 1998; Rubin et al 1999; Banks 1999; Kniesel et al
2000; Kniesel et al 2000)。BBB通過を調査する為の動物モデルはBonate et al 1995に
記載され、細胞培養モデルを開発するための早期研究はde Boer et al 1999に記載されて
いる。
BBB は頭脳および脊髄を保護するが、神経系に影響を与える傷害や病気を治療するため
の多くの薬剤も排除する。特に、蛋白質及びペプチドは、ほんの少数の例外を除いて、実
質的な量でBBB を通過することができない(例Langer 1990)。少数の例外は、限られた輸
送系及びある種の神経受容体、例えばトランスフェリン受容体に関与する(例、Kastin et
al 1999、及びGranholm et al 1998) 。但し、それらの限られた例外は、種々のポリペ
プチドを使用して中枢神経疾患を治療するのに適さない。治療用ポリペプチド(および他
の型の有用な薬剤)をBBB通過させるよりよい方法の必要性が周知であり、多くの総論に出
版されている（Zlokovic 1995、Cloughesy et al 1995、Ｄａｖｉｓ et al 1995、Abbott
et al 1996、Begley 1996、Kroll et al 1998、Pardridge et al 1998、Rochat et al 1
999およびRapoport 2000）。
本発明はBBB によって保護される頭脳または脊髄組織内にポリペプチドを送達する方法
に関する。ここに記載される「ポリペプチド」は、遺伝子発現によって生体細胞内で形成
された(アミノ酸をつなぐことによって形成された) あらゆるペプチド分子を指す。細胞
内の遺伝子発現は下記に関与する：(i)DNA 遺伝子配列から転写して、メッセンジャーRNA
(mRNA)鎖を形成し、続き、(ii)正確な配列でmRNA鎖を翻訳してアミノ酸から成るポリペ
プチド鎖を形成する。遺伝子配列の発現によって形成されたそのよう分子は、翻訳後に切
断、細胞分泌、糖鎖形成、システイン架橋結合などで処理されるかどうかにかかわらず、
全てポリペプチドと参照される。
学者によっては完成した機能的なポリペプチドを「蛋白質」と記載する（ポリペプチド
の断片、または活性化するのに必要な処理をされていないポリペプチド前駆体とは異なる
）。本発明では、ポリペプチドは意図した機能を遂行することができなければ対象とはな
らず、従って、「ポリペプチド」及び「蛋白質」の用語は交換可能に使用される。
ここで対象となる(特許請求の範囲内にある)ポリペプチドは、3 つの特性を必要とする
。第一に、ポリペプチドは、ここに記載される介入方法などを使用して、一つ以上の種類
の神経細胞に挿入された外来性遺伝子（「外因性」遺伝子とも呼ばれる）によって発現さ
れなければならない。但し、ベクターによって運ばれる外来性(外因性)遺伝子は、中枢神
経内に普通発現される「天然の」または「自然な」遺伝子と同じ配列を有するものでもよ
い。これは、例えば、ポリペプチドがもはや適量では生成されていないため病気に苦しん
でいる人にそのポリペプチドのレベルを増加する処置で起こりうる。
第二に、ポリペプチドは、血液脳関門によって通常保護される頭脳または脊髄組織内に
ポリペプチドを放出する一つ以上の種類の神経細胞により発現されなければならない。こ
こに使用される 「血液脳関門を通してポリペプチドを送達する」、または「頭脳または
脊髄組織内（または中）にポリペプチドを放出する」という表現は、外来性ポリペプチド
がBBB内に完全に存在する少なくとも１つの細胞または細胞種類に接触しなければならな
いことを意味し、かつ必要とする。この条件は、BBB をまたぐ神経細胞が、ポリペプチド
を、そのポリペプチドとBBBをまたぐ他の神経細胞とが接触する位置でのみ分泌する場合
は満されない。その代り、大抵の場合、この条件は、神経細胞が、外来性ポリペプチドを
BBB内の場所にて、脳脊髄液(CSF)及び/またはシナプス液に分泌するときだけ満たされる
。
第三に、外来性ポリペプチドは、治療上および/または別の用途上有用である、望まし
い有用な(むしろ病原性が無く)神経活性があるときだけ対象となる。これは、ウイルス感
染や他の有用でない感染、検査、そして頭脳または脊髄組織を侵襲または攻撃する方法を
除く。多くの検査が、実験動物で神経細胞またはグリア細胞に感染するウイルスを使用し
て行われた。これは、抗ウィルス薬候補を検査するために、また狂犬病ウイルスなどのウ
イルスを動物に感染させ、数時間後に動物を殺し、そしてどの神経細胞がウイルスによっ
て感染したか見るため頭脳組織のサンプルを分析することによって、神経網及び神経接続
を分析する「トレーサー」研究を行うために行われた。これらの実験では、外来性ポリペ
プチドをBBBによって保護された頭脳または脊髄組織に導入するのにウイルスを使用した
が、そのような感染を実験動物に与えることは、治療的よりもむしろ病原的であることが
明らかである(殆どの動物は実験の一環として屠殺された)。従って、本発明はそのような
トレーサーおよび他の病原体テストとは大幅に異なり、BBBにより保護された組織に治療
上または別の用途上有用及び有益なポリペプチドを導入する、人間の医学治療、及び家畜
や絶滅の危機に瀕した動物の育種などの分野において用いられる方法を提供するように設
計されている。
また「神経活性」は上述した第三要素に必要な部分である。ここに記載される「神経活
性」ポリペプチドは、BBB によって保護された頭脳または脊髄組織内の所望の意図した領
域に適切に送達された場合に、治療上または別の用途上有用な、および/または望ましい
結果または効果を出すことができるポリペプチドである。様々な例が以下に、そして表に
記載されている。
有用な神経活性ポリペプチドとは、神経細胞に対する直接効果なしに、グリア細胞に対
する直接効果のみを出すポリペプチドを含む場合もあることが注意されるべきであり、そ
の場合処理されたグリア細胞と液体により連絡している神経細胞間に治療効果または他の
有利な結果をもたらす反応を発生させることが必要とされる。
さらに、用語「ポリペプチド」は、天然ポリペプチドまたは遺伝子工学により形成され
たポリペプチドの変形体、誘導体および断片を含む。この例として下記のものを含む:(i)
ある遺伝子に由来する神経活性部分、および(安定性、輸送、分泌、または他の有用な特
性または活性を高めるため)他の遺伝子に由来する「リーダー」配列を有するキメラポリ
ペプチドまたは融合ポリペプチド；および(ii)望ましい神経活性を有するポリペプチドの
断片または一部（例えば単クローン抗体の可変領域から単離された単鎖結合断片）。
次のセクションは神経障害に苦しんでいる人または動物に治療上の利点を提供できる神
経活性ポリペプチドの概観を4 つの分類に分け記載する。
神経栄養因子
ニューロトロフィックファクター（神経栄養因子）の接尾語「トロフ」はギリシャ語の
「栄養」又は「食物」に由来する。「トロフィック」とは、ある分子がある系の刺激、成
長、滋養、維持、または支持にかかわることを意味する。「神経栄養因子」とは、神経の
成長を促進するか、神経細胞間の新しいシナプス接続の形成を引き起こすか、または他の
神経活動を刺激または支援する因子である。但し、この用語は次を除く:(i)(酸素、ブド
ウ糖、アミノ酸、およびヌクレオチドなどの)すべての細胞に必要とされる栄養素、及び(
ii)(グルタミン酸塩、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンなどの)神経細胞間の神
経インパルスを直接制御する神経伝達物質。
殆どの神経栄養因子はホルモンと同様に作用する。まずこれは１つの種類の細胞によっ
て分泌され、続いて他の細胞と相互作用する。但し、分泌後に、典型的に近隣の細胞とだ
けしか相互作用しないところが、ホルモンとは異なる。これはある点では「傍分泌」因子
と同様に作用する。傍分泌とは、局所的にだけ作用するホルモン様分子を示し、他方「内
分泌」因子とは全身系で作用し、分泌細胞から遠い細胞に影響を与えることができる。
神経栄養因子はLindsay 1994、Snider et al 1994、Bothwell et al 1995、Lewin et a
l 1996およびSkaper et al 1998などの論文と多数の米国特許に記載されている。神経細
胞の成長を刺激することで発見された最初の神経栄養因子は神経成長因子(NGF)と呼ばれ
た。後に、他の神経栄養因子も発見され、、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来
神経栄養因子(GDNF)、繊毛様神経栄養因子のような手の込んだ名称、およびニューロトロ
フィン３、ニューロトロフィン４のような連続番号を用いる名称を必要とした。
多くの神経栄養因子はポリペプチドであり、下記を含む多くの中枢神経障害の有望な治
療法を提供する：(1)自動車事故、震盪症等のような物理的傷害によって引き起こされた
脳障害；(2)虚血（不十分な血の流れ）または低酸素症（不十分な酸素の供給）を含む脳
卒中、心拍停止、溺水、窒息、血液損失または他の問題によって引き起こされる脳障害；
及び(3)アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症
のような神経変性病。これらの可能性はHefti 1994、Thoenen et al 1994、Ibanez et al
1995、McMahon and Priestley 1995およびYuen and Mobley 1996などの論文に記載され
る。
便宜上、障害、損傷および傷害のような用語は、一つ以上の治療ポリペプチドが頭脳ま
たは脊髄の適切な局所に輸送されると、該ポリペプチドにより抑制または治療されるあら
ゆる中枢神経系障害（外傷、疾病等に由来する)を示す。
視床下部放出因子
視床下部放出因子は視床下部の神経細胞によって産生され分泌される短いポリペプチド
である。これらのポリペプチドは、脳下垂体を刺激して、成長、新陳代謝、血液中の水と
塩分のバランス、生殖等にかかわる多数の重要な身体機能を制御し、影響を与える様々な
ホルモンを分泌させるものであり、多くの研究の課題となっている。視床下部放出因子を
記載する論文はTurnbull et al 1999、Phelps et al 1999およびSawchenko et al 2000を
含む。
ペプチド神経伝達物質
多数のペプチド神経伝達物質、例えばサブスタンスP、エンケファリン、エンドルフィ
ン、血管作用性小腸ペプチド(VIP)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、ガラニン
、ソマトスタチンが記載されている。多くの場合、ペプチド神経伝達物質はグルタミン酸
またはアセチルコリンのような古典的な神経伝達物質と同様に作用する。それらはシナプ
スで神経細胞によって放出され、シナプスで他の神経細胞の特定の受容体と結合して、神
経信号の伝達を刺激または抑制する（これらは神経インパルス、発火、または脱分極とも
呼ばれる)。他の場合、ペプチド神経伝達物質とシナプス受容体との結合は、他の神経伝
達物質に対する標的神経細胞の感受性を高める、または減らすような、より長期の効果を
出す。疼痛の認識では、例えば、サブスタンスP は脊髄の侵害受容性（疼痛送信）神経線
維によって放出され、興奮性であり、他方、エンケファリン及びエンドルフィンは反対の
効果をもたらし疼痛情報の伝達を抑制する。モルヒネによる疼痛軽減はエンドルフィン受
容体との結合に起因する。但し、疼痛処置のためのエンドルフィンの使用はそのようなペ
プチドを安全に頭脳内へ輸送することが難しいために、現在可能ではない。
サイトカイン及び他の成長因子
あるサイトカインおよび他の成長因子は、神経栄養因子として局所的に作用して神経の
成長を刺激する機能を持つ。但し、サイトカインは、神経系に関する様々な非神経の分裂
細胞の成長及び有糸分裂を刺激する機能の点で、神経栄養因子と区別される。例として、
酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子(aFGF及びbFGF)、上皮細胞成長因子(EGF)、血小板由
来成長因子(PDGF)、インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ(IGF-I及びIGF-II)、腫瘍壊死因
子B(TGF-B)、白血病抑制要因子(LIF)、及び様々なインターロイキン等が含まれる。
これらの分子は中枢神経組織の成長、損傷後の再構築及び修復、及び中枢神経系内の免
疫反応などの正常な生理的な過程に関わっている。それらは、神経中枢系の損傷または感
染を治療するのに使用される可能性がある一方で、特に神経中枢系を通して全身的に投与
される場合に、癌細胞を刺激する危険がある。それにもかかわらず、それらは神経学研究
者の興味を大いにひき、個別の限られた神経中枢領域にサイトカインや類似分子を輸送す
る方法の開発は大きな関心を集め、潜在的に有益である。
表１に一般に知られている神経中枢系活動性のポリペプチドの部分的なリストを提供す
る。適用の一分野をもう少し詳しく説明するため、表２にはいくつかの神経中枢系障害例
、及びこれらの神経中枢系障害を治療するのに現在大変有望と考えられるポリペプチドを
記載する。表１及び表２は部分的なリストしか含んでおらず、（ヒト、マウス、及びラッ
トゲノム配列プロジェクトを含む）多数の研究の試みから他の様々な神経活性ポリペプチ
ドが急速に同定されている。
神経活性ポリペプチドの評価、及び治療を要する患者における該療法の使用を妨げてい
る最も大きな、また最も困難な障害は、頭脳および脊髄の特定領域に神経活性ポリペプチ
ドを実際に送達する大変な難しさであり、その領域で治療効果、予防効果または他の利点
を提供するため、該ポリペプチドが特定の標的神経細胞群またはグリア細胞群に接触する
必要がある。従って、本発明の目的及び目標は次のとおりである：(i)血液脳関門によっ
て保護される頭脳及び脊髄組織の領域に外来性ポリペプチドを送達する方法を提供するこ
と、及び(ii)外来性ポリペプチドを、頭脳及び脊髄組織の標的の、特定の、および限られ
た領域に、および/または神経中枢系内の標的の、特定の、および限られた種類または分
類の細胞に送達する方法を提供すること。
中枢神経系薬物送達法の従来技術
薬物送達の文献調査（例えば、Langer et al 1989; Langer 1990; Madrid et al 1991;
Thoenen et al 1994; Zlokovic 1995、Cloughesy et al 1995、Davis et al 1995、Abbo
tt et al 1996、Begley 1996、Kroll et al 1998、Pardridge et al 1998、Rochat et al
1999及びRapoport 2000）によると、ポリペプチドを血液脳関門を通して送達する為に現
在利用でき、有効であり、そして臨床上実用的である代替法は、少数同定されるだけであ
る。血液脳関門を通して薬物を送達する為の様々な方法の試みは大した成功が無く、Zlok
ovic 1995及びRapoport 2000などの論文に概説される。これらの試みは次の通りに分類さ
れ、要約することができる。
１．細胞及び膜に穴をあける手術、または少くとも皮下針の使用等の物理的侵入を要求
する侵襲的な方法。その例は、脳室内への注射又は注入であり、そのために、神経外科医
が、脊髄液の生産部位又は集積結節として機能する「脳室」の一つに接近して、薬物を、
脳室に集積する液体に注入することが必要である。これらの脳室のほとんどは頭脳の奥深
くにある（ヒトの第４脳室は幾分接近しやすいが、頭脳を去る液体の出口である為、頭脳
大半に薬物を送達するのに有用でない）。脳室への薬物注入は、針を使うだけとしても、
困難及び危険である。刃または針によるどの貫通でも毛管を途中で傷つけることになり、
血液が、破損した毛管から漏れれば、血液脳関門によって血液から保護されなければなら
ない神経細胞に接触する事になる。血液の漏出を最小に抑えるために焼灼法を使用する場
合は、焼灼された毛管、小動脈および静脈はもはや血液を運ばなくなり、それらの血管に
よって供給されていた神経細胞は死滅するかもしれない。
別の侵襲的な方法は、頭脳の目標領域に高率に神経栄養因子を分泌できる、遺伝的に選
択及び/または作製された細胞の移植を含む（例えば、米国特許5,082,670 Hefti et al 1
992)。頭脳の目標部分へのそのような細胞の挿入は刃または針を使用する侵襲的な接近を
必要とし、深刻な問題および危険が生じる。このような問題のために、これらの侵襲的な
方法は非常に限られた臨床試験、末期の病気に苦しんでいる患者、及びどの処置によって
も助けることができないとても重症で衰弱した病気の患者以外は、人間に利用することが
できない。
２．化学的、細胞的、担体輸送的、又は他の非外科的な方法で神経栄養因子又は類似分
子を血液脳関門を通して送達する非侵襲性な方法。これらの方法は通常かなり大量の小胞
、複合体、または他の高分子を血流に注入することを必要とし、注入された「運送物」分
子が小量でも頭脳に入り、血液脳関門を渡って頭脳組織に送達されるよう期待される。こ
れらの方法の例は米国特許5,154,924 (Friden 1992)、Racagni et al 1994中のThoenen e
t alによる章、及びZlokovic 1995などに記載されている。
これらの方法を用いる上重要な問題1 つは、ある化合物が有意な量でBBBを通過するこ
とができれば、その同じ化合物はまたより速くそしてより多量に身体の残りのより透過性
のある毛管を通過することである。これにより、二つの深刻な問題をもたらす。第１は、
多量の神経活性化合物が非中枢神経系の組織に送達されるときに起こる副作用であり、そ
のような化合物は末梢神経系、又は他の種類の細胞や組織を破壊しうる。第２の問題は、
ヒトに注射する前に、多量の複雑な薬剤を注意深く合成し、精製し、品質検査しなければ
ならないときに起こる非常に高い費用である。さらに、そのような注射または注入は通常
、頻繁に多数回繰り返されなければならないし、また多量の神経活性化合物の注射または
注入の後、患者に副作用があった場合緊急手段がすぐ取られるように、通常自宅よりもむ
しろ病院または医院で、少なくとも１日以上患者の監視を必要とする。
また、従来の方法では選択した神経細胞、神経細胞類、又は頭脳領域だけに外来ポリペ
プチドを投与することができない。対照的に、本発明は、制御可能かつ選択的な（または
少なくとも濃縮された）態様で、標的神経細胞に外来ポリペプチドを投与するいくつかの
有望な方法を提供する。中枢神経系内のある部位または領域だけ、および/またはある種
類又は集団の神経細胞だけを標的とすることによって、副作用の危険性及び重症度を最小
に抑えることができる。
遺伝子治療
中枢神経系障害を治療する可能性がある１つの方法は遺伝子療法である。遺伝的に頭脳
及び脊髄神経細胞を修飾する従来の研究で２つの主要な方法が使用された。１つの方法で
は、細胞を身体の外で遺伝的に改変し、次に中枢神経系内のどこか、通常BBB内の領域に
移植する。もう１つの方法では、遺伝子「ベクター」を中枢神経系の一つ以上の領域に、
BBBによって普通保護される細胞を遺伝的に改変するために、注射する。身体の他の部分
で上手く働く方法を、頭脳または脊髄組織の治療に応用するとき深刻な問題が起こるので
、この２種類の方法を以下により詳しく記載する。
遺伝子改変細胞の移植
従来の組織では、細胞移植は、通常一群の細胞を単離し、それらの細胞を細胞培養（試
験管内(in vitro)）条件で処理し、そして動物または患者に処理細胞を移植することを伴
う。いくつかの場合、細胞を宿主に移植した後の潜在的な拒絶問題を最小にするために、
細胞を宿主から得る。他の場合では、細胞を他から得る（不死細胞株、胎児又は幹細胞、
等）。遺伝子操作は、精密な制御技法を含み、又は「ショットガン」方法とその後の選択
試験を含みうる。
この一般的な方法を中枢神経系組織で使用することは、以下に簡単に列挙するものを含
むいくつかの理由のため、通常は実用的でない。第一に、中枢神経系は非常に不均質であ
り、ある領域からの神経組織は別の領域からの神経組織の代わりにできない。第二に、成
体の中枢神経系の神経細胞は有糸分裂後であり、欠失が生じても再び分裂再生することは
無い。第三に、神経細胞の突起または軸索は、いったん切断されると、容易に再成長して
シナプスその他の接続を再構築することができない。第四に、中枢神経系の組織の外科的
または類似の抽出は、手術が最高レベルの技術と注意を用いてなされても、患者に大変な
危険を与える。
これら及び他の理由のために、大半の場合、患者から中枢神経系の一群の神経細胞を取
り出し、神経細胞を遺伝的に処理し、そして患者の頭脳または脊髄に戻すことは簡単に実
行可能ではなく、または実用的でない。従って、中枢神経系組織に遺伝子改変細胞を移植
する殆どの試験では、同じ患者から採取された細胞を使用する試みは行われていない。そ
の代り、初期の実験では所望のタンパク質（例えばアルツハイマー病患者の頭脳に移植す
る場合、神経成長因子）を異常に多量に分泌するように改変された遺伝子改変細胞（必ず
しも神経細胞ではない）が使用された。このような試験及び治療の試みはBlesch and Tus
zynski 1996、Karpati et al 1996、Fick and Israel 1994、Fisher and Ray 1994及びFr
iedman 1994などの論文及び米国特許5,082,670 (Hefti et al 1992)などの特許に記載さ
れている。この様な研究は興味深く、いつか有用になるかもしれないが、外来細胞を中枢
神経系組織に移植することが必要なかぎり、大きなリスクおよび危険性は不可避である。
そのよう移植では頭脳または脊髄組織に穴をあけ、または切断しなければならず、移植の
過程は、侵入または置換されなければならない頭脳又は脊髄組織を必ず傷つける。
対照的に、細胞を動かさずに行う中枢神経系細胞の遺伝子操作（インサイチュ(in situ
)処理と呼ぶ） は、頭脳または脊髄の組織に侵略的な損傷を加えないで問題を訂正するよ
り良い希望を提供する。
中枢神経系細胞のインサイチュ遺伝子改変
この方法は中枢神経系内の細胞を動かさずに遺伝的改変することによって中枢神経系に
所望のポリペプチド源を導入することを目指す。従来技術では、これは頭脳または脊髄組
織に外来遺伝子を有する遺伝子ベクターを直接数回注入することによって達成された。但
し、この方法は侵襲的であり、頭脳または脊髄組織を針や刃物によって貫通又は切断しな
ければならない。その代りに必要なものは、BBBによって保護された組織に穴をあけ、切
断し、または別の方法で侵入し、あるいは貫通することなく、BBB内に位置する細胞を遺
伝的にトランスフェクションし、または形質転換する非侵襲的な方法である。
用語「トランスフェクション」及び「形質転換」は交換可能に使用される。両用語は、
外来遺伝子からポリペプチドが生成発現される様に、一つ以上の既存の細胞へ外来性（外
因性）遺伝子を導入する方法を示す。科学者によっては、「トランスフェクション」は、
しばらくだけ持続し、結局は停止する感染に類似して、外来遺伝子を一時的にだけ発現す
ることを意味する。対照的に、「形質転換」は、通常は外来遺伝子が一つ以上の細胞の染
色体に組み込まれるために、任意の及び全ての細胞子孫に受け渡される永久的な遺伝子変
化を意味する。但し、それらの用語の境界ははっきりせず、それらの用語の使用の区別は
全科学者によって統一されていない。その為、「トランスフェクション」及び「形質転換
」は、標的細胞に侵入した後に外来性遺伝子がどのくらい長く発現され続けるかに関わら
ず、ここでは交換可能に使用される。
遺伝子ベクター
遺伝ベクターには２つの大きな分類がある。ウイルスベクターはウイルスに由来し、ウ
イルスの脂質外被または殻表面（キャプシドとして周知）を利用する。これらのベクター
は、ウイルスがある種の細胞の一つ以上の特定の表面蛋白質に結合し、次に細胞にウイル
スのDNAまたはRNA を注入するという性質を利用する。これらはヒトの遺伝子療法の試み
で使用されたベクターの主要的な種類になっており、多数の公開論文に記載されている。
単純ヘルペスウイルス（例えば欧州特許453242、Breakfield et al 1996)、アデノウィル
ス(La Salle et al 1993)及びアデノ随伴ウイルス(Kaplitt et al 1997)に由来するベク
ターを使用した中枢神経系神経細胞への遺伝子導入が報告されている。
他の全ての遺伝子ベクターは非ウイルスベクターの広い種類に一般に分けられる。これ
らのベクターは通常、当業者によって理解される「遺伝子発現構成体(gene expression c
onstruct)」を含んでいる。説明上、該構成体はプラスミドであってよく、通常次のもの
を含む：(i)大腸菌のような宿主細胞ですぐに増殖するための複製開始点；(ii)プラスミ
ドを有する宿主細胞が、抗生物質を不活性化するため、他の炭素源を全く必要とせずラク
トース上で成育するため、又はある化合物が存在する場合に発色するための、少なくとも
１つの選択可能なマーカー遺伝子、及び(iii)遺伝子発現構成体が標的哺乳類細胞に注入
された後に所望のポリペプチドを発現するコード配列及び適当なプロモーターを含む、少
なくとも１つの運送物遺伝子。
非ウイルス遺伝子ベクターは、遺伝子発現構成体に、標的細胞への遺伝子構成体(gene
construct)の侵入を可能にし、促進する薬剤を加える事によって作製される。一般的に使
用される薬剤のいくつかは、カチオン性脂質、陽性荷電分子、例えばポリリジンまたはポ
リエチレンイミン、及び/又は標的細胞の表面に発現される受容体に結合するリガンド（
場合によっては、ウイルスから元々取得されたウイルスリガンド等）である。非ウイルス
遺伝子ベクターの主要な分類は下記のとおりである。
１．カチオン性遺伝子ベクター。DNA鎖及び細胞表面は双方陰荷電である。従って陽性
荷電薬剤はDNA鎖の電気的反発を解消し、標的細胞への侵入を援助する。例として、ポリ
リジンまたはポリエチレンイミン(PEI)、および様々なカチオン脂質がある。このような
薬剤はSahenk et al 1993、Nabel et al 1997及びLi et al 2000等の論文に記載されてい
る。
２．細胞表面の受容体分子を通して通常ある種類の細胞に侵入する分子にDNA鎖を結合
した、受容体ターゲティング遺伝子ベクター。この方法は肝臓細胞を用いて米国特許5,16
6,320 (Wu et al 1992)にて実証された。この方法の使用により、特定の種類の細胞によ
って選択的に取り込まれる分子にDNAを結合することにより、DNA送達をある種類の標的細
胞に向けることができる。この方法は、細胞の受容体に依存し、該受容体は通常細胞外膜
をまたぐ蛋白質であり、その一部は細胞外に露出され、かつその一部は細胞質内に固定さ
れる。この種類の取り込みに適するためには、受容体は「エンドサイトーシス」と呼ばれ
る過程を経なければならず、これは、適当なリガンドが受容体に結合すると、受容体とそ
れに結合したリガンド両方が細胞内に引き込まれる過程が誘発されることを意味する。
エンドサイトーシスは、本発明の一面（エンドサイトーシスを活性化および促進させる
リガンドを同定する為に神経線維を使用する新規な生体内選別法）において相当な重要な
ので、以下により詳しく説明する。
３．他の非ウイルス遺伝子ベクター。ウイルスベクターには問題点及び制約があるので
、そしてカチオン化合物及び受容体ターゲティングリガンドベクターは、現在、標的細胞
による外来遺伝子の発現を誘導する点でウイルスベクター程に有効ではないので、研究者
は、細胞への遺伝子送達を高める方法を開発しようと試みている。１つのそのような試み
では、エンドサイトーシスを介して外来分子または粒子を細胞外膜を通して引き込まれる
ときに形成される「エンドサイトーシス小胞」を破裂できるウイルスのキャプシド蛋白質
を使用する。外来DNAは、遺伝子として機能し始める前に、エンドサイトーシス小胞から
脱出しなければならず、ある種のウイルス（例えばアデノウィルス）は、エンドサイトー
シス小胞を破裂させる進化したキャプシド分子を有し、これにより細胞質内で外来DNAを
放出させる。この種の研究例はCuriel 1997に記載されている。
他の分野でも他の様々な研究がなされているが、それらのどの試みも未だ遺伝子ベクタ
ー研究の主流には達していない。
ウイルスの中枢神経系への感染及びトレーサー研究
いくつかのウイルス（例えば狂犬病及びポリオウイルス）は中枢神経系組織内で神経細
胞から神経細胞に伝染するという特性があり、研究者が、ウイルス伝染を利用し、「神経
間追跡」を使用し、神経系および神経経路を追跡することを可能にした。
ポリオウイルスによる運動神経細胞の伝染パターンと、筋萎縮性側索硬化症患者の運動
神経細胞の退化パターンとの間には重要な類似性がある。同様に、アルツハイマー病の初
期特徴である前脳基底核のコリン作動性神経細胞の退化は、嗅上皮に狂犬病ウイルスを投
与した後の神経細胞損傷に対して重要な類似性を示す。これらの以前に発表されていない
観察がここに開示される。なぜなら、中枢神経系組織のウイルス伝染パターンと、ある中
枢神経系障害の神経変性パターンとが類似していることから、ここに開示される方法（す
なわちある神経細胞から、担体神経細胞と接点を共有する他の神経細胞に、ポリペプチド
を輸送し送達するために、治療ポリペプチドを頭脳又は脊髄へ非侵害的に送達する方法）
は、次の２つの見込みを提供するからである：（i）強力な治療上の処置；及び(ii)研究
者によって、例えば、頭脳又は脊髄組織内の遺伝子発現パターン及び／又は神経細胞機能
を選択的に変えるために、及び／又は中枢神経系組織内の様々なネットワーク及び原理、
例えばウイルス感染から神経変性疾患までに及ぶ攻撃に対する中枢神経系組織の反応を支
配する因子を研究するために、使用される強力な実験方法。
エンドサイトーシス表面分子
本発明の一面は、エンドサイトーシス過程（すなわち、細胞内部への外来分子の輸送)
を活性化させ、促進させるのに使用することができる「リガンド」分子の生体内(in vivo
)スクリーニングおよび同定のための新規な方法の発見および開示である。これらの種類
のリガンド分子は、特定の目標とされた種類の細胞へ有用な「運送物」又は「運搬物」分
子を引き込み、または運ぶのに使用することができる媒体、担体または輸送系とみなすこ
とができる。目的が、頭脳または脊髄組織、あるいは他の標的細胞にポリペプチドを送達
するという遺伝子療法または同様の遺伝子操作である場合、該運送物分子は、外来遺伝子
を有するDNAの一部分でも良い。但し、この種類のエンドサイトーシス送達は遺伝子療法
に限られず、特定の標的細胞種類に治療薬剤、診断化合物、または他の有用な薬剤を送達
するのに使用することができる。
この種類のエンドサイトーシス送達（取り込みとも互換的に言われる）は主に、細胞表
面にある「受容体」として知られる種類の蛋白質に関与する。但し、少なくともある種の
他の表面分子もエンドサイトーシス過程を誘発すると知られている（例えば、コレラ及び
破傷風毒素は、特定の表面炭水化物分子と特異的に結合して、それによって生じたリガン
ドと炭水化物の複合体の取り込みを活性化させ、促進すると知られている）。従って、こ
こでの参照のほとんどは、本発明の説明に用いられる典型的な分類としてエンドサイトー
シス受容体蛋白質に関するものであるが、他の種類のエンドサイトーシス表面分子もまた
、ここに論議されるエンドサイトーシスリガンドの標的として使用することができる。
細胞膜及びエンドサイトーシス受容体蛋白質の構造、またエンドサイトーシスの過程及
び機構は、Alberts et al, Molecular Biology of the Cellなど、様々な参考論文に記載
される。上記の第３版(1994)では、関連ページは478-488、618-625および731-744（細胞
膜及び受容体蛋白質）、618-626及び636-641（エンドサイトーシスにかかわる蛋白質およ
び過程）である。またエンドサイトーシスは、ピノサイトーシス（細胞内に取り込まれる
リガンドが比較的小さい場合）またはファゴサイトーシス（細胞全部またはウイルス粒子
などのより大きな物が細胞に取り込まれる場合）を含む。
エンドサイトーシス受容体蛋白質に結合する候補リガンドの全てが、エンドサイトーシ
スを促進して完了できるわけではない。例として、p75受容体として知られている重要な
種類の「低親和性」神経成長因子受容体がほ乳類で同定され、該受容体に結合できる単ク
ローン性抗体が多数の研究チームによって作製された。但し、それらの単クローン性抗体
系統の殆どはp75受容体に結合した後エンドサイトーシスを促進して完了することはでき
ない。ほんの少数の特定の単クローン性抗体のみがp75受容体によって取り込まれる。こ
れはChandler and Shooter 1984に最初に開示され、MC192抗体として知られている特定の
抗体系統を含み、その後p75受容体を有している細胞によって取り込まれるとYan et al 1
988によって報告された。
哺乳類細胞にエンドサイトーシス輸送をすることができるリガンドを同定するために相
当な研究がなされている。その研究の多くは、ファージおよびファージディスプレーライ
ブラリーと呼ばれる遺伝研究ツールを用いる。非常に簡潔には、ファージ（この単語はバ
クテリオファージの短縮語である）とは細菌に感染して、繁殖できるウイルスである。「
線維状ファージ」（「Ff」 と短縮される）として知られている長形の、ある種類のファ
ージが遺伝子研究者により研究開発された。なぜなら、生存可能で伝染的であるファージ
粒子の表面に、アクセス可能な（表示される）外来蛋白質を発現するよう設計ができるか
らである。
一系統の線維状ファージは、バクテリア複製開始点が含まれるよう処理され「ファージ
ミド」に変換された。そのDNAは、大腸菌細胞内で環状プラスミドとして二本鎖形態で、
または宿主細胞を殺さずに新しい伝染性ファージ粒子として分泌されるためにファージ被
膜蛋白質内に梱包される一本鎖形態で、多量に増殖することができる。このファージ系統
はまたカナマイシン耐性遺伝子を選択可能マーカーとして与えられ、これによりファージ
を保有する大腸菌は、非耐性細胞を殺す抗生物質であるカナマイシンを含んでいる培養液
中で増殖することができる。M13系統と呼ばれるこのファージ系統は市販されており、遺
伝研究に広く使用されている。
様々な研究者及び会社が、ファージ（例えばM13ファージ）の多数個体群が様々な異な
った外来蛋白質を表示するように処理されている完全な「ファージディスプレーライブラ
リー」を作製した。血液脳関門外に伸展する神経線維の表面の標的エンドサイトーシス受
容体に結合できるエンドサイトーシスリガンドを同定する生体内スクリーニング方法を作
製して試験する為に、本出願人は二つのファージディスプレーライブラリーを使用した。
該ファージディスプレーライブラリーの一つは、scFvライブラリーとして知られており、
約130億個のファージミドを含み、それぞれがヒト抗体の抗原結合性「可変断片」領域に
通常存在する外来ポリペプチド配列を含む。もう１つのファージディスプレーライブラリ
ーは、PhDC7Cライブラリーとして知られており、それぞれ「コンビナトリアルケミストリ
ー」と呼ばれる方法を使用してランダムに配列さた７アミノ酸を含む小さい外来ポリペプ
チド配列を含む。両ファージディスプレーライブラリーは下記の「詳しい説明」および「
実施例」に詳しく記載されている。
ファージディスプレーライブラリーは膨大な数の異なる「リガンド候補」又はその他の
ポリペプチド配列を選別する為の強力で有用な手段を提供する。それらを用いることによ
って、研究者は、特定の結合活性または細胞活性があるために対象となる外来ポリペプチ
ド配列を偶然に有する少数のファージを、膨大なライブラリーから同定し、単離し、次に
増殖させることができる。
但し、いくつかの細胞的及び生理学的な要因の為に、ファージディスプレーライブラリ
ーを生体内で（すなわち生きている動物体内で）スクリーニングすることは（従来技術の
下では）非常に困難又は完全に不可能であった。その代り、そのようなスクリーニングは
ほぼ全て、（固定化した抗原または抗体、または同様な結合性試薬を有する）アフィニテ
ィーカラム、又は（培養細胞を使用する）試験管内条件に限られた。
その結果、エンドサイト−シスを活性化し促進できるリガンド分子を同定し単離する試
みでは、本発明前には、癌細胞及び自己免疫病気に関わる細胞へ送達可能なリガンドの同
定において現実的及び実質的な進歩があり、それはそれらの２種類の細胞が試験管内細胞
培養で容易に育成及び試験することができる為であった。そのような研究の例は、米国特
許5,977,322 (Marks et al 1999), 6,113,898 (Anderson et al 2000), 6,376,170 (Burt
on et al 2002)及びPCT出願WO 2000-29004 (Plaksin), 2000-38515 (Ferrone)及び2000-3
9580 (Christopherson et al)である。神経細胞など他の種類の組織細胞へのエンドサイ
トーシス送達を促進するリガンドを同定する為にファージディスプレーライブラリーをス
クリーニングする場合、同様な成功的な進歩は認められなかった。
本明細者は神経細胞（特に血液脳関門をまたぎ、その外に伸展する線維を有する神経細
胞）を遺伝的に形質転換させる方法を捜していた。さらに、本明細者は、ウイルスベクタ
ーの医学的利用を阻止妨害する問題及び制限を知っていたので、細胞（特に、BBBをまた
ぎ、その外に伸展する線維を有する神経細胞）に外来DNA鎖を取り込ませることができる
他の種類の輸送及び送達系を捜していた。
これらの研究の全てが統一され、本発明をもたらした。近年の分子生物学及び神経科学
の大きな進歩にも関わらず、本発明前には、頭脳及び脊髄の神経細胞に治療効果を提供す
るために、侵襲的な損傷なしに血液脳関門を通して有用なポリペプチドを輸送するよりよ
い方法が依然として強く求められていた。
従って、本発明の一つの目的はBBB内の標的細胞にポリペプチドを送達する為の改良さ
れた非侵襲性方法を開示することである。
本発明のもう一つの目的は、BBBを「またぐ」感覚神経細胞又は運動神経細胞にトラン
スフェクションする新規方法を開示することであり、その方法でBBBをまたぐ神経細胞が
血液脳関門内に完全に位置する神経細胞に治療ポリペプチドを送達する。
本発明のもう一つの目的は、血液脳関門内に完全に位置する標的とする部分、領域又は
分類の神経細胞に選択的に影響を与えるように、遺伝子工学方法及び化合物を使用して、
中枢神経系組織にポリペプチドを輸送する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、選択した、標的とする、限られた種類及び分類の神経線維
、及び他の選択した標的とする分類の動物細胞内に効果的に「運送物」又は「運搬物」分
子（外来蛋白質をコードするDNA鎖を含むが、これに限定されない）を送達するのに使用
できるリガンド分子を同定し、単離する為の新しく、実用的な生体内方法を開示すること
である。
本発明のもう一つの目的は、選択した、標的とする、限られた種類及び分類の動物細胞
へ、治療薬剤、診断用もしくは分析用化合物、又はDNA配列を効率的に送達するのに使用
できるリガンド分子を同定し、単離する為の新規方法を開示することである。
本発明のもう一つの目的は、コンビナトリアルケミストリーによって作製された複数の
候補ポリペプチド又は他の化合物を含んでいるライブラリー、レパートリー、または他の
組合わせから、細胞内にエンドサイトーシス輸送を起こす特定の候補を同定し単離する新
規な生体内スクリーニング方法を開示することである。
下記の概要、図面、及び好適な実施形態の記載により、上記の及び他の本発明の目的が
より明白になる。
Abbott, N.J., et al, "Transporting therapeutics across the bloodbrain barrier," Mol. Med. Today 2(3): 10613 (1996)
BBB内に完全に位置する細胞に外来ポリペプチドが接触するように、ほ乳類または他の
高等動物の血液脳関門(BBB)を通して、及び中枢神経系(CNS)内へポリペプチドを非侵襲的
に輸送及び送達する方法および化合物が開示される。この方法は、従来不可能であった人
間及び動物の治療方法を実現し、また家畜などにおいて商業目的に使用することができる
。
この方法は、血液脳関門を「またぐ」特定の種類の神経細胞に遺伝子ベクターをトラン
スフェクトする事によって達成される。そのようなBBBをまたぐ神経細胞の例は、感覚神
経細胞（例えば嗅覚受容体神経細胞および侵害受容神経細胞）及び運動神経細胞である。
自律神経系の節前神経細胞もまたある治療に有用かもしれない。BBB外に伸展する神経「
投射(projections)」にベクターを接触させトランスフェクションする為に、複数の遺伝
子ベクターを患者または動物に導入及び投与する。ベクターがBBBをまたぐ神経細胞の末
梢投射に導入された後、中枢神経活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する
ベクターが主細胞体へ逆行輸送によって運ばれ、そこでトランスフェクトされた神経細胞
により発現され、治療上または他の用途上有用なポリペプチド分子が生成する。これらの
ポリペプチドは通常細胞によって分泌される種類のものであり、又はそれらに分泌を促進
するリーダー配列を与えることもできる。従って、それらはトランスフェクトされた神経
細胞内で輸送され、BBBによって保護された中枢神経系組織内の一つ以上の部位で分泌さ
れる。BBB内のそのような位置で分泌されたポリペプチドは、血液脳関門内に完全に位置
する（従って保護された）標的神経細胞と接触できる。
この方法を使用して、神経栄養因子のようなポリペプチドをBBB内に完全に位置する標
的とした種類及び分類の神経細胞に非侵襲的に送達することができる。これは、老化、病
気、又は他の障害のために退化している又は損傷した頭脳及び脊髄神経細胞を治療する新
規方法を可能にする。あるいは、この新規方法により、神経活動を抑制できるポリペプチ
ドをBBBを通して輸送して、神経因性疼痛のような不必要な過剰の神経活動による障害を
抑制することができる。またこの方法は、中枢神経系内に内分泌機能を調節できるポリペ
プチドを送達する新規方法を可能にし、これにより、ヒトの様々な健康上の問題の治療法
を改善し、また家畜及び絶滅危ぐ種を含む動物などの成長、成熟、生殖または他の内分泌
に関連した機能を改善することができる。
さらに、神経線維内に取り込まれ、その中で送達されるエンドサイトーシスリガンドを
同定及び単離する為の新規な生体内のスクリーニング方法を開示する。このリガンドを用
いて、特定のBBBをまたぐ細胞にベクターを送達することができる遺伝子ベクターを調製
することができる。簡潔に述べると、このスクリーニング法は次の工程を使用する。(1)
複数の候補リガンドを、生存動物の体内において、候補リガンドが神経線維（ラット脚の
坐骨神経束など）に直接接触できるような第一部位に投与すること；(2)エンドサイトー
シスを活性化させ促進できる特定リガンドを神経線維が取り込むために必要な十分な時間
を与えること；(3)神経によって取り込まれなかった又は送達されなかったリガンド候補
を収集することを避けるために、リガンドのの投与位置から十分に遠い位置（ラット臀部
の坐骨神経の結紮部位の下流など）で神経線維の一領域を収集すること；及び(4)収集し
た神経領域から取り込まれたリガンドを取り出すこと。
この方法は、（ポリペプチドリガンドの）ファージディスプレーライブラリー、又はコ
ンビナトリアルケミストリー合成によって作製された他のリガンドレパートリーを使用し
て遂行できる。この方法は本発明の好適な実施態様であるので、これを開示及び特許請求
する。
上記概略に示されたように、本発明は４つの明瞭な要素又は成分を有する。この４つは
全て、本発明を首尾よく遂行するために、協調的かつ連続的な方法で共同的に機能しなけ
ればならない。それらの４要素は、下記に番号順に概説したとおりである。
(1)適当な遺伝子ベクターは、少なくとも１つの望ましい「運送物遺伝子」を含むDNA配
列、あるいはマーカー遺伝子（研究における検出および分析を簡易化するため）及び／又
は運搬物遺伝子(治療上その他の望ましい有用なポリペプチドをコードする）を含むDNA配
列を保有する。この種のベクターを用いて、(2)血液脳関門をまたぐ一つ以上の特定種類
の神経細胞（例えば嗅受容体神経細胞、下部運動神経細胞）にトランスフェクトする。運
送物遺伝子は、BBBをまたぐ神経細胞に入った後、神経細胞により逆行輸送と呼ばれる自
然な過程により神経細胞の細胞体に運ばれる。主要細胞体に達した後、遺伝子が発現され
、それにより(3)BBBをまたぐトランスフェクトされた神経細胞内で「外来性」または「外
因性」ポリペプチド分子が形成される。このような外来性分子（場合により、患者内で十
分に生産されない「内在性」または「天然性」ポリペプチドと同一であってもよい）は、
トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に位置する分泌部位に輸送され
る。次にポリペプチド分子は、トランスフェクトされたBBB をまたぐ神経細胞によりBBB
内に位置する分泌部位で分泌される。この分泌により、外来性ポリペプチドは、(4) BBB
内に完全に位置するその他の「標的」中枢神経系神経細胞又は他の細胞に接触する（そし
て治療上またはその他の有用な方法で治療、調節または影響を与える）。
以下では、ウイルス由来ベクターを用いて、この治療方法を説明する。但し、後に説明
するように非ウイルスベクターもまた使用可能である。
該治療方法を説明する最初の例が、三図面すべてに共通の指示番号を用いて、図ａ〜ｃ
に説明される。図ａは「巨視的」に該治療を示す。遺伝子ベクター100を多数含んでいる
液体を患者80の鼻洞に導入する。該ベクターは嗅受容体神経細胞200の露出された「末梢
投射」212（図ｃ参照）に接触する。これらの神経投射は鼻洞内の表面でアクセス可能で
あり、臭感覚にかかわる生化学的な過程の１つとして様々な空気中の化合物と直接接触す
る。
図c に別スケール（微視的、細胞レベル）で示されるように、遺伝子ベクター100 によ
って運ばれたDNA が神経投射212に入ると、逆行輸送（後述する）によって主細胞体224に
運ばれる。この例の遺伝子ベクターは、鼻受容体細胞を十分に感染する種類のウイルスに
由来するので、該ベクターDNA（不活性だが感染性であるウイルスゲノム内に挿入された
単なる１成分として図ｂに示される運送物遺伝子160を保有する）はこの過程を促進する
。従って、感染性ウイルスを用いてベクター送達系を作製することにより、図ｃに示され
るように、少なくともいくつかのトランスフェクトされた神経細胞において、確実に運送
物遺伝子160からメッセンジャーRNA 鎖299が転写される。
トランスフェクトされた神経細胞200内において、リボゾーム226 が関与する正常な細
胞機構によって、運送物遺伝子160から転写されたmRNA 鎖は、複数個の外来ポリペプチド
分子300に翻訳される。
自然な輸送及び分泌機構のため（所望ならば、遺伝子工学技術によりポリペプチド鎖の
末端に一つ以上特別な輸送配列又は分泌配列を追加することにより実現または増強するこ
とができる）、外来ポリペプチド分子300の少なくともいくつかは（順行輸送と呼ばれる
過程によって）BBBをまたぐ神経細胞200の様々なシナプス末端242（又は他のペプチド分
泌部位）に輸送される。
BBB により保護された中枢神経系組織内に完全に位置する上記部位で、BBBをまたぐ神
経細胞200により、外来ポリペプチド分子300 が放出される。この分泌過程により、分泌
された外来ポリペプチド分子300 は、「標的」神経細胞と称するその他の分類の神経細胞
に直接に接触する（そして治療効果またはその他の調節効果を与える）ことができる。こ
れらの「標的」神経細胞はBBB 内に完全に位置する。図ａ及びｃの模式図の説明では、後
述するように、ポリペプチドは、種々の「標的」神経構造を含む「糸球体」910と呼ばれ
るほぼ球状の構造体内で、トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞200により分泌され
る。
この過程を簡単に述べると、上記概説及び図ａ〜ｃは、どのようにして、(1)運送物遺
伝子を運ぶ遺伝子ベクたーを用いて(2) BBBをまたぐ神経細胞をトランスフェクトし、(3)
外来ポリペプチドが発現され、次にBBB内の中枢神経系組織内に分泌され、そこで(4) BBB
内に完全に位置する「標的」中枢神経系神経細胞に接触するかを示す。
この４つの要素はそれぞれ以下により詳しく記載される。遺伝子ベクターの最適設計は
、トランスフェクトされる特定の種類のBBBをまたぐ神経細胞に依存するので、最初に、B
BBをまたぐ神経細胞を説明する。
BBBをまたぐ神経細胞の種類
BBB をまたぐ神経細胞は大きく３種類に分けることができる。感覚神経細胞、運動神経
細胞、および自律神経節前細胞である。ここに考察されるこれらの種類のBBB をまたぐ神
経細胞のすべては広く研究され、これらの種類の神経細胞それぞれをトランスフェクトす
る為に使用することができる遺伝子ベクターは知られている。
最初に記載されるBBBをまたぐ神経細胞の主な分類は感覚神経細胞であり、それは、視
覚、嗅覚、味覚、および接触、疼痛、肢の位置などの様々な感覚に直接かかわる「前線」
の細胞である。
感覚神経細胞は、BBB外にある表面または組織領域（またはその極近傍)に伸びる特別の
部分（「末梢投射」と称する）を有する。「末梢投射」は、遺伝子ベクターが最も直接に
アクセス可能である、BBBをまたぐ神経細胞の一部である。末梢投射に接触するために遺
伝子ベクターはBBB を通過する必要はない。
逆に、用語「中枢投射」は、主細胞体から離れて伸展する神経細胞の線維状の部分を指
し、これはさらに、(i)多くの種類の感覚神経細胞のように主細胞体がBBB外にあれば、Ｂ
ＢＢ内まで；又は(ii)運動神経細胞及び自律神経節前細胞のように主細胞体がBBB内にあ
れば、頭脳中心又は脊髄上部近くまで、伸展する。
中枢又は末梢投射に関連して、用語「軸索」に注意されたい。殆どの場合、「軸索」と
は主神経細胞体から出現する単一の最も大きく、最も長い投射を指す。但し、多くの感覚
神経細胞は２本の軸索を有し、一方は末梢に伸展し、もう一方は頭脳中央部に伸展する。
殆どのBBBをまたぐ神経細胞の主要な役割の一つは末梢神経系と中枢神経系との間で神経
インパルスを往復することであるので、実際にBBB を通過するBBB をまたぐ神経細胞の当
該部分は、殆どの場合適切に軸索と分類することができる。
BBBをまたぐ４分類の神経細胞が、本明細書に開示した使用方法において考慮に値する
。そのうち２分類は、感覚神経細胞である(i)嗅受容体神経細胞と(ii)侵害受容性（疼痛
信号伝達性）神経細胞である。３番目の分類は、主に筋骨格制御にかかわる運動神経細胞
であり、細胞体が脳幹にあるために特別な関心がある舌の運動神経細胞と呼ばれる亜分類
を含んでいる。４番目の分類は、「自律神経節前細胞」と呼ばれ、これらの神経細胞の遺
伝子変化は自律神経系に影響を与える可能性があるので、ほとんどの人間医学的利用のた
めには大して有望な候補ではない。但し、ある種の病状の治療や種々の研究のために有用
でありうるので認識すべきものである。これら４分類それぞれを次に別々に考察する。
嗅受容体神経細胞
本使用に好適なBBBをまたぐ神経細胞の分類の1つは嗅受容体神経細胞である。嗅覚の役
割のため、それらの末梢投射は鼻洞の内部表面に露出され、アクセス可能であり、鼻を通
して吸引される様々な空気中化合物により直接に接触および活性化される。
これらの神経細胞は様々な生理学の教科書、例えばGuyton and Hall著、Textbook of M
edical Physiology第９版(1996)、ページ678-681に、またページ681-682の引用文献に記
載されている。非常に簡潔に説明すると、人間の嗅覚膜には約2.5平方センチの表面積が
あり、通常約１億個の受容体神経細胞がある。各嗅受容体神経細胞の露出された先端には
、繊毛と呼ばれる通常約６〜12本の極小の毛があり、これは数ミクロン下方の粘液層に伸
展する。臭気の認識を誘発するほとんどの分子は、繊毛及び／又は受容体神経細胞の露出
された表面膜をまたぐ受容体蛋白質と相互作用すると推定される。臭いの感覚を誘発する
殆どの分子は神経細胞本体に侵入しないが、少数の特定の種類の分子（例えばほとんどの
糖蛋白質に非特異的に結合するコムギ胚芽凝集素など）は、おそらくある種のエンドサイ
トーシスによって嗅受容体神経細胞内に取り込まれ、輸送される。また、いくつかの公開
報告によると、アデノウイルスベクターを、嗅覚膜への接触を介して、嗅受容体神経細胞
にトランスフェクトする（外来遺伝物質を挿入する）ことできる。これは、トランスフェ
クトされた神経細胞によるマーカー遺伝子の発現によって示された。
図ｃに模式的に説明するとおり、嗅容体神経細胞200はいくつかの細胞部分から成り、
それらが一つ以上の遺伝子ベクター100と相互作用する。鼻洞膜90は明確な層として模式
的に示されており、嗅上皮の嗅支持細胞の露出された頂上表面から構成される。神経投射
210は鼻洞膜90を通過し、露出された末端212（粘膜先端、終端、またはノブともいう）を
形成する。この露出された神経先端212は鼻腔洞内に存在するので、液体の鼻へのスプレ
ーによって運ばれる本遺伝子ベクターは神経先端212に接触することができる。
嗅受容体神経細胞200は、細胞質220、主細胞体224内に位置する核222、mRNAをポリペプ
チドに翻訳するリボゾーム226、および血液脳関門(BBB)を通過する軸索240から成る。
背景技術で注記したように、BBBは単一の膜構造でなく、その代り、毛管壁を形成する
内皮細胞間に非常に密な接着を有する毛管壁ネットワークである。何人かの学者は、嗅上
皮（鼻洞中の、嗅受容体神経細胞の投射を有する粘性膜表面）は頭脳の延長とみなすこと
ができ、従ってそこはBBBが存在しない中枢神経系組織の一領域であると主張しているが
、生理学的な研究から、嗅糸球体がBBB内に完全に位置しており、そして誤った不要な神
経インパルスを誘発するかもしれない不要な分子から、BBB によって保護されていること
が明らかである。その事実を示すために、図ａでは二重破線900を用いてBBBを模式的に示
す。嗅受容体神経細胞200の末梢投射210及び主細胞体224はBBB外に位置するが、軸索240
はそれを通過して、BBBにより保護された中枢神経系組織内に位置する多数のシナプス末
端242に分岐する。従って、嗅受容体神経細胞200 はBBB をまたいでいる。
嗅受容体神経細胞200 のシナプス末端242 は、図ｃで「糸球体」910と示されたほぼ球
形の構造体に位置する。ヒトには数千の糸球体があり、各糸球体は嗅受容体神経細胞から
のほぼ25,000本の軸索のシナプス末端を含んでいる。各糸球体910 は、大きな「僧帽」細
胞及び小さな「房飾」細胞からの数千の樹状突起及び投射920 の末端でもある。僧帽及び
房飾細胞の細胞体および樹状突起は糸球体に位置するように表示されるが、それらの主細
胞体は糸球体の上にある球根構造に位置する。さらに、各糸球体（又は糸球体に密接する
周囲領域）は、神経細胞930（これは、前脳基底核に位置し、興奮性神経伝達物質のアセ
チルコリンによって主に活性化されるために「前脳基底核コリン作動性神経細胞」と呼ば
れる）から下に伸展する（突起と呼ばれる）長い線維932の先端に位置する末端934 もま
た含んでいる。
図ｃの模式図は選択的な説明図であり、標的神経細胞構造全てを説明するものではない
。例えば、糸球体内又は近辺には次の線維からの末端が見つかる：(i) 主細胞体が中脳部
分にある縫線核と呼ばれる脳領域の「セロトニン作動性」神経細胞から伸びる線維；及び
(ii)青班核と呼ばれる頭脳部分に主細胞体が位置する「ノルアドレナリン作動性」神経細
胞から伸びる線維。送達される治療ポリペプチドに応じて、BBB内に完全に位置する上記
又は他の神経細胞が、ここに開示する治療の標的とされる。
一般的には、トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞200から放出されたポリペプチ
ドは、いわゆる「トランスシナプストレーサー研究」（例えばLafay et al 1991; Barnet
t et al 1993)により、ウイルス感染した嗅受容体神経細胞から放出されたウイルス粒子
によって感染されることが判明したあらゆる（又はほぼあらゆる）種類の神経細胞に接触
して、調節効果を発揮することが予想される。そのような神経細胞は、例えば、僧帽細胞
及び房飾細胞（これらは非常に多数の末端 が糸球体にあるので多数が感染する）、並び
に少なくともいくつかの前脳基底核コリン作動性神経細胞、縫線核セロトニン作動性神経
細胞、及び青班核ノルアドレナリン作動性神経細胞（これらはトレーサー研究で感染が示
された）である。
種々の「グリア細胞」もまた、嗅受容体神経細胞200から分泌されるポリペプチド分子3
00と接触しうる。以下に詳述するように、グリア細胞（ニューログリア細胞とも呼ばれる
）は、神経信号を受信または送信することができず、代りにBBBにより保護される中枢神
経系組織内に位置する神経細胞を支持および支援する種々の細胞を含んでいる。
従って、ここでは用語「標的細胞」は、BBB により保護された中枢神経系細胞内に完全
に位置し、そして遺伝子ベクター100の運送物遺伝子によってコードされる外来ポリペプ
チド分子300の所望の「標的」である細胞を参照するの使用される。実際に遺伝子ベクタ
ーによって接触されトランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞は、ここでは標的細胞
とみなされない。その代り、そのようなBBBをまたぐ神経細胞は送達機序の一部として見
なされるべきであり、「送達細胞」、「トランスフェクション経路」、またはトランスフ
ェクトされた「一次」神経細胞として参照される。
嗅受容体神経細胞が送達経路として使用される場合、もう一つの生理学的な要因が重要
になる可能性があり、認識されるべきである。嗅受容体神経細胞は次第に死滅し、新しく
生成した神経細胞によって絶えず置換されている。マウスでは、嗅受容体神経細胞の「半
減期」は約３か月であり、ヒトの半減期とほぼ同等であると推定される。
従って、嗅受容体神経細胞が遺伝子ベクターによって安定に形質転換されても（すなわ
ち遺伝子ベクターにより一つ以上の外来遺伝子が嗅受容体細胞の染色体に挿入されても）
、それにかかわらず形質転換された細胞は次の数週および数月にわたって次第に死滅する
。その結果、使用したポリペプチド及びベクターの種類、及び特定の患者に望まれる効果
に応じて、数週間ごとに患者に追加ベクターを再投与する必要があるかもしれない。
侵害受容性神経細胞
BBBをまたぐ感覚神経細胞の別の分類は、身体及び皮膚から脊髄に疼痛信号を送信する
。これらの神経細胞は侵害物質、信号、または環境事象に応じて神経インパルスを発生さ
せる。従って、これらは、皮膚が切断され、擦られ、打撃され、または非常な高温か低温
にさらされた場合に、疼痛感又は不快感を発生させる過程を始める神経細胞である。これ
らの疼痛信号を送る神経細胞は、通常「侵害受容体」または「侵害受容性」神経細胞と呼
ばれ、時によって、ノーシセプター又はノーシオセプターと呼ばれる。侵害受容性神経細
胞は、背根神経節の一部分である、異なる機能を有する数種類のBBB をまたぐ感覚神経細
胞の1 つである。
図d は、非常に模式的に侵害受容体神経細胞400を表示する。殆どの他の感覚神経細胞
のように、この神経細胞400は、その主細胞体402を、BBB外の、BBBにより保護されない組
織領域に有する。侵害受容体神経細胞400の場合、主体402は脊髄480に比較的近い背根神
経節内に位置する。この神経細胞は、脊髄480から外へ皮膚まで伸展する末梢投射410を有
する（他の投射は身体内のより深い別の領域に伸展する）。この末梢投射410 は、皮膚表
面405直下の浅い組織層に、多数の「表面近辺末端」412を分岐する。
反対方向には、侵害受容体神経細胞400は、血液脳関門を通過する軸索420を有する。図
dBに示すように、軸索420は、脊髄480 のBBBにより保護された中枢神経系内で、突起422
、424及び426（図dBに示す)に分岐する。各突起は、脊髄480内で侵害受容体神経細胞が「
二次」神経細胞に疼痛信号を送信するように、一つ以上のシナプス接続で終わる 。
横断面として示される脊髄480 の表面には、(i)患者の前方に位置する腹側正中裂482(
または前正中裂と呼ばれる）；および(ii) 2 つのより小さい後外側溝（又は後中間溝）
に挟まれた背側正中溝484(また後正中溝と呼ばれる）がある。脊髄480 の本体は「灰質」
490 を囲む「白質」486から成る。灰質490 は左右の前角492 、及び左右の後角494 から
成る。この4 つの角はすべて灰質交連 と呼ばれる中央部分に接続される。図d及びe に示
されるように、脊髄から側方に出る神経線維の大束は通常、後根（又は背根）及び前根（
又は腹根）と呼ばれる。用語「神経節」は、一般に中枢神経系の外にある神経細胞体の集
合を指し、これらの神経束を参照するのにも使用される。
皮膚表面405 が切られるか、または擦られると、神経信号が、侵害受容体神経細胞400
の表面付近の末端412から始まり、末梢投射410 を通り、細胞体402 を通り、BBB を通過
する軸索420を通り、脊髄480 の後角494内部 の分岐した樹状突起422-426に到る。樹状突
起422-436の先端シナプスから神経伝達物質が放出され、それが脊髄神経細胞の神経イン
パルスを誘発する。その神経インパルスは脊髄の上に移動し、頭脳内の処理センターに至
り、到着した神経信号は、頭が疼痛として解釈するように処理される。
様々な医学的な問題が「神経因性疼痛」として分類されている。名前が示すように、神
経因性疼痛は、不必要で過剰な疼痛信号を発生させる様に神経細胞に影響を与える病理学
的状態に関わる。これは、しばしば、慢性及び不適当な疼痛反応を生ずるBBB内神経接続
の解剖学的再構成に関わる。用語「痛覚過敏」もまた「過剰な疼痛」の同義語として用い
られ、「異痛症」もまたこの症状に使用される。
神経因性疼痛は、有名な医学的な問題の集合体であり、この広い分類には、糖尿病性神
経障害、切断された肢または指からの「幻肢痛」、くも膜炎 、三叉神経疼痛、伝染後疼
痛（例えばヘルペスゾスターウイルスにより引き起こされる「帯状疱疹」の発生）、そし
て外傷性傷害及び手術後に起こる、通常の回復期間の後でも退かず長引く慢性疼痛が含ま
れる。灼熱痛（カウザルギー）はもう一つの種類であり、焼けるような感覚に関わる（根
単語の「カウザ」は 「焼灼」と同じ根源に起因し、カウゼーション（原因）とは全く関
係ない）。他の種類の神経因性疼痛もまた知られており、神経因性疼痛には広範囲の強さ
があり、迷惑程度から始まり、衰弱的、耐え難い、又は非常に激しい痛みまで及ぶ。実際
、神経因性疼痛は多くの自殺の重要な要因であり、慢性及び不治の疼痛はとても強く、無
情であり、多くの患者が自殺する。
多くの種類の神経因性疼痛に広く関わると信じられる細胞的機序が図dBで説明される。
この模式図では、軸索420NPは、神経病理学的な問題に関与して、あまりに多くの樹状突
起422、424、426を発芽し、脊髄480NP の後角にある脊髄神経細胞432、434、及び436と相
互作用を始める（そのいくつかが不適当かもしれない）。単一の侵害受容体軸索からのあ
まりに多くの樹状突起の発芽及び慢性活性化は、疼痛に侵された脊髄480NP 内へ及びそれ
を通過して、あまりに多くの疼痛信号の伝達を引き起こし、または悪化させる。疼痛送信
性の神経細胞が関与するあまりに多くの神経接続状態は、図dBで示されており、「過剰神
経支配」と呼ばれる。
図dA〜dCおよび以下に説明されるように、本発明は、患部またはその近傍に、侵害受容
性神経細胞をトランスフェクトする遺伝子ベクターを投与することによって、神経因性疼
痛を制御および軽減する方法を提供する。図dAにベクター100NPCとして示されるこの種類
のベクター（「NPC」は「神経因性疼痛制御」を意味する）は、後述するように、神経活
動を（増加よりもむしろ）抑制するように設計された「NPC」運送物遺伝子を有する。
侵害受容性受容体は皮膚下の浅い領域に位置するので、皮下、筋肉内、又はその他の比
較的浅い注入が好ましい投与経路である。あるいは、局所的及び他の投与方法もまた評価
することができ、例えば(i)ジメチルスルホキシド、メシルサリサイレート等のような組
織浸透促進剤を含んでもよい、ベクターを含む軟膏、クリーム、その他の溶液または懸濁
液の局所的適用；(ii)荒らされた、すり減らされた、または別の方法で物理的処理された
皮膚領域への、ベクターを含む製剤の局所的適用；及び/又は(iii)「皮はがし」処理に使
用される化学薬品等により化学的に処置された皮膚への、ベクターを含む製剤の局所的適
用である。
さらに考察のために、神経因性疼痛制御のために遺伝子ベクター100NPCを含んでいる液
体を、皮下の浅い部分で、患者によって最も強く神経因性疼痛を感知する明白な「焦点」
（位置、座位、ホットスポットとも呼ばれる）の皮膚に、またはその近辺に注入すること
を考える。上記のように、ベクター100NPCは神経活性を（増加よりもむしろ）抑制するよ
うに設計されている遺伝子を含む。そのような抑制遺伝子は例えば次のものをコードする
：(i)一つ以上の種類の神経栄養性又は他の神経刺激性ペプチド又は化合物に結合して不
活性化する単クローン抗体（または抗体断片）；又は(ii)神経刺激に関わる一つ以上の種
類の神経細胞受容体に競合的に結合し、占有し、そして遮断するペプチド断片。NPC遺伝
子は（逆行輸送を介して）侵害受容性神経細胞の細胞体402に送達され、そこでその遺伝
子から上記複数のNPCポリペプチドが発現される。次にNPCポリペプチドは、神経軸索420
により（順行輸送を介して）BBBを通過して、過剰神経支配状態（脊髄内の成分を有する
）により誘発または悪化され疼痛に侵されている脊髄480NP内に送達される（図dB参照）
。
NPC ポリペプチドは、脊髄内の過剰神経支配状態部位又はその近辺で、BBBにより保護
された脊髄組織内に放出される。抑制効果を出すことによって（高神経活性を刺激または
維持する細胞作用剤又はその過程を結合、阻止、競合または抑制することによって）、NP
C ポリペプチドは、処置の種類に応じて永久に、あるいは数日間または数週間、神経因性
疼痛の病状を減少および軽減することを促す。
運動神経細胞
BBBをまたぐ神経細胞の別の分類は、運動神経細胞と通常呼ばれる。これらはに主に中
枢神経系から身体の筋肉に指示を送信し、骨格筋系を「神経支配」し、筋肉を中枢神経系
の制御下に置く。通常「脊髄運動神経細胞」と呼ばれる運動神経細胞の１つの主要な亜分
類は、その細胞体を脊髄内に置き、BBBを通して伸展して末梢神経細胞および筋肉に接触
する投射を持つ。
図ｅ（図eA〜eC）は、「トランスフェクション経路」としての脊髄神経細胞の使用を模
式的に示す。この経路を介して、BBB内に完全に位置する上位運動神経細胞に治療ポリペ
プチドを送達することによって、脳卒中発作、外傷性傷害、神経変性疾患または同じよう
な原因のために衰弱した肢を持つ患者の筋肉の神経制御を刺激し高める。図eAは脊髄520
のBBBにより保護された組織に細胞体502を有する脊髄神経細胞500 を示す。脊髄520 には
図dAで示されているのと同じ構造があり、運動神経細胞の細胞体502 は前角522 の灰質内
に位置する。脊髄運動神経細胞500 の軸索はBBB を通過する長い「突起」504を形成し、
筋線維束550 まで伸展する。筋線維束550 内で、神経軸索又は突起504は樹状突起及び末
端506に分岐し、（健康な人では）筋肉組織と相互作用して必要時に筋肉収縮を誘発し、
そのため腕、足等の「随意運動制御」を提供する。
図eBは脳卒中発作、又は頭脳もしくは脊髄の損傷、又は神経変性疾患（筋萎縮性側索硬
化症など）、又は腕もしくは足の随意的運動制御を損なった同じような病気等に苦しむ患
者の3 つの別個の脊髄神経細胞の細胞体（512、514、516と示される）を模式的に示す。
この機能障害状態は、少なくとも3 つの運動神経細胞の細胞体の上位に位置する頭脳又は
脳幹内の上位運動神経細胞の死滅又は損傷が少なくとも一因である。脊髄神経細胞細胞体
512-516の上に位置する頭脳または脳幹内の死滅又は損傷した上位運動神経細胞のいくつ
かは、脊髄神経細胞512 及び516 に神経インパルスを供給していた。図eBに図示するよう
に、様々な上部運動神経細胞が損傷又は死滅すると、突起532 及び536（図eB の点線）は
静止し、退化を開始し、その結果、3 つの脊髄運動神経細胞のうち1 つだけ（中心突起53
4）が、上位運動神経細胞から来る神経信号の活動的な供給を受ける細胞として残る。2
つの運動神経細胞512 及び516 はもはや神経インパルスを受信しないので、静止及び不動
化し、長期間にわたり萎縮し、変質し、そして死滅する危険にさらされる。
図eCは、もはや普通に作動しない筋肉束550 に、複数の遺伝子ベクター100 を含んでい
る液体を注入した後のこの症状治療結果を模式的に示す。ベクター100 は、神経栄養性因
子又は神経活動もしくは細胞分裂を刺激する他のポリペプチドをコードする治療遺伝子を
含む。ベクターに含まれる遺伝子は細胞体512-516に輸送され、その遺伝子から神経刺激
性ポリペプチド分子が発現する。次に、これらのポリペプチドは3 つの運動神経細胞によ
って分泌され、信号として機能して、近辺のまだ生存可能で活性である神経細胞、例えば
活動的な突起534 を持つ上部運動神経細胞、の付加的な樹状突起の成長及び/又は活性化
を刺激し誘引する。これにより、活動的な突起534は付加的な突起534a及び534cを発芽し
、他の神経細胞とシナプスを形成することができる。付加的な新しく発生したシナプス接
続は、その後、脊髄運動神経細胞512 及び516 からの突起を再び活性化させ始める。理学
療法及び運動療法と組み合わせると、これは、患者の腕もしくは足のより良い自発的な制
御の回復につながる。
舌運動神経細胞
本発明に非常に有用かもしれない運動神経細胞の１つの亜分類は、BBB を通して伸展し
て舌筋肉を支配する投射を持つ。これらの「舌運動神経細胞」は、摂食、会話の為の舌の
動きを制御する。細胞体は脳幹の中にある。従って、それらは中枢神経系 の脳幹部分に
外来ポリペプチドを送達する為の有望な経路を提供する。
図fは舌運動神経細胞600 を示す。これは、細胞体602を脳幹950 内に有し、さらに患者
60のBBB を通過し、舌62の中で終わる長い末梢投射604を持つ。神経投射604 のアクセス
可能な先端は、舌62に注入される担体液体を介して遺伝子ベクター100Aと接触する。
そのベクターDNA は、神経投射604 を通して細胞体602 に逆行輸送される。運送物遺伝子
から治療ポリペプチドが発現し、脳幹内の領域に舌運動神経細胞600 から分泌される。こ
れらの分泌されたポリペプチドは脳幹950 に位置する他の様々な神経細胞952 及び954 に
接触し効果を出す。
自律神経節前細胞
BBBをまたぐ神経細胞の最後の主要な分類は、自律神経節前細胞と通常呼ばれる。運動
神経細胞と同様に、細胞体はBBB内に位置する。軸索はBBB を通過して伸展し、交感神経
及び副交感神経細胞と接続する。「自律」系の一部として、これらの神経細胞は意識制御
下にない様々な機能の制御にかかわる（例えば血圧、消化、排泄、発汗）。
用語「節」は神経細胞の集まりを意味する。従って、「節前」神経細胞とは、細胞体が
中枢神経系内に塊（また核と呼ばれる）として存在し、その軸索がBBB通過して投射されB
BB外にある神経節に存在する神経細胞を神経支配し接触する細胞を含む。
本発明の方法および遺伝子ベクターは、自律神経節前細胞を遺伝的にトランスフェクト
する為に、適宜、適用および使用する事ができると考えられる。少なくともある場合では
、そのようなトランスフェクトされた自律神経節前細胞は、脳幹及び/又は脊髄に、更に
おそらく他のBBB 内に完全に位置する中枢神経系神経細胞に、外来ポリペプチドを輸送し
送達すると考えられる（一般的支持データにつき、例えばPickard et al 2002参照）。
但し、感覚神経細胞及び運動神経細胞は、少なくとも本発明の開発初期には、操作及び
分析が幾分し易いことが認識されるべきである。これは複数の要因のためである。一方で
は、感覚及運動神経細胞の投射は、露出したアクセス可能な表面部位（又はその近傍に）
（嗅覚神経細胞の場合）、また、比較的浅い筋肉及び皮下領域（又はその近傍）に実際に
達する（疼痛送信性及び運動神経細胞の場合）。対照的に、自律神経節前細胞末端は、自
律神経節内の皮膚表面下の奥深くに達する。従って、自律神経節前細胞を、BBBをまたぐ
「トランスフェクション経路」として使用する場合、正確なベクター送達を行うことは、
感覚又は運動神経細胞よりもいくらか技術的に困難である（またいくらか危険である）。
その為、実施例及び本文の殆どは、本発明を説明するために、遺伝子ベクターによって
トランスフェクトされるBBB をまたぐ神経細胞として、感覚神経細胞又は運動神経細胞を
使用することに集中する。当該種類のBBB をまたぐ神経細胞は、一般に本発明の初期開発
および試験の好適な候補であると考えられる。しかし、自律神経節前細胞は、BBBをまた
ぐ「トランスフェクション経路」として利用可能であり、最終的に種々の治療又は他の処
置に非常に有用となるかもしれない。
遺伝子ベクター
上に要約した様に、一つ以上の有用な「運送物」遺伝子（マーカー遺伝子及び/又は運
搬物遺伝子を含みうる）を運ぶ遺伝子ベクター（例えばウイルスベクター、リポゾーム、
そしてBBBをまたぐ神経細胞上のエンドサイトーシス受容体を標的とするリガンドベクタ
ーなど）は、一つ以上のBBB をまたぐ神経細胞へのベクターDNA(有用な運送物遺伝子を含
む)のトランスフェクションを促進するように、BBBをまたぐ神経細胞の末梢投射に接触す
る。そのような神経細胞内に入ると、少なくとも複数の運送物遺伝子は、自然な逆行輸送
過程によって、投射を通して主細胞体に送達される。細胞体内に入ると、正常な細胞内機
構によって、運送物遺伝子から、遺伝子にコードされたポリペプチドが発現される。
注目する殆どのポリペプチド（神経成長因子など）は、ホルモンもしくは成長因子とし
て機能するものであり、必要な機能を遂行するために通常自然に細胞から分泌されなけれ
ばならないので、そのようなポリペプチドは、トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経
細胞により発現される場合、そのトランスフェクトされた神経細胞からの分泌に適するも
のであろう。
従って、本発明は、BBBをまたぐある種類の特定中枢神経系神経細胞をトランスフェク
トすることができる遺伝子ベクター類を開示し、それにより、トランスフェクトされた神
経細胞は有用な治療ポリペプチドを発現し、そして通常は血液脳関門により外来ポリペプ
チドから保護された中枢神経系組織内に分泌する。
図b はウイルスベクター100 を模式的に示す。このベクターは3 つの主要成分を持つ：
外殻部分110 、結合リガンド蛋白質120、及びゲノム150（図bでは二重鎖DNA 又はdsDNAと
示される）。
脂質性「外被」が無いウイルスベクター（アデノウィルス由来ベクターなど）では、外
殻部分110 は、相互に半連結式にかみ合うキャプシド蛋白質112 から成る。そのようなベ
クターの蛋白質「殻」は通常キャプシドと呼ばれ、結合リガンド蛋白質120 は通常各ウイ
ルス粒子の外面に露出したキャプシド蛋白質のドメインに過ぎない。
他のウイルスベクター（ヘルペスウイルス由来ベクターなど）では、外殻部分（通常「
外被」と呼ばれる）は脂質から成り、通常は、殆どの哺乳類細胞の外膜を構成する脂質二
重層に匹敵する二重層として形成される。そのようなベクターでは、結合リガンド蛋白質
120 は通常外被層をまたぎ、各蛋白質の外部突出は外側へ伸展し、そのため細胞表面蛋白
質に接触し結合できる。
脂質外被があるかどうかにかかわらず、ウイルスの結合リガンド120 は、その種のウイ
ルスが感染できる細胞の表面の相補的な蛋白質に付着する（抗体抗原間の結合反応と同等
な非共有結合様式で）。ある種のウイルス（及びそれらから得られるベクター）は、非常
に特異的な結合リガンドを有する。これらの種類のウイルスは、相補的な表面蛋白質を有
する種類の細胞にのみ感染する。別の種類のウイルス（及びそれらから得られるベクター
）は、より特異性の低い結合リガンドを有し、より広い種類の細胞と結合し感染する。
図b に示すベクター100 によって運ばれるベクターゲノムは、二重鎖DNA (dsDNA)から
成る。別の種類のウイルスベクターは、一本鎖DNA または二重鎖RNA を運ぶことができる
。様々な遺伝子ベクターには4 つの分類のゲノムが知られ、そのようなベクターはどれで
も、ここに開示されるように使用できる。dsDNAを運ぶ一般的なウイルスベクターのゲノ
ムは、本発明の早期評価のための望ましい候補である。実験室での合成遺伝子又は単離遺
伝子の処理では、ssDNA（相互の固有の塩基誘引ため「粘着的」である）又はRNA（DNA よ
り幾分不安定である）よりdsDNA が使いやすい。従って、今までに開発されたウイルスベ
クターの殆ど（ヘルペスウイルスもしくはアデノウィルスから得られるベクターなど）は
dsDNA ゲノムを含んでいる。
ウイルスベクターの使用のために開発された慣用的な専門用語を使用すると、ウイルス
ベクター（また他の種々の遺伝子ベクター）によって運ばれるゲノム150は、いくつかの
「ドメイン」から成る。一つ以上の「運送物遺伝子」160 は、一般にはウイルスゲノムの
中に挿入され、これによりウイルスゲノムがトランスフェクトされた細胞内に入った後、
ウイルスゲノムの両端が適正に作用することができる。従って、ウイルスゲノム中への運
送物遺伝子160 の挿入は、2つの「挟み込み配列(flanking sequence)」155及び157を形成
し、これらは、運送物遺伝子の両端を挟み込む天然もしくは改変ウイルスDNA配列を含ん
でいる。挟み込み配列155 及び157 の先端は、ウイルスポリペプチド158 及び159 にしば
しばつながれる。一般に、このようなポリペプチド「キャップ」構造は、ウイルスDNA が
細胞に侵入した後、ウイルスDNA を通常破壊又は分解しようとする細胞内において比較的
安定であり、防御機構に対して耐性であるように進化したものである。必要であれば、こ
れらのポリペプチド「キャップ」の一方又は両方は、様々な細胞過程（細胞核へのウイル
スDNA の逆行輸送、能動輸送など）を促進および加速ように、選択及び／又は改変される
。
「運送物遺伝子」160 は3 つの別個のドメインを持つ。プロモーター領域162 は、「転
写酵素」に対してすぐに二重螺旋DNA鎖からメッセンジャーRNA鎖を転写し始めるよう指示
する信号配列を含む。このプロモーター領域は通常「TATA」ボックス又は類似信号を含み
、これは、TATA ボックスから通常約25塩基下流に位置するDNA 配列からmRNAを転写し始
めるように該酵素に指示する。説明を簡単にするために、TATA ボックスとmRNAに転写さ
れる第一塩基との間にある約25塩基の配列は、遺伝子プロモーターの一部と見なす。ある
いは、好ましければ、それは「非転写リーダー配列」の一部として参照され、実際の遺伝
子プロモーターの一部として見なされる必要はない。
遺伝子プロモーターは、その遺伝子から転写されるmRNA 鎖の塩基配列を規定する「コ
ード」領域164へと続く。この領域は、mRNA 鎖のAUG「開始」コドン（ポリペプチドのＮ
末端の最初のアミノ酸のメチオニン残基を規定する）及び「終了」コドン（リボゾームに
よるmRNA鎖の翻訳を切断する）を規定するDNA 配列を含んでいる。いくつかのベクターで
は、運送物遺伝子のコード領域は、宿主細胞内の「編集」過程によって最終的なmRNA鎖か
ら削除されるイントロンをも含む。
コード領域は、「非翻訳」配列166へと続く。このドメインは宿主細胞内で転写され、m
RNA鎖の一部となる。これらのドメインが、mRNA鎖上にある場合、宿主細胞内のmRNA鎖を
安定化し、酵素による急速な分解に対して保護する。但し、この非翻訳配列は、リボゾー
ムによってポリペプチド配列に翻訳されない。
この一般的な遺伝子構造の変異体が可能であり、それも本発明で使用できる。一例とし
て、一つのポリペプチドコード領域164 の後に、そして非翻訳配列166の前に、「配列内
リボソーム再進入部位」（IRES）（例えば脳心筋炎ウイルスなどのRNAウイルスに由来す
る）を、第2 コード配列と共に挿入して、第2 ポリペプチドの同時発現を実現することが
できる。（例：Wong et al 2000）。ＩＲＥＳの指示により、リボゾームはmRNAの第2 位
置に結合して、第2 ポリペプチドを第1ポリペプチドと平行して発現し始める。
ウイルスは、そのDNA (又はRNA)を細胞内に導入する様々な異なった方法を進化させた
。従って、遺伝子工学により作製されたウイルスベクターは、感受性細胞にDNA 「運搬物
」を送達するために、同様の感染過程を利用できる。
一例として、脂質外被がないウイルス間にほぼ共通する過程では、ウイルスのキャプシ
ド蛋白質は宿主細胞外膜に表示される蛋白質分子に付着する。この付着過程は、「陥入」
と呼ばれる過程を開始させ、その結果、ウイルスは、細胞膜脂質から形成される脂質二重
層外被又は小胞内に引き込まれ、充填され、この小胞は細胞内の細胞質液に分散する。続
いて、この泡様の小胞（しばしば「エンドソーム」呼ばれる）は、ウイルスのキャプシド
蛋白質の援助により、あるいは細胞質内の消化過程又は消化器官により破裂する。エンド
ソームの破裂により、細胞質内にウイルスDNA を遊離する。
別の例では、脂質二重層外被を有するヘルペスウイルス及び他のウイルス間にほぼ共通
する過程では、ウイルスおよび細胞を包囲する異なる脂質二重膜が融合して合体する。そ
の結果、細胞質内にウイルス脂質外被の内容物全てが移転する。
特定のウイルスベクターによりいずれの感染様式が使用されるかに関わらず、結果とし
て、有効なウイルスベクターは、その遺伝子物質の一部又は全部を細胞質液内に移転させ
る。図aの例に戻るが、ウイルスベクター100はそのDNA150を嗅受容体神経細胞200 の露出
粘膜先端212 に挿入する。
場合によっては、運送物遺伝子を含む遺伝子ベクターをBBB をまたぐ神経細胞にトラン
スフェクトした後、使用したベクター系の複製及び移動特性に応じて、複数の結果及び効
果を生む。ほとんどの場合、ベクター及び運送物遺伝子は、トランスフェクトされたBBB
をまたぐ神経細胞内に残り、そしてそのトランスフェクトされた神経細胞内で運送物遺伝
子から発現されたポリペプチドは、そのトランスフェクトされた神経細胞から単に分泌さ
れると考えられる。但し、ある種のベクター（「トランス神経性」ベクターと言われる）
はBBB をまたぐ神経細胞により、それ自身BBB 内に分泌されうる。これにより、そのよう
なトランス神経性ベクター（すなわちその遺伝子物質）は、BBB内に完全に位置する他の
神経細胞と接触してトランスフェクトすることができる。
遺伝子ベクター及び遺伝子構成体を、本使用方法のために開発する場合、コードポリペ
プチドを多量に発現する為の周知の様々な技術及びDNA 配列を使用できる。そのような技
術および配列は、下記「遺伝子及びベクター構成体；発現、送達、及び分泌促進因子」で
考察される。
「マーカー遺伝子」（「レポーター遺伝子」とも呼ばれる）は、形質転換細胞およびそ
の細胞系譜や運命をより簡単に、より速く、より安く、より確かに、より高く、検出、定
量、同定することを可能にするものであり、本遺伝子ベクターによって運ぶことができる
運送物遺伝子の１つの重要な種類である。遺伝子工学では周知の上記遺伝子は、企業、商
業、医学などの様々な分野で、当業者に容易に明白である様々な方法で、その研究、評価
、開発を促進および改善することができる。
種々の遺伝子ベクターの追加コメントは下記実施例に示す。
治療ポリペプチド候補
本遺伝子ベクターは基本的に担体、運搬体、または送達系とみなされるべきである。そ
のため、担体によって送達および輸送する運送物及び運搬体は、特定な使用を意図する使
用者が選択する。
一般に、本遺伝子ベクターは、トランスフェクトされた神経細胞により対応ポリペプチ
ドが発現されるように、任意の核酸配列を有する任意の選択された遺伝子を本質的に輸送
および送達することができる。そのため、医者及び研究者が関心をよせる殆どのポリペプ
チドは、トランスフェクトされたBBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に分泌することができ
る。但し、医者及び研究者が関心をよせる殆どの場合、分泌の必要性は、２つの理由から
厳しい制約ではない。第一に、ほぼ全ての種類の「神経活性」ポリペプチドは本来分泌さ
れる。一般に、そのような神経活性は、該ポリペプチドがある中枢神経細胞から分泌され
、他の中枢神経系細胞に作用することから、発見および同定された。第二に、関心のある
特定の候補ポリペプチドが通常自然に分泌されなければ、そのポリペプチド配列に、細胞
分泌を引き起こすことが知られる多数の「リーダー」ポリペプチド配列を結合することが
できる。
ここに開示するエンドサイトーシスリガンドは、トランスフェクトされた神経細胞によ
るポリペプチドその他の化合物の分泌を取り扱うものではなく、また直接関わっていない
。その代り、これらのリガンドは、特定のBBBをまたぐ神経細胞に遺伝子ベクターを標的
送達する事を可能にするように設計および意図されている。これらのエンドサイトーシス
リガンドは、治療薬剤、診断用化合物、その他の化合物などの運送物分子を、該リガンド
が特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を持つBBB をまたぐ神経細胞（他の標的
細胞）に輸送及び送達するための系として利用できる。
従って、時として、BBB をまたぐ神経細胞内に輸送できる薬剤または他の非DNA化合物
は、BBB 外でアクセス可能な末梢投射を介して侵入し、BBB内にある中枢投射で同神経細
胞から分泌される（これは、コムギ胚芽凝集素のようなトランスシナプス性トレーサー分
子により示された）。
運送物成分とエンドサイトーシスリガンドとを連結する連結成分を用いることにより、
リガンド運送物複合体がBBB をまたぐ神経細胞に侵入した後に、運送物がリガンドから解
離することができるのであれば、薬剤その他の化合物の当該送達経路は特に有望かもしれ
ない。そのような連結成分はしばしば「不安定」剤と言われ、特に密着性や耐久性が無く
、様々な条件下で遊離できることを意味する。種々の不安定な連結成分が周知である（例
えば、酸感受性スペーサー分子が、Shen et alによる米国特許4,631,190及び5,144,011に
記載される）。必要であれば、下記のような分子複合体を形成するために、特定のエンド
サイトーシスリガンド（又はリガンド類）と、特定の治療薬剤、分析用化合物、その他の
関心のある運送物成分と共に、どのような不安定連結成分を用いることができるか決定す
ることができる。このような分子複合体は、(1)アクセス可能な末梢投射を介してBBB を
またぐ神経細胞に運送物成分を送達することができ；そして(2)該複合体がBBBをまたぐ神
経細胞に侵入した後、運送物成分はエンドサイトーシスリガンドから解離することができ
；そして(3)解離した運送物成分が、BBBをまたぐ神経細胞により、BBB内の分泌場所で分
泌されることが可能である。
再び、遺伝子ベクターを用いてBBBをまたぐ神経細胞に外来遺伝子を導入することによ
り、中枢神経組織内に導入することができるポリペプチドの範囲と種類に関して、表1 及
び2 に、１つの用途（ヒトの様々な神経変性又は神経因性疾患の治療）で利用できる選択
肢のいくつかを列記する。表には説明がないので、列記した項目に関する付加的な情報を
提供するため、下記概説により、ヒトの医学治療に使用することができる種々のポリペプ
チド、及びそのようなポリペプチドにより調節できる特定の疾患群をいくらか広く列記す
る。この説明は完全ではなく、本発明の方法が公知になれば、神経学または神経薬理学の
専門家は、他の潜在的な使用法及び治療法を認識すると思われる。
１．表1 に列記するような様々な神経栄養因子、成長因子、または神経突起抑制因子は
、神経変性疾患のような中枢神経系障害、または脳卒中発作、心拍停止、窒息、血液損失
などの虚血性もしくは低酸素性発作、または他の物理的な傷害もしくは外傷に起因する様
々な形の神経損傷を防止又は修復する。
２．様々な神経栄養因子ホルモン、成長因子、または神経突起抑制因子は、既存の神経
細胞間の新しいシナプス接続の形成を刺激し、及び／又は神経突起の成長を誘導して、シ
ナプス接続を一方で促進し、他方で抑制することができる。患者により、この種の治療は
老化もしくは様々な病気による神経機能損失の回復を促進する。またそれは、脳卒中発作
、頭部外傷、又は他の虚血性、低酸素、興奮毒性等の発作後に、患者が筋肉、会話、及び
他の機能を取り戻すのに役立つ。
３．種々の内分泌性、傍分泌性、及び関連する類似ポリペプチドは、様々な腺性、成長
関係、成熟関係、性的、その他の障害の治療に役立つ。
４．BBB 内のある神経伝達物質分子の量を増加できるポリペプチドは、様々な神経変性
疾病を治療できる。例えば、脳内のドーパミンレベルを増加できるポリペプチドは、（酵
素、ホルモン、分泌因子、または他の様々な機序により）パーキンソン病の治療に使用で
きる。また、アセチルコリンレベルを増加できるポリペプチドはアルツハイマー病の治療
に有用である。
５．細胞毒素又は成長抑制ポリペプチドは、BBB 内で、ある種の癌または他の疾病の治
療に使用できる。
６．種々の受容体拮抗剤、抗体、または一つ以上の神経活性を抑制及び阻害することが
できる他のポリペプチドは、神経性疼痛、痛覚過敏症、及び類似症状を制御および軽減す
るのに使用することができる。
７．中枢神経系の特定ポリペプチドの欠乏に起因するリソソーム蓄積症は、中枢神経系
内にそのポリペプチドを送達する事によって治療できる。
８．ウイルス、プリオン、または細菌による中枢神経系の感染は、感染の伝播を制御ま
たは低減するものを中枢神経系に送達することによって治療できる。例えば、受容体に結
合してウイルス結合を阻害するポリペプチドの送達は、中枢神経系内のHIVなどのウイル
スの伝播を減らせることができる。
９．中枢神経系内の抗原に組換え抗体を送達することによって、有益または有用な方法
で生理学的な過程を制御することができる。例えば、No-Goのような神経突起抑制分子が
結合したミエリンへの組換え抗体の送達は、脊髄傷害および他の外傷性傷害の後に、中枢
神経系神経の再成長および再生を可能する。
標的の中枢神経系神経細胞またはグリア細胞
用語「標的細胞」は、（i）中枢神経系の一部であり、BBB内に完全に位置し；そして（
ii）本方法及び本ベクターによってBBBにより保護された頭脳または脊髄組織に送達され
た外因性のポリペプチドと接触する、または接触するように意図した神経細胞又はグリア
細胞を指す。
この用語は意図的にBBBをまたぐ神経細胞を除外する。しかし、そのような神経細胞は
、接触およびトランスフェクトするのに使用される遺伝子ベクターの「一次」又は「開始
」標的であり、そのような用語によって参照される。本発明の全過程では、複数過程方法
において、その後に、BBB により保護された中枢神経系組織内へのベクターコードポリペ
プチドの送達に続く限りにおいて、BBB をまたぐ「開始標的」のトランスフェクションは
価値があり、有用である。従って、本発明の真の「標的」はBBB内に完全に位置し、BBBに
より保護された神経細胞またはグリア細胞であり、送達機構で使用されるBBBをまたぐ神
経細胞は、真の標的細胞というよりもむしろ経路及び通路とみなされるべきである。
本明細書では「グリア」細胞が参照される。BBBにより保護された頭脳および脊髄組織
内の細胞は、神経細胞およびグリア細胞（いくつかの医学テキストでは「ニューログリア
細胞」 とも呼ばれる）と言われる２つの部門に分けられるためである。定義により、用
語「神経細胞」は神経信号を受け取り、送信できる細胞に限られる。用語「グリア細胞」
はより広い意味があり、神経信号を受け取り、送信することができない全ての種類の中枢
神経系細胞を含んでいる。これらのグリア細胞は、中枢神経系内で、支持機能、ハウスキ
ーピング機能、および「養育」機能とみなすことができる様々な活動を実施す。これは神
経細胞が、必要な機能を実行するために役立つ。「グリア」とは「グルー（接着剤）」と
同じ根単語に由来する。グリア細胞は中枢神経系細胞同士を付着させる「グルー」として
当初考えられた。グリア細胞は様々な分類に分けられ、オリゴデンドログリア細胞、アス
トロサイト、上衣細胞、およびミクログリア細胞を含む。これらは中枢神経系の重要な部
分であり、神経学のほぼあらゆる教科書に記載される。
いくつかの理由のため、本発明の初期の研究は、グリア細胞よりも神経細胞に接触して
、それを調節する外因性ポリペプチドの使用に集中する。その傾向を生む一つの大きな理
由は、まずグリア細胞に関わり、次に二次効果としてのみ神経細胞に影響する反応及び効
果と比べて、直接神経細胞が関与する中枢神経系の反応を確認し、定量化することは大い
に簡単であるからである。
従って、研究者によってはBBB内に完全に位置する「標的」神経細胞に焦点を合わせ本
発明を評価することを好むが、次が認識されるべきである：(1)本発明の方法およびベク
ターは、外因性ポリペプチドをグリア細胞に接触させ、それを処置することによって、中
枢神経系組織を処置する方法を提供する為にも有用となりうること；および(2)グリア細
胞が関与する特定の症状は、ある種のグリア細胞癌（例えばグリア芽細胞腫および星細胞
腫）の治療法、及び外傷性傷害、低酸素症、虚血症のような侵襲に対するグリア細胞の反
応を制御する方法などの、比較的初期の研究および評価において有利であること。
用語「標的」が意味するように、BBB内に完全に位置する神経細胞又は細胞全てが、必
ずしも本発明を使用して送達されたポリペプチドに接触する必要はない。遺伝子ベクター
によってBBB をまたぐ神経細胞（又は神経細胞塊）をトランスフェクトする場合、BBB内
に完全に位置する神経細胞又はグリア細胞は：(i)トランスフェクトされた神経細胞の、B
BB内に位置するシナプスまたは他の末端の近傍に位置するか；又は(ii)トランスフェクト
された神経細胞の、BBB内に位置するシナプスまたは他の末端の近傍に位置する細胞突起
または細胞伸張(例えば樹状突起、軸索、または末端）を有する。「トランス神経細胞性
」ベクターを使用する場合（すなわち、遺伝子ベクター自体が、BBB をまたぐ「一次」神
経細胞を通して、BBB内に位置する二次または三次神経細胞へ移動し、そこでそれらの細
胞をトランスフェクトして、コードポリペプチドを発現する場合）、「標的」神経細胞又
はグリア細胞は、ベクターに含まれる外来遺伝子によりコードされたポリペプチドを発現
して分泌するトランスフェクトされた二次または三次神経細胞の近辺に位置してもよい。
頭脳内の一つ以上の神経細胞がどうやってBBB内の「標的」神経細胞になることができ
るかの例として、前脳基底核コリン作動性神経細胞、セロトニン作動性縫線神経細胞、及
びノルアドレナリン作動性青班神経細胞は、BBB をまたぐ嗅受容体神経細胞に直接にシナ
プス接続していない。それにもかかわらず、嗅神経細胞が、本遺伝子ベクターによってト
ランスフェクトされれば、これらのBBB内のコリン作動性、セロトニン作動性、ノルアド
レナリン作動性神経細胞は、標的神経細胞となることができる。なぜなら、それらは、ト
ランスフェクトされた嗅受容体神経細胞によって分泌されたポリペプチドを取り込むこと
ができるからである。このことは、BBB 内のコリン作動性、セロトニン作動性、ノルアド
レナリン作動性神経細胞が、ウイルス感染した嗅受容体神経細胞から放出される狂犬病ウ
イルスまたは単純ヘルペスウイルスによって感染するという事実から証明された(Lafay e
t al 1991, Barnett et al 1993)。
もし中枢神経系の神経細胞またはグリア細胞が、BBB内で、BBB をまたぐ細胞の中枢投
射の隣りに、又はその極近傍に位置すれば、それらを、外因性ポリペプチドによる接触及
び治療の「標的」にすることができる。この原理は、トランスフェクトされた細胞と標的
細胞との解剖学的関係に間する最新情報から支持されれば、最も有利に利用することがで
きる。この種の解剖学的知識は、ウイルス又は他の「トランス神経細胞性の標識分子」を
使用した技術文献内で見つけることができる。例えば、トランス神経細胞ウイルスを実験
動物のBBB をまたぐ神経細胞に投与した後、中枢神経系の神経細胞またはグリア細胞の特
定な種類が、そのウイルスにより感染されたならば、その後に感染された中枢神経系神経
細胞又はグリア細胞の種類は、本発明の目的のために標的神経細胞又は標的グリア細胞と
して使用できる。このような神経地図作製は様々な研究者によってある程度に既に遂行さ
れており、Loewy 1998及びNorgren et al 1998などの文献に記載されている。さらに、こ
のような研究は現在も続けられ、神経回路の情報をより多く提供し続けている。本発明を
実行する者は、その新しい情報を考慮することができる。
感覚又は運動神経細胞の末梢投射に遺伝子ベクターを接触させる好ましい方法は、標的
の末梢投射の構造と位置に左右される。例えば、嗅受容体感覚神経細胞への投与は、鼻へ
の点滴注入によって、例えば、鼻スプレーまたは鼻洞内に置くことができる液体充填材を
用いて、一定期間（例えば30〜90分間）、嗅投射を含む鼻表面に直接に接触させる。
必要であれば、遺伝子ベクターと嗅神経細胞投射との間の直接かつ持続的維持な接触は
、次の過程により更に促進される：(i)鼻用鬱血除去薬を使用して、鼻洞表面を覆う粘液
を最小にすること；(ii)希イソプロピルアルコール、アセトンのような洗浄剤または類似
薬剤を使用して、接触表面を洗浄し準備すること；及び/又は(iii)耳鼻科医によって一般
に患者の再発性鼻洞感染の治療に使われる機械的摩擦方法を使用すること。一般的に、中
程度の炎症に至った表面の神経投射は、静止または休息状態の細胞よりも、細胞内への外
来分子の取り込みの感受性が高くなりがちである。また更に、「電気穿孔法」という試験
管内細胞トランスフェクション法のようにして、鼻腔表面を電荷又は電場を与えて、遺伝
子ベクターの侵入を促進することも可能であろう。必要があれば、これらの方法のうちの
いずれかまたは全ては、全身麻酔又は局所麻酔下に遂行できる。
必要であれば、神経への接触および取り込みは、「粘液被着剤」と呼ばれる化合物によ
って更に促進され、高めることができる。このような化合物は、鼻スプレーなどの膜透過
的方法で血流内に様々な薬剤をより多量に送達するために開発された。粘液被着剤の例は
、キトサン(Janes et al 2001)及び様々な多糖類コロイド(Schipper et al 1999)である
。粘液被着剤の詳細につき、Rillosi et al 1995及びLim 2000も参照されたい。
侵害受容性神経細胞の一部である投射への投与は、皮膚及び皮下注入を介して、様々な
調節皮膚剥削術を用いて、そして十分な浸透を達成することができれば局所適用によって
も行われる（皮膚浸透はジメチルスルフォキシドのような薬剤によって必要であれば促進
することができる）。運動神経細胞投射をアクセス経路として使用する場合、通常皮下ま
たは筋肉内注入により投与する。例えば、舌下神経核の下位運動神経細胞の一部である投
射は、舌の筋肉に遺伝子ベクターを注入することによってアクセス可能である。場合によ
り、遺伝子ベクターを静脈内に投与する（特に特定神経を指向する成分を含む場合）。但
し、一般的には、遺伝子ベクターの投与は、所望の標的部位に高濃度のベクターを確立し
維持する筋肉内注射又は類似の注射によることが望ましい。
このことは、この方法（特定神経細胞への標的トランスフェクション）と、脳脊髄液へ
の注入による遺伝子、ポリペプチドまたは他の化合物の送達との間の重要な相違を指摘す
る。脳脊髄液体系への物理的な送達（頭脳室または脊髄のくも膜下腔内へのカテーテルに
よる注入）では、神経作用剤は、中枢神経系の多数な及び多種類な細胞に分配される。対
照的に、本発明では、BBBを またぐトランスフェクトされた神経細胞に密接する（又はシ
ナプス接続する）限られた数の細胞または神経突起に、望ましい治療ポリペプチドを、い
かに標的的に送達することができるか、または制御下に優先的に送達することができるか
を記載する。
必要ならば、ヒト以外のほ乳類の頭脳及び脊髄に、さらにハ虫類や鳥などの血液脳関門
がある他類の動物に、ポリペプチドを導入するために、ここに開示する方法及び遺伝子ベ
クターを用いることができると考えられる。そのため、本発明は、家畜、ペット、および
他の動物の成長速度及び／又は生殖状態を制御調節する為に有用となろう。この目的及び
他の目的では、下垂体腺からの強力なホルモンの分泌を調節するために、嗅受容体神経細
胞を通して視床下部放出因子を送達できる。例えば、動物の成長速度を加速させるために
、成長ホルモン分泌を刺激するようにGHRHを送達する。また可逆的避妊などの避妊を達成
または促進するために、LH及び/又はFSHの正常分泌を抑制するように、過最大投与量のGn
RH を継続的に送達しうる。ここに開示する方法を、他の哺乳類、または鳥類やハ虫類の
ような他類の動物に用いる場合、次の主な変更が必要である：(i)選択した種類の動物に
おいて、BBBをまたぐ神経細胞の投射をトランスフェクトする為に十分に適する遺伝子ベ
クターの選択と使用、また(ii)特定種類の動物において望ましい活性を示すポリペプチド
の選択と使用。
上記及びその他の潜在的な適用を軽視するのではないが、遺伝子ベクターに関する残り
の説明は、本発明の方法および手順を証明するための動物実験、及び医学目的のヒト治療
にのみ関する。
ウイルスベクター
種々の哺乳類ウイルスベクターを記載する論文は、Karpati et al 1996およびKaplitt
and Makimura 1997を含む。神経細胞のトランスフェクションに、少なくとも４種類のウ
イルスベクターが使用された。それらのウイルスは次の通りである。
A.アデノウイルス
これらは、頻繁に様々な腺組織に見つかる二重鎖DNAウイルスである。野生型ウイルス
は呼吸器感染、結膜炎、および他の様々な障害を起こす。複製ができない様に（ただし特
種な細胞および／または実験室条件の培養基を除く）遺伝的改変されたアデノウィルスは
、ヒト遺伝子治療などのほ乳類の生体内研究に使用されるウイルスベクターの主要な種類
となった。アデノウィルスベクターは、Smith and Romero 1999で論説されるように、種
々の神経細胞のトランスフェクションに使用された。
B.アデノ随伴ウイルス（ディペンドウイルス、アデノサテライトウイルス）
これらは、複製にアデノウィルスが必要な単一鎖DNA ウイルスである。アデノ随伴ウイ
ルスベクターを調製する方法はRobbins(編集)1997年のBartlett and Samulskiによる章に
記載されている。
C.単純ヘルペスウイルス（HSV）
これらは、脂質外被によって囲まれるキャプシドを持つ二重鎖DNAウイルスである。神
経細胞をトランスフェクトするための遺伝子改変されたHSVベクターの使用がStaecher et
al 1998に解説されている。
D.レンチウイルスを含むレトロウイルス
これらのウイルスは、DNAではなくRNA を含んでいる。マウスの下位運動神経細胞にGDN
F遺伝子を送達し発現するレンチウイルスベクターの使用がHottinger et al 2000に記載
されている。
この4 つの分類のウイルスは、細胞をトランスフェクトして、しかし標的細胞に侵入し
た後も非病原性である（通常複製に必要な蛋白質をコードする一つ以上の遺伝子の削除ま
たは欠陥のため）ウイルスベクターの作製において、現在最も研究され、そして関心を集
めている。
但し、既知の他の分類の向神経性ウイルス（例えばウイルス性脳炎を引き起こす種々の
ウイルス、例えばRNAウイルス）は、神経細胞を選択的（または少なくとも優先的）にト
ランスフェクトできるベクターの有望な候補を提供する。上記分類ウイルスのいずれかは
、他のウイルスのベクターを非病原性にするのに使用された方法と同等の遺伝子処理によ
って、安全及び非病原性にすることができれば、本使用のために十分に適する。
あるいは、もしくはその上、遺伝子工学技術を使用して、神経細胞への親和性が強くな
い種々のウイルスベクターに、嗅神経細胞、運動神経細胞、又は他の種類のBBBをまたぐ
神経細胞の投射の表面蛋白質に優先的に結合する選択した及び／又は改変した表面蛋白質
（キメラ表面蛋白質を含む）を与えることができる。神経細胞結合親和性が高められた改
変ウイルス表面蛋白質が適切に開発され使用されるならば、ここに開示されるように使用
された場合に、ウイルスベクターの速度、効力、および他の利点を高めることができる。
非ウイルスベクター
背景技術にて簡潔に要約したように、また様々な下記実施例や多数の出版論文に詳しく
記載されるように、複数の種類の非ウイルス遺伝子ベクターが周知であり、本使用に関し
て評価される。神経投射をトランスフェクトできる非ウイルスベクター分類の主要な候補
は次を含む；(1)陽イオン性物質、例えば陽イオン性リポソーム、及び(2)エンドサイトー
シス受容体に結合するポリペプチドリガンドを含む蛋白質・DNA複合体。
神経細胞のエンドサイトーシス受容体に結合できるリガンドに関して、本出願人によっ
て、BBB外にある神経線維の表面のエンドサイトーシス受容体に結合できるリガンドを同
定および単離する為に非常に有用かつ非常に強力な生体内スクリーニング方法が開発され
た。簡潔に説明すると、この新規な生体内スクリーニング方法は次の過程を使用する：
(1)生きている動物体内で、候補リガンドが直接神経線維と接触できる第１の部位（例
えばラット脚の坐骨神経束）に多数の候補リガンドを投与する；
(2)エンドサイトーシス取り込み及び逆行性輸送を活性化および促進する特定リガンド
が神経線維内に取り込まれるために十分な時間を与える；
(3)神経線維に取り込まれなかった、または逆行性輸送で送達されなかったリガンド候
補を回収することを避けるために、リガンド投与部位から十分に遠い位置で、神経線維の
一部を収集する；そして
(4)リガンドを複製して、さらに処理するため、収集された神経線維の部分からリガン
ドを取り出す。
この新規な生体内スクリーニング方法は、任意の特定のエンドサイトーシス受容体また
は他のエンドサイトーシス促進性表面分子に特異的に結合できる改善された非ウイルスベ
クター(および標的ウイルスベクター)を開発する為の強力な手段を提供する。従って、そ
れは本発明の好適な実施態様を提供するので、以下の個別の章に、そして種々の実施例に
詳しく記載される。
非ウイルスベクターを用いて所望の結果を達成する可能性を高める為に多数の方法およ
び技術が専門家に知られている。一例として、神経細胞を標的とする非ウイルスベクター
は、黒質線条体及び中脳辺縁系のドーパミン作動性神経細胞に対して標的指向的にプラス
ミドを送達するためにニューロテンシンを使用できることが報告される(Martinez-Fong e
t al 1999)。他の様々な例は次項で考察される。
一般には、陽イオン性又はエンドサイトーシス性の送達機構に使用するために作製され
たプラスミドベクターは次の両方を含む：(i)大腸菌などの宿主細胞でプラスミドの複製
を可能にする配列、及び(ii)標的細胞で治療ポリペプチド遺伝子の発現を可能にする配列
。複製のために、ベクターは、通常、複製開始点及び形質転換細胞の簡単な選択を可能に
するマーカー遺伝子を含む。例えば、大腸菌での複製のために、プラスミドpBR322 (Boli
var et al 1977)はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従ってそれら
の抗生物質の使用により形質転換細胞の急速かつ簡単な同定が可能になる。
標的細胞内で治療ポリペプチドの遺伝子発現を可能にする配列は、通常、複製開始点（
必要な場合）、発現遺伝子前のプロモーター、必要なリボゾーム結合部位及び/又はRNAス
プライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含んでいる。
遺伝子及びベクター構成体；発現、輸送及び分泌促進因子
様々な周知の遺伝子工学技術およびDNA配列又はポリペプチド配列を用いて、次のこと
を改良し、増加することができる：(i)この方法が、首尾よく特定動物または患者におい
て希望及び意図した結果を、認識可能なレベルで達成する可能性；(ii)治療した動物また
は患者において処置の効力、効果、持続期間、または他の望ましい点；および(iii)治療
の状態、進行および結果、並びに外因性遺伝子及び／又はポリペプチドの位置および濃度
を追跡し、監視する研究者及び医者の活動。
この項は、そのような周知技術および配列の様々な例と共に、それらを本発明の方法と
ベクターにどう適用するかを簡潔に記載する。この説明例の一覧は完全なものでも排他的
なものでもなく、本使用のために他の様々な遺伝子工学技術、試薬、遺伝子及びペプチド
配列及び断片を使用できる事を専門家は認識するだろう。
さらにここに開示した技術や配列を様々な方法で互いに組み合わせうることは当業者に
は明白である。一例として、BBBをまたぐ神経細胞において成熟形ニューロトローフィン
をコードする遺伝子を発現するために、次の２つを含むポリペプチドをコードする遺伝子
構成体を開発することができる：(i)成熟形ニューロトローフィンをコードする配列のＮ
末端のプレプロBDNF リーダー配列、および(ii)成熟形ニューロトローフィンをコードす
る配列の他の位置に置かれる「エピトープタグ」。同様に、現在周知である、または将来
発見される他の付加的な遺伝子工学技術または配列が本使用のために適応できる。
遺伝子ベクターに含まれる運送物ポリペプチドの発現を高める為の技術の一例として、
ポリペプチドのコード配列を強力な「遺伝子プロモーター」の制御下に置くことができ、
それによってコード配列を含んでいるmRNA鎖の転写を大いに促進する。ヒト細胞(ヒト神
経細胞を含む)で強いプロモーターとして機能する様々なプロモーター配列が知られ、そ
れは例として次を含む；サイトメガロウイルスの(CMV)プロモーター、ロウス肉腫ウイル
ス(RSV)の末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、およびシミアンウイルス40(SV-40)の「早
期」プロモーターなどの、種々の病原性ウイルスに由来するプロモーター配列。
あるいは、場合により、ある条件下またはある化合物の存在下でしか活性でない、いわ
ゆる「誘発性」プロモーターの制御下に一つ以上の遺伝子(例えば、標識ポリペプチドを
コードする遺伝子など)を置くことが望まれる。
また通常「組織特異的」プロモーターと言われる遺伝子プロモーターも注目されている
。これらの種類のプロモーターは、特定の種類の組織または細胞においてのみポリペプチ
ドコード配列を効率的にmRNAに発現する。組織特異的プロモーターを含んでいる遺伝子構
成体が間違った細胞または組織に送達されても、それらの「意図してない」細胞には通常
その組織特異的プロモーターを認識できる転写因子または酵素が無いので、遺伝子構成体
はそれらの「意図されない」細胞には発現されない(または低い率でしか発現されない)。
従って、組織特異的プロモーターは、ここに記載される評価のために非常に有用な候補と
なる。
遺伝子組み換え動物研究の報告によると、いくつかの組織特異的プロモーターは既に同
定され公開されており、ほかの遺伝子組み換え動物研究が報告されると共に、さらにその
数は増えている。以下のリストは、完全なものでも排他的なものでもなく、本発明に有用
であろう組織特異的プロモーターの複数の例を含む。
(i)他の種類の神経細胞より嗅受容体神経細胞で大いに高活性である組織特異的プロモ
ーターとして、Servenius et al 1994に記載されている嗅マーカー蛋白質プロモーター、
およびQasba and Reed 1998に記載されているM4嗅受容体蛋白質プロモーターがある。
(ii)交感神経細胞より侵害受容性感覚神経細胞で大いに高活性であるWatson et al 199
5に記載されている組織特異的プロモーター。最小「カルシトニン遺伝子関連ペプチド」(
CGRP)を発現するこの遺伝子は、神経成長因子(NGF)が存在すると大いに高活性になるので
、化合物誘発性遺伝子プロモーターを提供しうる。従って、CGRP遺伝子プロモーターを使
用すると、交感神経細胞での遺伝子発現を最小に制限でき、望ましくない副作用を最小に
制限できる。侵害受容性感覚神経細胞及び交感神経細胞は受容体仲介性エンドサイトーシ
スによりNGFを取り込むことが知られているため、この種類の遺伝子プロモーターは特に
有用となりうる。侵害受容性及び交感神経細胞種類両方が多分トランスフェクトされるの
で、アクセス可能な神経細胞に標的指向的に遺伝子を送達するために、NGF受容体仲介性
エンドサイトーシスを利用する非ウイルスベクターを末梢投与する場合、CGRPプロモータ
ーなどの遺伝子プロモーターによってトランスフェクトされた交感神経細胞内で実質的に
は発現しない遺伝子構成体は、非常に有効となりうる。
(iii) Bechade et al 1994、Rajendra et al 1997およびZafra et al 1997などの論文
に記載されている、侵害受容性神経細胞または他の感覚神経細胞より脊髄運動神経細胞で
大いに高活性であり、グリシン受容体のアルファ1サブユニットの発現を促進する組織特
異的プロモーター。
一般に、遺伝子組み換え動物系において、導入遺伝子構成体が、所定の遺伝子発現を特
定の分類のニューロンに制限することが示された場合に、適切に調製した遺伝子構成体(
同じプロモーターおよび関連遺伝子発現要素を含んでいる)をウイルスまたは非ウイルス
ベクターによりインビボに送達すると、同じパターンの遺伝子発現制限を期待することが
できる。従って、遺伝子発現構成体を設計する場合、遺伝子組み換え動物の技術(例:Caus
ing and Miller 2000)を参照するべきである。
関連した類似方法では、また更に様々な方法で外来遺伝子の発現を刺激、抑制または制
御する天然または合成プロモーター及び/又は促進因子を使用することも可能で好適であ
ろう。例えば、通常は沈黙であるが神経損傷後に活性化される遺伝子プロモーター（Funa
koshi et al 1998参照）の使用によって、他の神経細胞に実質的に影響することなく、損
傷した神経細胞で外来遺伝子発現を確立するか、または大幅に高めることが可能である。
あるいは、ストレス反応の結果としてグルココルチコイド副腎ストレスステロイド量が高
くなる場合(例：Ozawa et al 2000)、グルココルチコイド応答性プロモーターが神経損傷
後の遺伝子発現を促進するのに使用されうる。あるいは、単純ヘルペスウイルス(Lachman
n et al 1997)に由来する潜伏関連転写プロモーターは、他の様々なプロモーターよりも
更に長い期間、遺伝子発現を促進しうる。
蛋白質発現を高める技術の別例として、トランスフェクト用遺伝子を作製するために、
しばしば一つ以上「非好適」コドンを削除し「好適」コドンに取り替える。その非好適コ
ドンと好適コドンの区別は、ほとんどの種（およびある種内の多くの異なる細胞型）が、
(i)リボゾーム内の翻訳系を遅れず迅速に通過する好適コドンと、(ii)リボゾーム内で翻
訳過程を遅らせる非好適コドンとの両方を含んで進化したという事実に由来する。好適、
非好適コドンのこの方式は、単一細胞内で正しいバランス量の多数の異なる蛋白質がすべ
て適した濃度で存在できるようにするように、遺伝子発現制御に非常に有用な細胞機構を
提供する。但し、遺伝子工学では、非好適コドンを除き、好適コドンと取り替えることに
よって、遺伝子ベクターは正常な制御機構を迂回することができ、外来蛋白質の通常以上
に高い生産を促進する。この種類の方法は米国特許5,795,737 (Seed et al 1998)及びそ
こに引用される様々な論文などの多数の研究報告に記載されている。
別の周知の遺伝子工学技術は「システイン枯渇」ポリペプチド変異体を含む。周知のよ
うに、ポリペプチド鎖のシステイン残基(高反応性であるスルフヒドリルグループ-SHが付
いているアミノ酸)は他のシステイン残基と反応しがちである。二つのシステイン残基が
互いに反応すると、二硫化物結合を形成する。二硫化物結合は、細胞内でポリペプチドが
合成され「翻訳後加工」 にて適切な三次元構造に折り畳まれることを保障するために非
常に重要である。但し、蛋白質を作製するのに遺伝子工学が使用されるとき、二硫化物結
合に関与しないシステイン残基は問題を発生させ、望ましい結果を妨害するかもしれない
。そのような問題は、ポリペプチド配列のある位置の一つ以上のシステイン残基を、他の
残基と取り替えることによって大抵避けられ克服できる。これは、ある遺伝子の特定位置
のシステイン残基を指定するコドンを、他のシステイン以外のアミノ酸残基を指定するコ
ドンと取り替えることによってできる。これらの種類のシステイン枯渇「変異蛋白質」は
米国特許4,737,462などの様々な特許に記載されている。
また、遺伝子工学技術を利用して「リーダー配列」及び/又は「シグナル配列」を、本
遺伝子ベクターによってコードされる外来ポリペプチドに加えることができる。用語「リ
ーダー配列」は必ずしも一貫してまたは正確には使用されないが、一般に次の特性の一方
もしくは両方を有するポリペプチド配列を示す：(i)通常輸送または分泌を受けない外来
ポリペプチドにリーダー配列を加えたときに示されるように、細胞内の特定位置にリーダ
ー＋ポリペプチド分子を輸送する、またはその過程を促進させる、又は宿主細胞によって
リーダー＋ポリペプチド分子の分泌を引き起こすこと；及び/又は、(ii)より短い最終的(
成熟形)ポリペプチドから自然な「翻訳後加工」によって切り離される初期ポリペプチド
の一部であること。ほぼすべての場合は、リーダー配列はポリペプチドのN末端に位置し
、最初に作製される末端であり（しばしば「頭部」とも呼ばれる）、ポリペプチドの作製
と同時にリボゾームから最初に現れる。
同様に、用語「シグナル配列」は必ずしも一貫してまたは正確には使用されていない。
一般に、それは、通常その結果または過程に至らない他のペプチド配列に、その結果また
は過程を与える配列によって示されるように、特定の結果、効果または過程を導くポリペ
プチド配列を指す。例として、シグナル配列は下記を誘導する：(i) ポリペプチドを小胞
または他のコンパートメントへ封入、貯留、または他の処理によって「封緘」すること；
(ii)細胞の特定の部分または領域へのポリペプチドの輸送；又は(iii) 宿主細胞によるポ
リペプチドの分泌。従って、「シグナル配列」は「リーダー配列」より広く使用され、そ
して一般にリーダー配列を含んでいる。さらに、ポリペプチドの成熟した最終的な形を作
製するために、シグナル配列が初期ポリペプチドから切り離される必要はない。シグナル
配列は頻繁に成熟形ポリプチドに保たれる。
本発明に非常に有用である2 つの過程の一方または両方を高めると信じられる様々な神
経性リーダー及び/又はシグナル配列が周知である。それらの2 つの過程は次のとおりで
ある：(i)合成された細胞内に存在するポリペプチドを、神経細胞の主体から「中枢系投
射」を通過し、血液脳関門を通過し、及び/又は頭脳の望ましい標的領域の近辺へ送達す
るポリペプチドの順行性輸送; 及び/又は、(ii) 神経細胞による、神経細胞のシナプス末
端または他の末端からの分泌。
様々な状況で非常に有用となりうるそのような種類のリーダー配列の一つは、「プリプ
ロBDNF」と呼ばれる初期ポリペプチドに存在するリーダー配列である。BDNFは脳由来神経
栄養因子の略称である。BDNFは神経成長因子(NGF)の相同体であるが、NGFとは違いプリプ
ロBDNFは侵害受容性神経細胞によって効率的に順行輸送されることが既知である。それは
動物実験によって確認され、侵害受容性神経細胞内で発現されたそのBDNFは後に脊髄組織
で検出されることが示されている。より短い最終形(または「成熟形」)BDNFは、より長い
初期ポリペプチドからリーダー配列が切断されて作製される。BDNFポリペプチドおよびプ
リプロBDNFリーダー配列はConner et al 1998、Altar et al 1999及びTonra 1999を含む
いくつかの出版論文に記載されている。BDNFポリペプチドおよびプリプロBDNFリーダー配
列を分析する専門家ならだれでも、このリーダー配列、および神経細胞内の順行性輸送及
び/又は分泌を実行または促進すると知られている他のどのペプチドリーダー配列も、本
発明の成功率そして効率の増加に非常に有用であることを認識するであろう。
エピトープタグ配列
接頭辞の「エピ」は露出されたアクセス可能な表面を指す。例として、表皮（エピダー
ミス）は一番外の真皮(皮膚)表面であり、上皮（エピセリウム）は粘膜の露出表面である
。
同様に、用語「エピトープ」（抗原決定基）は、抗体によって強く結合される蛋白質の
表面露出された領域を指すのに使用される。抗体は、抗原蛋白質の表面全体を覆わず、そ
の代り、抗体の一部である局在した結合ドメインは、抗原の一部である局在した結合ドメ
インに結合する。これは、各ピースの一つ(一つだけの)縁に沿ってフィットする２枚のジ
グソーパズルピースと似ている。
極小ビーズに単クローン抗体を固定したカラムに抗原蛋白質の消化（切断）断片を通す
試験によって、特定株の単クローン抗体に関して、抗原蛋白質のエピトープ領域を同定す
ることは困難ではない。但し、異なった単クローン抗体は、抗原蛋白質の異なった表面に
結合するので、蛋白質には一般にいくつかの異なったエピトープ領域があり、どの領域が
エピトープであるかを定める共通要因は、その領域が蛋白質表面に露出され、抗体にとっ
てアクセスしやすいかどうかである。この理由のため、複雑な蛋白質の三次元構造を定め
る為に、研究者によって頻繁にエピトープ分析が使用されている。一般に、蛋白質のエピ
トープ部位として示されるアミノ酸配列は、蛋白質表面に露出された抗体にとってアクセ
スしやすいアミノ酸配列である。
遺伝子工学でのエピトープ「タグ」配列の使用は次の事実に基づく：既知エピトープ配
列と非常に高い選択性で結合する単クローン抗体を作製して同定することは比較的容易で
あること。いくつかのそのような単クローン抗体株（およびこれらが結合する高親和性の
対応抗原アミノ酸配列）が周知である。例として、c-myc及びインフルエンザウイルス由
来の赤血球凝集素蛋白質などのポリペプチドの既知アミノ酸配列と結合する単クローン抗
体株が含まれる。
細胞のポリペプチド発現はN(アミノ)末端に始まり、C(カルボキシ)末端で終わるので、
一般にC末端の、またはその近辺のアミノ酸区域が蛋白質表面に露出される確率が高い。
これは、最終的な三次元ポリペプチドを形成する折り畳み及び形成過程が、鎖の形成およ
び伸張と同時に起こるという事実に基づく。なぜなら、鎖の形成と同時に、鎖の特定位置
の様々なアミノ酸残基またはドメインは相互に引き付けるか反発し始めるからである。こ
の説明は非常に簡潔で、蛋白質の折り畳みの詳細を十分に説明しないが、鎖の最初の部分
は、ポリペプチドの「核」の形成としてリボゾームから現れ、残りの鎖は、普通は最初の
核を包むか、または別の方法で最初の核に加わることが想像できる。
この要因のため、ポリペプチド「尾部」(カルボキシ末端)またはその近辺にあるアミノ
酸配列は、ポリペプチド表面にエピトープ領域として露出されアクセスしやすい可能性が
比較的に高い。中央ドメインへのエピトープ領域の挿入がポリペプチドの重要な活性また
は特性を破壊または低下させるという危険性を下げるために、この要因を利用して、一般
的には、エピトープタグを含むように修飾しようとするポリペプチドの尾部(カルボキシ
末端)またはその近辺に、エピトープタグ配列を置くべきである。一般にこれは、エピト
ープタグを使用する初期実験では最もよい方法であり、必要に応じて、この方法を使用し
て得られた実験データを用いて次の研究を最適にすることができる。
または、もしくはその上、ポリペプチド分子の完全な三次元構造が既知であり、触媒活
性又は受容体結合に不可欠なポリペプチドの「活性」部位が既知であれば、ポリペプチド
分子の反対側の表面に、アクセスしやすいエピトープ領域を挿入することが可能である。
比較的簡単な試験管内スクリーニング試験により、そのように修飾された「タグ付き」
蛋白質がまだ好適な活性を有するか検査され、それらの最初の検査を通過したタグ付き蛋
白質は、生体内動物実験でさらに広範に検査される。
従って、ここに開示する遺伝子ベクター系では、特有な、または少なくとも非常に珍し
い、検出可能な「エピトープタグ配列」を、ほぼあらゆる種類の周知蛋白質(例えば神経
成長因子)に追加(または挿入)するように遺伝子構成体を作製することが可能である。周
知の遺伝子工学技術を使用し、遺伝子ベクターに含まれる遺伝子構成体のコード配列を変
更するのは簡単であり、それによって「天然」コード配列に比較的少数の付加的なコドン
を加え、または、天然コード配列中の少数のコドンを天然蛋白質に通常存在しない他のコ
ドンに置き換える。
ここに開示される様々な研究および治療では、エピトープタグを付加されたポリペプチ
ドを発現する遺伝子構成体を含む遺伝子ベクターは非常に有用であり、研究者及び医者が
、ここに開示される遺伝子療法の結果および効果を監視し測量することをより容易にさせ
ることができる(また場合によっては、それを可能にするのに必要とされる)。天然ポリペ
プチドの分析中に起こる問題の一例として、現在技術では天然の神経成長因子(NGF)は、
組織固定法によって分解される傾向にある。さらに、熟練研究者でもNGFは正確に測定し
にくく、ラット及びヒトのような広く異なる動物に見つかるNGFの近縁形にも、高い相同
性及び抗体交差反応性がある。従って、NGF（及び他の様々な神経活性ポリペプチド）の
エピトープタグ付加形を使用する事によって、 そのような困難を避け、または少なくと
も最小にすることができる。
エピトープタグ付加されたポリペプチドは、ヒト臨床治療よりは研究ではるかに頻繁に
広く使用されている。一般的に、エピトープタグ付加されたポリペプチドは、細胞培養実
験及び動物実験で、ある治療方法の効果及び効力の開発、最適化、及び証明をする為に使
用される。さらに、それらは時々米国の「治験薬」適用の下に、および類似の公式検討や
その他の認可の下に承認された小規模「第一相」又は「第二相」ヒト臨床試験で使用され
る。治療がより大きな複数の場所での第三相臨床試験で検証できるようになると、エピト
ープ配列を認識し攻撃する抗体による免疫反応を発生させる危険を減らすために、通常全
てのエピトープまたは他の「外因性」配列は除かれる。
ファージライブラリーおよびコンビナトリアル化学由来のエンドサイトーシスリガンドの
生体内同定
要旨に述べた通り、本出願人は、神経線維内に取り込まれて輸送されるエンドサイトー
シスリガンドを同定および単離するための新規な生体内スクリーニング方法を作製した。
この新規な方法は、本発明を実行する好適な態様であり、本明細書に詳述する通り、当業
者は、この方法を用いて、BBBにより保護されたCNS組織内にポリペプチドを送達するため
に用いることができる改良された遺伝子ベクターを作製することができる。
当該生体内スクリーニング方法および、このスクリーニング方法から得られるエンドサ
イトーシスリガンドを十分に理解するために、エンドサイトーシスリガンド受容体蛋白質
に関する背景情報が提供される必要がある。ほとんど全ての細胞表面受容体と同じく、エ
ンドサイトーシス受容体は細胞外側の膜にまたがっている。従って、これらは３つの異な
るドメインを有する：(i) 細胞を取り囲み接触している水性液により運ばれる分子に露出
し、アクセス可能である細胞外部分；(ii)細胞を取り囲む脂質二重膜に埋め込まれた内部
部分；および(iii)細胞内側の水性細胞質に露出された細胞内部分。
一般に、リガンド受容体は、他の種々の非リガンド受容体とは異なる２つの特性を有す
る。第一の特性は、特定種類のエンドサイトーシスリガンド受容体がそれぞれ、単一種の
細胞外分子（または、場合により、極少数の限られた構造上類似した細胞外分子）と相互
作用し、それにより誘発および活性化されることである。この結合機構は、「鍵と錠」の
関係に匹敵すると考えられる。ある正確かつ特定の大きさと形の少数の鍵だけがある錠に
適する。この特性から、リガンド受容体は、例えば、細胞の外側を浮遊している栄養素を
捕獲し、それらを細胞内部に運ぶ種々の輸送蛋白質から区別される。
第二の異なる特性は、リガンドとエンドサイトーシスリガンド受容体蛋白質とが結合す
る場合、この２つの分子はより長い期間互いに結合していることである。このことから、
リガンド受容体は、アセチルコリン、グルタミン酸、およびその他の古典的な神経伝達物
質により刺激される神経伝達物質受容体から区別される。（大部分の神経伝達物質受容体
で見られるように）ミリ秒単位で測定される代わりに、リガンド結合反応は通常、分や時
間単位で、または日にち単位でも測定される。
エンドサイトーシスリガンド結合反応では、リガンドがリガンド受容体に結合し、リガ
ンド−受容体複合体を形成し、これが細胞内に取り込まれ、そこで典型的にはリガンドお
よび受容体が共に最終的に消化され、それらの構成ブロックがリサイクルされる。これが
どのようにして起きるかを理解するために、動物の大きさ、健康、神経または生殖系、ま
たは他の特性や器官に永続的な変化を誘発するポリペプチドホルモン、例えば成長ホルモ
ン、神経成長因子などを考えるべきであろう。もしこのような種類のホルモンが受容体か
ら遊離されれば、細胞外液中に戻って浮遊し、次には他の細胞上の別の受容体に接触して
それを活性化し、その結果、制御されなかった、そして潜在的に調節されえない効果が生
じるだろう。
本明細書では、用語「エンドサイトーシス」および「取り込み」は互換的に用いられ、
細胞表面上の分子に特異的に結合した（通常は「親和的結合」という）細胞外分子（栄養
素や酸素以外）が細胞内に引き込まれるという細胞によるプロセスを指す。このプロセス
は、リガンドと受容体蛋白質との結合が関与する、受容体の仲介によるエンドサイトーシ
スを含む。またこれは、リガンドが他の種類の細胞表面分子（表面糖質を含む）に特異的
に結合し、他の種類のリガンド複合体を形成し、それが細胞内に取り込まれるというプロ
セスも含む。用語「エンドサイトーシス」および「取り込み」は、リガンド分子と細胞表
面分子が特異的に結合して複合体を形成し、それが次に細胞により取り込まれることに関
与するのであれば、飲作用（非常に小さな粒子や可溶性分子の摂取に関与する）および食
作用（ウイルス粒子や細菌細胞などの大きい粒子の摂取に関与する）というプロセスもま
た含む。
エンドサイトーシスに関連するプロセスはよく知られており、多くの文献、例えばAlbe
rts et al, Molecular Biology of the Cell（第3版、1994）のページ618-626（エンドサ
イトーシスの説明）、636-641（エンドサイトーシスを補助促進するクラスリン蛋白質お
よびトリスケリオン(triskelions)の説明）および731-734（リガンドが膜蛋白質に結合し
た場合の内部構造変化の説明）で検討されている。
ほとんどの種類の動物細胞では、一般的な直径が約10ミクロンすなわち1/100ミリメー
ターの範囲であるので、リガンド−受容体複合体のエンドサイトーシスは、非常に短い距
離間の脂質小胞輸送に関与する。
しかし、神経細胞のリガンド−受容体複合体は、はるかに長い距離を移動しうる。頭脳
および脊髄の多くの神経細胞は、複数センチメーター伸びる長い線維（例えば軸索、樹状
突起、「突起(processes)」）を有し、人間では手足から脊髄まで（またはその逆）神経
信号を運ぶいくつかの種類の神経細胞は１メーターを超える線維を有する。従って、この
ような長い線維内で起こるエンドサイトーシスにより、リガンド−受容体複合体は、いく
つかのリガンド−受容体複合体が最初に神経細胞内に入る所である神経線維の最先端から
、神経細胞の主要な細胞体まで、いかに長くても全ての行程を運ばれなければならない。
前述した通り、分子が、神経細胞の先端（または末端）から、核が存在する細胞の主体
まで軸索または樹状突起に沿って輸送される場合に、「逆行」輸送が起きる。その反対方
向の輸送は「順行」輸送と呼ばれる。さらに「軸索輸送」という用語も認識理解されるべ
きである。多くの種類の神経細胞は、その主細胞体から伸びる最長線維である単一の主線
維を有する。この最長の線維を通常軸索と呼ぶ。用語「軸索輸送」は、分子が移動する方
向とは関係なく（すなわち細胞体へ、または細胞体から）軸索内の分子輸送の任意の形態
を指し、また含む。従って、軸索内で起きる逆行輸送は軸索輸送の一種である。しかし、
本明細書では、移動方向も指摘するので「逆行輸送」という用語の方が好ましい。
エンドサイトーシスリガンド受容体に結合することができる候補リガンドの全てが、取
り込みプロセスを完全に活性化および誘導することができるのではない。一例として、既
知の受容体に実際に結合するモノクローナル抗体をかなり容易に作ることができるが、そ
のような抗体調製品が、受容体を介したエンドサイトーシスの全プロセスをうまく誘発し
て完了することができるという報告はわずかしかない。ラット神経細胞において受容体を
介したエンドサイトーシスのプロセスを誘導して完了することができると報告された抗体
の一例は、最初にIgG-192と命名され、次にMC192と呼ばれたモノクローナル抗体である（
Chandler and Shooter 1984）。この抗体MC192は、1980年代中頃に「低親和性神経成長因
子受容体」として知られ、続いてp75受容体と呼ばれたラット神経細胞受容体に特異的に
結合する。モノクローナル抗体MC192が作られた数年後、他の研究者により、それを放射
性標識してラットに注射したところ、それが取り込まれ、表面にp75受容体を発現した神
経細胞の細胞体に逆行輸送されると報告された（Yan et al 1988）。
この例から、リガンド−受容体エンドサイトーシスを誘導して完了することができる抗
体を理論的には開発することができることが示された。しかし、このような研究成果を人
間の医学に用いる前に、大きな障害が依然残っており、２つの重要な問題点が即座に生じ
る。
第一の問題点は、上記の事実を人間の医学にまで拡張する困難性に関する。明らかに、
抗原またはみ実証されていない抗体断片を人間に注射することは非常に問題であり、多く
の場合不適法である。さらに大事なことに、動物試験においてうまく機能する特定の抗体
が人間においてもうまく機能することを証明するために実行する必要があるスクリーニン
グ試験は、人間の研究において現在認められていない方法で行わないならば、非常に困難
であり、潜在的には不可能である。このような研究試験に直面する障害を真面目に考え始
めるならば（おそらく脊髄組織のサンプルを除去し、分析して、放射性標識されたトレー
サー分子が実際に脊髄に到達するかどうか決定する必要がある）、数日以内に死刑執行さ
れる判決を受けた殺人者、または数日以内に癌または他の末期症状により死亡するであろ
う人間に対して試験を行うことを考えざるをえない。しかし、組織を分析するために人間
の脊髄から固体組織を除去する試験は、現代医学を用いる産業国では認められていない。
第二の困難な問題点は、もし抗体断片自体が、所望のとおりエンドサイトーシス誘発剤
として機能するならば、「エンドサイトーシス受容体抗体断片」は、どのような種類の分
子を一緒に細胞内部に運ぶのかという問題に関する。明らかに、抗体断片は、何も結合さ
れず何も神経細胞内部に引っ張り込めないならば、治療上の価値はない。その代わり、そ
のような抗体断片は、単なる担体（または列車を引っ張る機関車）として見なされるしか
ない。それらは、ある種の「運送物」または「運搬物」分子を、入り込もうとする神経細
胞内に運び込み、または引っ張り込むことができないならば、有用ではない。
しかし、任意の付加的な分子断片をエンドサイトーシス抗体断片に結合すると、生成し
た複合体は必ず大きくなることが、最初から認識されなければならない。複合体の増大に
より、その大きさに応じて、複合体における抗体断片単独と同じ効率で細胞内に引き込ま
れる性質は実質的に低下しうる。このような抗体断片に関して必要とされる研究において
、初期の段階ではこのような問題に答える良い方法はない。その代わり、その輸送担体を
評価し、それ自体で機能することが証明されなければならず、その後に、その担体が「運
送物」または「運搬」成分を運ぶ（または引っ張る）という性質を試験する価値が生じる
。
従って、今日までに公開された報告によれば、エンドサイトーシス受容体に対して作ら
れた抗体のうち少数の組しか、受容体を介したエンドサイトーシスのプロセスを誘導して
完了するという天然リガンドの性質を模倣することができないので、まれに生じる取り込
み抗体を同定するためには、数十または数百のモノクローナル抗体候補をそれぞれ試験す
るので、上記の問題はさらに困難になり費用もかかるようになる。
さらに注意すべきことに、細胞培養条件を用いて候補エンドサイトーシスリガンドを評
価する生体外(in vitro)スクリーニング方法には２つの大きな問題がある。この２つの問
題は、癌細胞および自己免疫疾患に関与する血液細胞に関する研究分野において有効に一
定の進展を示した。
この２つの問題を理解するために、まず注意すべきことに、エンドサイトーシスを活性
化および誘導することができる稀な「干草の中の針である」リガンドを同定および単離す
るためには、候補リガンドの「ライブラリー」または「レパートリー」のほとんどの評価
は、通常、(i) ファージディスプレイライブラリーまたは(ii)「コンビナトリアル化学」
により作製された調製品のいずれかから始まる。ファージ（細菌細胞に感染することがで
きるウイルス）およびファージディスプレイライブラリーは、Koivunen et al 1999, Cab
illy 1999, Shusta et al 1999, Larocca et al 1999, 2001, 2002, Rader 2001およびMa
noutcharian et al 2002などの文献に記載されている。コンビナトリアル化学は、Lockho
ff et al 2002, Flynn et al 2002, Edwards et al 2002, Ramstrom et al 2002, Ley et
al 2002, Lepre et al 2002, Liu et al 2003, Edwards 2003およびGeysen et al 2003
などの文献に記載されている。
ファージディスプレイライブラリーを選別してエンドサイトーシスポリペプチドリガン
ドを同定するために、研究者が生体外細胞培養調製品を使用しようとした場合、２つの大
きな問題にぶつかる：(i) 細胞内に取り込まれることなく、複数の異なるファージが、通
常、細胞表面上の複数の異なる蛋白質やその他の分子に結合すること；および(ii)細胞を
殺して溶解することなく、あるいは細胞および／または取り込まれたファージのその他の
所望のプロセシングを妨害する重大な問題を生じることなく、細胞表面に接着していて、
かつ細胞内に取り込まれなかった任意および全てのファージをリンスし、洗浄し、または
確実に除去することが非常に難しいこと。このような２つの要因から、「偽陽性」の選択
を抑制することが非常に難しい。従って、ファージライブラリーからのエンドサイトーシ
スリガンドの生体外スクリーニングは、細胞培養液中で容易に増殖することができる癌細
胞または血液細胞を用いた研究においてのみ有意義な程度に成功を収めた。これに対して
、凝集性組織を形成する足場依存性の細胞が関与する細胞培養においては、ファージライ
ブラリーからのエンドサイトーシスリガンドの生体外スクリーニングは、実質的な程度に
は成功していない。
上に要約した問題点は、全ての細胞がクローン複製したものであり、全く同一受容体を
有する最も単純な組織培養系にも当てはまる。正常に生存している動物（そこでは、各々
自分自身の特定のセットとして受容体その他の表面分子を有する複数の異なる組織および
細胞が互いに密接に共存しており、そのような異なる組織領域および細胞の間を血液およ
びリンパ液が常時循環している）においてファージライブラリースクリーニング試験を簡
単に実行しようという考えは、ファージライブラリーのスクリーニング技術に精通してい
る技術者および最も簡単な細胞培養条件でさえもこれをうまく実行するのはかなり難しい
ことだと理解する技術者には見られない。
従って、癌および自己免疫疾患を遺伝的に形質転換して治療するために用いることがで
きる改良した遺伝子工学方法およびベクターを開発するために、ファージディスプレイラ
イブラリーを用いる場合、多くの研究が行われ、多くの成果が得られた。しかし、その他
の疾患を治療するために、あるいは身体の中で凝集性組織に存在する神経細胞やその他の
細胞の形質転換を実現する遺伝子ベクターを作るために、ファージディスプレイライブラ
リーを用いる場合には、ほとんど研究されず、ほんの微々たる限られた成果しか得られな
かった。従来技術の下では、正常な動物において生体内試験によりファージディスプレイ
ライブラリーから神経細胞およびその他の凝集性組織の細胞内にエンドサイトーシスを介
して取り込まれるものをスクリーニングする際に偽陽性を排除する試みおよびその困難性
は、非常に大変で厄介なので、この研究分野における実質的な進展は事実上抑制されてい
る。本発明前には、誰も、本発明の生体内スクリーニング方法により今や達成することが
できる結果のために、どのようにファージディスプレイライブラリーを使用するべきか理
解していなかった。
従って、以下において図１〜３を参照して、この新たに開発した生体内スクリーニング
方法を説明することができる。更なる情報は実施例22〜31にある。
好ましい態様では、この生体内スクリーニング方法は、ラットやマウスなどのげっ歯類
の坐骨神経を用いる。双方の種は安価であり、交配および生育しやすく、小型哺乳動物の
ほとんどの遺伝子研究において標準的な動物モデルとして用いられている。膨大な基礎情
報、種特異的バイオ分子（例えば遺伝子プロモーター配列、遺伝子コード配列、モノクロ
ーナル抗体など）および特別な動物家系が、マウスを用いた遺伝子研究のために開発され
てきた。これらの情報は、インターネットサイト、例えばwww.informatics.jax.orgおよ
びwww.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/MmHome.htmlから自由に得ることができる。ラット
遺伝学のための対応する情報、試薬および家系はいくらか少ないが、それでも膨大で、か
つ非常に有用であり、例えばhttp://rgd.mcw.edu, http://ratmap.gen.gu.seおよびwww.h
gsc.bcm.tmc.edu/projects/ratなどのインターネットサイトから得ることができる。
ラットは、マウスより大きいので、坐骨神経（動物の両側にあり、脊髄から腰および脚
を通って足先まで伸びる）の研究がやりやすい。これは、下記にしめすような周知の方法
により行うことができる。
しかし、マウスでも、坐骨神経は、本明細書に開示した方法により必要な手術操作がで
きるほど十分に長く、かつ十分に識別可能である（このような研究を依然にしたことのあ
る研究者が操作する場合には特に）。さらに、眼科外科医および神経外科医により一般に
用いられる双眼顕微鏡や手術道具を用いて、マウスにおける手術操作を行うことができる
。手術方法に関する追加の説明は実施例25にある。
また必要ならば、その他の種類の実験動物（霊長類、哺乳類以外の脊椎動物、またはあ
る種の無脊椎動物）について、この生体内スクリーニング方法に用いることができるかど
うかを評価することができる。特に、いくつかの動物は、格別に大きな神経軸索を有する
ことが知られている。一例として、ある種のイカは、推進力を生む筋肉を制御する「巨大
軸索」を有する。同様に、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞は、異常に大きい細
胞成分を有するので、研究所では広く用いられている。異常に大きい神経線維または神経
束を有するイカやその他の動物を、必要ならば、本明細書に開示した通りに用いることが
できる。
図１に模式的に示すように、候補リガンドを坐骨神経束に接触するように配置すること
ができる。このことを実施例25および26で詳細に説明する。簡単に述べると、誘導性受容
体（例えば低親和性p75神経成長因子受容体）を標的にする場合、最初の結紮1102を、坐
骨神経束1090の周りに配置して締め付ける。この結紮1102は、神経束の周りに縫合糸を巻
き、それから締め付けて縛ることによって作る。このようにして作った結紮は止血帯とし
て機能し、神経線維内の液体および分子の正常な流れを妨害する。
図１に示す通り、結紮1102は、坐骨神経束1090が、脚と足の異なる部分に作用する２つ
の主要な分枝に分かれる所である「脛骨神経二分岐」1092に隣接するように配置すること
ができる。結紮1102は、好ましくは脛骨神経二分岐1092の上流で、かつその極近くに配置
するべきである。背景のところで述べた通り、用語「上流」および「近位」は、動物の脊
髄により近い位置（図１の右側方向）を指す。反対に、用語「下流」および「遠位」は、
脊髄から離れて、より脚および足に近い位置（図１の左側方向）を指す。
結紮1102の目的は、坐骨神経束の表面に発現しているp75受容体の数を増やすことであ
る。p75受容体は、神経細胞にホルモン様効果を示すポリペプチドである神経栄養因子類
（神経成長因子類ともいう）と相互作用する。かなり早くに発見されて最も知られている
このような分子は神経成長因子と呼ばれた。さらにこのような分子が発見され、例えば、
脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン-3、ニューロトロフィン-4/5などと命名
された。神経栄養因子類は神経細胞を効果的に刺激して、通常、代謝活性の増加、他の神
経細胞とのシナプス接続の追加形成などを誘導する。運動神経細胞の神経線維が損傷また
は障害を受けた場合、その運動神経細胞が応答する方法の一つは、神経線維上のp75受容
体数を増やして、周囲の細胞外液に存在しうる任意の神経成長因子分子類を捕捉および結
合する機会を増やすことによる。神経線維表面上のある種の神経受容体を「上方制御(upr
egulating)」するという当該プロセスが見出され、この発生は、ある種の神経変性疾患、
特に筋萎縮性側索硬化症（ALS、ルー・ゲーリック病、および運動神経疾患ともいう）に
おいて認められた。また種々の外傷後にも発生する。
従って、結紮1102は、このような神経応答を利用するために設計されている。神経線維
の周りに縫合糸を巻いて締め付け、線維内の液体の流れを止めるように結紮を作ることに
より、脊髄と結紮部位との間の神経線維の全長に沿ってp75受容体を増加させることがで
きる。種々の検査、例えばp75受容体に結合するモノクローナル抗体を用いた染色検査に
基づき、p75受容体の増加は約10〜15倍と推定される。
このような神経線維による結紮に対する受容体発現応答は約１週間にわたって起きる。
従って、結紮1102を坐骨神経束の周囲に配置し締め付けた後、その傷を閉じて縫合し、次
の手術を行う前に、その動物に少なくとも数日間、好ましくは約１週間、回復時間を与え
るべきである。
第二の工程では、互いに約２〜３cm離して２つの異なる部位を外科的に開く。一つの部
位は、結紮1102を配置した部位に近接したところであり、実際、前と同じ部位を外科的に
開いてもよい。この部位で、メスまたははさみを用いて２つの端（直角、斜めなどでよい
）を生じるように坐骨神経束を切断する。これらの切断は、結紮1102の直ぐ上流と下流で
行われ、該結紮を含む神経束の小さな部分を切り出し、捨て去ることができる。これらの
切断により神経束に２つの端、遠位端1094（これはもはや活性でなくなる）および近位端
1130（脊髄方向側）が生じる。
坐骨神経束1090を切断した部位に一塊の物質1150を配置する。この塊1150は、多数のフ
ァージ粒子（好ましくは数百万または数十億の「コロニー形成単位(cfu)」）を含む多孔
性かつ透過性の物質（例えばコラーゲンゲル発泡体）から成る。この塊1150をこの位置に
、(i) 塊1150に含まれるファージ粒子と(ii)坐骨神経束1090の切断端1130とが持続的に密
接するように配置して固定するべきである。
このような配置と固定を、例えば下記の通りに行うことができる。
(a) 縫合糸1132を用いて、坐骨神経束1090の２つの切断端1094（遠位切断端）および1130
（近位切断端）を結びつける；および
(b) 塊1150の周り、および坐骨神経1090の２つの切断端1094および1130の周りにシリコー
ンゴムなどの防水材からできた小さなスリーブ(sleeve)またはカフ1136を巻きつけて固定
し、その塊および２つの神経端を小量の防水円筒内に包含する。必要ならば、スリーブ11
36を、その周りに１本以上の縫合糸を巻いて縛ることにより、スリーブの外側表面に接着
材の小滴またはビーズを配置することにより、あるいはその他の適当な手段により固定す
ることができる。
従って、ファージ粒子を含む物質塊を配置する当該部位を、ファージ配置部位またはフ
ァージ接触部位と称する。この部位は、ファージ粒子のライブラリーまたはレパートリー
が坐骨神経の切断端に接触する部位である。エンドサイトーシスを（例えば神経線維表面
のp75受容体を介して）誘発するポリペプチド配列を表面に出現させたファージ粒子は、
この部位で神経線維によって取り込まれる。
別個の部位で、好ましくはファージ配置部位から約１ｃｍ以上離れた部位で、第二の部
位を外科的に開き、第二の結紮1202（縫合糸の輪によって作る）を坐骨神経束の周りに配
置し、締め付けて縛る。ラット臀部は、坐骨神経線維の外側に接着したファージによって
起こる偽陽性の大きな危険を排除するのに十分にファージ配置部位から離れた都合の良い
位置であるので、当該部位は、好ましくは臀部領域にあるべきであり、本明細書ではそこ
を臀部結紮部位と呼ぶ。臀部結紮1202は、坐骨神経束1090の周りの狭窄または止血帯とし
て作用し、神経線維内でその閉塞点を超えて液体や分子が実質的に流れることを抑えるた
めに十分にきつくなければならない。従って、この結紮は、神経束の内側に、かつ臀部結
紮1202の下流側にファージ蓄積領域を形成する。
そのラットの傷を閉じて縫合し、適当な時間（例えば約18時間）放置することによって
、エンドサイトーシスのプロセスを効果的に活性化および誘導することができるリガンド
を保持しているファージ粒子が、神経線維内に入り、続いてかなりの長さの神経線維を脊
髄に向かって逆行輸送されるために十分な時間を与える。
この放置時間後に、ラットを苦痛なく殺し、臀部結紮部位を開き、その臀部結紮の直ぐ
下流の隣接する坐骨神経束の領域を取り出す（回収する）。次に、この短い神経線維束を
小片に分け、ファージ粒子を損傷させることなく細胞膜（脂質二重層から成る）を部分消
化する化学物質により処理する。この処理により、神経線維内に取り込まれた生きたファ
ージ粒子を回収および単離することができる。
上述した一連の生体内スクリーニングを行うことによって選択されたファージ粒子を、
所望の方法により増殖させ、および／または操作することができる。一例として、本明細
書に開示した生体内スクリーニング方法により選択したファージ群を用いて、下記方法の
いずれかまたは全てを行うことができる。
（１）ファージが「ファージミド」（ファージが単に細菌の複製起点を有することが必
要である）である場合、それをヘルパーファージなしに大腸菌を用いて増幅して、プラス
ミド形状の二重鎖DNAを作製することができる。様々な有用な技術、例えば所望量の環状
プラスミドDNAの合成など、が可能となるので、現代のファージディスプレイライブラリ
ーのほぼ全てがファージミドを使用している。
（２）選択したファージを、ヘルパーファージと共に大腸菌を用いて増幅して、ssDNA
を含有する新しい完全に感染性のファージ粒子を作製することができる。これらのファー
ジ粒子を、別の生体内スクリーニングサイクルにおいて開始材料として用いることができ
、（初期のサイクルにおいて）それを用いて、エンドサイトーシスファージの「濃縮群」
を、エンドサイトーシス誘導効率がさらにより高いリガンドを含むであろう「精鋭群」に
精製することができる。
（３）ファージ分析に適当であることが示唆されるまで十分な回数のスクリーニングサ
イクルを行った後（多くの場合、少なくとも１回から約３回までのスクリーニングサイク
ル後、いくつかの場合、おそらくより多くの回数後）、生体内スクリーニングの最終回に
より（実際には任意回の生体内スクリーニングにより）選択されたファージを用いて、下
記の一方または両方を作製することができる。(i) 特定のエンドサイトーシスリガンドを
コードする遺伝子の正確な配列を決定するためにヌクレオチド配列決定法を行うために、
所望量の二本鎖または一本鎖DNA；および／または(ii)特定コート蛋白質中のリガンドド
メインのアミノ酸配列を決定するために処理および配列決定法を行うために、エンドサイ
トーシスリガンドを有する所望量の可溶形状のコート蛋白質。
生体内スクリーニングの結果の写真確認
本明細書に開示した生体内スクリーニング方法の有効性および成功が、図２の写真によ
り視覚的に示される。この写真は、当該生体内選択方法の実際の試験において、蛍光試薬
を用いて撮られたもので、坐骨神経束内に取り込まれたファージの位置と濃度を示す（こ
の試験に用いたファージの調製と染色試薬は、下記実施例27に記載する）。図２の写真の
左側は、図１に示すファージ蓄積領域1204に相当する神経部分におけるかなり高濃度の蛍
光標識されたファージを示す。写真中央部の詰まった狭いゾーンは、腰部の結紮1202によ
り作られた。写真の右側は、腰部結紮に近い側の坐骨神経（すなわち脊髄方向のもの）を
示す。腰部結紮1202をぎりぎり通過して、坐骨神経のその部分に達することができたファ
ージはほとんどまたは全くないので、その部分に蛍光標識はほとんど示されない。
生体内スクリーニングとコンビナトリアルケミストリーの併用
エンドサイトーシスリガンドの生体内スクリーニングおよび同定のための、本明細書に
開示した一般的な方法は、「コンビナトリアル」化学合成によって作られた候補リガンド
分子と共に用いることができる。過去20年間にわたって、この方面の化学合成とスクリー
ニングが著しく活発になった。2003年4月における国立医学図書館のデータベース検索か
ら、この研究分野には900を超える総説記事が判明した。最近の総説には、Lockhoff et a
l 2002, Flynn et al 2002, Edwards et al 2002, Ramstrom et al 2002, Ley et al 200
2, Lepre et al 2002, Liu et al 2003, Edwards 2003およびGeysen et al 2003がある。
これらの総説に記載された合成方法および手法を用いて、幅広く、非常に多様なコンビナ
トリアルライブラリーを提供することができる。
このようなコンビナトリアルライブラリーの本質的な特徴の一つは、当該ライブラリー
を、少なくとも１種類以上のスクリーニング試験に適用する必要があることである。そう
でなければ、数十万、数百万の異なる候補の混合物は全く無価値であろう。なぜなら、誰
も、数千万、数百万の候補の混合物のうち、どの化合物が、なんらかの目的のために有用
であるか予想できないからである。
従って、任意の種類のコンビナトリアルライブラリーは、１または複数の有用な方法で
候補化合物を同定または操作するために用いることができる（すなわち、反応やスクリー
ニング法によって修飾、単離、あるいは識別される特定の化合物を同定または操作するこ
とができる）一種の「ハンドル」を有する候補化合物を提供するように、作られる。
かなり多様な当該「ハンドル」が知られており、種々の周知の方法により、少なくとも
１つの、通常は複数の当該「ハンドル」を、本明細書に開示する神経線維の操作を用いた
コンビナトリアルライブラリーの生体内スクリーニングに適用することができる。例えば
、コンビナトリアルケミストリーの全項目を処理および調節するために用いることができ
る周知の部類の「ハンドル」方法には、下記のものが含まれる。
１．通常プラスチック、デンプンまたは類似化合物から製造される微小なビーズ、チュ
ーブまたはその他の固体表面。これらのビーズやその他の固体表面は、通常、基材または
「アンカー」として作用し、化学鎖の結合部位となる反応性基を（その表面上に）有し、
その反応性基に化学鎖が付加される。必要ならば、哺乳類細胞により貪食摂取されるのに
十分に適する直径を有する当該微小ビーズを作ることができる。
２．コンビナトリアルライブラリー中の各候補化合物において１回だけ生じる特別な反
応部分。このような独特の反応部分を用いて、結合、化学反応、またはそのほかの操作を
行うことができ、これを用いて、スクリーニング方法のいずれの段階でも、またはその実
行後でも、目標位置に輸送された特定の化合物、注目する化学反応または細胞反応に関与
した特定の化合物、あるいは、スクリーニング試験中に、成功しなかった候補とは異なっ
て作用した特定の候補化合物を、沈殿、濃縮、またはそのほか集積、単離、結合、標識、
あるいは操作することができる。
３．ある波長の光によって励起した場合に別の波長の光を放射する非毒性の蛍光「標識
」または「タグ」。これにより、「フローサイトメーター」という（セルソーターなどと
もいう）装置を用いて、蛍光活性を有する細胞または粒子を分離することができる。分類
機能を有する典型的なフローサイトメーターでは、何百万の細胞または粒子が、一度に、
既知の、または調節した速度で細いチューブを通過することができる。この経路の一箇所
で、各細胞または粒子は、励起波長光の中を通過する。蛍光標識またはタグを含む、また
はそれに結合した各細胞または粒子は、異なる波長の光を放射することにより応答する。
ナノ秒間で生じるこの蛍光を、蛍光波長に合わせた光学センサーが検出する。蛍光センサ
ーが、ある細胞または粒子により放射された蛍光を検出すると、細胞または粒子の流路の
少し下流の位置で、少量の気体または液体の噴射の引き金をひく。この気体または液体の
噴射は、蛍光細胞または粒子が経路中の連結点を通過する時点に合わす。気体または液体
の噴射により蛍光細胞または粒子は、流路中の片側に押し出され、分離収集チューブ内に
入り、収集容器まで運ばれる。このように、フローサイトメーターは、数時間または数分
間でも何百万の細胞または粒子を処理し、そして何百万の集団の中から単一の蛍光細胞ま
たは粒子でさえ単離することができる。
４．その他の種類の標識またはタグ。例えば放射性同位体、または磁気共鳴映像法、ラ
マン散乱などの最新の分析方法によって位置確認および追跡することができる特別な分子
構造を含む化合物。
５．一分類の候補化合物がポリペプチドを含むか、またはそれに関連する場合には、フ
ァージディスプレイライブラリーは、このようなポリペプチドを処理するために非常に強
力で、柔軟で、かつ適合する「ハンドル」系を提供する。高度に効果的で、かつ潜在的に
有用なリガンドポリペプチドを有する単一のファージ粒子を単離しさえすれば、その単一
ファージ粒子を、急速に完全なコロニー株に増殖させることができ、これから、本明細書
に記載の方法や当業者に周知の方法を用いて、ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコ
ードする遺伝子を無制限に供給することができる。
実際、PhD-C7Cファージディスプレイライブラリーは、ポリペプチドとの使用に適合し
たコンビナトリアル法の一例を提供する。このライブラリーでは、本質的にランダムな７
アミノ酸長の短ポリペプチドを、コンビナトリアルケミストリーによって作った。これら
のランダムに作られた短ポリペプチド配列をファージ粒子内に組み込んだ。これらのファ
ージ粒子は、PhD-C7Cライブラリー中のコンビナトリアルな分類群のポリペプチドを操作
、増殖および選別するために用いることができる「ハンドル」を提供する。
上記のとおり、コンビナトリアルライブラリーは、必ず、研究者がそのライブラリー中
の候補化合物を処理および操作することができる少なくとも１種のシステムまたは機構を
受け付けるように作られなければならない。そのほか、効果的かつ論理的な方法により選
別することができなければ、このようなライブラリーを作ることは無意味であろう。従っ
て、コンビナトリアルライブラリーを選別するために過去20年間に開発された広範かつ多
様な方法は、非常に洗練されており、かつ強力である。従って、本明細書に開示された生
体内スクリーニング方法は、コンビナトリアルケミストリーによって作られた候補化合物
を選別するための１つのより新しい（そして潜在的に強力で有用な）方法を単に提供する
ものとみなすことができる。
生体内スクリーニングを、他の受容体、他の種、そして他の神経細胞類に拡大する遺伝子
工学方法
関連技術分野の研究者に明らかな種々の方法により、最初にラットの坐骨神経の運動神
経細胞を用いて開発および試験された本発明を、研究者、医者、その他の者にとって興味
のあるいくつかの方向に拡大拡張することができる。
一例として、神経解剖学および神経追跡研究分野の研究者に明らかな方法により、本発
明を、坐骨運動神経細胞以外に広げて、(i) ファージライブラリーを前眼房内へ注射した
後に、上頚神経節から伸びる交感神経突起および三叉神経節の感覚神経から伸びる感覚神
経突起と共に；(ii)試験ライブラリーを鼻腔内に投与した後に、嗅覚受容感覚神経細胞（
収集性嗅球組織）、三叉神経節の感覚神経、および上頚神経節の交感神経と共に；(iii)
後眼房内に注射した後に、網膜神経節の感覚神経細胞と共に；そして(iv)側脳室やそのほ
かの脳室内に注射した後に、中枢神経系の種々の神経細胞と共に用いることができる。こ
のような方法により、上記の特定の分類群の神経細胞が関与する疾患を診断および治療す
る際に用いるために、上記の特定神経細胞群によって天然に発現されたエンドサイトーシ
ス受容体を標的とするリガンドを同定および単離することができる。
同様に、細胞工学および分子生物学の研究者に明らかな方法により、最初にラットのp7
5受容体を用いて開発および試験された本発明を拡大拡張して、(i) p75受容体以外のエン
ドサイトーシス受容体と共に；(ii)受容体以外のエンドサイトーシス表面分子と共に；(i
ii)ラット以外の種に存在するエンドサイトーシス受容体、例えばヒトの受容体と共に；
そして(iv)神経細胞以外の特定の種類の細胞および組織に存在するエンドサイトーシス受
容体（例えば、腎臓、肝臓、肺、心臓などの細胞の表面にのみ通常かなりの数で存在する
受容体）と共に用いることができる。
この種の研究は、多数の事例で行われてきた。なぜなら、特定の種類のヒト受容体蛋白
質をコードするヒト遺伝子配列が一旦判明すると、そのヒト遺伝子配列（またはその一部
分）を用いて、マウスやラットなどの異なる種類の動物を形質転換することができるから
である。そして遺伝的に形質転換された動物は、ヒトアミノ酸配列と全く同じ配列を有す
るヒト受容体蛋白質を発現する。ほんの一例として、ヒトやそのほかの霊長類においてあ
る種の運動神経細胞にポリオウイルスを感染させることができるヒト受容体蛋白質を用い
て、マウスを形質転換した。従って、この形質転換マウスを安価な動物モデルとしてポリ
オおよびポリオウイルスの研究のために用いることができた。
同様にして、どのようにして、この種の遺伝子工学を、本明細書に開示した生体内スク
リーニングを実行するために適合させることができるのかということを示す例として、当
分野に周知で利用可能なDNA配列、試薬および方法を用いて、当業者は、下記の一連の工
程を実行することができる。
１．完全に配列決定されたp75遺伝子のヒト相同体（Johnson et al 1986）を、マウス
またはラットに通常見出されるp75遺伝子プロモーターの支配下に、キメラ遺伝子として
組み込むことができる；
２．このp75遺伝子のキメラ体（マウスまたはラットプロモーター／ヒトコード配列）
を用いて、選択した種類のマウスまたはラット、例えばp75受容体の発現を適当に抑制し
たノックアウト変異を有するマウス系統を遺伝的に形質転換することができ、このような
家系は、Jackson Laboratories社（www.jax.orgまたはwww.jaxmice.jax.org）からストッ
ク番号002213（家系名B6.12954-Ngfrtm1Jae）として入手できる；
３．この形質転換マウスまたはラットは、ヒト型p75受容体蛋白質を発現し、ヒトp75受
容体は、ラットp75受容体蛋白質が通常存在するのと同じ所、例えば血液脳関門の外側に
伸びる坐骨神経線維の表面に出現する；
４．次にリガンドライブラリー（例えばscFvまたはPhD-C7Cファージディスプレイライ
ブラリー）を、本明細書に開示したのと同じ方法によりスクリーニングして、ファージ粒
子のリガンドドメインとヒト型p75受容体との結合を介してエンドサイトーシスにより取
り込まれ、逆行輸送される候補ファージを同定する；
５．代替または追加として、ラットp75受容体蛋白質を介して細胞内に入ることが見出
されたリガンドを、生体外で試験して、該リガンドが、ヒトp75細胞受容体を有する細胞
（例えば懸濁培養中で容易に増殖し、天然型ヒトp75を発現するヒト神経芽細胞腫細胞株
）にも入ることができるかどうか決定することができる；
６．代替または追加として、ラットp75受容体を介してラット神経線維内に容易に入る
リガンドのエンドサイトーシスの効率が、非常に高くはないがかなり高く、そのリガンド
がヒトp75受容体と相互作用する場合、そのリガンドを開始化合物にして、(i) 部位特異
的またはランダム突然変異誘発法を用いて、ラットp75結合リガンドの種々の類似体を作
り、そして(ii)生体内スクリーニングを用いて、ヒトp75受容体を介して容易に細胞内に
入ることができる有望な類似体を同定および評価することができる。
これらは、どのようにして、本明細書に開示した生体内スクリーニング方法を、ヒトの
治療、診断、分析および研究に用いるために、ヒト細胞内に運送物(passenger)分子また
は運搬物(payload)分子を効率的に輸送することができるリガンドを発見、単離および分
析するための使用に適合させることができるのかということを示すほんの少数例である。
本発明により実現される分子複合体および方法
本明細書に開示したスクリーニング方法の真の価値は、エンドサイトーシス取り込みを
活性化および実行することができる特定のリガンドを同定する行為ではなく、続いて、こ
のような選択したリガンドを、治療、診断および類似の目的に用いることができる「分子
複合体」に組み込んで用いる能力に由来する。
本明細書中、用語「分子複合体」とは、少なくとも２つの異なる成分、すなわち少なく
とも１つのリガンド成分および少なくとも１つの運送物または運搬物成分を含む分子集合
体を指す。
該リガンドまたは該リガンドを含む分子複合体に言及するクレーム内に包含されるため
には、リガンド成分は下記の２つの判定基準を満たさなければならない。
第１に、該リガンド成分は、本明細書に開示した生体内選別方法により同定されたもの
である必要がある（すなわちクレーム１などのクレームにより保護されるために、該リガ
ンド成分は、このような選別をするために少なくとも神経線維内へのエンドサイトーシス
取り込みが必要である生体内選別方法により同定されたものである必要がある）。この種
の同定は、本発明のスクリーニング方法において、そして実際にこの方法により同定され
たリガンドを用いた分子複合体の形成において必須の工程である。この事実を説明するた
めに、何十億の候補リガンドポリペプチドを含むファージライブラリー（例えば実施例28
および29において用いて選別されたscFvライブラリーなど）は、表面にp75受容体を有す
る細胞内に運送物成分を運搬するために用いることができる有能で、特異的で、効果的な
エンドサイトーシスリガンドとして完全に機能することができる候補リガンド配列を実際
に有する何百の、何千の、または何百万ものファージ粒子を実際に含有すると推定するこ
とができる。しかし、このように巨大なライブラリーでは、理論的に有能な何百の、何千
の、または何百万ものファージ粒子は、当該目的には全く無用であり、運送物分子と結合
して、治療を要する動物または人間に注射すると望ましくない全ての反応を招くであろう
他の何十億のファージ粒子により取り囲まれている。
明らかに、既知の有用なエンドサイトーシス活性を有するリガンド配列を有する当該フ
ァージを同定および単離するために必要とされるスクリーニングおよび処理工程は、所望
の有用な治療上、分析上または類似の結果を実際に達成することができる分子複合体の作
成において絶対に重要な工程である。
本明細書または特許請求の範囲に記載のとおりに分子複合体中の運送物または運搬物成
分を輸送するために用いられるリガンド成分に適用される第２の条件は、本明細書に開示
した生体内スクリーニング方法によって最初に同定されたリガンド成分を含む分子複合体
が、そのリガンドが結合するエンドサイトーシス表面分子を有する標的種類または分類群
の細胞内に実際に入ることができる必要があることである。このような分子複合体が、少
なくとも１つの上記分類群の細胞内に入ることができないとすれば、その分子複合体は、
特許請求の範囲により保護されず、かつ保護されることを意図しない。
しかし、明白なことに、特定かつ標的の種類のエンドサイトーシス表面分子を介して細
胞内に入ることができる特定リガンドがいったん同定されたならば（そしてその特定リガ
ンドがポリペプチドである場合、そのアミノ酸配列がいったん判明したならば）、その特
定リガンドを所望量で合成することができ、それをエンドサイトーシス輸送系として用い
て、広範な有用な「運送物」または「運搬物」分子を標的細胞に運ぶことができる。従っ
て、本明細書に開示した新規で強力な生体内スクリーニング方法によってこのようなリガ
ンド成分が同定された後には、そのようなリガンドをエンドサイトーシス輸送成分として
用いる場合、「運送物」または「運搬物」分子をも含む分子複合体において、それらは特
別な種類または分類群の運送物または運搬物分子に限定されない。
本明細書では、用語「運送物(passenger)分子」と「運搬物(payload)分子」は相互に交
換可能であり、その運送物分子が、リガンド成分が結合するエンドサイトーシス表面分子
を有する標的細胞内に入った後に、１または複数の有用な機能または効果を発揮するとい
う複合分子（上記リガンドを含む）中の一部分を指す。当該用語は広義に解釈されるもの
であり、一般的には、運送物または運搬物分子とは、当該用語が他の輸送様式においてど
のように使用されているかということを認識して解釈されなければならない。車、バス、
列車、航空機および自転車は全て、他の輸送手段では実際上簡単には達成することができ
ない速度および距離にて乗客を運ぶことができるので、有用である。同様に、貨物列車、
トレーラー車、タンク車および船は、貨物（これは目的地に輸送する場合には有料貨物と
みなしうる）を運ぶことができるので、有用である。車、バス、列車、航空機、自転車お
よび船は非常に有用かつ有益な輸送様式であり、これは単に１人の特定人を１つの特定地
に運ぶことができるからだけではなく、多数の様々な人または貨物を、多数の選択した目
的地に運ぶことができるからである。
従って、本明細書で記載および考慮される運送物または運搬物は広義に解釈されるべき
であり、下記の主要な分類を含むが、それらには限定されない：
(1) 動物を遺伝的に形質転換するため、または遺伝子治療を必要とする人間を医学的に治
療するためのものである遺伝子ベクターの一部分であるDNAセグメント。実際、本研究の
第一の目的の一つは、望ましくない副作用の危険および程度を大きく増やすように他の種
類の細胞の状態または活性を壊すことなく、特定の種類の細胞だけを特異的に標的として
形質転換させることができる新しい種類の遺伝子ベクターを作るために用いることができ
る細胞標的化成分を同定および作成することであった；
(2) 人間の医学または獣医学に用いるための治療用および／または診断用化合物（例えば
医薬、画像化用化合物など）；
(3) 標的種類の細胞に効率よく輸送することができると、産業上の研究や開発などにおい
てより有用となる分析化合物、試薬およびその他の物質。
最後に、同様に注意すべきことに、リガンド成分および運送物または運搬物成分の両者
を含む分子複合体は、当該２つの成分を結合および団結する何らかの有効な手段を有し、
少なくとも運送物または運搬物成分が標的細胞内に確かに取り込まれるまでは団結してい
る複合体を形成する必要がある。場合により、運送物または運搬物成分に応じて、直接的
な共有結合により、または「配位」結合（この用語は、共有結合とイオン結合との中間の
強度および／または安定度を有する種類の分子結合を指す）により、運送物または運搬物
成分をリガンド成分に直接に連結することができる。しかし、運送物成分をリガンド成分
に直接に連結した場合、この種の分子複合体は、少なくともいくつかの目的用途には適さ
ないだろう。なぜなら、分子複合体が標的細胞内に入った後、しばしば運送物成分はリガ
ンド成分から遊離される必要があり、従って運送物成分は、リガンド成分が連結したまま
ではその目的機能を発揮できないからである。同様に、このことは、車、トラックまたは
バスは、目的地に到着したならば乗客を降ろすことができるドアを備えているので、実質
的により有用であるということに匹敵する。
従って、本明細書に開示したリガンド成分と運送物成分を有する分子複合体のほとんど
の種類は、適当な「連結成分」をさらに含むべきであり、この連結成分は、下記の２つの
異なる要件を調整する適当な手段によりリガンド成分と運送物成分とを連結するものであ
る：(i) 連結手段は、リガンド成分はその機能を果たして、運送物成分を細胞内部に入り
込ませる一方で、分子複合体を完全に維持することができるほどに十分に強くかつ安定で
ある必要があり、および(ii)多くの場合で、運送物成分が、リガンド成分と連結している
間は、その所望の効果が発揮できないならば、連結手段は、分子複合体が確かに細胞内に
入った後に、運送物成分が、最終的に分子複合体から遊離または分離することができる種
類の構造または機構を有する必要がある。
本特許出願は、上記の２つの拮抗する要件を達成および／または調整することができる
連結成分の候補を包括的に記載するのには適していない。多種類の連結成分候補が、薬物
送達分野の技術者には周知であり、従ってリガンド成分、運送物成分および標的細胞種の
全てが完璧に詳細に判明した後に、本明細書に開示した所定の分子複合体での使用に関し
て、任意の連結成分候補を評価することができる。
特定の種類の分子複合体を、既知のリガンド、既知の運送物成分、および既知の標的細
胞種を最適に組み合わせるように設計する場合に、利用できる選択肢の範囲を概括し、実
務上紹介するために、広範な連結成分の種類のいくつかを簡単に述べる。
１．比較的に非特異的な反応基により共有結合を形成する架橋剤、例えばグルタルアル
デヒド、および調節可能な長さのスペーサー鎖の両端に２つのアルデヒドまたはそのほか
の非特異的反応基を有する化合物。
２．特異的な分子基によってのみ共有結合を形成する架橋剤。例えば、実施例24に記載
した「スルホ−SMCC」であり、これは、遺伝子ベクターや親和的精製などの用途のために
、DNA鎖の末端をポリペプチドのリジン残基に架橋するために用いられる。
３．非常に高いレベルの接着性および親和性を有する親和性結合剤（実施例27に記載の
ようにビオチンとアビジンという２つのポリペプチド間で起きるようなもの）、および所
望のより低い、しかし実質的なレベルの接着性および親和性を実際に有する親和性結合剤
（親和的精製法において溶離条件を調節するなどの種々の手段により調節することができ
るもの）。
４．２つの成分を結合させるためにイオン引力および／または水素結合を用いる結合剤
。イオン引力および水素結合は特に強くはないので、典型的には、この種の結合剤は、か
なり狭い範囲に一緒に集まった全て同一極性の多数のイオン電荷を有する化合物である。
例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、およびDNA鎖およびRNA鎖の骨格中の陰性荷電
リン酸基と引き合って結合するほかの陽性荷電化合物がある。
５．分子複合体を酸性に晒すと（例えば、細胞内の酸性の消化器官であるリソソーム内
で起きる）、弱くなり壊れるように設計された特別な種類の接続分子。このような種類の
接続分子は、米国特許4,631,190 (Shen et al 1986)および5,144,011 (Shen et al 1992)
に記載されている。
上記のことは単なる簡単な概説であり、他の種類の接続分子もまた当業者に知られてい
る。しかし、運送物成分をリガンド成分に連結するために、広範な種々の強度、安定性お
よびその他の特性を備えた多様な周知の選択肢が利用できることは明らかである。
実施例22〜32の概括（生体内スクリーニング法）
実施例22〜31に記載の方法は複雑であり、それらの試験では特別なタイプのファージお
よび細胞を試薬として用い、そしていくつかの試験方法は、本出願人が成功しなかった以
前の方法を分析した後に選択して最終的に解決したものである。従って、このセクション
では、これらの実施例および得られた情報の構成に関して概括し、簡単な説明を行う。
実施例22は、使用した３種類のバクテリオファージを記載する。これらは、（１）エン
ドサイトーシスリガンドを保有しないM13KO7ヘルパーファージ；（２）約130億種のファ
ージミドを有するscFvライブラリーと称されるファージディスプレイライブラリー、ここ
で各ファージミドはヒト抗体に通常現れる候補リガンドを有する；および（３）「コンビ
ナトリアルケミストリー」により相互にランダムな配列である７アミノ酸残基を有する小
さな外来ポリペプチド配列を保有する、PhD-C7Cライブラリーと称するファージディスプ
レーライブラリー、である。
実施例23は、使用した宿主細胞（主に大腸菌TG1株）、および様々なファージ群におい
てそれらの特定ファージ群を増幅し、その力価を測定するために用いたいくつかの技術を
記載する。
M13KO7ヘルパーファージは、リガンドポリペプチドを保有していないが、抗体−ファー
ジ結合体を作成するために用いられるので、実施例22に最初に記載される。これらの結合
体は、このヘルパーファージの表面に架橋された、ラットp75受容体によって取り込まれ
ることが知られている複数のMC192モノクローナル抗体を表示するために調製される。
これらの抗体−ファージ結合体が最初に試され、坐骨神経線維によって取り込まれること
が示された。従って、これらのことから確立された一組のツール（プローブ薬剤に匹敵す
る）を用いて、本出願人は、ラットにおいて坐骨神経線維を操作することによって生体内
でエンドサイトーシスをスクリーニングすることが可能となる効果的な方法のコンセプト
と詳細を考え出すことができた。実施例24には、抗体をヘルパーファージに架橋する方法
が記載される。実施例25および26には、最終的に坐骨神経において抗体−ファージ結合体
のエンドサイトーシスおよび逆行輸送を達成した方法が記載される。実施例27には、図２
に示すように、抗体−ファージ結合体のエンドサイトーシスおよび逆行輸送を証明する写
真を撮るための方法および試薬が記載される。
抗体−ファージ結合体を用いて、p75を介してファージ粒子を信頼性よく取り込むため
の一組の一貫した方法を開発した後、本出願人は、scFvライブラリーと称するファージデ
ィスプレイライブラリーの試験を開始した。実施例22には、このライブラリーの主な特性
が記載される。非常に簡単に述べると、このライブラリーは、もともとヒトＢ細胞から得
られた莫大な数（おおよそ130億）の外来遺伝子インサートを有する。これらの遺伝子イ
ンサートは、種々の祖先のヒトからの広範なヒト抗体の「可変断片」をコードする。この
ライブラリーを用いて行われた最初の生体内スクリーニング試験から、一貫した結果は得
られなかった。従って、本出願人は、これらの問題点に取り組み、最終的に、実施例28に
記載の「バイオパニング」と称する技術によってscFvライブラリーを生体外で事前にスク
リーニングする方法により解決した。非常に簡単に述べると、このプレスクリーニングは
、硬質プラスチック表面に固定したp75ポリペプチドを用いる。これらの固定化p75ポリペ
プチドに結合するファージ粒子を、この工程により選択して、これを用いて次の生体内ス
クリーニングを行うことによって、理解解釈することができるより一貫した結果が得られ
た。実施例29には、これらの方法および得られた結果が記載される。
続いて、本出願人は、PhD-C7Cライブラリーと称する別のファージディスプレイライブ
ラリー上で生体内スクリーニング法を試験した。実施例22に要約するように、このライブ
ラリーはコンビナトリアルケミストリーにより作られ、ランダムに作られた、ファージの
pIIIコート蛋白質内に挿入された短いポリペプチド断片（７アミノ酸残基である）を有す
る。実施例30には、これらの試験および結果が記載される。
これらの全てのスクリーニング試験の結果、神経線維によって取り込まれ、かつ輸送さ
れる特定のファージを選択するための、ファージライブラリーの生体内スクリーニングは
、巨大なディスプレイライブラリーから、神経線維内へのエンドサイトーシス工程を活性
化および実行することができるリガンド成分を偶然にも保有する特定のファージを、同定
および単離する実用的かつ効率的な方法であることが確認される。
これらの結果を総合すると、確率、および非常に特化された一組の試験により試される
集団の大きさに依存する確率的工程が関与することも確認される。本発明の主張および請
求は、この種の選択方法が、各スクリーニング試験すべてにおいて成功することではない
。そうではなく、本発明にて主張および請求することは、以前には知られておらず、また
は不可能であった方法で、生きた動物に対して生体内試験を行うこの選択方法を用いて（
所望ならば繰り返し用いて）、確かに神経線維内に入り込み、逆行輸送される少数のディ
スプレイファージクローンを、潜在的に大きい、および／またはランダムな開始ライブラ
リーまたはレパートリーの中から、同定、選択、および単離することができるという事実
である。
力価の測定および写真データからもまた、当該方法により生体内スクリーニング方法が
実行され、たとえ巨大分子複合体に結合されていてもエンドサイトーシス工程を活性化お
よび実行することができるリガンド分子およびリガンド断片を効率的に同定することがで
きることが明白に証明される。これらの結果に基づき、この種の生体内スクリーニング方
法により、研究者は、このような分子（エンドサイトーシスリガンドと称する）を同定し
、そしてそれを「運送物」または「運搬物」成分を細胞内に輸送するための分子輸送シス
テム（担体とも称する）の一部として用いることができる。このような運送物成分として
、細胞内に効率よく輸送されるものであるならば、例えば、遺伝子ベクターの一部である
DNA断片、治療上、診断上、またはほかの医療上効果を供することができる薬物または診
断用分子、並びに産業上の研究および同様の努力においてより有用である分析用化合物が
挙げられる。
また、本特許出願にて記載および提出されたとおり、生体内スクリーニング試験におい
て十分に機能するポリペプチドリガンドをコードするヌクレオチド遺伝子配列も、このよ
うなポリペプチドリガンドのアミノ酸配列も知られていない。本出願人の研究所（オース
トラリア）は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列情報を決定する機器を保有していな
い。従って、このようなデータを決定することができる外部の契約研究所に、生体内スク
リーニング試験にて十分に機能するいくつかの選択されたファージを送付した。しかし、
結果データを未だに受け取っておらず、本特許出願日にはこのようなデータは知られてい
ない。
BBB内への薬物投与／送達のための遺伝子ベクターの使用
本発明を用いて、BBBによって保護されていない組織内または組織上に、BBBにまたがる
１または複数の種類の神経細胞にトランスフェクションすることができる１または複数コ
ピーの遺伝子ベクターを投与することができる。明らかに、好適かつ可能な投与方法は、
ベクターをトランスフェクションするBBBにまたがる神経細胞の種類、およびベクターが
接触する末梢投射の種類と位置に依存する。上記および実施例のとおり、嗅覚受容体神経
細胞への投与は、鼻内滴下により行うことができ；侵害受容神経細胞への投与は、皮内注
射、皮下注射、または筋肉内注射により、および局所投与により行うことができ（これは
、上記の通り、表皮通過および組織浸透を高める１または複数の薬剤または技術を伴って
よく）；骨格筋を神経支配している下位運動神経への投与は、筋肉内注射により行うこと
ができ；そして、舌下神経核の下位運動神経への投与は、舌の筋肉内への注射により行う
ことができる。
医学または神経科学分野の専門家には明らかなことに、末梢に投射している神経細胞に
遺伝子ベクターを投与するために別の方法が存在する。また、該専門家に明らかなことに
、(i) BBBにまたがる他の種類の神経細胞（様々な種類の感覚神経細胞および運動神経細
胞、並びに、交感および副交感神経系の節前神経細胞を含む）が、潜在的に有用なトラン
スフェクションの標的であり；および(ii)そのような種類の神経細胞の解剖上および構造
上の周知の特徴および特性から、神経学者または研究者は、遺伝子ベクターを該神経細胞
に投与する種々の方法を開発することができる。
内分泌および傍分泌ホルモン系の調節
また、明らかなことに、本発明は、従来利用されなかった新規な方法として、特定の遺
伝子によりコードされたポリペプチドを脳内の細胞、系および領域に非侵襲的に送達する
ことによって、例えば、保護された脳組織であるCNS（例えば下垂体および松果体など）
、または体内の他の部位（例えば甲状腺、胸腺、副腎、その他の分泌腺、または膵臓、生
殖器官など）のいずれかにおいて、種々の腺または器官からの種々の内分泌および／また
は傍分泌ホルモンの放出を増加または抑制させることによって、種々の「下流」の効果ま
たは活性を調節する方法を提供することができる。
本特許出願は、内分泌または傍分泌を詳しく分析するのに相応しい場所ではなく、以下
の記載は単に非常に簡単な紹介および概括である。内分泌および傍分泌系に関して、より
多くの情報が、ほとんどの良好な生理学の教科書に適切な要約として記載されており、ま
た数々の完全な教科書、例えばWilson & Foster 1992, Barrow & Sleman 1992, Brown 19
93, DeGroot 1994などに記載されている。最近の総説記事は、内分泌系または傍分泌系の
作業上の知識を満足させるために特に有用なわけではない。なぜなら、それらの焦点は、
主に問題点（例えば腺管腫瘍、殺虫剤などのホルモン破壊剤）、治療（外科手術や薬剤）
、またはホルモン系と、ほかの系、例えば免疫応答系との相互作用であるからである。し
かし、総説記事は、内分泌系または傍分泌系の作業知識を超えて、ヒトの疾患または先天
性以上の治療、または家畜の繁殖などの目的のために潜在的な治療を目指す場合には、良
い基礎情報を提供する。
内分泌系の重要な成分の一つは下垂体であり、これは、脳の基底に位置し、視床下部と
いう脳組織の一領域からぶら下がっている。下垂体前葉は、少なくとも６種類のホルモン
を放出することが知られており、これらの各ホルモンの放出は、視床下部ホルモンといわ
れる「上流」のホルモンによって刺激または抑制されている。これらのホルモン系（すな
わち対形成、関連）は以下の通りである。
１．チロトロピン放出ホルモン（TRHと略される；正式には甲状腺刺激ホルモン放出ホ
ルモン）といわれる視床下部ホルモンは、下垂体からチロトロピンといわれるホルモン（
正式には甲状腺刺激ホルモン、TSHといわれる）を放出させる；
２．コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体から
アドレノコルチコトロピンを放出させる；
３．成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体から成長
ホルモン（ソマトトロピンともいわれ、ヒト成長ホルモンの場合、しばしばhGHまたはHGH
と称される）を放出させる；
４．成長ホルモン抑制ホルモン（GHIH、またソマトスタチン）といわれる視床下部ホル
モンは、下垂体からの成長ホルモン（ソマトトロピン）の放出を抑制する；
５．ゴナドトロピン放出ホルモン（GRHまたはGnRH）といわれる視床下部ホルモンは、
下垂体から、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンといわれる２種類の「性腺刺激」
ホルモンを放出させる；
６．プロラクチン抑制ホルモン(PIH)といわれる視床下部ホルモンは、下垂体からのプ
ロラクチンといわれるホルモンの放出を抑制する。
BBBにより保護されている脳組織内で、上記の視床下部ホルモンの一つの濃度を増加さ
せる遺伝子ベクターを投与することによって（本明細書に開示された方法によって、永続
的というよりもむしろ一過的な増加を起こすことができ、そして一過的な増加は、通常、
ヒトの医学的または発生学的疾患の治療に好ましいと思われる）、調節可能な方法で「下
流の」または「依存的な」下垂体ホルモンの放出を刺激または抑制することができる可能
性が高い。従って、このように遺伝子ベクターによって下垂体の刺激または抑制を誘発し
、および／または目標とした結果、下垂体ホルモンの放出または抑制によって起こされる
のと同タイプの生理学的効果を刺激、抑制、または調節することが可能である。
代わりの方法として、「上流の」視床下部ホルモンではなく、下垂体ホルモンを直接コ
ードする遺伝子ベクターを投与することによって、目標とした内分泌または傍分泌系を刺
激または抑制することが、少なくともいくつかの系において可能であろう。この方向に沿
って、放射標識トレーサーの研究から、脳室内に直接に注射することによってCNS内に送
達した少なくともいくつかの種類の蛋白質は、CNSから血液循環内にかなり急速に排除さ
れることが示された（例えばFerguson 1991）。従って、ホルモンタイプのポリペプチド
を、BBBにより保護されたCNS組織内に送達する速度が十分に高い場合には、これらのホル
モンポリペプチド分子のいくつかは循環血液内に拡散し、そして全身性に分配される。
ホルモンやその他のポリペプチドを脳内に送達して、脳内の特定の領域、細胞または構
造に接触させることに関し、本発明は、少なくともいくつかの場合に、以前には利用でき
なかったやり方で標的へ送達を行う方法を提供することができる。神経活性分子（例えば
神経栄養因子）をCNS内に送達する従来技術方法のほとんどは、該分子の送達方法として
薬剤送達の内分泌モデルが適していることを前提としている。この前提が普及している証
拠が、数々の動物実験、および、組換え神経栄養因子を脳脊髄液内に（典型的には側室内
に）注射または注入する制限ヒト臨床研究において認められる。これらの薬剤投与方法は
、脳および脊髄内の脳脊髄液の流れが、末梢内の血液循環と同じく、CNS内部の循環であ
るという前提に基づいている。
しかし、この前提は保証されない。なぜなら、CNS内のCSFの流れは、血液循環よりも、
末梢のリンパ系により類似しているからである。リンパ液の流れと同じく、CSFの流れは
、液体の再循環というよりもむしろ一方向の排出により近い。
従って、神経活性分子（例えば神経栄養因子）が、内分泌的（全身的）ではなく、むし
ろ傍分泌的（局所的）に生理学的効果を発揮する場合、適当な薬剤送達方法は、好ましく
は、例えば静脈内点滴または注射などの全身投与によるべきではない。なぜなら、(i) 非
常に高価な薬剤化合物の浪費量が多く；そして(ii)全身性に注射された分子が所望の標的
以外の種々の細胞や器官と反応した場合、望ましくない悪影響が起きる可能性があるから
である。その代わり、利用できるならば、より狭い範囲に集中する系、および標的を目指
す系が用いられるべきである。
本発明は、いくつかの観点から傍分泌送達を模倣した、実質的に改善された薬物送達法
を提供する。この方法は、BBBにまたがる神経細胞のうち特定の選択された集団にのみト
ランスフェクションして、続いてその細胞が、所望の限られた「分泌域」にポリペプチド
を放出することによって、標的細胞または標的領域への薬剤の限定的および集中的送達を
実行し、または少なくとも促進することができる（特に静脈注射などのほかの方法と比べ
た場合）。
特定の組換え分子、例えば神経栄養因子を分泌するように遺伝子的に加工した細胞をCN
S内に移植する多くの研究によって示されるように、当技術分野において、継続した薬剤
送達を達成するために遺伝子治療を利用できることが知られている。しかし、そのような
研究のほとんどは、その目的が、移植した細胞により薬剤が、全身性に分配されるように
分泌され、そして内分泌様の薬剤送達が達成されることであると説明または示唆している
。これに対して、本発明は、全く異なった形の遺伝子治療を開示し、BBBにまたがる細胞
のうち限られた数の隣接細胞にトランスフェクションすることによって、BBB内の神経細
胞の特定の集団および／または特定の種類に、治療用ポリペプチドを、傍分泌様に、限定
的に送達することができる。
神経系の選択的な調節
本発明により、神経系の疾患を治療する全く新しい方法の開発が可能となる。開示され
た傍分泌様薬剤送達方法により、CNS内の特定の神経系の機能を選択的に調節するための
新しい方法の開発が可能となる。
生理学的には、中枢神経系内の神経細胞系の機能は、BBBを貫通する神経細胞の機能変
化に応答して変化しうる。例えば、BBBを貫通する侵害受容神経細胞の電気的活動の変化
は、痛みの知覚およびその痛みへの応答に関係する二次感覚神経細胞および関連するCNS
神経細胞系の電気的活動に変化をもたらす。BBBを通して投射する神経細胞と、BBB内に全
体が存在する神経細胞との間の解剖学的な接続は、固定されておらず、静的ではない。そ
の代わり、これらの接続の性質、数、および分布は、経時的に、かつ種々の事象に応答し
て変化しうる（その結果、しばしばCNS内のさらにほかの神経細胞系において下流の変化
をもたらす）。すなわち、CNS内の神経細胞系は、可塑的であり、変化可能であり、そし
て血液脳関門を貫通する神経細胞の機能変化に対して応答する。
このような生理学的事実に基づいて、少なくともいくつかの場合に、本発明は、トラン
スフェクション可能な末梢投射する神経細胞系とCNS内の標的神経細胞系とのシナプス接
続による神経支配パターンを変更することによって、CNS内の少なくとも数種の神経細胞
系の構造と機能を選択的に調節および変更することができる。
一例として、当技術分野では、神経栄養因子は、CNS系において、末梢近くに位置する
ほかの神経細胞から来る電気的活動、例えば神経パルスの数および頻度の変化に応答した
シナプス密度および神経支配パターンの可塑的変化に関与していることがよく知られてい
る。生理学的には、これらの神経栄養因子は、上記において傍分泌様に作用する。従って
、ここに開示した傍分泌的薬剤送達方法を用いて、１または複数の末梢投射する神経細胞
と、それが相互作用するCNSの神経細胞または神経細胞系との接続の性質および程度を選
択的に調節することができる。すなわち、遺伝子ベクターをBBBにまたがる神経細胞にト
ランスフェクションすることによって、これらのBBBにまたがる神経細胞と、BBB内に全体
が存在するCNSの神経細胞との接続の性質および程度を改変することができる（少なくと
もいくつかの場合）。
例えば、この原理を、以下の２つの好ましい実施態様により説明することができる：
(i) BBBにまたがる侵害受容神経細胞のトランスフェクションを介して、組換え抗NGFを投
与することにより、痛みの知覚に関与するBBBにより保護されている神経細胞系を調節す
ることができること；および
(ii)BBBにまたがる脊髄の運動神経細胞のトランスフェクションを介して、組換えNT-3ま
たはGDNFを投与することにより、運動機能の随意制御に関与するCNSの神経細胞系を調節
することができること。
神経疾患の治療
本発明は、神経栄養因子または神経保護因子を、変性の危険性がある神経細胞に送達す
る方法により、CNSの神経変性疾患（例えばアルツハイマー病）の治療において有用とな
るだろう。例えば、アルツハイマー病は、神経栄養因子（例えば神経成長因子）をCNS内
に投与することによって、おそらく有効に治療することができると考えられる。この目的
に沿って、本発明により、アルツハイマー病患者において変性の危険性がある前脳基底部
のコリン作動性神経細胞に、比較的に集中的かつ標的指向的に神経栄養因子を送達するこ
とができる。少なくとも数人の患者において、この種の治療により、この神経変性を遅く
し、潜在的には停止することができるだろう。
また本発明は、損傷を受け、生き残った神経細胞に、神経細胞の成長因子（例えば神経
栄養因子）を送達することにより、CNSの外傷または損傷（例えば頭部損傷）の治療にお
いて有用となるだろう。ほんの一例として、皮質の運動神経（しばしば脳梗塞において、
ときに頭部外傷において損傷を受ける）に作用するGDNFを、ここに開示した方法によりそ
れらの神経細胞に送達することができる。このような潜在的な有効性が多くの記事、例え
ばSchacht et al. 1996に記載されている。
また本発明は、学習障害や記憶障害の症例、例えば老化、痴呆にて、頭部の外傷または
損傷後に、種々の大手術後に、特に心肺バイパス装置を用いた手術後に起きる学習または
記憶障害の治療において有用となるだろう。このような外傷および損傷はしばしば１また
は複数のCNSの領域内の機能を喪失させる。可能であるならば、機能の回復には、CNSの構
成の補償的変化、例えば典型的には、影響を受けた神経細胞の発芽および成長、並びにほ
かの神経細胞との機能的シナプスの形成が必要であり、関与する。このような「神経可塑
的」な過程が、指や四肢が切断された動物の研究および人間の症例において示された。そ
こでは、脳梗塞の被害者が、治療を受けることによって、麻痺した手足を再び実際に使え
るようになった。この治療では、患者は、１または２本の健康な手足を包帯で体に固定し
、脳梗塞後に四肢に残った動作と制御の範囲に応じて、これを広げるように、機能しない
手足を再び動かし、使いはじめるように積極的に働きかける運動を繰り返した。
神経栄養因子は、上記のような過程において重要な機能を発揮することができ（例：Lo
1995）、また脳内へのNGFの投与が、種々のCNSの活性と機能、例えば記憶と学習を高め
ることが示されている（例：Fischer et al. 1987および1991）。
従って、本発明は、改良された送達系を用いて、NGFやそのほかの神経栄養性因子およ
び神経刺激性因子をCNS内に、そして脳内に送達することにより、この種の非常に有用な
治療法をさらに詳しく説明することができる。
さらに本発明は、神経細胞の興奮毒性損傷に起因する障害、あるいは虚血（脳梗塞や心
停止の際に起きるような血流低下）、低酸素症（溺れ、一酸化炭素中毒の際に起きるよう
な酸素供給低下）または頭部外傷が関与する疾患や損傷に起因する障害の治療において有
用となるだろう。動物実験では、NGFの注入により、コリン作動性神経の細胞体および線
維網の逆行性萎縮、並びに梗塞によって誘発され、梗塞の大きさや重症度によって検出さ
れるコリン作動系のほかの変化を、抑制または回復させることができた（例Cuello et al
1992）。NGFの投与（またはクレンブテロールによるNGF合成の生体内誘導）により、中
大脳動脈永久閉塞ラットモデルにおいて梗塞の大きさが減少することが示された（Semkov
a et al 1999）。ほかの動物データからも、NGFは、脳損傷後に作用して、神経損傷の進
行を抑えることが示唆されている（例Guegan et al 1998）。本発明は、脳梗塞やほかの
脳損傷後にNGFを投与するために有用であろうから、続いて起きる神経欠損の程度と重傷
度を低下させることができるであろう。
本発明はさらに、感覚神経細胞および／または該細胞とシナプス接続するCNS内の神経
細胞の機能を調節することによって感覚機能障害を治療する方法に関する。例えば、継続
的な大きな痛みは、侵害受容神経およびCNS（脊髄または頭脳）の変化に関係しており、
抗NGFの鞘内投与により、このような変化を回復させ、痛みを和らげることが報告されて
いる（例Christensen et al 1996および1997）。本発明により、感覚系の１または複数の
成分に作用するポリペプチド（例えばNGFと結合し失活させる抗体、NGF受容体を占有し妨
害する抗体）を送達し、その生理学的機能を変更することによって、感覚系の機能を調節
することができる。
また本発明は、神経ペプチド遺伝子、例えば、痛みをブロックし抑えることができるポ
リペプチド（いわゆる「エンドルフィン」など）を発現する遺伝子；成長因子を発現する
遺伝子；細胞を再生または延命させるポリペプチドを発現する遺伝子；および毒性ポリペ
プチド、例えば腫瘍細胞を殺す毒性ポリペプチドを発現する遺伝子、を送達して発現させ
ることによって神経の生理機能を調節するために用いることができる。
そのほか、本発明は、いくつかの特定のポリペプチドの過少または過多のいずれかに相
関する種々のCNS関連神経疾患または欠乏症の治療に用いることができる方法を提供する
。これを実行するために、本方法を用いて、下記のいずれかのポリペプチドを、BBBによ
り保護されているCNS組織内に送達することができる：(i) 欠乏症を軽減除去するために
追加量のポリペプチドを供給するポリペプチド；または(ii)特定分子の過多により誘発さ
れる、すなわち特徴付けられるCNSの疾患を調節することを助けるための、特定の分子、
受容体または反応を阻害、拮抗またはそのほか抑制するポリペプチド。
以下の実施例は次の通りに構成されている。
実施例１〜８は、完全に血液脳関門内に位置する神経細胞に神経細胞刺激ポリペプチド
を、このようなポリペプチドをコードする遺伝子を保有するベクターを用いて、嗅覚受容
体神経細胞をトランスフェクションすることにより、送達することに関する。例示目的の
ため、ヒトNGFを模範のポリペプチドとして用いる。当業者に認知されている通り、他の
形態のNGF（医薬または研究の興味の対象となり得る、マウス、他の齧歯動物、若しくは
サルのNGF、または任意の突然変異したNGF、エピトープタグ付きNGF、断片化されたNGF、
若しくはその他の形態のNGFなど）をコードする遺伝子を代替として用いることができる
。
実施例１〜７は、如何にしてＮＦＧ（またはその他の神経栄養ポリペプチドまたは類似
のポリペプチド）をラットなどの実験動物の前脳基底核中のコリン作動性神経細胞に送達
することができるかについて記載している。実施例１〜４は、種々の連続工程に分けられ
た完全な実施形態を含む。実施例１は、ベクターの組立について記載し；実施例２は、そ
れらのベクターの副鼻腔への投与について記載し；実施例３は、血液脳関門を通してポリ
ペプチドの送達をモニタリングする方法について記載し；実施例４は、実験動物に対する
このような治療の生理学的及び行動の効果を測定する方法について記載する。
その「始めから終わりまで」の記載に続いて、実施例５〜８は、異なるタイプのベクタ
ーを用いた、NGFをコードする遺伝子または類似の遺伝子の嗅覚受容体神経細胞への送達
について記載している。実施例５は、ヘルペスウイルス由来のベクターについて記載し；
実施例６は、リポソームベクターについて記載し；実施例７は、神経細胞表面上のエンド
サイトーシス受容体に結合するリガンドを有するベクターについて記載し；実施例８は、
ある神経細胞から別の神経細胞へと完全なベクターを輸送することを促進することができ
る「経ニューロン性（transneuronal）」ポリペプチドを用いるベクターについて記載す
る。
実施例９〜13は、神経抑制（刺激ではない）因子をコードする遺伝子ベクターを用いた
異なるアプローチを伴い、NGFに結合しこれを不活性化する「抗NGF」と呼ばれるポリペプ
チドを例示として用いる。これらのベクターは、望んではない過剰の疼痛信号（しばしば
神経因性疼痛または異痛と呼ばれる）を患う領域で、痛覚(疼痛信号伝達)神経細胞をトラ
ンスフェクションするために、皮膚または筋肉部位に注入される。過度な活性の疼痛信号
伝達回路を抑制することにより、このアプローチは神経因性疼痛を減少させ制御するのを
助けることができる。
実施例14〜20は、神経刺激因子をコードする遺伝子を保有する遺伝子ベクターを発作、
脊髄損傷などゆえに障害を負った筋肉組織へ注入する、３番目の主なアプローチ方針につ
いて記載する。これらのタイプの障害を負った筋肉はしばしば、上位運動神経細胞（完全
に血液脳関門内に位置する）及び下位運動神経細胞（血液脳関門にまたがる）間の接触を
正しく機能させることを損うことによって起こるまたは悪化する自発的制御の欠如（また
は障害）を患う。神経刺激因子をコードする遺伝子を用いてこのような障害を負った筋肉
中で下位運動神経細胞をトランスフェクションすることは、下位及び上位運動神経細胞間
で新しい追加の接続を形成し及び／またはそれらの神経細胞クラスの間のシナプス活性レ
ベルを増加し、それによってこのような筋肉系に対する正しい神経支配及び中枢神経系制
御を再構築するなどの手段によって、損傷した運動制御ネットワークを拡大し、修復し、
再接続させるのを助けることができる。
実施例21は、舌の内部に位置するあるタイプの運動神経細胞のトランスフェクションに
ついて記載する。この投与経路は、脳幹のある部分にポリペプチドを送達する経路を提供
するので、特別の注意に値する。
NGFを前脳基底核中のコリン作動性神経細胞に送達するため、嗅覚受容体をNGF遺伝子でト
ランスフェクションするためのアデノウイルスベクターの構築
実験室でのみ存在する遺伝子組み換え宿主細胞以外では複製することができないアデノ
ウイルス由来の非病原性ベクターを調製する方法が、Graham and Prevec 1995などの論文
に公表されている。アデノウイルスベクターにより保有され送達されるのに十分な小さく
、トランスフェクションされたヒト神経細胞内部において有意レベルでNGF（またはGDNF
、NT-3、CNTF、またはBDNFなどの他のいくつかの中枢神経系活性ポリペプチド、または表
１に列記されているような他の多数のポリペプチドのいずれも）を発現する、遺伝子構成
体を作る方法が、Romero et al 2000、Baumgartner and Shine 1998、Dijkhuizen et al
1997、及びGravel et al 1997などの論文に記載されている。そのような遺伝子構成体を
保有するアデノウイルスベクターを増殖させ、精製し、濃縮し、力価測定する方法は、「
Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997）のEn
gelhardtによる章（169〜184頁）などの出版物で見ることができる。
NGFポリペプチド（またはその他の選択された中枢神経系活性ポリペプチド）の発現を
実行する遺伝子構成体は、遺伝子関連部位すべての正確な選択を必要とする。本明細書中
で用いられる「遺伝子」または「遺伝子構成体」などの用語は、通常、既知方法を用いて
実験室条件下で操作することができ、血液脳関門をまたいだ神経細胞にトランスフェクシ
ョンした場合に(i)遺伝子によってコードされるポリペプチドを合成するため神経細胞体
内部で正常な転写及び翻訳機構を引き起こすこと、及び(ii)血液脳関門内部に位置する樹
状突起、突起(processes)、シナプス、またはその他の末端から成熟ポリペプチドを適当
にプロセシングし、分泌するように細胞に指示を出すことが可能である、完全かつ機能的
な転写単位のことを指す。
「発明の詳細な説明」で記載されている多数の変異体及び強化体(enhancements)を含む
、単なる「簡素な基本」タイプの遺伝子構成体の変異体及び強化体の多数が当業者に既知
である。そのような変異体または強化体のいずれも、本明細書中で用いられる「遺伝子」
または「遺伝子構成体」の用語の中に含まれる。
ヒトNGF、マウスNGF、及び他のタイプのNGFの配列（イントロンなし）をコードする完
全なアミノ酸は公開されて知られており、簡単な操作を施されたプラスミドの形態で様々
な研究者から入手することができる。あるいは、それらは既知技術または公開された情報
を用いて作ることができる。
さらに、特異な「エピトープタグ」配列（c-mycなど）を有するポリペプチドを所望す
る場合、遺伝子構成体のコード部分は「エピトープタグ」配列をコードするDNA配列を含
まなければならない。エピトープタグを含むことは、研究者が遺伝子ベクターによってコ
ードされる外因性ポリペプチド分子と試験動物または患者の血液脳関門内に生来存在する
内因性（天然）ポリペプチドとを区別するのをエピトープタグ配列が手助けすることがで
きる状況において、本発明を例証し、洗練し、その他増強するのに役立つであろう。
その他の非常に重要な遺伝子構成体部分は遺伝子プロモーターであり、嗅覚受容体神経
細胞中での遺伝子発現を実行することができる多くの既知遺伝子プロモーターが知られ、
入手できる。嗅覚受容体神経細胞中での特異的な遺伝子発現を実行することが知られてい
る「選択的」遺伝子プロモーターの具体例には、嗅覚マーカータンパク質遺伝子(Serveni
us et al 1994)及びM4嗅覚受容体遺伝子(Qasba and Reed 1998)で同定されたプロモータ
ーが含まれる。このような選択性プロモーターの使用は、望まないまたは制御不能な外部
遺伝子の発現が周囲の細胞または組織で起こる機会を最小にすることに役立つ。
あるいは、所望する場合には、哺乳動物細胞中で異常に強いプロモーターであることが
知られている種々のタイプのウイルス及びその他のプロモーターを、トランスフェクショ
ンした細胞中でNGF（または他の中枢神経系活性)ポリペプチドを最も実際的なレベルで発
現させることを含むような目的のために使用することができる。そのような強力なプロモ
ーターの具体例には、サイトメガロウイルス由来の初期遺伝子プロモーター及びシミアン
ウイルス40由来の後期遺伝子プロモーターが含まれる。所望する場合には、選択されたプ
ロモーターを活性化する誘導因子が十分な量のトランスフェクションした神経細胞中に輸
送されることが保証される方法で投与することができる限り、誘導可能な遺伝子プロモー
ターも用いることができる。
上記の通り、本明細書での議論を簡明にするため、本明細書で用いられる「遺伝子プロ
モーター」という用語には、いわゆる「TATAボックス」及びTATAボックスと実際の転写開
始点との間の約25塩基の配列が含まれる。
いったんプロモーター及び遺伝子構成体のコード配列が選択されれば、ベクターにコー
ドされたポリペプチドの発現、パッケージング、輸送、分泌、及び／または性能を増進す
るために、その他の種々の遺伝子構成体部分を選択することができる。これらの遺伝子部
分には、例えば、(i)ベクターにコードされたポリペプチド（またはリーダー配列または
シグナル配列を取り除くことができる「成熟」体）を適切にプロセシングし分泌すること
をトランスフェクションされた神経細胞に指示する「リーダー」または「シグナル」ペプ
チド配列をコードするDNA配列、(ii)リボソームによる翻訳及び放出を容易にするため、m
RNA中の「停止」コドンに続く「テイル」非翻訳領域として働くmRNA配列に転写されるDNA
配列、及び(iii)DNA配列がmRNA中に転写されているとき、RNAポリメラーゼにmRNA鎖を切
断するように指示する転写ターミネーター配列が含まれる。これらのタイプの機能配列は
既知で、クローニングされた遺伝子がトランスフェクションされた哺乳動物細胞によって
高レベルで発現することを可能にするほぼすべての哺乳動物遺伝子クローニングベクター
から取得または改作することができる。成熟NGF配列に先行するプレプロNGF配列に代えて
、成熟BDNFポリペプチドに先行するプレプロBDNF配列を利用することにより、少なくとも
いくつかのタイプの神経細胞では、血液脳関門内での感覚神経細胞末端からの順行性輸送
及び放出を容易にすることができる。
前脳基底核中のコリン作動性神経細胞にNGFを送達するためのアデノウイルスNGFベクター
の嗅覚上皮への投与
適当な力価濃度でのべクター懸濁水溶液を点鼻することにより、NGF（または他のいく
つかの中枢神経系活性ポリペプチド）をコードする遺伝子構成体を保有するアデノウイル
ス由来（またはその他のウイルス由来）のベクターを、ヒト患者（医療目的のため）また
は試験動物（試験またはその他研究目的のため）のいずれかの嗅覚上皮へ投与することが
できる。
担体水溶液はアデノウイルス及び活性嗅覚上皮と相溶でなければならない。生理生理食
塩水（所望する場合、緩衝剤）を用いることができ、低張液若しくは高張液またはより高
レベルのウイルストランスフェクションを誘導することができるその他の任意の構成要素
を含む溶液も日常的実験を用いて試験することができる。Holtmaat et al 1996などの論
文にはマウスでの点鼻を介してアデノウイルスベクターを効率的に投与するための投与量
及び投与技術についての情報が提供され、このような方法は、当業者に知られた方法を用
いて、ラットまたはウサギなどのより大きな齧歯動物またはその他の哺乳動物での使用に
適合させることができる。
所望する場合、(i)遺伝子ベクターを含む液と嗅覚神経細胞との接触の程度及び／また
は保有期間、及び(ii)このような遺伝子ベクターを取り込むための神経細胞の受容性を増
加するための工程を取ることができる。このことは、例えば、遺伝子ベクター投与の数時
間前に試験動物（またはヒト患者）に鼻鬱血除去薬を投与することにより行うことができ
、ベクター投与前に副鼻腔を直ちにリンス及び／または洗浄するための水溶液（及び、場
合によっては、粘液質の、油質の、または他の粘性の皮膜のいずれをも取り除くのに役立
つことができるイソプロピルアルコールまたはアセトンなどの希釈溶液を用いたスワビン
グ(swabbing)工程）を用いることにより行うことができる。嗅覚神経細胞の受容性は、小
さな針金ループ、丸いへらの先端、または類似の道具を使用して穏やかな機械的摩擦を用
いることにより増加させることもできる。一般に、穏やかな炎症の時点まで刺激した表面
領域内の神経投射は、休止または休息状態であると認められる細胞よりも、外部分子の細
胞取り込みに対してより受容的である傾向がある。
遺伝子発現に十分な時間をとった後（通常約24時間から72時間）、いくつかの試験動物
を犠牲死させ、嗅覚上皮、嗅球、及び前脳基底核を取り除き、各組織をタイプ別に処理し
、そのタイプの組織内におけるベクターにコードされるポリペプチドの位置及び濃度を測
定することにより、遺伝子ベクターの送達効率を評価することができる。
ベクターにコードされるポリペプチドが内因性（おそらく齧歯動物の）ポリペプチドと
顕著に異なる場合、測定及びモニタリングの労力を比較的簡単なものとすることができる
。これらのタイプの分析は、(i)Xian and Zhou 2000などの論文に記載されるような方法
を用いて、内因性mRNA配列ではなくベクターmRNA配列に相補的なDNAプローブで細胞のmRN
Aをハイブリダイゼーションすること、(ii)Chie et al 2000などの論文に記載されている
ような、「ポリメラーゼ連鎖反応」（PCR）試薬を用いた技術及びベクターからDNAまたは
mRNA配列を検出するための方法、及び(iii)用いられたベクターによってコードされるポ
リペプチドまたはエピトープタグに選択的に結合し、試験種の内因性ポリペプチドに結合
しないモノクローナル抗体を用いる免疫染色法または類似方法などの方法を用いることが
できる（これらの抗体は市販により入手でき、所望する場合にはConner 2000、Rush et a
l 2000、及びZhang et al 2000などの論文に開示されている方法を用いて調製することも
できる）。
所望する場合、トランスフェクションされた嗅覚受容体による外因性mRNA及び／または
ポリペプチドの発現の時間依存レベルを、遺伝子ベクター投与後のある時間範囲にわたっ
て１回以上の試験を繰り返すことによって測定することができる。
所望する場合、データ分析の目的で細胞及び動物の対照個体群を提供するため、ヒト（
またはエピトープタグ付加された動物）のポリペプチド遺伝子構成体を保有する遺伝子ベ
クターを、試験動物の副鼻腔の片側にある嗅覚上皮に投与することができ、他のいくつか
の遺伝子（簡単に検出されるポリペプチドをコードするマーカー遺伝子など）を保有する
制御ベクターを動物の副鼻腔のもう一方の側にある嗅覚上皮に投与することができる。動
物を犠牲死させた後、左右の嗅覚受容体、嗅球、及び前脳基底核領域の組織学的及び免疫
学的な検査を用いて、(i)トランスフェクションされた嗅覚受容体によるポリペプチド発
現、及び(ii)血液脳関門にまたがる受容体細胞による、血液脳関門内部に位置する他の部
類の神経細胞へのポリペプチド輸送及び送達を評価することができる。
前脳基底核中のコリン作動性神経細胞へのNGFポリペプチド送達のモニタリング
完全に血液脳関門内にある中枢神経系領域にトランスフェクションされた嗅覚受容体神
経細胞（または血液脳関門にまたがり、かつ遺伝子ベクターによってトランスフェクショ
ンされた他のタイプの感覚神経細胞）を介して送達されるNGFポリペプチド（またはベク
ターにコードされている他の中枢神経系活性ポリペプチド）の量を、犠牲死させた試験動
物から得た細胞及び組織の組織学的及び免疫学的な分析を用いて、注目する特定の種類ま
たは部域の神経細胞でモニタリングすることができる。
嗅覚受容体神経細胞またはその他のタイプの感覚神経細胞への遺伝子ベクターの投与後
、中枢神経系内における任意の対象位置でのヒトNGF（または動物に投与された遺伝子ベ
クターによってコードされている他の任意の中枢神経系活性ポリペプチド）の生産、放出
及び分布をモニタリングし定量化するために、免疫組織化学及び「酵素免疫測定法」(ELI
SA)試験などの十分に確立された免疫方法を用いることができる。ヒトNGFがベクターにコ
ードされるポリペプチドである場合、マウス、ラット、またはその他の齧歯動物のNGFで
はなくヒトNGFを認識しこれに結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体の調製品
は市販により入手でき、あるいは文献（例えばConner 2000；Rush and Zhou 2000）で良
く解説された方法を用いて生成することができる。免疫組織化学を用いてNGFレベルを測
定する方法はConner et al 1992などの論文に記載され、ELISAを用いてNGFレベルの測定
する方法はZhang et al 2000などの論文や、商業的供給源から購入できるNGF-ELISA検出
キットに含まれている製造指示書に記載されている。
上記で簡単に説明した通り、ベクターが発現する（おそらくヒト）ポリペプチドを認識
しこれに結合するが、同種のマウスまたはラットのポリペプチドには結合しないモノクロ
ーナル抗体を用いた場合には、マウスまたはラットなどの実験動物でのベクターにコード
されるヒトポリペプチドのモニタリングをより簡潔かつより確実にすることができる。マ
ウスまたはラットNGFではなくヒトNGFに選択的に結合するモノクローナル抗体を発現する
ハイブリドーマ細胞株は作り出されており、そのようなモノクローナル抗体調製品を入手
することができる。齧歯動物ではなくヒトの他の中枢神経系活性ポリペプチドに選択的に
結合するモノクローナル抗体を発現する類似のハイブリドーマ細胞株も当業者に知られた
方法を用いて作製または構築することができる。
あるいは、またはさらに、上記の通り、Moller et al 1998などの論文に記載された方
法を用い、神経栄養遺伝子構成体の配列中にエピトープタグ（c-mycなど）を組み込んで
、トランスフェクションされた神経細胞中でのその遺伝子構成体によって発現されたポリ
ペプチドの免疫学的検出を容易にすることができる。このようなアプローチを用いた場合
、ベクター構築物によって発現されたポリペプチドは、そのポリペプチドによる治療のた
めの標的とされている神経細胞へ正確に送達するのに必要なすべての工程を行うことがで
きることを確認することが重要である。
例えば、特定方法の目的が治療用ポリペプチドを前脳基底核コリン作動性神経細胞の主
要な細胞体に送達することであり、ポリペプチドのモニタリングを容易にするために「エ
ピトープタグ」配列を用いる場合、標的の前脳基底核コリン作動性神経細胞が、トランス
フェクションされた血液脳関門にまたがる神経細胞によって分泌されたベクターにコード
されかつエピトープタグ付加されたポリペプチドの取り込み（受容体仲介エンドサイトー
シスなど）及び逆行性輸送を行ったことを保証するように、該標的の前脳基底核コリン作
動性神経細胞を評価することができる。これらのタイプの確認試験は、ベクターにコード
されるポリペプチドが標的の前脳基底核コリン作動性神経細胞によって取り込まれたこと
を実証するために、エピトープタグ配列に（及び／またはタグ配列とともに天然アミノ酸
配列の一部分を含む融合ポリペプチド中のドメインに）特異的に結合するモノクローナル
抗体などの試薬を用いる、Altar & Bakhit 1991、Ferguson et al 1991、DiStephano et
al 1992、及びvon Bartheld 2000などの論文で記載されている方法を用いて行うことがで
きる。
ベクター由来のNGFが抗原またはエピトープタグを保有している場合、タグ付きポリペ
プチドに選択的に結合するモノクローナル抗体は既知の方法を用いて作り出すことができ
、その後の免疫組織化学的測定またはELISA測定のいずれにも用いることができる。所望
する場合、NGFまたは他のいくつかの中枢神経系活性ポリペプチドの送達（及び血液脳関
門内部の組織に対するその後の神経学的及び生理学的効果）が嗅覚受容体神経細胞への遺
伝子ベクターの投与によって実際に仲介されていたことの確認は、Horowitz et al 1991
によって記載されているような硫酸亜鉛溶液などの化合物を用いた治療によってコントロ
ール動物でこれらの神経細胞を除去することにより行うことができる。
経シナプス追跡研究(例えばLafay et al 1991、Barnett et al 1993）に基づいて、NGF
などのベクターが発現するポリペプチドは、嗅覚受容体神経細胞での遺伝子発現に十分な
時間（おおよそ24時間から72時間の時間範囲が必要である）を与えた後に前脳基底核コリ
ン作動性受容体神経細胞で検出できることが一般に予測される。この期間には、嗅糸球体
中での受容体神経細胞のシナプス末端へのポリペプチド（該ポリペプチド発現後）の逆行
性輸送、該嗅糸球体内でのポリペプチドの分泌（約８時間から24時間）、及び前脳基底核
コリン作動性神経細胞へのポリペプチドの輸送（約８時間から24時間）が含まれることが
予測される。
実施例８で議論するように、あるタイプの「経ニューロン性」ベクターも本明細書中に
開示されている。その部類のベクターは、受容側の神経細胞を外部遺伝子でトランスフェ
クションして、完全に血液脳関門内に位置している１つまたは複数の部類の「下流の」神
経細胞に治療用外部ポリペプチドを発現させるように、感覚神経細胞によって血液脳関門
内部の他のタイプの神経細胞へ移すことができるであろう。
しかしながら、神経細胞間の「経ニューロン性」輸送を付与する特定の工程を取らない
限り、(i)本明細書に開示されているような遺伝子ベクターによる初期または「一次」神
経細胞（血液脳関門にまたがる神経細胞）のトランスフェクションによって、血液脳関門
内部の他の非一次神経細胞へのベクターの輸送が起きることはなく、(ii)永久的な遺伝子
形質転換というよりはむしろ一過性の遺伝子発現が結果として起こることが考えられる。
嗅覚受容体神経細胞などの感覚神経細胞がトランスフェクションの標的として用いられる
場合、そのような細胞でのベクター媒介遺伝子の発現は、最高ピークまたはプラトーレベ
ルのポリペプチド発現後の数日から数週間中に、実質的に減少し、完全に停止するであろ
うことが予期される。所望する場合、同じまたは類似した遺伝子ベクターを嗅覚受容体神
経細胞に再度与えることにより、血液脳関門により保護された中枢神経系組織中にNGFの
追加供給を送達することができる。
前脳基底核中におけるコリン作動性神経細胞へのNGF送達の生理学的効果のモニタリング
本明細書中に記載された遺伝子ベクター方法を用いて血液脳関門により保護された中枢
神経系組織に中枢神経系活性ポリペプチドを送達した際の実際の生理学的、行動的、及び
その他の効果の分析を可能にし及び向上するために、実験動物（またはこのタイプの治療
の臨床試験に志願するヒト）を(i)NGFまたは他のいくつかの選択された神経栄養性または
中枢神経系活性ポリペプチドをコードする遺伝子ベクターを受容する試験群；(ii)プラセ
ボ治療を受けるコントロール群の２つの群に分けることができる。プラセボ治療は、注入
部位の同一処理（鼻内壁の鬱血除去、リンス、スワビング、引っかき、及び／またはその
他の刺激を伴う同一の治療）に続き、(a)遺伝子ベクターが無い純粋な生理食塩水の点鼻
、あるいは(b)例えば、無害及び／または非機能性の遺伝子、いかなるポリペプチドをも
コードしないナンセンスDNA配列、または哺乳動物細胞で発現する場合には簡単に検出さ
れることができるが有意な生理学的効果がないポリペプチドをコードするマーカー遺伝子
を保有し得る遺伝子ベクターを含む溶液の点鼻のいずれかを用いなければならない。
動物試験をする場合、中枢神経系活性ポリペプチド（NGFまたは他のいくつかの神経栄
養因子など）を血液脳関門を通して保護された脳組織に導入することにより、少なくとも
２つのカテゴリーの観察可能な相違の一方または双方をもたらすであろう：(i)犠牲死さ
せた動物から除去された脳組織部位の組織学的、免疫学的、または他の生物学的分析によ
って評価することができる脳の神経解剖学に対する効果、及び(ii)動物の行動に対する観
察可能かつ測定可能な効果。
観察可能かつ測定可能な行動形態（迷路、水迷路などを含む事前の試みで直面したこと
を覚えている治療マウスまたはラットの能力など）に基づいて、実験動物の中枢神経系の
内部で起こったと思われることを評価するために多くの試験が開発された。さらに、その
ような他の試験を開発中であり、現在知られているか以後に発見されるそのような試験の
いずれも、完全に血液脳関門内に位置する標的神経細胞に対するポリペプチドの生理学的
効果の評価が適切であるとの条件で、用いることができる。
これらの試験の多くは、損傷、発作、神経変性疾患、またはその他の中枢神経系障害を
モデル化するために、動物の中枢神経系にいくつかのタイプの損傷を負わせる外科的また
は薬物介入を伴うことに注意すべきである。次いで、その後の試験では、ある治療がその
ような動物が負った損傷または疾患から回復するのに役立つかを評価することを追及する
。
そのような試験の一例は、海馬に投射した前脳基底核コリン作動性神経細胞軸索を「軸
索切断」した多用されるモデルである「海馬采脳弓損傷モデル」である（すなわち、神経
細胞の主要な軸索が外科的に切断される。治療しない場合、これは、典型的には、ほとん
どの種で約２週間以下の期間で神経細胞を萎縮させ死に至らしめる）。これは、前脳基底
核コリン作動性神経細胞の萎縮及び変性を誘導する(例えばHefti 1994）。しかしながら
、これは、海馬采脳弓まで投射している前脳基底核コリン作動性神経細胞が嗅球に投射し
ていないので、本明細書で開示された発明を評価する好ましい損傷モデルではないであろ
う。
代わりに、本明細書で使用するための好ましい損傷モデルは、本明細書で開示されるタ
イプの治療に直接関与するか、または影響を受ける神経経路の１つを破壊しなければなら
ない。例えば、（嗅球及び皮質の双方に投射している）ブローカ後肢の神経細胞の皮質投
射を外科的に切断する一方で、（嗅球からのNGFの逆行性軸索フローが遮断されないよう
に）嗅球への投射をそのままにしておくことにより、研究者が本明細書に開示された治療
の効果を評価することが可能となるより良い試みの形態を提供するであろう。
軸索路を切断する動物モデルの代替的アプローチは、前脳基底核コリン作動性神経細胞
から内因性NGFを取り除き、それによって前脳基底核コリン作動性神経細胞の萎縮及び変
性を誘導するように、特定の適切な標的組織を取り除くことである。このアプローチは、
一般に、発作に関連する興奮毒性損傷の効果をモデル化することができる。公開されてい
る例には、海馬組織の除去について記載しているSofroniew et al 1993が含まれる。ブロ
ーカ後肢からの神経支配を受ける嗅内皮質組織を除去して(Wenk et al 1980)ブローカ後
肢の前脳基底核コリン作動性神経細胞の萎縮を誘導するように、この方法を改変すること
ができる。
Sofroniew et al 1993に記載されている一般的方法を用いて、前脳基底核コリン作動性
神経細胞体の大きさに対するNGF送達（嗅覚受容体神経細胞のトランスフェクションなど
、本明細書で開示された遺伝子ベクターを用いる）の効果をモニタリングすることができ
る。および／またはNGFの存在または量によって直接影響を受ける１つまたは複数の酵素
またはその他のポリペプチドのレベルを評価することによってモニタリングすることがで
きる。そのような酵素またはポリペプチドは、したがって指標ポリペプチドとして用いる
ことができる（そのような測定に有用であろう候補酵素の一例は、アセチルコリン合成に
必要であるコリンアセチルトランスフェラーゼ、すなわちChATである）。除去された、軸
索切断された、またはその他の攻撃を受けた皮質中枢神経系組織の選択領域を有する動物
を試験するために、NGFを（脳室内への注射または注入などによって）中枢神経系に投与
したときに観察および測定することができる別の神経解剖学的効果は、損傷によって誘導
される生存皮質中のChAT免疫反応性線維の密度低下を防止または減少させるNGF投与の能
力によって示される（例えばGarofalo et al 1992)。したがって、１つまたは複数の皮質
中の選択領域を除去するか、または損傷を与える外科的介入または他の介入の後、生存す
る皮質中のChAT免疫反応性線維密度に対するNGF送達の効果（本明細書で開示される遺伝
子ベクターから生じる）をモニタリングするために、Garofalo et al 1992などの論文に
記載される方法を用いることができる。
神経解剖学的変化に加えて、皮質の除去により、ある種の測定可能な行動が低下し、試
験動物において学習及び記憶を必要とする種々の試験に対する正常な行動と悪化した行動
とを区別することができる。具体例には、「モリス水迷路」、受動的回避試験、反応試験
、及びGarofalo and Cuello 1994などの論文に記載されているような他の種々の動物モデ
ルを含む。このような試験動物における外因性NGFの中枢神経系組織への投与（脳室内へ
の注射または注入など）により、損傷によって誘導される動物の行動欠陥が有意に軽減さ
れ得ることが示されている。したがって、そのような行動、記憶及び／または学習の試験
は、血液脳関門にまたがる神経細胞の遺伝子ベクター処理を介して前脳領域へのNGF送達
の効果をモニタリングすることに適用及び使用され得る。
モリス水迷路などの試験によって測定されている通り(Fischer et al 1987及び1991）
、加齢も記憶及び学習性能を低下させる結果となるが、記憶及び学習性能の老化関連的な
衰退は、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー病のヒト患者及び種々の動物モデル
の双方）で起こる記憶及び学習の損失を測定及び定量化するために用いられてきた。外因
性NGFの中枢神経系組織への投与（脳室内への注射または注入など）によって、記憶及び
学習における少なくともいくつかのタイプの老化関連的な衰退を有意に軽減することがで
きることが示されている。したがって、そのような動物モデルで用いられる学習及び記憶
試験のタイプは、本明細書で開示された方法及び遺伝子ベクターによる中枢神経系へのNG
F送達の効果をモニタリングするのに用いることができる（Fischer et al 1987及び1991
）。
本明細書の実施例３及び４で言及されるモニタリング及び測定方法は、網羅的でも排他
的でもなく、当業者に知られているか以後に発見された他のモニタリング及び測定方法に
よって補足することができる。
NGFの非侵襲性送達用の単純ヘルペスウイルス由来ベクターの構築及び使用
上記の実施例は、血液脳関門により保護された中枢神経系組織へのNGFの非侵襲性送達
の経路及び方法として、血液脳関門にまたがる嗅覚受容体神経細胞について遺伝子をトラ
スフェクションをするためのアデノウイルス由来ベクターの使用及び評価について記載す
る。しかしながら、アデノウイルスベクターは、血液脳関門で保護された中枢神経系組織
へのポリペプチドの非侵襲性送達に用いることができる唯一のタイプの遺伝子ベクターで
はないと認知しておくべきである。したがって、実施例５〜８には、その他のいくつかの
部類の遺伝子ベクターの使用について記載している。
ヘルペスウイルスから得られ、かつ中枢神経系活性ポリペプチドをコードする１つまた
は複数の「運送物」遺伝子を保有する、本明細書に開示される遺伝子ベクターを構築する
ために、Goins et al 1999またはFederoff et al 1992などの論文に記載される方法を用
いることができる。HSV由来ベクターは、嗅覚受容体神経細胞を含む広範な種々のヒト細
胞をトランスフェクションすることができ、トランスフェクションされた血液脳関門にま
たがる神経細胞に運送物遺伝子を発現させ、かつ、そのようなポリペプチドを有意レベル
に分泌することを誘導することができる。
したがって、HSV由来ベクターは、所望する場合、実施例１〜４で記載されたアデノウ
イルス由来ベクターの使用と直接比較できる形式で用いることができる。実施例２〜４に
記載される方法（適宜、当業者に知られたその他または別の方法によって補足される）は
、HSV由来ベクターの点鼻及び転写後のモニタリング及び評価のために用いることができ
る。
NGFの非侵襲性送達のための脂質ベースのベクターの構築及び使用
哺乳動物細胞をトランスフェクションするために設計されたDNAプラスミド−脂質複合
体を調製する方法が、「Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.
Robbins出版1997)のNabelによる章（127〜133頁）などの多数の出版物に記載されている
。遺伝子導入に使用するために設計された種々のリポソーム調製キットは市販入手が可能
であるし、あるいは公開された方法を用いて熟練技術者は設計し作製することもできる。
特定の大きさ、タイプまたは濃度のプラスミドDNAまたは他のDNA調製物とともに使用され
る脂質配合物及び調製物のパラメーター（調製混合物中の脂質及びDNAの濃度及び比率、
温度などを含む）の好ましい選択は、多数の論文及び市販入手が可能であるほとんどのキ
ットに付いている説明書で論じられているパラメーターの範囲及び確認試験を用いて、種
々の調製混合物を日常的に試験して決定することができる。
生理食塩水溶液またはその他の担体液中に懸濁している脂質−遺伝子複合体の点鼻によ
る脂質ベース遺伝子ベクターの嗅上皮への投与は、実施例２に記載されたのと同じ一般的
方法を用いることができ、当業者に知られた手段によってそのような使用に適合させる。
実施例３及び４に記載される方法（適宜、当業者に知られたその他または別の方法によっ
て補足される）は、トランスフェクション後のモニタリング及び評価に用いることができ
る。
エンドサイトーシス受容体を標的とするDNAベクターの構築及び使用；サイクル式リガン
ド選択方法
「受容体標的性の遺伝子ベクター」を調製するために用いることができる一般的な原理
及び方法は、「Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins
出版1997）のFindeisの章(135〜152頁)などの種々の出版物に記載されている。上述した
通り、これらのベクターは、神経細胞表面上に曝されているある種の受容体に結合するリ
ガンドを含む。
「背景技術」で言及した通り、多くの既知タイプの神経細胞表面受容体は、リガンド分
子が受容体に結合した後、「エンドサイトーシス」と呼ばれる行程を受ける。名前に示唆
されている通り、エンドサイトーシス受容体は、リガンド分子がそれに結合した後、細胞
内部に取り込まれる。このような活性は放射標識したリガンドを用いた試験によって示す
ことができる。
エンドサイトーシス受容体の一例は、種々の感覚神経細胞（嗅覚受容体神経細胞を含む
）の表面上でアクセス可能な「p75」受容体である。該受容体はヒト及びラットの両方に
存在することが示されており、種々の研究に非常に有用である。これは、p75-NGFR受容体
（ここでNGFRは「神経成長因子受容体」を表す）としても知られ、危機またはストレス状
態を受けた種々の神経細胞で「上方制御(up-regulated)される」（すなわち、受容体をコ
ードするmRNAの発現が増加し、神経細胞表面上に現れる受容体の数が増加する）ことが示
されているので、本明細書に記載の使用において特別関心が高い。具体例として、末梢神
経損傷後にラット運動神経細胞でp75発現が増加し(Yan et al 1998）、筋萎縮性側索硬化
を患ったヒト患者の運動神経細胞でもp75の発現が増加した(Seeburger et al 1993）。
（理想的には試験または治療される種における）標的種類の神経細胞上のエンドサイト
ーシス受容体に結合する適切なリガンドの選択及び／または作製は、このような効果的な
受容体標的性の遺伝子ベクターの構築が鍵である。種々のそのようなリガンドはすでに既
知であり、その他のリガンドは上記に簡潔にまとめたような方法を用いて作製することが
できる。
エンドサイトーシス受容体はタンパク質であるので、通常、モノクローナル抗体の作製
中に抗原として受容体由来のポリペプチド配列を用いることによって、任意の当該受容体
に結合する相補的なポリペプチドを作製することが可能である。既知技術を用いて、受容
体由来の抗原配列をマウス、ラットまたはウサギなどの動物に注射し、次いで得られた抗
体産生細胞を不死化細胞株と融合し、得られた「ハイブリドーマ」細胞をスクリーニング
して、興味対象の受容体に対して高親和性で結合するモノクローナル抗体を分泌するクロ
ーン細胞株を同定し単離する。いったん所望のモノクローナル抗体株が作製され同定され
ると、通常、そのモノクローナル抗体の可変結合部分(しばしば頭文字「scFv」断片など
により参照され、ここで、「sc」は「単鎖」を指し、「Fv」は結合ドメインを含む可変断
片を指す）から、より小さいドメインまたは断片を単離することができる。次いで、その
結合断片をコードする遺伝子配列をプラスミドまたはその他のベクターに組み込んで、限
られた量の受容体リガンド断片を宿主細胞の発酵によって合成することができる。
その一般的なアプローチにより、１つまたは複数の末梢投射を有する任意の感覚神経細
胞上の任意の既知エンドサイトーシス受容体に本質的に結合するモノクローナル抗体を作
製することができる。
p75受容体の具体例の続きとして、192-IgGとして知られるモノクローナル抗体(Chandle
r et al 1984に記載）は、ラットのp75受容体に対して高親和性で結合することが示され
ている。192-IgGモノクローナル抗体（及び該抗体由来の種々の断片）は、p75受容体を発
現する末梢投射性の神経細胞でエンドサイトーシスを受け、逆行性輸送されることが示さ
れている(Yan et al 1988）。
いったん受容体結合性リガンドとして機能できるポリペプチド配列が同定されると、種
々の試薬を用いてDNA部分をリガンドポリペプチドに一時的に連結させ、それによりポリ
ペプチド−DNA複合体を作製することができる。１つの好ましい方法では、リガンドポリ
ペプチドに連結して、一連のリシン残基から成る「ポリリシン」ドメイン（または生理学
的ｐＨで正電荷を有するその他のアミノ酸残基）を有するポリペプチドを作製することが
できる。宿主細胞中でポリペプチドを発現するために用いられるポリペプチドコード遺伝
子に一連のリシンコドンを付加すること、あるいは二官能性の架橋試薬を用いてポリリシ
ンをポリペプチドに化学的に連結することなど、いつくかの方法によって、これを行うこ
とができる。化学的親和力のため（ポリリシン鎖は正電荷を有し、DNA鎖は負電荷を有す
る）、DNA部分は、ポリリシン「テイル」を有するポリペプチドに非共有的な形式で付着
する。ポリペプチドのリガンド部分がエンドサイトーシス受容体に結合すると、ポリペプ
チド−ポリリシン−DNA複合体全体（加えて、受容体たんぱく質も）が細胞内へ取り込ま
れるプロセスが開始する。複合体が細胞内に取り込まれた後、DNA分子は放出され、細胞
内で逆行性輸送されうる。
あるいは、ニューロトロフィン受容体のための通常のリガンド（NGF受容体に結合するN
GFなど）を用いることができる。放射標識されたNGFは、「trkA」と呼ばれる受容体を発
現する感覚神経細胞で、受容体仲介性に取り込まれ(internalization)、逆行性輸送され
ることが示されている(例えばBarbacid 1995）。したがって、NGFポリペプチドそれ自体
を、その受容体を有する細胞のリガンドとして用いることができる。NGFポリペプチドそ
れ自体（及び種々の他の神経細胞受容体リガンド）は、染色体に結合するDNA結合タンパ
ク質の部類であるヒストンで見出される正電荷と類似した正味の正電荷を有することに注
意しなければならない。したがって、まずポリリシンまたはその他類似の正荷電ドメイン
または共役体をNGFまたはその他の正荷電ポリペプチドに付加することは全く必要なく、
または最小限に留めることができ、ポリペプチドそれ自体が、受容体標的リガンド及びDN
A担体の双方として機能することができるであろう。
その他の種々の既知化合物もまた、１種類以上の血液脳関門にまたがる神経細胞上のエ
ンドサイトーシス受容体に結合することができるリガンドとして、及び／または遺伝子ベ
クターまたはそのある部分が神経細胞内に取り込まれた後に逆行性輸送または他のある機
能を促進することができるペプチド配列として使用される可能性について評価することが
できる良い候補となる。ほんの一例として、Wiley and Lappi 1993は、(i)p75神経細胞受
容体に結合するモノクローナル抗体192-IgGを、(ii)サポリンと呼ばれる植物由来毒素（
これは神経細胞体への細胞内輸送を促進し、そこでリボソームを不活性化すると信じられ
ている）に連結することにより形成した共役体について記載している。Wiley and Lappi
によると、この共役体は、研究目的のために特定の標的となる神経損傷を生じさせるのに
有用であると報告された。したがって、本明細書ではそれを「プローブ」化合物とみなす
。当業者に知られた方法を用いて、DNAの一部分は(i)「プローブ」化合物に非共有的に連
結され、(ii)プローブ化合物の助けで神経細胞体へと輸送され、次いで(iii)取り込み及
び輸送工程が完結した後に、プローブ化合物から細胞体に放出されることを可能とする形
式で、上記の、または類似のプローブ化合物を改変し適合させて、それらを神経細胞に対
して非致死性にすることが可能である。
さらに多様な神経毒が、クモ、ハチ、ヘビ、海洋性カタツムリ、及びその他の毒を出す
生物から得られている。より多く見られる神経毒の特徴の１つは、神経毒が、神経投射の
表面上の１または複数のタイプの受容体及び／またはイオンチャンネルに（しばしば非常
に高レベルの結合親和性で）結合することである。これは、野生生物が餌食を麻痺又は不
活動化させるために、または攻撃者に対し防衛をするために用いる重要なメカニズムの１
つである。猛毒の動物に噛まれ、または刺されたことによって通常生ずるレベルの痛みを
与えることなく医学上有用となりうる治療剤を求めて、このような神経毒の相当数が、神
経細胞受容体またはイオンチャンネルに対してより低い非毒性レベルの結合親和性を示す
アナログ、共役体、及びその他の変異体及び誘導体を形成するために、生化学研究者によ
って改変される。
さらに、病原菌由来の種々の毒（破傷風毒素、コレラ毒素などを含む）及び植物由来の
種々の化合物（レクチンまたは凝集素として知られるカテゴリーに属する化合物を含む）
が、本明細書に記載の使用のための候補となり、遺伝子ベクターが１つまたは複数の種類
の血液脳関門にまたがる神経細胞に結合し該神経細胞をトランスフェクションするのを助
ける選択的リガンドとなるかどうかを決定することについて評価することができる。
したがって、任意のそのような既知のまたは以後に発見された神経毒、微生物毒素、植
物レクチン、または血液脳関門にまたがる神経細胞の表面上に見られる１つまたは複数の
受容体、イオンチャンネル、蛋白質、糖共役体、またはその他の分子に選択的に結合する
ことができる他の機能的に類似した化合物、及びそのような神経細胞結合化合物のアナロ
グ、共役体、またはその他の変異体または誘導体のいずれもが、１つまたは複数のタイプ
の血液脳関門にまたがる神経細胞に遺伝子ベクターが選択的に結合しトランスフェクショ
ンするのを助けることができるリガンドとして、本明細書に開示された使用の可能性につ
いて評価され得る。
３番目の代替的アプローチとして、「好ましい実施形態」に記載され、図１に図示され
ている通り、ファージディスプレイライブラリーを用いる「コンビナトリアルケミストリ
ー」のアプローチを用いることができる。簡潔に言うと、このアプローチは、リガンドポ
リペプチド候補のアレイを作製するために、各ファージが単一のポリペプチド断片を発現
するファージディスプレイライブラリーを用いる。坐骨神経などの神経束上に位置する結
紮糸による閉塞を有するラットなどの生体内の神経細胞によって行われる受容体仲介性エ
ンドサイトーシス行程を用いて、すべてのアレイのファージをスクリーニングする。続い
て、（宿主細菌に感染することができる）生存ファージ粒子を、結紮糸の位置の直ぐ隣の
「遠位の」切り出した神経細胞セグメントから収集する。次いで、次の世代のファージを
成長させるために、収集したファージ粒子を大腸菌細胞に接種する。この新しい世代のフ
ァージは、結紮糸の隣の位置で神経細胞内に存在していた上記特定ファージを含む。「背
景技術」でより詳細に記載されている通り、当該ファージを実験室動物に接種し、続いて
処理した該実験室動物から回収した方法の点から、このスクリーニング方法によって選択
された特定ファージは、その特定ファージを(i)エンドサイトーシスプロセスによって神
経細胞の末梢投射内に取り込ませ、そして(ii)神経細胞軸索内で、結紮糸の隣の部位まで
逆行性輸送させるリガンドポリペプチド配列をおそらく発現しているに違いない。
このようなスクリーニング及び選択方法を数回繰り返すことにより（及び、所望する場
合には、高性能ファージ株に無作為または標的の突然変異誘発を起こすことにより）、エ
ンドサイトーシス受容体に結合してエンドサイトーシスを引き起こすリガンドとして非常
に有効であるポリペプチド配列をコードする挿入遺伝子を有するクローンファージ株を同
定することができる。それらのファージを分析し、リガンドの遺伝子配列およびアミノ酸
配列を決定し、その後非常に有効な受容体標的性トランスフェクションベクターを作製す
る際に使用する。
所望する場合、「フローサイトメトリー」と通常呼ばれる既知の機械を用いて行うこと
ができる「蛍光標示式細胞分取器」(FACS)などの種々の検査の使用により、このようなサ
イクル式スクリーニング方法をさらに改良することができる。如何にしてこの方法を用い
ることができるかの例として、プラスミド、ファージ、または「ファージミド」DNAをロ
ーダミンなどの化合物を用いて蛍光標識することができる。表面上にp75受容体を有する
ことが知られている組織培養で増殖した細胞を、種々のポリペプチド−DNA複合体ととも
にインキュベートし、次いでその細胞を、蛍光検出器を備える細胞分取機器に通す。特定
細胞から放出された蛍光が比較的強い場合、そのことは、ある細胞が標識されたポリペプ
チド−DNA複合体を大量に取得したことを示しており、同調した非常に短い気体または液
体噴流によってその特定細胞を含有する液体流は別々の回収装置に分けられる。このよう
にして、大量の「取り込まれた」DNAを含む細胞を高速自動装置を用いて早く容易に単離
することができ、続いて、高レベルのポリペプチド−DNA複合体の細胞内取り込みを引き
起こしたポリペプチドを評価または複製するために、再生産し、分析し、又は処理するこ
とができる。これは、本発明を簡素化し改良するために如何にして自動分析及び操作を用
いることができるかの単なる一例であり、その他の方法も当業者に明らかである。
今のところ、アデノウイルス由来の（または同様に作用する他の種々のウイルス由来の
）既知のキャプシドタンパク質にDNAセグメントを連結することにより、別の代替的DNA−
タンパク質複合体を調製することができる。このアデノウイルスキャプシドタンパク質は
、複合体が標的細胞に入った後にエンドサイトーシス小胞からベクター保有DNAの効率的
な放出を促進するのを助けることが知られている。このアプローチは、「Ｍethods in Mo
lecular Medicine: Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997）のCurielによる章（
25〜40頁）に記載されている。所望する場合には、アデノウイルスキャプシドタンパク質
配列及び受容体結合リガンド配列を融合タンパク質中で結合して一体化することができる
。
このような受容体標的性トランスフェクションベクターの点鼻では、実施例２及び６に
記載されるのと同じ一般的方法を用いることができる。それらの一般的方法は、当業者に
知られた手段によって、特に受容体標的性リガンドベクターを用いた使用のために適合さ
せることができる。実施例３及び４に記載された方法及び当業者に知られたその他の方法
を、トランスフェクション後のモニタリング及び評価のために用いることができる。
脳内の二次神経細胞へのNGF遺伝子を送達するための経ニューロン性ベクターの構築及び
使用
本実施例では、血液脳関門内に完全に位置する神経細胞内に外来遺伝子（外来遺伝子に
より発現されるポリペプチドだけではない）を輸送することができる「経ニューロン性」
遺伝子ベクターを構築するための方法を説明する。言い換えれば、このような経ニューロ
ン性遺伝子ベクターの目標は、単に血液脳関門にまたがる神経細胞ではなく、トランスフ
ェクションされた血液脳関門にまたがる「一次」神経細胞とシナプス接合を共有する他の
「二次的な」または「二次」神経細胞（及び二次神経細胞とシナプス接合を共有する三次
神経細胞も同様に可能性がある）をトランスフェクションし、遺伝子的に形質転換するこ
とである。経ニューロン性ベクターは、完全に血液脳関門内に位置する神経細胞により分
泌されることができる新しいポリペプチド及び／または補充されるポリペプチドの量及び
分布を共に大きく増加することができる。この治療は、パーキンソン病やアルツハイマー
病などの、広範囲性かつ播種性の脳傷害により特徴付けられるある種の脳変性疾患を治療
するのに有効な方法となり得る。
これらの経ニューロン性ベクターは、二次（または三次またはそれ以降の）神経細胞に
侵入した後、自身のマルチコピーを複製し産生することは期待されないことを認知してお
くべきである。その代わりに、このような経ニューロン性ベクターの目標は、完全に血液
脳関門内に存在する「下流の」神経細胞に、これらのベクターを単に配置させることであ
って、血液脳関門にまたがる「一次」神経細胞に該ベクターを限局させることではない。
しかしながら、（アデノ関連ウイルス由来の末端反復配列を用いてプラスミドの転写単位
を挟むなどの工程により、下流神経細胞内の染色体への遺伝子配列の組み込みを促進する
ための追加手段をとる場合に、より起こり易く、より頻繁に起こる）いくつかのケースに
おいて、このアプローチは、完全に血液脳関門内にあって該血液脳関門内によって保護さ
れる中枢神経系神経細胞に対する非侵襲性の遺伝子治療法をもたらしうることが認められ
る。
経ニューロン性ベクターを構築するための現在期待されているアプローチは、(i)破傷
風毒素の「非毒素フラグメントＣ」（例えばKnight et al 1999)；(ii)大麦レクチン(Hor
owitz et al 1999）；及び(iii)小麦胚凝集素(Yoshihara et al.1999)など、ある種の病
原体及びポリペプチドの経ニューロン性輸送について知られる種々の事実に基づく。大麦
レクチン及び小麦胚凝集素は、嗅覚受容体神経細胞から前脳基底核コリン作動性神経細胞
へ、同様に青斑核及び縫線核の神経細胞などその他の部類の神経細胞へ、活発に経ニュー
ロン性輸送されることが示されている。実施例７に記載したのと同じタイプのコンビナト
リアル選択方法を用いて、経ニューロン性輸送能力を有するその他のポリペプチド配列を
発見および作製することもできる。ファージを二次（または三次またはそれ以降の）神経
細胞へ経ニューロン性輸送するポリペプチドをコードする遺伝子配列を有するファージを
同定するためにファージディスプレイライブラリのサイクル式試験を行うことにより、こ
れを行うことができる。
経ニューロン性輸送能力を有することが知られるポリペプチドを用いて遺伝子ベクター
を構築するために既知の方法を用いることができる。例えば、化学反応を用いるか、ポリ
ペプチド末端の多数のリシン（または他の正電荷）残基をコードする遺伝子組み換え遺伝
子を用いて、ポリリシンを輸送ポリペプチドに共有結合することができる。ポリリシンは
正電荷であるため、溶液中でポリペプチドをDNAセグメントと混合すると、（負電荷の）D
NAセグメントを引きつける。これにより、程々に強いが非共有的な、ポリペプチドとDNA
との結合がもたらされる。このタイプの調製は、Knight et al 1999に記載されている。
生理食塩水溶液またはその他の担体液中に懸濁したベクターの点鼻による嗅覚上皮への
該遺伝子ベクターの投与は、当業者に周知の手段により本使用に適合させた実施例２記載
と同じ一般的方法を用いることができる。
実施例３及び４で説明した方法（当業者に知られた他の方法または追加の方法を適宜補
足する）をトランスフェクション後のモニタリング及び評価に用いることができる。血液
脳関門内の神経細胞（例えば前脳基底核コリン作動性神経細胞）内で経ニューロン的に(t
ransneuronally)トランスフェクションされたNGF遺伝子構成体の発現を実証することが、
in situハイブリダイゼーション及び／またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの感度の良
い方法を用いて行うことができる。実施例３に記載の通り、宿主中の対応ポリペプチドと
は明確に異なるポリペプチドを発現するNGF遺伝子配列の利用によって発現の検出を容易
にすることができる。
このような経ニューロン性ベクターにより生ずる生理学的効果及び行動効果の追加モニ
タリングを実施例４に記載されたような方法で行うことができる。
抗NGFポリペプチドを脊髄後角領域内に送達するためのウイルスベクターの構築及び使用
実施例１〜８には、神経細胞の成長または修復を刺激するのを助けるために神経成長因
子(NGF)などの神経栄養性ポリペプチドの送達について記載する一方で、実施例９及びそ
の後のいつくかの実施例には、本明細書中で「抗NGF」ポリペプチドとして称される完全
に異なるタイプのポリペプチドについて記載している。このようなポリペプチドは、血液
脳関門を通って輸送され、正しく標的とされる位置に送達された場合、神経因性疼痛また
は自律神経失調症などの種々の症状を治療し低減させるのを助けることができる。このよ
うなポリペプチドは、(i)脳脊髄液(CSF)またはシナプス液中でNGF分子に結合し、該NGF分
子がNGF受容体に結合することができないようにすることでNGF分子を不活性化することに
より、及び／または(ii)神経細胞上のNGF受容体タンパク質に結合し、遊離NGF分子が受容
体に結合したときに起こる細胞反応を引き起こさない形式で、それらの受容体を占有して
NGF分子がアクセスできなくすることによる、少なくとも２つの知られた機構によって働
かせることができる。
CSFまたはシナプス液中の遊離NGF分子に結合する抗NGFポリペプチドは既知であり、Rub
erti et al（1993及び1994）などの論文に記載されている。これらの抗NGFポリペプチド
をコードする遺伝子配列も既知であり、実施例１に記載される通り、哺乳動物細胞中で遺
伝子発現を実行する適当な遺伝子プロモーターを有する完全な遺伝子構成体中に組み込む
ことができる。
このような遺伝子構成体が、嗅覚受容体神経細胞やその他のタイプの感覚神経細胞では
なく、侵害受容性神経細胞中での発現を意図する場合、遺伝子発現を実行するのに用いら
れる遺伝子プロモーターに注意を払わなければならない。侵害受容神経細胞中で機能する
遺伝子プロモーターとなり得るものの範囲は知られ、それらの候補プロモーターから、日
常的な実験により、侵害受容神経細胞中で所望の遺伝子発現レベルを実行できる適当なプ
ロモーターを選択することができる。好ましいプロモーター選択も、種々の神経細胞中で
生来起こる発現レベルによって影響を受け得る。
例えば、CGRP遺伝子の発現を実行する遺伝子プロモーター（Watson et al 1995に記載
）を用いることにより、ベクターが保有する抗NGF遺伝子の発現を、トランスフェクショ
ンされた、神経ペプチドCGRPを発現する侵害受容神経細胞に制限することができる。治療
の１つの目的が、神経因性疼痛またはその他の慢性疼痛を患う患者の脊髄中のNGFレベル
を減少することである場合、CGRPプロモーターは、そのプロモーター活性がNGFの存在に
よって増強されるので、特に有用であろう。したがって、脊髄中のNGFレベルが増加した
とき、このプロモーターは、応答して抗NGFの合成及び分泌を増加させ、それによって自
己制限、自己制御する遺伝子発現系を作り出すことができる。
抗NGFをコードする配列及び選択したプロモーターを有する遺伝子構成体を、実施例１
及びRuberti et al（1993及び1994）に記載され引用されているような方法を用いて複製
欠失アデノウイルス由来の遺伝子ベクター中に置くことができ、あるいは実施例５及び本
明細書中で引用した論文に記載されているような方法を用いて、複製欠失ヘルペスウイル
ス由来の遺伝子ベクター中に置くことができる。
この実施例は、NGFによって悪化した神経因性疼痛を減少し制御する方法に関するので
、本明細書に開示される抗NGFベクターは、嗅覚神経細胞などの感覚受容体神経細胞中に
挿入されることはない。代わりに、これらのベクターは、Sahenk et al 1993に記載され
ているような方法を用いて、あるいは特定の患者が関与する臨床試験または治療処置にお
いて最も効果的であるとされるように、(i)異痛症などの神経因性疼痛に悩まされた領域
、及び／または(ii)血液脳関門にまたがる侵害受容神経により神経支配される領域の皮下
組織または筋肉組織など、高濃度の侵害受容神経を含む領域に注入される。
侵害受容神経細胞の投射を有する領域への注入後、少なくともいくつかの抗NGF遺伝子
ベクターは、血液脳関門外の侵害受容神経細胞の投射に接触する。感染中にDNAを細胞に
注入するためにウイルスが通常用いる同じ機構を用いて、ウイルスベクター（または実施
例６〜８に記載されるような非ウイルスベクターにより用いられる類似の機構）は、それ
らの組織を神経支配する血液脳関門にまたがる侵害受容神経細胞の外部の投射内に遺伝子
修飾されたベクターDNAを注入する。逆行性輸送により、ベクターDNAは、細胞細胞質を通
って脊髄の側面に位置する後根神経節と呼ばれる神経細胞領域に運ばれる。抗NGFポリペ
プチドをコードする遺伝子は、神経節（複数形は「ganglia」とも綴られる）内に在る侵
害受容神経細胞内で発現され、それにより血液脳関門にまたがる神経細胞内で抗NGFポリ
ペプチド分子が生成する。
少なくともいくつかの抗NGFポリペプチドは、血液脳関門内で囲まれて該血液脳関門に
より保護される組織において、脊髄の「後角」領域（及びその他の領域の可能性もある）
に位置するシナプス末端または類似の出口点に到達するまで、通常の順行性輸送により、
血液脳関門にまたがる神経細胞の軸索を通って輸送される。血液脳関門内に位置するシナ
プスに順行性輸送され放出される神経伝達ペプチドを含有する小胞中にポリペプチドがパ
ッケージングされるように、トランスフェクションされた細胞に指示するリーダーまたは
シグナルペプチドを、分泌または成熟ポリペプチドの開始点に追加することにより、この
順行性輸送工程の効率を増強することができる。侵害受容神経細胞中での使用に適するリ
ーダー配列の具体例はプレプロBDNF配列であり、これは、脊髄中の後角領域中に成熟BDNF
を順行性輸送するように侵害受容神経細胞に指示する（これらの神経細胞が通常合成する
）。
これらの位置で侵害受容神経細胞末端によって放出されたとき、抗NGF分子はNGF分子と
結合し、それによってその位置における脊髄組織中の遊離NGFの量を減少させることがで
きる。NGF結合の減少によって成熟侵害受容神経細胞が死滅することはないが、Christens
en et al 1996などの論文に記載されている通り、実験動物中への抗NGFの直接投与によっ
て実証されている侵害受容機能及び活性の可逆的な抑制（しばしば「ダウン・レギュレー
ション」と呼ばれる）がもたらされる。
後根神経節中の遺伝子発現（約24時間から72時間と予想される）及び脊髄の後角領域中
への抗NGFの順行性輸送及び放出（約８時間から24時間と予想される）のための十分な時
間を与えた後、脊髄中に抗NGFを検出することができる。
犠牲死させた実験動物において、電子顕微鏡検査法、免疫学的染色、及びベクター由来
の抗NGFを標識する種々の方法、例えばベクター遺伝子によってコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列中に適当な抗原性タグを追加するなどの適当な方法で、脊髄中の抗NGF
ポリペプチドの放出を直接モニタリングすることができる。遊離NGFの濃度を測定するこ
とによって抗NGFの濃度及び／または効果をモニタリングすることも可能である。抗NGFは
放出されると、脊髄中の内因性NGFに結合しこれを中和する。したがって、脊髄中のNGFの
レベルの変化は、実施例３で概説したものなど種々の免疫学的方法を用いて、またこれら
の方法を、トランスフェクションされた感覚神経細胞からの神経支配を受けた脊髄組織の
検査に適用することにより、モニタリングすることができる。脊髄中のNGFのレベルの変
化は、実施例10でより詳細に概説する通り、固有の神経解剖学的変化及び行動変化から推
測することもできる。
脊髄中の後角領域への抗NGFの送達の生理学的効果及び行動効果のモニタリング
試験結果の統計的な比較を可能にするため、実験動物を２つの群に分ける。一方の群（
試験動物）は、上記の通り、抗NGF遺伝子ベクターを享受し、もう一方の群（コントロー
ル群）は中枢神経系組織に対して既知の神経活性効果がない非コードDNA、無害の遺伝子
、またはマーカー遺伝子を含むベクターを享受する。脊髄への抗NGFの投与の生理学的効
果には、Christensen et al 1996及び1997などの論文で議論されているような脳の神経解
剖学に対する効果及び動物の行動に対する効果が含まれる。
動物モデルの適切な選択は、脊髄への抗NGF送達の生理学的効果を評価するのに重要で
ある。炎症性疼痛の動物モデルに加え、末梢神経に損傷または攻撃を与えることにより、
痛覚過敏及び「異痛症」（中枢神経系が穏やかな刺激を激痛と解する慢性及び／または神
経因性疼痛）の種々のモデルを作ることができる。
神経因性疼痛をモデル化するため、及び神経因性疼痛の治療可能性を試験するために、
一般的方法の単なる一例として、縫合糸（「結紮糸」）の環をラットなどの動物の後肢の
一方の坐骨神経の半分から３分の２の周囲に外科的に配置し、固く締めることができる。
数日から１週間内に、肢は、穏やかな刺激に対して過敏となり、深刻な痛みを受ける。次
いで、このように処置したラットを、自動センサーを有する特別の箱中に入れ、その底板
を温かくし始めてから、ラットがその温めた表面から過敏な脚を持ち上げて離すまで何秒
経過したかを測定し記録することができる。候補の治療によって、神経結紮された脚を上
げるまでに経過した平均秒数を、未治療対照動物の比較時間にまで延ばすことができた場
合、そのことは、その治療が神経因性疼痛を減少するのに効果的であり、大型動物でのよ
り詳細な試験及び／またはヒト患者での臨床試験に値するであろうことを示している。
しかしながら、末梢神経の結紮またはその他の攻撃または損傷は、注入部位から後根神
経節へのベクターDNAの逆行性輸送を妨害し、本明細書に記載された治療を評価するのに
用いられる当該試験の設計及び解釈を複雑にするであろうことを認知するべきである。し
たがって、脊髄に直接的に影響を及ぼし関与する攻撃は、少なくともいつくかの状況で好
ましいであろう。脊髄損傷に起因する慢性または神経因性の疼痛はしばしば臨床で見られ
、脊髄内でのNGFの過剰生産が、脊髄損傷にしばしば付随する「一次求心性出芽（primary
afferent sprouting）」として知られる状態に関与している(例えばKrenz et al 2000)
。したがって、痛覚過敏性または慢性の疼痛を再現可能に引き起こす脊髄損傷モデルを用
いて、痛覚過敏性または慢性の疼痛に対する脊髄への抗NGF送達の効果をモニタリングす
ることができる。具体例は、Krenz et al 1999に記載された脊髄損傷モデルであり、この
モデルは、本明細書に記載された方法を用いた脊髄への抗NGF送達の生理学的効果を評価
するのに適当であると信じられる。
痛覚過敏性または慢性の疼痛に関連する後角の感覚神経支配パターンの神経解剖学的変
化には、後角の層IIへの「Ａ」線維及び侵害受容CGRP含有線維の異常な発芽が含まれる（
例えばBennet et al 1996)。Bennet et al 1996またはChristensen et al 1997に記載さ
れた方法を用いる一方で、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの薬剤を用いてＡ線維を神経節
経由的に(transganglionically)標識すること、及びCGRP免疫組織化学を用いて後角の侵
害受容性（NGF応答性）線維を視覚化することにより、そのような神経解剖学的変化に対
する抗NGF遺伝子ベクターの投与の効果をモニタリングすることができる。
あるいは、脊髄中の末梢投射している感覚神経細胞と二次神経細胞とのシナプス接続の
数及び程度に対する抗NGF送達の効果は、Blessing et al 1994に記載されるような方法な
どを用いて経ニューロン性追跡方法などにより評価することができる。
動物モデルでの疼痛反応の確立した機能的モニタリング方法には、(i)上記で簡単に概
説し、Romero et al 2000などの論文に詳細に記載されている通り、温度刺激に応答して
脚を引っ込める保持時間を測定すること、(ii)Deng et al 2000などの論文に記載されて
いる通り、von Frey毛髪刺激剤の適用に対する応答を測定することが含まれる。
抗NGFまたは相当ポリペプチドによる治療が効きうるその他の症状は、しばしば「自律
神経失調症」と称される。この症状は、上位胸部または頚部の領域に脊髄損傷を有する患
者で最もよく起こり、上位脊髄中の節前交感神経細胞での正常な接続が破壊されている。
その結果、自律神経系での正常なフィードバック制御機構が破壊され、通常の刺激（例え
ば腸の充満を示す大腸の膨張など）が、生死に関わることがある他の反射結果を引き起こ
すことがある（心臓麻痺や心発作などの深刻な心血管症の危険性が大いに高まるレベルへ
の心拍数及び血圧の増加など）。
動物モデルの研究（例えばKrenz et al 1999)で示される通り、この状態の動物モデル
の脊髄中への抗NGFの直接注入は、そのような脊髄損傷後に起こり得る侵害受容神経細胞
による後角の異常かつ不要な神経支配を抑制することにより、この不要な反射応答を妨げ
あるいは制御することができる。
したがって、露出されたアクセス可能な侵害受容神経細胞（及び運動神経細胞などその
他の脊髄神経細胞も可能性がある）の投射に遺伝子ベクターをトランスフェクションして
、血液脳関門によって保護される脊髄領域中に抗NGFポリペプチドを導入する本発明の使
用方法は、自律神経失調症の治療に相当有望である。
脊髄中の後角領域中へ抗NGFポリペプチドを送達するための脂質ベースの遺伝子ベクター
の構築及び使用
実施例９及び本明細書で引用される論文に記載された方法を用いて、１つまたは複数の
標的とする部類の侵害受容神経細胞で発現する抗NGF遺伝子構成体を作ることができる。
既知の方法を用いて、得られた遺伝子構成体をプラスミドまたはその他の安定体などのDN
Aベクター内に置くことができる。次いで「Ｍethods in Molecular Medicine: Gene Ther
apy Protocols」(P.Robbins出版1997）のNabelの章(127〜133頁)および実施例６で記載さ
れているような方法を用いて、DNAベクターを脂質小胞（リポソーム）内部に置くことが
できる。
Sahenk et al 1993によって記載されるような方法を用いて、あるいは特定の患者が関
与する臨床試験または治療処置において最も効果的であるとされるように、神経因性疼痛
またはその他の慢性痛を患う領域で、皮下組織または筋肉組織などの高濃度の侵害受容神
経を含む領域に生理食塩水中のリポソーム懸濁液を注入するなどの手段により、得られた
リポソームベクターを侵害受容神経細胞の末梢投射に投与することができる。少なくとも
いくつかのリポソームベクターは、筋肉組織で血液脳関門外に位置する侵害受容神経細胞
の投射に付着して融合し、その結果、リポソームが運ぶ抗NGFコードDNAが神経投射内に供
給される。DNAセグメントの逆行性輸送により、少なくともいくつかの抗NGFのDNAが神経
細胞体に運搬され、そこで抗NGF遺伝子から抗NGFポリペプチドが発現される。
その後の脊髄中への抗NGFポリペプチドの送達及び脊髄組織中の抗NGFポリペプチドの生
理学上及び行動上の効果は、実施例９及び10で記載されているような方法を用いて測定し
、モニタリングすることができる。
脊髄の後角領域中へ抗NGFポリペプチドを送達するための侵害受容神経細胞上のエンドサ
イトーシス受容体を標的とするDNAベクターの構築及び使用
実施例９で記載される方法などの種々の既知の方法を用いて、侵害受容神経細胞で発現
する抗NGF遺伝子構成体を作ることができる。実施例11で記載される方法のようなその他
の既知の方法を用いて、リポソームなどの非ウイルスベクターによって侵害受容神経細胞
内に輸送することができるプラスミド体やその他の安定体中に、抗NGF遺伝子構成体を置
くことができる。
次いで、これらの安定なDNA体を用いて、実施例７に記載されるような方法を用いて、
タンパク質−DNA複合体を形成することができる。この複合体は、エンドサイトーシスを
誘発する侵害受容神経細胞の受容体に特異的に結合するリガンドとしてのポリペプチドセ
グメントを組み込んでいる。このような種々の受容体特異的ポリペプチドセグメントは既
に知られ、その他のものは実施例７に記載されるファージライブラリのアプローチを用い
て同定および開発することができる。
したがって、これらの工程が正しい順番で編成されると、血液脳関門内に取り囲まれて
いない、したがって末梢投射への比較的簡単なアクセスを提供する領域で、侵害受容神経
細胞の末梢投射上のエンドサイトーシス受容体を特異的に標的とすることができる遺伝子
ベクターが作製される。このような受容体特異的エンドサイトーシス遺伝子ベクターを用
いて、上記神経細胞内で発現する抗NGF遺伝子を、上記神経細胞にトランスフェクション
することができる。次いで、神経因性疼痛やその他の疼痛疾患を制御および軽減するよう
に、神経細胞自体が脊髄の後角領域中で抗NGFポリペプチドを送達し分泌する。
そのような抗NGFポリペプチドの脊髄組織内への送達は、実施例９に記載されるような
方法を用いてモニタリングすることができ、そのような脊髄組織内での抗NGFポリペプチ
ドの生理学的効果及び行動効果は実施例10に記載されるような方法を用いて評価すること
ができる。
脊髄中の二次神経細胞に抗NGF遺伝子を輸送する経ニューロン性抗NGFベクター
侵害受容神経細胞内で抗NGFポリペプチドを発現することができる遺伝子構成体（適当
な遺伝子プロモーターを含む）を実施例９に記載されるようにして作ることができる。既
知の方法を用いて、これらの遺伝子構成体をプラスミドまたはその他の安定体中に置くこ
とができる。
次いで、このような抗NGFプラスミドまたはその他のDNAベクターを、一つの神経細胞か
ら別の神経細胞へのタンパク質−DNA複合体の輸送を実現および促進することができる「
経ニューロン性ポリペプチド」と連結することができる。種々のこのような「経ニューロ
ン性ポリペプチド」は知られ、例えば、破傷風毒素の「非毒素フラグメントＣ」(例えばK
night et al 1999）、大麦レクチン(Horowitz et al 1999)、小麦胚凝集素(Yoshihara et
al 1999）(実施例８にも列記されている)を含む。
(i)末梢のシナプス末端で露出されており、かつ(ii)血液脳関門にまたがる神経細胞に
よって血液脳関門内のシナプスに内部輸送されるタンパク質に可逆的に結合することによ
り、このような「経ニューロン性ポリペプチド」は、トランスフェクションされた血液脳
関門にまたがる「一次」侵害受容神経細胞の細胞質を通り、血液脳関門を通り、後角中に
位置した神経細胞末端やその他の脊髄組織中の場所に、タンパク質−DNA複合体を輸送す
ることができる。次いで、経ニューロン性タンパク質の助けにより、タンパク質−DNA複
合体は、血液脳関門にまたがる侵害受容神経細胞のシナプス末端を出て、完全に血液脳関
門内に位置する近くの脊髄神経細胞内に入り、それによって血液脳関門により保護された
「二次」脊髄神経細胞にトランスフェクションされる。
血液脳関門により保護された「二次」脊髄神経細胞内へのこのような抗NGF遺伝子ベク
ター及びそのコード配列の送達は、犠牲死された実験動物から得た脊髄細胞及び組織を用
いて、インサイチュDNAプローブハイブリダイゼーション及びPCR分析など方法でモニタリ
ングすることができる。トランスフェクションされた「二次」脊髄神経細胞による抗NGF
ポリペプチドの発現は実施例９に記載されるような方法を用いてモニタリングすることが
でき、脊髄細胞中の抗NGF遺伝子及びポリペプチドの生理学的効果及び行動効果は実施例1
0に記載されるような方法を用いて評価することができる。
上位運動神経細胞内へ神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェ
クションするためのアデノウイルスベクターの使用
正常細胞中で複製することができない非病原性アデノウイルスベクターを調製する方法
がGraham and Prevec 1995などの論文に公表されている。種々の神経栄養因子をコードす
る遺伝子を含むそのようなベクターの具体例を記載した論文には、Dijkhuizen et al 199
7、Gravel et al 1997、Baumgartner et al 1998及びRomero et al 2000が含まれる。
「グリア細胞株由来神経栄養因子」(GDNF)をコードする遺伝子配列が単離され、プラス
ミドやアデノウイルスベクターなどの取り扱いやすい形にしたものが、Lindsay et al 19
96、Choi-Lundberg et al 1997、Baumgartner et al 1997などの論文及び本明細書で引用
するその他の種々の論文に記載されている。
「ニューロトロフィン-3」(NT-3)をコードする遺伝子配列が単離され、プラスミドまた
はアデノウイルスベクターなどの取り扱いやすい形にしたものが、Snider 1994及びBothw
ell 1995などの論文及び本明細書で引用するその他の種々の論文に記載されている。
GDNF及びNT-3は、従来技術で行われた試験によって示される通り、特に運動神経細胞に
投与したときに（他の既知の神経栄養因子と比較して）比較的強い活性及び効果を有して
いるので、本明細書に開示される運動神経細胞の治療での使用のための最初の試験に好ま
しい候補である。
運動神経細胞中で遺伝子発現を実行する多くの遺伝子プロモーターが知られ、入手でき
、本明細書で記載される試験において用いることができる。脊髄運動神経細胞をトランス
フェクションするための使用で特に注意に値するプロモーターの一部類には、脊髄運動神
経細胞中のグリシン受容体のいわゆるα-1サブユニットの発現を実行するプロモーターが
含まれる。グリシン受容体は侵害受容神経細胞またはその他の感覚神経細胞中で高濃度に
存在しないので、グリシン受容体（または感覚神経細胞中よりも脊髄運動神経細胞中でよ
り活性に発現するその他の遺伝子）の１つまたは複数のサブユニットを発現する遺伝子由
来の１つまたは複数の種類のプロモーターの使用は、所望の標的神経細胞におけるベクタ
ー中の神経栄養遺伝子の選択的発現の増加を助け、他方で非標的細胞における不要な発現
によって生じ得る潜在的な有害な副作用を最小限にできると予測される。
脊髄運動神経細胞のトランスフェクションに関与するいくつかの状況で有用であろう別
の部類のプロモーターは、ポリオウイルス受容体というタンパク質の発現を実行する。こ
の受容体タンパク質は感覚神経細胞中で実質的レベルで存在せず、したがってプロモータ
ーは感覚神経細胞中でサイレントであると推定される。しかしながら、種々の実験動物（
マウス及びラットを含む）はポリオウイルス受容体遺伝子またはそのプロモーターを有さ
ず、したがってポリオウイルスプロモーターを用いる場合、動物モデルで種々の研究を行
うことは幾分難しいであろうことに注意すべきである。
あるいは、所望する場合、トランスフェクションされた細胞内でのNGF（またはその他
の中枢神経系活性ポリペプチド）の可能な最高レベルの発現を誘導するなどの目的で、哺
乳動物細胞内で非常に強力なプロモーターとして知られている種々のウイルスプロモータ
ー及びその他のプロモーターを使用することができる。そのような強力なプロモーターの
具体例には、サイトメガウイルス由来の初期遺伝子プロモーター及びシミアンウイルス40
由来の後期遺伝子プロモーターが含まれる。所望する場合には、選択したプロモーターを
活性化する誘導因子を、トランスフェクションされた神経細胞内での適量の輸送が保証さ
れるように、投与することができる限り、誘導可能な遺伝子プロモーターを用いることも
できる。
したがって、GDNFまたはNT-3などの運動神経細胞内で機能する神経栄養遺伝子を保有す
るアデノウイルスベクターを、上記引用した論文に開示されているような種々の要素及び
方法を用いて組み立てることができる。
所望する場合、種々の試験動物組織内で、ベクター遺伝子によりコードされるポリペプ
チドの検出及びモニタリングを容易にするために、「エピトープタグ」配列をベクター遺
伝子のコード領域に組み込むことができる。このアプローチは、実施例１に詳細に記載さ
れ、Moller et al 1998などの論文に記載されている。そのようなアプローチを用いる場
合、Altar & Bakhit 1991、Ferguson et al 1991、DiStephano et al 1992及びvon Barth
eld 2000などの論文に記載される方法を用いて、ベクター構成体により発現されるポリペ
プチドが、そのポリペプチドによる治療のために標的とされている神経細胞に正確に送達
されるために必要なすべての工程を行うことができることを確認することが重要である。
アデノウイルス及び活性組織(tissue vigor)に適合する一定量の溶液（生理食塩水溶液
など）中に懸濁したアデノウイルスベクターを下肢に筋肉内注射することにより、所望の
遺伝子構成体を保有するアデノウイルスベクターを脊髄運動神経細胞へ投与することがで
きる。アデノウイルスベクターを含む溶液を増殖し、精製し、濃縮し、力価測定する方法
は、「Ｍethods in Molecular Medicine:Gene Therapy Protocols」(P.Robbins出版1997
）のEngelhardtの章（169〜184頁）などの出版物中に見出すことができ、Haase et al 19
98は、実験ラットの脊髄運動神経細胞への遺伝子導入のために、筋肉内注射によるアデノ
ウイルスベクターの効果的な投与における投与量及び投与技術に関する情報を提供する。
所望する場合、筋電図注入法を用いて、液が正確な所望の位置に確実に注入されることを
助けることができる。
トランスフェクションされた運動神経細胞、上位運動神経細胞、及び脳組織中のベクター
遺伝子及びポリペプチドのモニタリング
実験動物を用いる試験は、(i)ポリペプチドが接触して影響を与えうる種々の細胞及び
脊髄領域中の遺伝子ベクター及び該ベクターによりコードされたポリペプチドの動き、位
置、及び濃度を測定およびモニタリングし、そして(ii)そのような結果を正確に反映する
信用できかつ有用な統計的データを得ることに伴う作業を単純化するように設計すべきで
ある。例えば、無害な及び／または非機能的な遺伝子、ポリペプチドをコードしないナン
センスDNA配列、または哺乳動物細胞中で発現されると容易に検出することができるが有
意な生理学的効果を持たないポリペプチドをコードするマーカー遺伝子を保有するコント
ロールベクターを用いて、試験動物の片側の筋肉に遺伝子ベクターを投与し（例えば後肢
にベクター溶液を注射し）、同動物の別の側をコントロールとして処置することにより、
必要な作業を単純化し、より信頼できるものにすることができる。その後の組織学的処理
の際、脊髄（及び所望の場合には脳）の左右の領域を互いに比較して、ベクターDNA及び
／または
ベクター遺伝子によりコードされるポリペプチドの動き、濃度及び効果を評価することが
できる。
遺伝子発現に十分な時間（24時間から72時間）を与えた後、実験動物から腰髄を取り出
し、組織を処理することにより、脊髄運動神経細胞内での神経栄養因子遺伝子の発現をモ
ニタリングして、遺伝子ベクターの送達の効果を評価することができる。これらの分析に
は、(i)Xian and Zhou 2000などの論文に記載されているような方法を用いて、遺伝子ベ
クターのmRNAに相補的であるが内因性mRNA配列には相補的ではないDNAプローブを用いて
、細胞mRNAをハイブリダイゼーションする方法、(ii)Chie et al 2000などの論文に記載
されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の試薬及び方法を用いて、ウイルスベ
クター由来のDNAまたはmRNA配列を検出する方法、及び(iii)免疫染色法、ELISA、または
試験動物中でベクターのポリペプチドには選択的に結合するが内因性ポリペプチドには結
合しない抗体を用いる類似の方法などを用いることができる。多くのこのような抗体調製
品は市販入手が可能であり、あるいは、所望する場合（特定の「エピトープタグ」を有す
るポリペプチドを検出するためなど）、Conner 2000、Rush et al 2000及びZhang et al
2000などの論文に開示された方法を用いて、調製することができる。
実施例14及び15で概説される方法の目標は、トランスフェクションされた血液脳関門に
またがる脊髄運動神経細胞を用いて、完全に血液脳関門内にあり保護されている上位運動
神経細胞に治療用ポリペプチドを送達することである。このことは、(i)ベクターがコー
ドする神経栄養因子遺伝子を発現することにより、ベクターがコードする神経栄養因子ポ
リペプチドを作り出すこと、次いで(ii)血液脳関門により外部ポリペプチドから保護され
ているが上位運動神経細胞の軸索にアクセス可能である脊髄中の位置に該ポリペプチドを
輸送し送達することにより、達成することができる。
該ポリペプチドが、トランスフェクションされた脊髄運動神経細胞によって最も送達さ
れそうな脊髄内の正確な領域を同定する方法を容易にするために、適当な追跡方法及び試
薬を用いて「経ニューロン性標識」研究を行うことができる。仮性狂犬病ウイルスを利用
したこのような研究がCard et al 1990などの論文に記載されている。
経ニューロン性標識法を用いて、NT-3やGDNFなどのポリペプチドが上位運動神経細胞に
送達され、その結果、上位運動神経細胞が発芽して、トランスフェクションされた血液脳
関門にまたがる下位運動神経細胞とシナプス接続することの証拠を得ることもできる。脳
及び脳幹中の経ニューロン性標識された上位運動神経細胞の数は、上位と下位の運動神経
細胞間のシナプス接続の強さ及び数が増加することによってより多くなる。
コントロール及び試験ベクターを実験動物の両側に投与した場合、脊髄の左側及び右側
の間の妥当な相違を観察できる。他の動物の下行軸索の切断を用いて、実験動物の脳中に
検出されたNT-3またはGDNFが、トランスフェクションされた下位運動神経細胞からの逆行
性輸送に由来することを確認することができる。
上位運動神経細胞に神経栄養因子を送達することにより生ずる生理学的効果及び筋肉効果
のモニタリング
本明細書で開示される遺伝子ベクターを用いた脊髄または脳内へのNT-3またはGDNFなど
の神経栄養因子の投与の生理学的効果には、脊髄及び脳の神経解剖学に対する効果、及び
動物の生理学及び行動に対する効果が含まれる。特に、本明細書に開示される遺伝子ベク
ターを用いることにより与えられる筋力、筋肉制御、及び筋緊張（muscle tone）の改善
及び利益を種々の方法を用いて評価することができる。
これらの方法では、これまで動物モデルを用いた種々の従来試験で見られたものの基本
的な理解が必要となる。そのような試験のほとんどは、まず、動物の脊髄または運動神経
細胞系に神経細胞傷害または損傷を与え、次いで損傷がより十分に顕出するために一定期
間待ち、次いで試験治療を施し（皮下針を用いて動物の髄液中に神経栄養因子を直接に注
入するなど）、最後に、試験治療によって、コントロール動物または肢における同様の損
傷により与えられた傷害の程度を減少することができたかを決定するために動物試験を行
うことにより必ず行われることも認識されるべきである。実施例４に概説されている通り
、比較試験は、通常、次の一方または双方を伴う：(i)異なるコントロール動物、または(
ii)異なる形式で同じ動物の２つの異なる側を治療すること。
そのような試験の多くは、外科的軸索切断と称される「軸索切断術」を用いることを認
識すべきである。実施例４で言及した通り、軸索は神経細胞の機能発揮には極めて重要で
あり、神経細胞の軸索を神経細胞体に比較的近い位置で切断した場合には、数日の測定期
間にわたり、神経細胞の残りすべてが損傷していなくても神経細胞は萎縮し始め、結局は
死んでしまう。この理由は複雑であり、神経系の発達に関与する細胞因子（及び特に神経
栄養因子）が関与すると一般に信じられている。いわゆる「神経栄養説」によれば、胎児
の発達中の脳は、最初は神経細胞の供給過剰であり、次いで剪定プロセスが始まる。剪定
段階中、入ってくる神経シグナルを受信することを活発に続けない（及び／または１種類
以上の神経栄養因子が接触しない）神経細胞は、「アポトーシス」と呼ばれるプログラム
された細胞死として死に絶える。
多くの動物研究から、種々の神経栄養因子の適用（通常は髄液または脊髄組織への注射
）によって、軸索切断の損傷により上位運動神経細胞に誘導される萎縮、変性、及び死を
妨ぎうることが分かった。そのような動物試験の具体例、及び神経栄養因子が神経細胞に
適用された場合に生ずる結果は、Novikova et al 2000、Giehl and Tetzlaff 1996及びGi
ehl et al 1997などの論文に報告されている。
しかしながら、軸索切断の損傷が、外来遺伝子がトランスフェクションされた下位運動
神経細胞から遠い場合（例えば、本明細書に開示される遺伝子ベクターが実施例14のよう
に使用される場合）、軸索切断損傷は、トランスフェクションされた末梢運動神経細胞に
よる神経栄養因子の正常な逆行性軸索輸送を妨害するので、本発明のベクター及び遺伝子
が、軸索切断により誘導される萎縮や変性に対して効果を有することを実証するのは容易
ではない。トランスフェクションされた下位運動神経細胞が、上位運動神経細胞の切断端
の数ミリメートル内に在る場合、上位運動神経細胞は、トランスフェクションされた運動
神経細胞により発現され分泌される神経栄養ポリペプチドにより容易にアクセスする。し
たがって、軸索切断損傷を用いる適切な実験の設計では、軸索切断位置は、筋肉注射によ
り適度にトランスフェクションすることができる運動神経細胞の最も近くの先端に適度に
近い距離内にあることが好ましい。
神経栄養因子の投与によって、損傷した軸索の発芽及び再生が刺激されることが公に示
されている(例えばSchnell et al 1994）。したがって、本明細書に開示されている遺伝
子ベクターを用いて、損傷した上位運動神経細胞の切断端の約１〜５mm内に在る下位運動
神経細胞を介してNT-3またはGDNFなどの因子を送達する場合、運動皮質中へのビオチン化
デキストランなどの追跡化合物の注入を伴う順行性経路追跡研究(Ferguson et al 2001）
を用いて、種々の効果（発芽及び再生の刺激など）を研究し実証することができる。
下位運動神経細胞を介してNT-3またはGDNFを送達する本発明の使用では、最も高濃度の
誘引化合物が、トランスフェクションされた下位運動神経細胞の近くに集中している場合
（該分子が他の細胞中への活発な取り込みによるなどして急速に除かれまたは分散されな
い限り）、化学誘引物質勾配が確立することも期待される。損傷した運動神経細胞の再生
は、典型的には化学誘引勾配に応答して、化学誘引物質濃度が増加する方向に成長する。
Ferguson et al 2001に記載されているような順行性経路追跡方法を利用することにより
、損傷した上位運動神経細胞の再生における方向性成長に対する化学誘引物質勾配の影響
を評価し実証することができる。
トランスフェクションされた下位運動神経細胞から現れて確立した化学誘引物質勾配は
、再生中の損傷上位運動神経細胞が、GDNFまたはNT-3などの化学誘引化合物を放出してい
る神経細胞と新たにシナプス接続する速度を加速する。このシナプス接続速度の増加は、
動物モデルで経時的な研究を行い、そして追跡物質を血液脳関門外の領域に注入した場合
には上位運動神経細胞中の経ニューロン性追跡化合物の出現を経時的にモニタリングする
ことにより、実証することができる。適当な経ニューロン性追跡方法は、Ugolini 1995、
Travers et al 1995及びCard et al 1990などの論文に記載されている。
上位と下位との運動神経細胞間の機能性シナプス接続の確立は、下位運動神経細胞の電
気的性質をも変える。上位運動神経細胞活性の初期効果は、阻害性である傾向であり、し
たがってこの阻害が失われた場合、下位運動神経細胞は異常に活発な状態に入る傾向があ
る。したがって、上位運動神経細胞との回復または再生した接続によって、下位運動神経
細胞活性がより正常なレベルに回復することが期待され、これはより正常な感覚反射とし
て現れる。
電気生理学的方法は、そのような経時変化をモニタリングするのに用いることができ、
機能的なシナプス再接続が上位と下位との運動神経細胞間で起こりつつあるか否かの指標
を提供することができる。
上位と下位との運動神経細胞間の機能的再接続の確立は、筋力、筋緊張、及び協調など
運動機能の観察可能な変化ももたらす。筋力の経時変化、及び動物の細かな運動作業や協
調運動作業を行う能力（食物を得るために負荷を克服することなど）は、文献に記載され
た方法や当業者に知られた方法により試験しモニタリングすることができる。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェク
ションするためのレンチウイルス由来ベクターの使用
Hottinger et al 2000などの論文に記載された方法を用いて、(i)GDNF、NT-3またはそ
の他の神経栄養ポリペプチドをコードする配列、及び(ii)実施例14に記載されたようなト
ランスフェクションされた脊髄運動神経細胞中での遺伝子発現に適する遺伝子プロモータ
ーを有する遺伝子構成体を保有することが可能なレンチウイルスベクターを構築すること
ができる。このレンチウイルス由来の遺伝子ベクターを、実施例14に記載される方法を用
いて、筋肉内注射により脊髄運動神経細胞のアクセス可能な投射へ投与することができる
。
脊髄運動神経細胞をトランスフェクションした後、トランスフェクションされた神経細
胞中でのコードされたポリペプチドの発現、及び血液脳関門により保護された脊髄または
脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施例15に記載されたような方法により測定しモニ
タリングすることができる。神経栄養ポリペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理学的
効果、並びに軸索切断や類似の攻撃後に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペプチ
ドの能力は、実施例16に記載されたような方法により測定しモニタリングすることができ
る。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞をトランスフェク
ションするためのリポソームベクターの調製及び使用
実施例６で言及した通り、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのDNAプラス
ミド−脂質複合体の調製方法は、「Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Prot
ocols」(P. Robbins出版1997）のNabelによる章（127〜133頁）などの出版物に記載され
、種々の調製混合物の日常的試験を介して、細胞種または特定の使用に適合させることが
できる。
実施例14に記載されたような方法を用いて、神経栄養因子遺伝子を保有するリポソーム
ベクターを筋肉内注射により脊髄運動神経細胞のアクセス可能な投射に投与することがで
きる。脊髄運動神経細胞をトランスフェクションした後、トランスフェクションされた神
経細胞中でのコードされたポリペプチドの発現、及び血液脳関門により保護された脊髄ま
たは脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施例15に記載されたような方法により測定し
モニタリングすることができる。神経栄養ポリペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理
学的効果、並びに軸索切断や類似の攻撃後に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペ
プチドの能力は、実施例16に記載されたような方法により測定しモニタリングすることが
できる。
上位運動神経細胞に神経栄養ポリペプチドを輸送する脊髄運動神経細胞上のエンドサイト
ーシス受容体を標的にするDNAベクターの構築及び使用
神経細胞上のエンドサイトーシス受容体に結合するリガンドを用いた遺伝子ベクターを
調製するための試薬及び方法は実施例７に記載されている。これらの方法には、脊髄運動
神経細胞上のエンドサイトーシス受容体に活発に結合する高親和性リガンドを同定し作製
するために、モノクローナル抗体を用いる方法、またはファージディスプレイライブラリ
の反復式の選択を用いる方法が含まれる。
実施例７で紹介した通り、p75受容体に対するリガンドを用いて脊髄運動神経細胞への
遺伝子送達を標的化することができる。脊髄運動神経細胞は通常は低レベルのp75しか発
現しないが、損傷または神経栄養因子の欠乏に応答して、また筋萎縮性側索硬化症などの
種々の疾患において、p75の発現を増加する。したがって、p75を標的とする遺伝子ベクタ
ーは、治療支援が必要な脊髄運動神経細胞への、治療用タンパク質をコードした遺伝子の
送達を増強または標的化することを可能にする。
脊髄運動神経細胞を標的とする遺伝子ベクターの効率は、注射した筋肉中の「運動終板
」に遺伝子ベクターを集積させる化合物を、ベクター構成体自体に、または遺伝子構成体
を含む注射可能な溶液に含ませることにより、増強することができる。この目的のために
、ボツリヌス毒素が有用であろう。あるいは、アセチルコリン受容体のα1サブユニット
由来の17個のアミノ酸のペプチド配列を抗原として用いることによりモノクローナル抗体
を作製することができる(Yoshikawa et al 1997)。重症筋無力症と呼ばれる疾患において
、患者はアセチルコリン受容体のエピトープに対する抗体を作り出し、これらの抗体はシ
ナプス間隙中の筋肉終板上に局在化する。
したがって、このような受容体結合リガンドやその他の強化剤を用いた「受容体標的性
」遺伝子ベクターを用いて、実施例14に記載されているように、GDNF、NT-3またはその他
の神経栄養ポリペプチドをコードする配列、及びトランスフェクションされた脊髄運動神
経細胞での遺伝子発現に適した遺伝子プロモーターを有する遺伝子構成体を運ぶことがで
きる。リガンド−DNA複合体の筋肉内注射による脊髄運動神経細胞への投与は、実施例14
に記載されたような方法を用いることができる。脊髄運動神経細胞をトランスフェクショ
ンした後、トランスフェクションされた神経細胞中でのコードされたポリペプチドの発現
、及び血液脳関門により保護される脊髄または脳組織中へのポリペプチドの送達は、実施
例15に記載されたような方法により測定しモニタリングすることができる。神経栄養ポリ
ペプチドの筋肉上の効果及びその他の生理学的効果、並びに軸索切断または類似の攻撃後
に神経細胞の生存を長引かせる神経栄養ポリペプチドの能力は、実施例16に記載されたよ
うな方法により測定しモニタリングすることができる。
脊髄運動神経細胞と接触する中枢神経系神経細胞に神経栄養因子遺伝子を送達するための
経ニューロン性ベクターを用いる脊髄運動神経細胞のトランスフェクション
経ニューロン性輸送能力を有しうる遺伝子ベクターが実施例８に記載されている。脊髄
運動神経細胞のトランスフェクションに用いるために設計されるこのようなベクターは、
実施例８に記載された方法を用いて組み立てることができ、実施例14に記載された遺伝子
構成体を保有することができる。筋肉内注射による脊髄運動神経細胞への投与は、実施例
14に記載されたような方法を用いることができ、トランスフェクション後のモニタリング
は、実施例15及び16に記載されたような方法を用いることができる。
舌下神経核の下位運動神経細胞をトランスフェクションするために舌にベクターを注入す
ることによる脳幹内への神経栄養因子の送達
アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルス由来の遺伝子ベクターは、あ
るいはカチオン性リポソーム、エンドサイトーシス受容体に結合するリガンド、及び／ま
たは経ニューロン性ポリペプチドを用いて、上記実施例に記載されるように作製すること
ができる。このタイプのベクターは、上記の実施例に記載されるように、トランスフェク
ションされた運動神経細胞中で発現される神経栄養遺伝子構成体（または、所望する場合
、IN1またはNo-Goなどの１つまたは複数の神経突起抑制分子を阻害する組換え抗体または
類似のポリペプチドを発現する遺伝子構成体）を保有することができる。
図ｆに示めされる通り、そのような遺伝子ベクターを用いて、舌の血液脳関門外のアク
セス可能な投射を有する部類の下位運動神経細胞をトランスフェクションすることができ
る。「舌下神経核の運動神経細胞」として知られるこれらの神経細胞は、脳幹中の領域で
その他の神経細胞にシナプス接続されている。したがって、舌の内部の運動神経細胞末端
は、トランスフェクションされた下位運動神経細胞の近くに存在する投射を有するか、ま
たはその投射にシナプス接続している脳幹の神経細胞に神経栄養ポリペプチドを送達する
ための比較的直接的な経路を提供する。
これらの運動神経細胞への投与は、実施例14に記載されたような、しかし舌の筋肉への
注入に適合させた一般的な方法を用いて、舌への注入により行うことができる。実験動物
におけるトランスフェクション後のモニタリングは、脳幹神経細胞への外因性ペプチド（
例えばエピトープタグを付加したNGF、NT-3またはGDNFなど）の送達をモニタリングする
ために適切に適合させた実施例15及び16に記載されたような一般的な方法及びその他の当
業者に知られた方法を用いることができる。動物での使用の一例として、Ugolini 1995、
Travers et al 1995、またはCard et al 1990に記載されたような種々の経ニューロン性
追跡方法を用いて、舌下神経核中のトランスフェクションされた下位運動神経細胞と接触
する脳幹中の神経細胞を標識付けすることができる。本発明を用いて治療した動物で舌下
神経核と接触する二次神経細胞数を数え、そのようなデータをコントロール動物で見られ
た数と比較することにより、脳幹中の二次神経細胞への神経栄養因子の送達の証拠を得る
ことができる。
ヒト患者に有用なモニタリング方法の別の例として、異常興奮性の反射性まばたきはパ
ーキンソン病の１つの症状であり、疾患の重症度と臨床的に関連する。持続緊張的に活性
なセロトニン作動性の「縫線神経細胞」は通常、反射性まばたき回路に関与する脊髄三叉
神経の神経細胞を抑制し、これらのセロトニン作動性の縫線神経細胞の悪化が、異常興奮
性の反射性まばたきをもたらす(例えばBasso and Evinger 1996)。したがって、脳幹のセ
ロトニン作動性の神経細胞の変性速度を減少させる本発明の臨床的使用の効果の証拠は、
パーキンソン病患者で異常興奮性の反射性まばたきをモニタリングすることにより得るこ
とができる。
パーキンソン病ヒト患者での脳幹神経細胞の維持をモニタリングする別の方法は、患者
の嚥下反射の測定である。嚥下反射は、舌及びその他の口及び呼吸筋の協調運動に関わり
、パーキンソン病において刺激から反射嚥下までの時間は異常に延びる。嚥下反射試験は
、嚥下反射刺激としての鼻腔内カテーテルを介した喉への小量の水の送達を伴う。嚥下反
射の開始は、喉の筋肉の表面電極筋電図の記録を用いて正確に測定することができ、刺激
から反射嚥下までの時間を計算することができる(Iwasaki et al 2000)。したがって、脳
幹の神経細胞の変性速度を減少させる本発明の臨床的使用の効果の証拠は、パーキンソン
病患者で嚥下反射をモニタリングすることにより得ることができる。
生体内スクリーニング：ファージタイプ及びライブラリー
M13KO7ヘルパーファージを、New England Biolabs社(www.neb.com)及びAmersham Biosc
iences社(www4.amershambiosciences.com)などの種々の商業者から購入することができる
。このヘルパーファージ株は、pIIIコートタンパク質及びpVIIIコートタンパク質の双方
をコードする十分に機能的な遺伝子を含む。それは、細菌細胞中で低コピー数となるよう
にきちんと制御される（プラスミドp15a由来の）複製開始点をも含む。それは、ファージ
複製に不可欠なファージM13 pII遺伝子の変異(Met-40-Ile)も含む。この変異により、大
腸菌細胞による低コピー数でのファージ粒子としての分泌が可能となる。それは、M13複
製開始点内のAvaI部位に挿入されたカナマイシン耐性遺伝子をも保有する。このカナマイ
シン遺伝子は、カナマイシンに耐性でない大腸菌宿主細胞中で選択マーカーとして機能す
る。これらのヘルパーファージの使用および培養に間する追加情報は、商業者から、また
その使用について記載した種々の公開論文から入手できる。
scFvファージライブラリはCambridge Antibody Technology社(ケンブリッジ、英国 www
.cambridgeantibody.com)から供給された。該scFvファージライブラリは種々の特許（米
国特許第6，172，197号など）及び公開論文に記載されている。pIIIコートタンパク質（
線状M13ファージ粒子の一方末端に比較的少ない数で位置する）をコードする遺伝子配列
中に、Ｂリンパ球細胞（抗体を作る）由来の遺伝子配列を挿入することにより、該scFvフ
ァージライブラリを作製した。scFvライブラリ中の外来遺伝子配列の各々は、単一の遺伝
子配列中に単一の抗体の「重可変」（ＶH）及び「軽可変」（ＶL）ドメイン双方を含み、
平均分子量が約35キロダルトンである「単鎖(sc)」ポリペプチドとしてＶH及びＶLドメイ
ンを発現する。scFvライブラリは、推定13×109（すなわち130億）の異なる組変え体を有
する。最大の多様性を保証するため、これは祖先が異なる多数の人々から得た「可変断片
」(Fv)抗体ドメインを含む。該ライブラリは、異なる人種及び種族からの10の異なる群の
人々の免疫系により作製することができた広範かつ多様な異なるFv抗体ドメインをコード
すると評価される。
scFvファージはファージミドであることにも注意すべきである。該ファージは、大腸菌
細胞中で二重鎖プラスミドとして高コピー数で増殖することができる細菌複製開始点を有
する。該ファージは、ファージ粒子へと組み立てるための単鎖DNAの合成を引き起こすこ
とができるファージ複製開始点も含む。しかしながら、そのssDNA合成にはファージssDNA
転写タンパク質が存在することが必要であり、scFvファージはそのタンパク質をコードし
ていない。ファージssDNA転写タンパク質は、上述したM13KO7ヘルパーファージなどのヘ
ルパーファージによって供給しなくてはならない。
したがって、M13KO7ヘルパーファージを用いて、scFvファージミドにより既に感染され
た大腸菌細胞を同時感染する場合、多数の（scFvファージミド由来の）dsDNAプラスミド
を既に含有する細胞に、上記の（ヘルパーファージ由来の）ssDNA転写タンパク質を加え
ることにより、scFvファージミドプラスミドから多数のssDNA鎖の形成が引き起こされる
。次いで、これらの新たに形成されたssDNA鎖は、コートタンパク質（主にその宿主細胞
に感染した特定のscFv株由来のpVIIIコートタンパク質）の内部にパッケージングされる
。新たにパッケージングされたssDNAおよびそのコートタンパク質は宿主細胞から線状フ
ァージ粒子として分泌される。低コピー数のヘルパーファージDNA配列しか宿主細胞中に
存在しないので（ヘルパーファージDNA中の低コピー数性プラスミドp15a複製開始点のた
め）、これらの分泌されたファージ粒子のほとんどは、M13KO7ヘルパーファージDNAでは
なく、scFvファージミドDNAを含む。
ある特定の大腸菌宿主細胞によって分泌されるファージ粒子中のpVIIIコートタンパク
質は、ヒトＢリンパ球から得たDNA配列によりコードされる特定の抗体「可変断片」ポリ
ペプチド配列のクローン化コピーを含む。このヒト抗体DNA配列は、pVIIIコートタンパク
質をコードするファージミド遺伝子の中央近くの所定及び標的部位でscFvファージミドDN
A中に挿入した。
PhD-C7CファージディスプレイライブラリをNew England BioLabs社 ( www.neb.com、カ
タログ番号8120）から入手した。このライブラリは、推定２×109個の異なる組換え体を
含み、７個のアミノ酸のランダム配列をコードする外来性DNA挿入体が、M13ファージのpI
IIコートタンパク質のＮ末端をコードするDNA配列の近くに挿入されている。このライブ
ラリは、あるファージが坐骨神経束の神経細胞によって取り込まれて輸送されるかについ
て決定するために試験される本質的にランダムなペプチド配列のレパートリーを提供する
。
細胞のタイプ、特性、及び方法
別に言及した場合を除き、すべてのファージ増幅及び力価測定はCambridge Antibody T
echnology社の大腸菌株TG1を用いた。M13ファージと共に働くように特別に設計され開発
されたこの株は、Stratagene社(ラ・ホーヤ、カリフォルニア州；www.stratagene.com)な
どの会社によっても販売されている。この株の培養及び形質転換方法に関する追加情報は
商業者のウェブサイトから無料でダウンロードできる。
その他の特徴のうち、TG１株は、「lacIq」リプレッサー遺伝子を有する。これは、グ
ルコースによる分解産物抑制とともに、pIIIファージコートタンパク質をコードするM13
遺伝子の発現制御下に置かれた「lac」プロモーターを負に制御する。TG1細胞と共に用い
られるほとんどのタイプのM13ファージは、pIII遺伝子の開始点に挿入された「アンバー
」終止コドンを含む。後述する通り、これにより、遺伝子を再度クローニングする必要な
く、HB2151などの非抑制型大腸菌株にて、可溶性のpIIIポリペプチド（外来アミノ酸配列
を含むキメラpIIIポリペプチドを含む）の発現が可能となる。
グルコースを含まず、その代わりに細菌の唯一の炭素源としてラクトース（特定の糖分
子）を含む培地中にTG1細胞を移すことにより、効果的に「アンバー」終止コドンを不活
性化することができる。イソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）と呼ばれる化合物
も加える。これにより、宿主細胞がラクトース分子を栄養物として代謝することを可能と
する「lac」オペロンの発現が強力に誘導される。これにより、形質転換された細胞が唯
一の炭素源としてのラクトースを有する培地中で成長することを可能となることに加えて
、形質転換された細胞がX-Galと呼ばれる化学物質を明青色に変換することも可能となり
、その結果、形質転換されたコロニーが寒天プレート上で容易に同定され単離される。
特定のファージを「増幅」（再生産）するのに用いる典型的方法（生体外パニング法ま
たは本明細書で記載される生体内選択方法の後などで行われる）において、寒天プレート
上で成長したTG１細胞のコロニーを、１リットルあたりトリプトン16ｇ、酵母抽出物10ｇ
、及びNaCl 5gを含む液体培地に接種した（トリプトン及び酵母抽出物を含むこの液体培
地は2TY培地と称される）。約0.5〜0.8単位の光学濃度（600ナノメートルの波長で測定し
たOD600)まで振盪培養器中で細胞を増殖した（別に示さない限り、培養はすべて37℃で行
った）。ファージ調製物を大腸菌培地に加え、その混合物をインキュベートした。細菌細
胞へのファージの結合を容易にするため、初期培養を30分間静止状態で行った。これに続
き、細胞を新しい栄養に最大限に曝すため、200rpm運転の振盪培養器中で30分間培養を行
った。
次いで、これらの細胞を3500rpmで10分間遠心分離し、古いブロス及び代謝産物を含む
上清を捨てた。細胞ペレットを500マイクロリットル(μL)の新しい2TY培養ブロス中に再
懸濁し、その混合物をアンピシリン及びグルコースを加えた2TY寒天培地を含有する４枚
の非常に広い四角形のプレート(24.3cm×24.3cm)表面に広げた。プレートを30℃で一晩イ
ンキュベートした。アンピシリンが存在しているので、scFvファージミドまたはPhDC7Cフ
ァージを含む大腸菌細胞のみがプレート上でコロニーを形成した。
次の日、必要時まで凍結させることができる標準化ファージ溶液を調製するために、各
寒天プレートから10 mLの2TYブロス中にコロニーをすくい取り、50 mLチューブに入れた
。半分量の無菌100％グリセロールを加え、次いで、そのチューブを室温で10分間反転式
撹拌機中に置くことにより溶液を混合した。その１mL量を保存のために−70℃で凍結した
。
試験にファージのバッチが必要なとき、グリセロール含有ストックの１mL量を融解し、
融解したストック100μLを、フィルター滅菌した2％(w/v)のグルコース及び100 mg/mlの
アンピシリンを含む2TYブロス25 mLに加えた。OD600密度が約0.5〜0.8になるまで振盪培
養器中で37℃で細胞を増殖させた。次いで、最終濃度が１mLあたり５×109 cfu（コロニ
ー形成単位）となるようにM13KO7ヘルパーファージを加えた。混合物を静止状態で30分間
、次いで200rpmの振盪トレー中で30分間インキュベートした。次いで、細胞を約10分間35
00rpmで遠心分離し、細胞ペレットをカナマイシン（50μｇ/ｍL）及びアンピシリン(100
μｇ/ｍL）を含む事前に温めた（グルコースなしの）2TY培地25mL中に再懸濁した。これ
らを、高速振盪しながら一晩25℃でインキュベートし、ファージ粒子を生産した。
20％ポリエチレングリコール(PEG)及び2.5 MのNaClを用いて沈殿させることにより上清
からファージ粒子を精製した。次いで、これらの粒子を最終量1.5 mLの無菌リン酸緩衝生
理食塩水(PBS)中に４℃で再懸濁した。
ファージ粒子を含む溶液を「力価測定する」ために（すなわち、感染ファージ粒子が各
１mLの溶液中に何個存在したか評価するために）、OD600密度が約0.5〜0.8になるで、TG1
細胞を300rpmの振盪培養器中で約４時間2TY培地中で成育させる。ファージ上清試料を、
順次10倍ずつ2TY培地中により希釈した。すなわち各希釈液50μLを順次エッペンドルフチ
ューブ内のTG1細胞懸濁液450μLに加えた。そのチューブを30分間静かにインキュベート
し、続いて300rpmで30分間振盪した。感染したTG1細胞の各希釈液100μLを事前に温めた2
TY寒天プレート(アンピシリン100μｇ/ｍL、フィルター滅菌したグルコース2%(w/v)、及
び寒天1.5%(w/v)を含有する2TY培地）上に筋状に延ばした。プレートを一晩インキュベー
トし、次の日、コロニー数を数えた。TG1細胞は、ファージ由来のアンピシリン耐性遺伝
子を保有していた場合に限り、アンピシリン含有培地で成長することができた。
M13KO7ヘルパーファージへのp75受容体結合抗体(MC192)の架橋
MC192（またChandler et al 1984に最初記載されたクローン192）として知られるモノ
クローナル抗体調製物は、Cell Sciences社(www.cellsciences.com)及びChemicon社(www.
chemicon.com)などの会社から市販されている。これらのモノクローナル抗体はラット神
経細胞上の「低親和性」(p75)神経成長因子受容体に結合する。ヒトp75受容体に結合する
モノクローナル抗体もUnited States Biological(www.usbio.net)などの会社から入手す
ることができる。
ラットのp75受容体に結合する種々の他のモノクローナル抗体と違って、MC192抗体は、
抗体−受容体複合体のエンドサイトーシスを引き起こすことができ、その結果MC192抗体
が神経細胞内に取り込まれる。このことは、放射標識した抗体を用いた研究によって示さ
れた(Johnson et al 1987、Yan et al 1988）。
ラット神経細胞へのファージのエンドサイトーシスを実行するMC192抗体の能力を評価
するために、多工程方法を用いて、M13KO7へルパーファージに化学的に架橋したMC192抗
体を含有する調製物を作製した。まず、スルホスクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル
）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（スルホ-SMCCと略す、オーストラリアのPierce社
から購入した）を、MC192抗体上の第1級アミノ基と（活性なスルホ-NHSエステル末端を介
して）反応させる。これにより抗体と各架橋基との間にアミド結合が形成され、スルホ-N
HSは副産物として放出される。未反応のスルホ-SMCCを取り除くため、活性化した抗体を
、Microcon YM-100遠心ろ過機（100キロダルトンカットオフ、カタログ番号42412、Milli
pore社、米国）を用いて精製した。
次の段階で、M13KO7ファージを2-イミノチオレーン（2-IT；別名トラウト試薬）と共に
インキュベートし、遊離スルフヒドリル基を形成した。これらの基は、ファージのpVIII
コートタンパク質中のリシン残基に結合した短鎖の末端に位置した。YM-100 kDaフィルタ
ーを用いてこれらのファージを濾過し、余分な試薬を取り除いた。
次いで、抗体調製物をファージ調製物と1:10の割合で混合し、活性化抗体のマレイミド
基と活性化ファージ上のスルフヒドリル基とからチオエステル架橋結合を形成した。反応
生成物を濾過して余分な抗体を取り除き、ヨードアセトアミド（Sigma Chemical)を加え
て残留する遊離活性スルフヒドリル基をブロックした。反応生成物をPEG/NaCl (2.5 MのN
aCl水溶液中の20％(w/v)ポリエチレングリコール（平均分子量8000））中で２回沈殿させ
て、遊離の抗体を取り除いた。
得られたファージ混合物は、ファージの全長に沿ってランダムに位置した種々の数のMC
192抗体を含んでいた。反応混合液中の抗体とファージとの比が10:1ゆえに、平均して約
２から約20の抗体がほとんどのファージ粒子に結合していたと推定及び評価された。
ラットの外科的治療及びファージの配置（emplacement）
雌のSprague-Dawleyラットを用い、外科手術をハロタン麻酔剤下に行った（酸素中２％
濃度、麻酔装置に経管接続したノーズコーンにより投与した）。あるいは、所望する場合
、ペントバルビツール酸ナトリウムなどの長期作用型の注射麻酔剤を用いることもできる
。
正しい処置方法を用いることにより成功する可能性が相当増すので、この外科手術をラ
ットにするための好ましい処置方法についていつくかのコメントを以下に示した。細胞及
びファージに非常に精通した多くの人々は本発明の生体内処置を行うのに必要な小動物の
外科手術には精通していないであろう。
このタイプの手術を初めて行うときはいつでも、処置の重要な部位及び態様への視野及
び注意を集中することを助けるため、トレーニングには20倍の倍率を付与できる双眼顕微
鏡をほぼ常に用いることに留意されたい。数分間の処置を行った後、その後の処置（また
は処置の繊細かつ困難な部分、例えば神経末端間にファージ含有ゲルフォームを置いた後
に坐骨神経の２末端を一緒に縫合する際）に顕微鏡を使用するか否かを選択することがで
きる。マウスを用いた場合、より小さいサイズゆえに、技術者が非常に高いレベルの経験
及び処置に対する慣れを身に付けるまで、すべての処置に双眼顕微鏡を使用することにな
るであろう。
ラットが６週齢のとき、最初の外科手術を行ってp75細胞受容体の発現を「上方制御」
した（増加させた）。このように坐骨神経を損傷させた場合、運動神経細胞（これは脊髄
中に細胞体を有し、そして坐骨神経を通って投射する軸索線維を有する）が刺激され、細
胞及び軸索表面上のp75受容体の発現数が増加する。予め結紮した神経細胞によるファー
ジの取り込みと結紮していない神経細胞によるファージの取り込みとの相違を比較する試
験により、予め結紮する工程は、p75受容体濃度及びファージ取り込みをおよそ13倍増加
したことが示された。これらの試験には、ファージ取り込み試験、及びラット脊髄の腰部
から得た組織断片の染色（Mc192抗体による）が含まれた。
ラットp75受容体について２つの他の要因も注意すべきである。まず、p75受容体は、脊
髄に由来し、かつ血液脳関門内に取り囲まれていない筋肉組織に軸索または他の神経線維
を送り出す運動神経細胞の表面上に相当数存在する。これには坐骨神経が含まれる。しか
し、ラットが急速に成長するラットの生後約２週間だけ、坐骨神経表面上に相当数のp75
受容体が存在する。約１週間から２週間後、坐骨神経上の受容体数は低下し、約６週齢ま
で、坐骨神経表面上に非常に少量で、しばしば検出できない量で存在する。
第２の注目要因は次のことである。３週齢以上であるラットの坐骨神経表面上にはp75
受容体は多くないので、制御された損傷を坐骨神経に与えた後でさえ、p75受容体エンド
サイトーシス系はかなり容易に飽和する。本生体内スクリーニング試験中、それは多くの
場合に明らかに飽和状態であった。しかしながら、本明細書に開示したいずれの結果も無
効になるのではなく、この要因は越えることができない「天井」値とみなすべきである。
したがって、これらの飽和制限は、p75受容体を用いた当該生体内スクリーニング試験に
おいて活性であると出願人が信じる機構及び効果を確認し有効にすると思われる方法で研
究し利用することができる。
最初の外科手術中、いずれの拘束機器の使用も必要ではない。後肢を最も高くして動物
を横にし、毛を剃り、皮膚を拭き取る。外科用ハサミまたは外科用メスを用いて、大腿骨
と平行に約１〜３cmほど大腿中央の皮膚の切開を行った。閉じた外科用ハサミ（刃長２〜
４cm）の先端を用いて、触診により大腿骨の位置を見つけ、ハサミの先を、筋層を通して
大腿骨の尾方に、動物の大きさに応じて１〜２cmの深さまで押した。次いで、ハサミを開
き、出血を最小限にして筋肉を切り離し、筋肉下にある坐骨神経を露出する１〜２cmの窓
を形成した。開創器または縫合を用いて筋肉を開いたままにし、手術窓を最大にすること
ができるが、これは熟練技術者には必要ない。
この侵入処置により、坐骨神経をはっきりと見ることができる。坐骨神経は、容易に分
離される膜により周囲組織にゆるく付着しているだけである。神経自体は強靭な神経髄鞘
により保護され、位置に応じて推定50000本の軸索が神経束内にある。交感神経やその他
の神経の軸索は有髄でないものもあるが、運動神経軸索（及びほとんどの感覚神経軸索）
は、シュワン細胞由来であり、かつ血液脳関門の外部の神経組織塊の大半を構成するミエ
リン鞘によって取り囲まれている。
坐骨神経下に曲がった鉗子を挿入することにより結紮糸を配置する。そして鉗子を用い
て神経をやさしく持ち上げ、存在する場合にはゆるく付着している膜を１〜２cmの長さで
取り除く。鉗子を開き、該鉗子を用いてある長さの6/0の絹縫合糸を掴み、該鉗子を引く
ことにより絹縫合糸を神経の下に引き込む。次いで、脛骨神経二分岐（tibial branch bi
furcation）によって坐骨神経束がより小さな２つの束に分けられる位置よりわずかに上
の部位に縫合糸を置き、神経の周りでしっかり結び、それを結紮する。絹またはナイロン
などの非吸収性の縫合糸を用いることが重要である。黒色の絹が一般的には好ましい。そ
れは弾性がより低く（結紮糸のきつい締め付けを容易にする）、黒色の結紮糸はその後の
手術中においてより容易に位置を見つけられるからである。
器具を回収し、分離した筋肉を再結合し、切開の長さに応じて１〜３本の縫合糸で皮膚
切口を閉じる。次いで、動物を麻酔から回復させる。
７日後、外科用ハサミを用いて、坐骨神経を再度露出し、結紮糸を含む２〜３mmの坐骨
神経断片を切り取った。
MC192-M13KO7抗体−ファージ結合体10μLを含む約９立方ミリメートルのコラーゲンマ
トリクスゲルフォーム（約3.3×106〜約2.1×109cfu/mLの力価を有する）を、神経束の２
つの切断端の間に挿入した。
10-0ナイロン外科用縫合糸を用いて、ファージを含むゲルフォームの両側に位置する坐
骨神経の切開端を一緒に縫合した。ゲルフォーム中の抗体−ファージ結合体が神経線維の
両端と直接接触し続けるように、シリコンゴム製の小さなフレキシブルスリーブを、神経
端及び抗体−ファージ結合体を含むゲルフォームの周囲に置いた。
切断及びファージ配置を行った同じ外科手術中に、6-0絹縫合糸を用いて、ラット臀部
近くの切断部位の約２cm上の位置で坐骨神経束を結紮した。この結紮を本明細書では臀部
結紮といい、p75受容体発現を増加させるのに用いた最初の結紮と区別する。
臀部結紮は、坐骨神経細胞内へ取り込まれた抗体−ファージ結合体が、脊髄の神経細胞
までずっと逆行輸送されるのを妨げる閉塞部位を作り出した。したがって、抗体−ファー
ジ結合体は、臀部結紮のすぐ下流の位置（遠位）の神経線維内に集積した。
エンドサイトーシス取り込み及び逆行輸送のために十分な時間を与えるために、18時間
後に、ラットをクロロホルム吸入により犠牲死させ、次の実施例に記載する通り、臀部結
紮に対して遠位の神経セグメントを採取した。
神経の採取及び取り込まれたファージの収集
前実施例で言及した通り、(i)ファージ粒子を含有するコラーゲンゲルを配置し、そし
て(ii)臀部結紮を配置した18時間後に、ラットを犠牲死させた。
臀部結紮とその結紮のすぐ遠位の神経線維セグメントとを含む神経セグメントを採取し
た。そのために、臀部結紮の下流（遠位）の約0.5 cmの位置で、さらに追加の結紮を坐骨
神経周囲に配置し固く締めて、神経束の切断端からのファージ粒子の損失を防いだ。次い
で、神経セグメントの両端周囲にしっかりと結ばれた２つの結紮環を共に含む坐骨神経束
のセグメントを切り出し、取り出した。
切除した神経束を、外側の膜が取り除かれるまで、滅菌したティッシュペーパーと共に
鉗子を用いて無菌PBSで３回こすり洗いした。次いで、神経細胞を乾燥したガラスプレー
ト上に移し、結紮糸を取り除いた。
次いで、溶解緩衝液（細胞膜を消化するがバクテリオファージ粒子を消化しない）450
μLを適用した。該溶解緩衝液は、pH８の1%トリトンX-100、10 mMトリス及び２mM EDTAを
含有し、かつ1/100容量のプロテアーゼ阻害剤混合物(Sigma Chemical)（ジメチルスルホ
キシド中の4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフロリド、ペプスタチンＡ、E64、ベ
スタチン、ロイペプチン、及びアプロチニンを含有する)を含有する。溶解緩衝液中で、
外科用メスを用いて神経線維を小片に切り、得られた懸濁物をエッペンドルフチューブに
移し、ボルテックス上で１時間室温でインキュベートした。次いで、そのチューブを４℃
で10分間10000 rpmで遠心分離し、坐骨神経砕片をペレットにした。
その上清（ファージ粒子を含む）を収集し、氷上に保存した。他方、砕片ペレットをさ
らに300μLの溶解緩衝液と共にインキュベートし、室温でさらに１時間ボルテックスした
。次いで、溶解した砕片を室温で１時間インキュベートし、試料を別のエッペンドルチュ
ーブに移し、４℃で10分間10000 rpmで遠心分離して、残っている砕片をペレットにした
。上清を収集してその前の上清に加え、20容量％のCaCl2を加えて、溶解緩衝液中のEDTA
を不活性化した。
実施例25に記載したように、得られた混合上清の一定量を力価測定して、ファージ粒子
濃度を決定した。別の一定量には50容量％のグリセロールを加え、その後の使用または分
析のために混合物を−20℃で凍結保存した。生体内選択の最終回を除くすべての回で、さ
らに別の一定量を用いて大腸菌細胞に感染させ、上記と同じ処置を用いて、増幅したファ
ージ調製物をその次の生体内選択サイクルの試薬として用いた。
神経セグメントの組織学的写真
蛍光染色技術を用いて、臀部結紮のすぐ下の坐骨神経束内に取り込まれ及び輸送された
MC192-M13KO7抗体−ファージ結合体を視覚的に確認する顕微鏡写真を撮った。
これらの写真確認を行うために、過剰量の麻酔（80 mg/kgのペントバルビタールナトリ
ウムを腹腔内に注射する）で動物を安楽死させた。次いで、２％パラホルムアルデヒド及
び0.2％パラベンゾキノリンを含有する氷冷した0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液400 mLを用
いて30分間にわたり心臓を通して該動物の潅流固定を行った。次いで、臀部結紮を含む坐
骨神経セグメントを切断し、同じ固定液中にさらに１時間置いた後、30％ショ糖リン酸ナ
トリウム緩衝液に移した。
次いで、未だ無傷の神経束をOCT化合物(TissueTek，Sakura Finetechnical社、東京、
日本）中に埋め、凍結した。ミクロトームを用いて、埋め込み凍結した神経束からクライ
オスタット縦断切片（厚さ50ミクロン）を作製した。
次いで、神経束の中心付近から作製した特定の縦断組織切片を免疫試薬で処置して、フ
ァージ粒子の存在及び濃度を明らかにした。１つの試薬は、バクテリオファージ粒子上の
pIIIキャプシドタンパク質に結合するビオチン配列付きのウサギ由来の抗体調製物（Sigm
a Chemicals社、カタログ番号B2661）であった。これらの抗体を組織切片と共に室温で１
時間インキュベートした。次いで、ファージに結合するウサギ抗体上のビオチン配列に非
常にしっかりと結合するストレプトアビジン配列を含むAlexa Fluor 488(Molecular Prob
es社、カタログ番号S-11223）を加え、室温で１時間インキュベートした。
臀部結紮の両方の側の神経線維セグメントを含む神経線維の部分をカバーする神経束の
蛍光写真を取った。白黒で複写したそれらの写真のうちの１つを図中の図ｂとして提供す
る。
その写真は、抗体−ファージ結合体が臀部結紮の遠位側に確かに蓄積したことを明確に
示している（他の写真も非常に類似した結果を示した）。これらの写真及びその他の試験
からの類似の写真から、本明細書に記載した結合、エンドサイトーシス、及び輸送の機構
が確かに本明細書に開示したように効率的に機能したことが明確に確認される。
受容体特異的な取り込み性の抗体を架橋していないM13KO7ファージを注射したコントロ
ール処理からの同様の写真及びその他の分析試験により、結紮の遠位側の同じ位置にコン
トロールファージが無いことが示された。
ファージ粒子を付着させたモノクローナル抗体を用いた前述の試験及び結果から、本明
細書に開示した本発明のいくつかの重要な点が確認された。特に、これらの結果から、(i
)ラット神経細胞のp75受容体に結合することができる完全な線状ファージ粒子は、坐骨神
経線維によって取り込まれ、次いで逆行輸送がなされ得ること、及び(ii)上記の結紮、配
置、及び採取の行程を用いて、十分かつ効果的に、血液脳関門外部で起こるファージと線
維との接触に基づき、完全かつ生存可能な感染性のファージ粒子が神経細胞線維内に取り
込まれ、次いで該線維内で輸送されることを可能とする特定のリガンドを、生体内でスク
リーニング及び選択することができること、が確認された。
神経線維を用いた生体内スクリーニングへの一般的アプローチを確かめ、かつ、このよ
うな生体内スクリーニング試験を確実かつ効果的に行うことができる方法及び試薬の組み
合わせを考案し、開発し、最適化し、そして確認した後、本出願人は非常に多数の候補リ
ガンドを含むファージディスプレイライブラリの生体内スクリーニングを実際に試験する
ことにより、それらのアプローチの適用拡大を行った。
scFvファージライブラリの生体外バイオパニング（biopanning）
上述したように、ラット神経細胞のp75受容体はエンドサイトーシス活性を有すること
が知られている。神経細胞表面上の該受容体の数は、種々の神経細胞損傷に応答しておよ
そ10倍から15倍まで増加することも知られている。ラットでは、坐骨神経が２つの主な枝
に分かれる脛骨神経二分岐部位の若干上の位置の坐骨神経束周囲に固い結紮環を配置する
ことにより、制御され再現できる形式で、このような損傷を作り出すことができる。その
部位での結紮は、脊髄と結紮部位との間の坐骨神経線維に沿ってp75受容体の相当な数の
増加を引き起こす。また、p75受容体数が増加した患部の神経線維セグメントは十分に長
いので、ある位置でファージ含有ゲルを配置し、続いて離れた位置で取り込まれ及び輸送
されたファージを採取することが可能となる。
これらのすべての要因によって、p75受容体は、非常に多数の候補リガンドを有するフ
ァージディスプレイライブラリを用いた本明細書に開示する生体内選択方法の最初の試験
及び確認のために有用であり、調節可能な標的となった。
したがって、本出願人は、scFvファージディスプレイライブラリの最初の試験を、特に
p75受容体に特異的に結合することができる候補リガンドに限定することを選択する。本
出願人は、ディスプレイライブラリ（実施例22で記載したように、多種類の祖先に由来す
る10人の異なるヒトの免疫系に匹敵するように設計された推定130億種類の可変断片抗体
配列を含有する）中の他のリガンドが、エンドサイトーシス及び逆行性輸送を引き起こす
他の神経細胞表面受容体に必ず結合することができるであろうことを理解していたが、sc
Fvライブラリを用いたこの試験の決定及び目標は、p75受容体に結合するリガンドに試験
を限定することであった。
最初の一連の研究により一般的原理を確認し、しかしまた様々な結果データも得た後（
これらの試験及び結果は実施例30に記載され、また、あるサイクルで選択されたファージ
を次のサイクルの開始材料として用いるという生体内スクリーニング方法のサイクル反復
を評価する試みを始めるときに利用される）、本出願人は、「バイオパニング」と呼ばれ
る生体外(in vitro)方法を用いてscFvファージディスプレイライブラリを処理することに
よって、p75受容体エンドサイトーシスに焦点を当てることを決定した。
この生体外方法では、組換えヒトp75受容体ポリペプチド調製物を用いた。このポリペ
プチドは市販され、ヒト神経成長因子(NGF)受容体の細胞外ドメインの１〜250個のアミノ
酸残基をコードし、それがペプチドリンカーを介してヒトIgG1タンパク質のFc領域（
カルボキシ末端が６個のヒスチジンで標識されている）に融合されている。グリコシル化
タンパク質を得るために、Sf21(ヨトウ蛾Spodoptera frugiperda由来)として知られる昆
虫細胞株及びバキュロウイルス発現ベクターを用いて、キメラタンパク質を細菌細胞では
なく真核細胞内で発現させる。組換え成熟キメラタンパク質はジスルフィド結合ホモ二量
体として存在する。各単量体は466個のアミノ酸を含有し、51 kDaの計算重量を有する。
しかしながら、グリコシル化はタンパク質の大きさ及び重量を増加させるので、硫酸ドデ
シルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)では、各単量体は90〜100
kDaのタンパク質として移動する。
これらのポリペプチドを免疫チューブ(immunotubes)の表面上にコーティングした。こ
のために、ポリスチレン親水性表面を有する７mLのMAXISORP（商標）チューブ(カタログ
番号444474、Nalge Nunc International社、デンマーク)を用いた。リン酸緩衝生理食塩
水(PBS)0.5 ml中に懸濁した５μg/mL濃度の組換えヒトp75受容体タンパク質を免疫チュー
ブ中で４℃で一晩インキュベートした。
次の日、チューブを排水し、次いでPBSでリンスし、3% (w/v)スキムミルク含有PBSで縁
まで満たし、室温で２時間ブロックした。一方、scFvファージディスプレイライブラリ50
μLを、エッペンドルフチューブ中で室温で１時間、3%スキムミルク含有PBS 450μLで予
めブロックした。免疫チューブをPBSでリンスし、そのチューブに予めブロックしたファ
ージ溶液500μLを加え、室温で２時間インキュベートした。
0.1% Tween 20含有PBSで15回洗浄した後、新鮮な100ｍMトリエチルアミン(TEA)溶液(pH
11) 500μLにより室温で15分間インキュベーションして、残留している結合ファージを
溶出した。溶出されたファージをエッペンドルフチューブに移し、1Mトリス塩酸緩衝液（
pH7.4）250μLを加えて中和した。
溶出液の半分を用いてTG1大腸菌宿主細胞に感染させ、OD600光学密度0.5〜0.8まで培養
する。溶出液のもう一方の半分を予備として保存した。バイオパニングされたファージ調
製物をTG1細胞と共に、30分間静置下に、次の30分間300rpm振盪下に、１時間37℃でイン
キュベーションした。次いで、連続希釈した感染細胞溶液をアンピシリンを含む2TY寒天
プレートに広げて、ファージの力価を決定した。
増殖のため、残っている細胞を４枚のアンピシリンを含む2TY寒天プレート(243mm x 24
3mm)に広げた。これらのプレートを30℃で一晩インキュベーションした。コロニーをこす
り取って2TYブロス液中に入れ、OD600レベル0.5〜0.8まで成長させた。次いで、M13KO7へ
ルパーファージを加え、最終濃度を１mL当たり５×109cfu（コロニー形成単位）にした。
この混合物を静置下に30分間、次いで200rpm振盪トレー中で30分間インキュベーションし
た。次いで、細胞を3500rpmで10分間遠心分離し、細胞ペレットをカナマイシン（50μｇ/
ｍL）及びアンピシリン(100μｇ/ｍL）を含む事前に温めた（グルコースなしの）2TY培地
25mL中に再懸濁した。これらを、高速振盪しながら一晩25℃でインキュベートし、ファー
ジ粒子を生産した。20％ポリエチレングリコール(PEG)及び2.5 MのNaClを用いて沈殿させ
た。次いで、これらの粒子をコラーゲンゲルと混合し、およそ500億（５×1010）cfuのフ
ァージを含むゲルの塊を、生体内スクリーニング処理中にラット脚中に配置した。
本出願人は、生体内で試験するp75結合リガンドの多様性を最大限保存したかったので
、生体内スクリーニング前に１回だけ生体外バイオパニングを行った。多くのタイプのp7
5結合抗体がp75受容体を有する細胞により取り込まれないことが知られているので、生体
外スクリーニングを連続すれば、この多様性は危なくなるであろう。懸念することは、固
く結合するリガンドは、生体内のp75受容体を封鎖及び／または変形して、それによりp75
受容体の正常なエンドサイトーシスプロセスを行う能力を妨げると思われることである。
生体外バイオパニングの追加実行は、エンドサイトーシス誘発能力とは関係なく、固く結
合するリガンドを選択する傾向にあるので、生体内で細胞内へのエンドサイトーシス輸送
を実現するのに相当に効果的である候補リガンドが除外されてしまうであろう。
それにも関わらず、scFvファージライブラリを用いて３回連続してバイオパニングを行
い、このライブラリが生体外スクリーニングの反復に対してどのように応答するかを評価
した。比較できる結果を確立するため、２回目及び３回目で用いる各ファージ溶液をPBS
で希釈し、１回目で用いた溶液の力価と一致させた。
１回目のバイオパニングではscFv力価がおよそ3000cfuという結果となった（これに対
してPBSを試験したコントロール値はおよそ1200cfu）。他方、２回目のバイオパニングで
は約8400万cfuへの非常に大きな増加という結果となった。３回目のバイオパニングでは
力価が約8500万cfuという結果となり、２回目のバイオパニングより有意な増加はなかっ
た。
scFvライブラリから取り込まれたファージの生体内（坐骨神経内）選択
前述の実施例で言及した通り、実施例29に記載されるような（ヒトp75受容体ポリペプ
チドを用いた）１回のバイオパニングにより選択されたscFvファージディスプレイライブ
ラリの「濃縮」物を、ラットにおける一連の生体内スクリーニングの開始試薬として用い
た。これらの生体内スクリーニングでは、実施例25及び26に記載されるようなMC192/M12K
O7抗体−ファージ結合体を用いて開発し、試験し、最適化した処置及び方法を用いた。
簡潔に言うと、最初の操作では、最初の結紮を坐骨神経の脛骨神経二分枝のすぐ上に置
き、結紮より上の坐骨神経線維上でp75受容体発現の増加を誘導した。１週間後、第２の
操作では、坐骨神経束を切断し、切断端でシリコンゴム製スリーブ内部に、１回のp75バ
イオパニングにより得た約500億cfuのscFvファージを含有するコラーゲンゲルを詰めた。
第２の操作中には、結紮糸を臀部領域の坐骨神経の周りに配置し、きつく締めて障壁を作
り、取り込まれ及び逆行輸送されたファージ粒子を結紮に対してすぐ遠位の神経線維内部
に蓄積させた。１８時間後、第３の操作では、ラットを犠牲死させ、臀部結紮及び結紮遠
位およそ0.5 cmの神経線維を含む神経線維セグメントを採取した。採取した神経線維を洗
浄し、小片に切り、ファージ粒子を取り出して単離した。大腸菌細胞及びヘルパーファー
ジを用いて、ファージ粒子を増幅し、力価を測定した。
切除した神経セグメントから回収したファージの絶対数は実験間で変動したが、常にコ
ントロールファージ群を試験し、その結果を試験ファージ群のデータと比較することによ
り、標準化した取り込み及び輸送の測定値を作製した。
例示するため、代表的な実験（コントロール及び試験選択の両方につきn＝3）から得た
絶対数を用いる。５×1010（すなわち500億）cfu（力価推定）のコントロールファージ（
非改変M13KO7ヘルパーファージ）をファージ接触部位に配置した。18時間後に切除した神
経セグメントから回収したコントロールファージの数値は、力価測定により14650（±297
5、平均値標準誤差(SEM)、n＝3)であった。同量（５×1010cfu）のscFvファージ（実施例
28に記載の通りp75認識のために１回バイオパニングしたもの）をファージ接触部位に配
置し、18時間後に切除した神経セグメントから回収したscFvファージの数値は、力価測定
により190400（±14415 SEM、n＝3)であった。それらの２つの結果を比較すると、切除し
た神経セグメントからコントロールファージより13倍を上回るscFvファージ（p75のため
１回バイオパニングしたもの）が回収されたと計算された。この実験を３回繰り返し、各
回同様の結果であった。
scFvファージの取り込み及び輸送のこの顕著な増加が本当にscFvのp75への結合の結果
であるかどうかを試験するため、坐骨神経を予め結紮しない（したがって、運動神経細胞
は、約２週齢超のラットで出現する非常に低くかつしばしば検出できないレベルを上回っ
てp75の発現を増加しない）別の組の動物で、この実験を繰り返した。これらの試験では
、コントロールファージ（M13KO7）及び試験ファージ（scFv）の適用量を従前と同じく５
×1010cfuとした。18時間後に切除した神経セグメントから回収したコントロールファー
ジの数値は 14815±4481 (n=3)であった。18時間後に切除した神経セグメントから回収し
たscFvファージ（p75認識のために１回バイオパニングしたもの）の数値は 16413±4541
(n=3)であった。これらのデータから、６週齢超のラットで本来見られる非常に低レベル
のp75受容体を有するラットを試験した場合、scFvファージ（p75認識のために１回バイオ
パニングしたもの）の細胞取り込み及び輸送の効率性はコントロールファージの効率性と
は本質的に異ならないことが明確に示された。これにより、p75の発現レベルと、p75受容
体認識のためにバイオパニングされたscFvファージの取り込み及び輸送の効率性との間に
明確な関係があることが確認された。この試験を３回繰り返し、同様の結果を得た。
パニングを行わないscFvライブラリのサイクル試験
生体外バイオパニング処理（実施例28に記載）を決定して用いる前に行った一連の試験
で、実施例25及び26に記載されるように坐骨神経線維を用いて、一連のサイクル式の生体
内スクリーニング方法によりscFvライブラリを試験した。ある回の試験から得られたスク
リーニング選択されたファージ群を、次の試験サイクルで開始試薬として用いるので、こ
れらの試験を「サイクル式」と称する。
これらの試験は、ファージライブラリが、エンドサイトーシス取り込み及び逆行性輸送
を活性化し実行する特定のファージ媒介リガンドを含むことの明確な証拠を与えたが、こ
れらのサイクル式試験の結果は非常に変動した。データのばらつきにより、本出願人はデ
ータが次の解釈と一致するという結論に至った：
(i)神経線維表面上のp75受容体の数は限定されるゆえ、リガンド−受容体結合及び取り込
みプロセスは飽和していた；
(ii)投与ファージ群は非常に多様であり、初回では、任意のある特定のファージは１また
は少数個しか存在せず、その後の回では、数百またはさらには数千の異なるファージ候補
を含んでいるようであった；
(iii)したがって、任意のある特定のファージが、異なる動物での２つの異なる実験で選
択される可能性は極めて低いものであった（この可能性は、試験群中の任意のある特定の
ファージのコピー数を、神経束から効率的に採取した代りのファージ数によって割ったも
のとほぼ等しいとみなすことができる）。
これらの要因から、異なる動物を用いた異なる実験間で見られる非常に高い変動性を明
確に説明することができる。したがって、このような高変動性に直面し熟慮した後に、本
出願人は、投与群内での変動を減少させ、かつ、神経束から採取するのに利用されうるp7
5結合ファージ候補のコピー数を実質的に増加させるための事前スクリーニング工程（す
なわち生体外バイオパニング）と共に実験を行うことを決めた。
事前スクリーニング工程の前に行ったscFvライブラリ試験から得られたデータから、１
回目、２回目、おそらく３回目の連続的なスクリーニングサイクルはすべて細胞による取
り込み及び逆行性輸送においてより良い効率をもたらすようであることが示された。しか
し、用いた特定の条件下では、さらに多数回の生体内スクリーニングを用いた場合、それ
らの効率は下がる傾向にあった。結果として起こる低下の原因は明らかではなかった。他
方、２回目または第３回目の選択から選択されたファージのうち、有意な割合の個別コロ
ニーが、神経細胞受容体に結合して取り込み及び逆行輸送を刺激するリガンドを表示する
ことが合理的に予測されうる（それらは繰り返し選択されたので、それらが偽陽性である
可能性は低い）。
サイクル式生体内スクリーニングはまだ徹底的には評価されておらず、特に、バイオパ
ニングまたは同様の取組みにより予めスクリーニングされたファージ群では未だ試験され
ていない。それにも関わらず、これまでに行われた作業によって以下のことが明確に実証
および確認されたと信じる。
(1)少なくともいくつかのタイプのファージ群で、ある回のスクリーニングで選択され
た候補群を次回のスクリーニングで開始試薬として用いる一連のサイクル式生体内スクリ
ーニングは実際に可能であり、少なくともいくつかの場合において、細胞中へのエンドサ
イトーシス輸送を誘発および実行する際に非常に有効である候補リガンドを同定し単離す
るのを助けるようである。
(2)サイクル式方法を止めるべき時点についての有用な指標を与える数値指標の開発は
可能であり、これにより、該スクリーニング方法においてその時点までに同定された最良
の性能を与えたと思われる候補リガンドを注意深く分析及び配列決定することが可能とな
る。
(3)少なくともいくつかのファージリガンドは、エンドサイトーシスを仲介することが
従来知られていなかった表面分子に結合した後に、取り込み及び逆行性輸送を刺激したと
思われる。
最後に、これらの分析の意味合いを考慮する際、このタイプの生体内スクリーニングの
基本的かつ決定的な目標は、神経線維によって取り込まれる何千ものファージ候補を提供
することができる非常に濃縮された、すなわち「優良な」ファージ群を作製することでは
ないことを注意されたい。その代わり、この目標は、エンドサイトーシスの取り込みプロ
セスを活性化し実行するのに非常に有効であるほんの１つまたは少数の特定のリガンドを
同定し単離すること（そしてポリペプチドリガンドの場合には、そのヌクレオチド遺伝子
配列及び／またはアミノ酸配列を決定すること）である。このようなタイプのリガンドは
、いったん同定単離されると、大量複製することができ、表面上に特異的な標的エンドサ
イトーシス受容体または類似分子を有する特定の部類の細胞内へ有用な運送物または運搬
物分子を輸送する分子複合体に組み込むことができる。
scFvファージライブラリを予めスクリーニングするためにp75ポリペプチド配列を用い
る上述のバイオパニング工程では、既知または疑いのある任意のエンドサイトーシス受容
体、あるいはエンドサイトーシス活性を有すると疑われる他の表面分子に由来する既知の
ポリペプチド配列または断片を（免疫チューブの表面に接着させる「抗原」分子として）
用いうることに留意されたい。また、エンドサイトーシス活性を有すると疑われる任意の
グリコシル化細胞表面分子を用いることもできる。
PhD-C7Cファージライブラリを用いた生体内選択
実施例22に簡単に言及した通り、PhD-C7Cファージディスプレイライブラリは、M13ファ
ージのpIIIキャプシドタンパク質のＮ末端をコードするDNA配列の近くに挿入された７個
のアミノ酸のランダム配列をコードする外来DNA挿入物を有する推定20億種類のファージ
を含む。このライブラリは、あるファージが坐骨神経束の神経細胞により取り込まれ輸送
されるかどうかを決定するために試験される本質的にランダムなペプチド配列のレパート
リーを提供した。
上記の坐骨神経処理を用いたPhD-C7Cライブラリの生体内スクリーニングから、このラ
イブラリがまさに期待どおり実施されることが示された。相当数のファージが坐骨神経線
維によって取り込まれ、臀部結紮の直ぐ遠位のファージ蓄積領域に輸送された。回収した
神経セグメントから生存した形で特定ファージが取り出され、これらのp75選択生存ファ
ージを上記のいずれかの方法で複製し操作することができる。
所望する場合には、上記で示した通り（scFvライブラリのp75バイオパニングについて
上述した通り）、任意の既知かつ利用可能な受容体ポリペプチド配列をバイオパニング抗
原として用いたバイオパニング技術を用いて、PhD-C7Cライブラリを予めスクリーニング
することもできる。
このように、(i)限定された数及び種類の細胞だけの表面に存在する特定のエンドサイ
トーシス分子を介して、細胞のエンドサイトーシスプロセスを効率的に活性化し実行する
リガンドを同定するために、生体内スクリーニングを使用するための新規で有用な方法、
及び(ii)標的のエンドサイトーシス受容体または他の表面分子を有する細胞内へ有用な運
送物または運搬物分子を効率的に輸送するのに用いることができる分子複合体中へそれら
のリガンドを組み込むための新規で有用な方法が記載されている。本発明は、例示及び記
載の目的のために特定の実施形態を参照して説明されているが、例示された実施例の種々
の改変、変更、及び等価交換が可能であることは当業者に明らかである。本明細書中の教
示から直接得られ、かつ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することのないいずれの変更も
本発明の範囲に属するとみなす。
したがって、血液脳関門を通って脳及び脊髄組織内へ（特に、完全に血液脳関門内に位
置する神経細胞内へ）治療用または他の有用なポリペプチドを非侵襲的に輸送するための
新規かつ有用な手段、及び限定された数及び種類の細胞だけの表面に存在する特定のエン
ドサイトーシス分子を介して細胞のエンドサイトーシスプロセスを効率的に活性化し実行
するリガンドを同定する生体内スクリーニングを使用するための新規かつ有用な手段が示
され、記載されている。本発明は、例示及び記載の目的のために、ある特定の実施形態を
参照することにより説明されているが、例示された実施例の種々の改変、変更、及び等価
交換が可能であることは当業者に明らかである。本明細書中の教示から直接得られ、かつ
、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することのないいずれの変更も本発明の範囲に属すると
みなす。
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［図面の簡単な説明］
［図ａ］図ａは、BBB内に完全に位置する神経細胞に治療ポリペプチドをBBBを通して
送達するために、嗅受容体神経細胞の露出した投射（「粘液先端」）に遺伝子ベクターを
トランスフェクトすることを示す。トランスフェクトされた嗅受容体神経細胞では、ベク
ター内の遺伝子からポリペプチドが発現され、BBBを貫通する神経軸索を介して輸送され
る。次にポリペプチドは、BBBをまたぐ神経細胞によりBBB内に分泌されて、前脳基底核の
コリン作動性神経細胞のようなBBB内に完全に位置する中枢神経系神経細胞と接触するこ
とできる。
［図ｂ］図ｂは、神経細胞にトランスフェクションするウイルスベクターを示す。こ
のベクターは、キャプシド殻、表面結合リガンド、および有用な「運送物」又は「運搬物
」遺伝子を含む遺伝的に改変されたゲノム、を含む。
［図ｃ］図ｃは、嗅受容体神経細胞のトランスフェクションを示す。また、ベクター
内にコードされたポリペプチドが移動して、前脳基底核内に主細胞体が存在するコリン作
動性神経細胞の一部である神経突起の先端に位置する終端に到達及び接触するための、嗅
球を通した経路を示す。
［図ｄ］図ｄ（図dA、dB及びdC）は、神経因性疼痛のような状態で見られる不必要で
過剰な神経接続又は活性を抑制するために、遺伝子ベクターを用いて、BBB内に完全に位
置する神経栄養性因子生産細胞に、抗神経栄養性ポリペプチドを送達することを示す。こ
の方法では、「NPC （神経因性疼痛制御）」ベクターを、皮膚などの組織を神経支配する
侵害受容性神経細胞にトランスフェクトする。侵害受容性神経細胞は、ベクター内にコー
ドされた抗神経栄養活性を持つポリペプチドを発現し、脊髄組織にそれらのポリペプチド
を放出する。図dB（治療前の異常に多数の不要な疼痛信号を送る神経接続を示す）及び図
ｄＣ（治療後の減少した不要な疼痛信号を送る神経接続を示す）に示されるように、この
ような神経栄養性受容体又は因子の遮断又は阻害は、神経因性疼痛症状を誘発又は悪化さ
せる過剰な神経接続の抑制又は萎縮をもたらす。
［図ｅ］図ｅ（図eA、eB及びeC）は、BBB内に完全に位置する種類の神経細胞（上位
運動神経細胞と呼ばれる）に治療ポリペプチドを送達するために、筋肉内の「脊髄運動神
経細胞」に遺伝子ベクターをトランスフェクトすることを示す。この種の治療は、例えば
脳卒中発作、損傷または病気のために麻痺又は損傷した四肢を持つ患者で遂行される。図
eAに示されるように、遺伝子ベクターは筋肉組織に注入され、BBBをまたぐ脊髄運動神経
細胞にトランスフェクトされ、それらの神経細胞は、ベクター内にコードされた神経栄養
活性を有するポリペプチドを発現して、脊髄組織内にそれらのポリペプチドを放出し、そ
れによりBBB内に完全に位置する上位運動神経細胞に神経栄養性ポリペプチドを送達する
。図eBは治療前の脳卒中発作障害または同様の患者の状態を示す。そこでは、上位運動神
経細胞の神経「突起」の一部（しかし全てではない）が退化及び／又は萎縮し、もはや脊
髄運動神経細胞と十分に相互作用できず、四肢の障害又は麻痺に至る。図eCは神経成長因
子により治療した後の改善された状態を示す。その状態では、上位運動神経細胞の１つに
属するまだ機能的な神経突起が新しく付加的なシナプス接続を形成（「発芽」）し、治療
前には十分に神経支配されていなかった脊髄運動神経細胞と相互作用できるようになる。
［図ｆ］図ｆは、BBB内に完全に位置する神経細胞にBBBを通して治療ポリペプチドを
送達するために、舌下神経核（脳幹の一部）の下位運動神経細胞の投射に遺伝子ベクター
をトランスフェクトすることを示す。これらの神経投射の露出末端は舌にある。従って、
この種の神経細胞は、中枢神経系の脳幹部分内に外来ポリペプチドを導入する為の比較的
最短経路を提供する。
図１は、２つの結紮をラットの坐骨神経束のまわりに配置したこと、及びファージがエンドサイトーシスを介して坐骨神経線維内に取り込まれる様に、ファージを含むコラーゲンゲルを、坐骨神経束の切断端と接触させて配置したことを模式的に示す。 図２は、臀部結紮の隣の坐骨神経束内に集まった蛍光標識された抗体−ファージ結合体の写真である。結紮（縫合糸により締め付けた環） は坐骨神経線維によって取り込まれた抗体−ファージ結合体が結紮部位を越えて逆行輸送されることを防ぐ。 図３は、サイクル式の生体内リガンド選択法を模式的に示す。この方法では、明細書中に開示した生体内方法に従って、リガンド表示ファージをファージディスプレーライブラリーから、神経細胞によるエンドサイトーシス取り込みに関して選択し、そして１つのサイクルにより選択されたファージ群を、次サイクルのスクリーニングの開始材料として使用する。

Claims (93)

  1. 高等動物の血液脳関門を通して神経活性ポリペプチド分子を送達する方法であって、下
    記工程を含んで成る方法：
    （ａ）神経活性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を有し、そして血液脳
    関門にまたがる少なくとも1種類のアクセス可能な神経細胞にトランスフェクションする
    ことができるように構成されている遺伝子ベクターを作成する工程、
    ここで、各アクセス可能神経細胞は、動物の血液脳関門を通過しなかった化合物にアク
    セスすることができる少なくとも１つの末梢投射を有し、
    遺伝子ベクターが高等動物に投与される場合、少なくとも１つの遺伝子ベクターと、少
    なくとも１つの末梢投射とが直接に接触するような方法で投与され、
    遺伝子ベクターをアクセス可能神経細胞にトランスフェクションした後、アクセス可能
    神経細胞内で、神経活性ポリペプチドをコードする遺伝子が、神経活性ポリペプチドを複
    数発現することができる；および
    （ｂ）(i) 少なくとも１つの遺伝子ベクターが、少なくとも１つのアクセス可能神経細胞
    に接触してトランスフェクションされること；および(ii)少なくとも１つのアクセス可能
    神経細胞が、上記遺伝子によりコードされる神経活性ポリペプチドを発現し、続いてその
    神経活性ポリペプチドを、血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に分泌する
    こと、が保証される位置および様式で、遺伝子ベクターを高等動物に投与する工程。
  2. 血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞が感覚神経細胞である、請求項１の方法
    。
  3. 感覚神経細胞が嗅覚受容体神経細胞である、請求項２の方法。
  4. 感覚神経細胞が侵害受容神経細胞である、請求項２の方法。
  5. 血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞が運動神経細胞である、請求項１の方法
    。
  6. 運動神経細胞が脊髄の運動神経細胞である、請求項５の方法。
  7. 運動神経細胞が舌下神経核の運動神経である、請求項５の方法。
  8. 血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞が副交感神経系の節前神経細胞である、
    請求項１の方法。
  9. 血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞が交感神経系の節前神経細胞である、請
    求項１の方法。
  10. 神経活性ポリペプチドが、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、傍分泌因子、視床下
    部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、神経栄養因子に結合する抗体、神経栄養因子受
    容体に結合する抗体、中枢神経系細胞により発現される受容体のポリペプチドアンタゴニ
    スト、アゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群から選択
    される、請求項１の方法。
  11. 遺伝子ベクターが、哺乳動物細胞上で活性であるウイルスキャプシドの少なくとも一部
    分を含む細胞トランスフェクション成分を含む、請求項１の方法。
  12. 遺伝子ベクターが、カチオン性リポソームまたは他の遺伝子トランスフェクション脂質
    を含む、請求項１の方法。
  13. 遺伝子ベクターが、アクセス可能な神経細胞上の少なくとも１種類のエンドサイトーシ
    ス受容体に特異的に結合するリガンドを含む、請求項１の方法。
  14. リガンドが、下記工程を含む選択工程を通して同定されたものである、請求項１３の方
    法：
    （ａ）選択した種類の複数の神経細胞を、ファージミドまたはファージディスプレイライ
    ブラリーと接触させる工程、
    ここで、ライブラリイー中の各ファージは、候補DNA配列を有し、その候補DNAによりコ
    ードされるポリペプチドを、露出されたファージ表面上に有し、
    そしてファージディスプレイライブラリーは、複数の候補DNA配列を有し、対応ポリペ
    プチドがファージ表面上に露出された複数のファージ粒子から成る；および
    （ｂ）ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１種類のクローンファージ株
    を選択する工程、
    ここで、選択したクローンファージ株は、選択した種類の神経細胞内に輸送されたもの
    である。
  15. 遺伝子ベクターが、脳神経関門にまたがる選択した種類のアクセス可能な神経細胞から
    、動物の血液脳関門により保護された中枢神経系組織内に完全に位置する少なくとも１種
    類の神経細胞へ、関連遺伝子物質を、神経細胞を通して輸送することを促進することが示
    された高分子を含む、請求項１の方法。
  16. 遺伝子ベクターが、下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項１の方法
    ：
    （ａ）キメラポリペプチドを発現する神経細胞内で、キメラポリペプチドの順行性輸送を
    実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  17. 遺伝子ベクターが、下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項１の方法
    ：
    （ａ）動物の血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に位置する神経細胞末端
    においてキメラポリペプチドの分泌を実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  18. 高等動物の血液脳関門を通して神経活性ポリペプチド分子を送達する方法であって、神
    経活性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を有する遺伝子ベクターを高等
    動物に投与する工程を含んで成る方法：
    ここで、遺伝子ベクターは、血液脳関門にまたがる少なくとも1種類のアクセス可能な
    神経細胞にトランスフェクションすることができるように構成されており、
    遺伝子ベクターが高等動物に投与される場合、遺伝子ベクターとアクセス可能神経細胞
    とが直接に接触するような位置と様式で投与され、そして
    (i)少なくとも１つの遺伝子ベクターが、少なくとも１つのアクセス可能神経細胞に接
    触してトランスフェクションされること；(ii)少なくとも１つのトランスフェクションさ
    れたアクセス可能神経細胞が、遺伝子ベクターが保有している少なくとも１つの遺伝子に
    よりコードされる少なくとも１つの神経活性ポリペプチドを複数発現すること；および(i
    ii)少なくとも１つのトランスフェクションされたアクセス可能神経細胞が、少なくとも
    １つの神経活性ポリペプチドを、血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内の位
    置に、複数分泌すること、が保証される位置および様式で、遺伝子ベクターが高等動物に
    投与される。
  19. 遺伝子ベクターが、感覚神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている
    、請求項１８の方法。
  20. 遺伝子ベクターが、運動神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている
    、請求項１８の方法。
  21. 遺伝子ベクターが、副交感神経系の節前神経細胞にトランスフェクションされるように
    設計されている、請求項１８の方法。
  22. 遺伝子ベクターが、交感神経系の節前神経細胞にトランスフェクションされるように設
    計されている、請求項１８の方法。
  23. 神経活性ポリペプチドが、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、傍分泌因子、視床下
    部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、神経栄養因子に結合する抗体、神経栄養因子受
    容体に結合する抗体、中枢神経系細胞により発現される受容体のポリペプチドアンタゴニ
    スト、アゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群から選択
    される、請求項１８の方法。
  24. 遺伝子ベクターが、哺乳動物細胞上で活性であるウイルスキャプシドの少なくとも一部
    分を含む細胞トランスフェクション成分を含む、請求項１８の方法。
  25. 遺伝子ベクターが、カチオン性リポソームまたは他の遺伝子トランスフェクション脂質
    を含む、請求項１８の方法。
  26. 遺伝子ベクターが、アクセス可能な神経細胞上の少なくとも１種類のエンドサイトーシ
    ス受容体に特異的に結合するリガンドを含む、請求項１８の方法。
  27. 遺伝子ベクターが、脳神経関門にまたがる選択した種類のアクセス可能な神経細胞から
    、動物の血液脳関門により保護された中枢神経系組織内に完全に位置する少なくとも１種
    類の神経細胞へ、関連遺伝子物質を、神経細胞を通して輸送することを促進することが示
    された高分子を含む、請求項１８の方法。
  28. 遺伝子ベクターが、下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項１８の方
    法：
    （ａ）キメラポリペプチドを発現する神経細胞内で、キメラポリペプチドの順行性輸送を
    実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  29. 遺伝子ベクターが、下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項１８の方
    法：
    （ａ）動物の血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に位置する神経細胞末端
    においてキメラポリペプチドの分泌を実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  30. 高等動物において、血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に、神経活性ポ
    リペプチド分子を非侵襲的に送達する神経細胞工程を開始するように、および開始するこ
    とができるように設計された遺伝子ベクター：
    ここで、
    該遺伝子ベクターは、その中に組み立てられた形で細胞トランスフェクション成分およ
    び関連遺伝子物質を含み、
    該遺伝子ベクターは、動物の血液脳関門にまたがり、そして血液脳関門を通過しなかっ
    た遺伝子ベクターにアクセスすることができる少なくとも１つの末梢投射を有する少なく
    とも１種類のアクセス可能な神経細胞にトランスフェクションすることに適しており、か
    つトランスフェクションすることが可能であり、
    （ａ）細胞トランスフェクション成分は、遺伝子ベクターが、(i)選択された種類のアク
    セス可能神経細胞に結合して、(ii)遺伝子ベクターが保有する関連遺伝子物質を、アクセ
    ス可能神経細胞内に挿入するために選択され、そして
    （ｂ）関連遺伝子物質は、神経活性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子を
    含み、
    該遺伝子は、トランスフェクションされたアクセス可能な神経細胞内で、該遺伝子から
    神経活性ポリペプチドまたはその前駆体を発現させる遺伝子プロモーターを有し、
    複数の神経活性ポリペプチドまたはその前駆体が、
    (i)トランスフェクションされたアクセス可能神経細胞内で、動物の血液脳関門により
    保護されている中枢神経系組織内の神経細胞の分泌位置に輸送され、そして
    (ii)トランスフェクションされたアクセス可能神経細胞により、動物の血液脳関門によ
    り保護されている中枢神経系組織内の神経細胞の分泌位置において分泌されること、が示
    されたものである。
  31. 生体内(in vivo)哺乳動物試験において、神経活性ポリペプチド分子を非侵襲的に送達
    する神経細胞工程を十分に開始することができ、該神経活性ポリペプチド分子が、遺伝子
    ベクターによりコードされており、少なくとも１種の哺乳動物において、トランスフェク
    ションされたアクセス可能神経細胞内で、血液脳関門により保護されている中枢神経系組
    織へ発現されることが示された、請求項３０の遺伝子ベクター。
  32. ヒト臨床試験において、神経活性ポリペプチド分子を非侵襲的に送達する神経細胞工程
    を十分に開始することができ、該神経活性ポリペプチド分子が、遺伝子ベクターによりコ
    ードされており、治療を受けたヒト患者において、トランスフェクションされたアクセス
    可能神経細胞内で、血液脳関門により保護されている中枢神経系組織へ発現されることが
    示された、請求項３０の遺伝子ベクター。
  33. 少なくとも１種の感覚神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている、
    請求項３０の遺伝子ベクター。
  34. 嗅覚受容体神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている、請求項３３
    の遺伝子ベクター。
  35. 侵害受容神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている、請求項３３の
    遺伝子ベクター。
  36. 少なくとも１種の運動神経細胞にトランスフェクションされるように設計されている、
    請求項３０の遺伝子ベクター。
  37. 高等動物の交感神経系または副交感神経系に属する少なくとも１種の節前神経細胞にト
    ランスフェクションされるように設計されている、請求項３０の遺伝子ベクター。
  38. 遺伝子ベクターが、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、傍分泌因子、視床下部放出
    因子、神経伝達物質ポリペプチド、神経栄養因子に結合する抗体、神経栄養因子受容体に
    結合する抗体、中枢神経系細胞により発現される受容体のポリペプチドアンタゴニスト、
    アゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群から選択される
    神経活性ポリペプチドをコードする、請求項３０の遺伝子ベクター。
  39. 細胞トランスフェクション成分が、哺乳動物ウイルスのキャプシドの少なくとも一部分
    を含む、請求項３０の遺伝子ベクター。
  40. 細胞トランスフェクション成分が、カチオン性リポソームを含む、請求項３０の遺伝子
    ベクター。
  41. 細胞トランスフェクション成分が、アクセス可能な神経細胞上の少なくとも１種のエン
    ドサイトーシス受容体に特異的に結合するリガンドを含む、請求項３０の遺伝子ベクター
    。
  42. リガンドが、下記工程を含む選択工程を通して同定されたものである、請求項４１の遺
    伝子ベクター：
    （ａ）選択した種類の複数の神経細胞を、ファージミドまたはファージディスプレイライ
    ブラリーと接触させる工程、
    ここで、ライブラリイー中の各ファージは、候補DNA配列を有し、その候補DNAによりコ
    ードされるポリペプチドを、露出されたファージ表面上に有し、
    そしてファージディスプレイライブラリーは、複数の候補DNA配列を有し、対応ポリペ
    プチドがファージ表面上に露出された複数のファージ粒子から成る；および
    （ｂ）ファージディスプレイライブラリーから、少なくとも１種類のクローンファージ株
    を選択する工程、
    ここで、選択したクローンファージ株は、選択した種類の神経細胞内に効率的に輸送さ
    れたものである。
  43. 細胞トランスフェクション成分が、脳神経関門にまたがる選択した種類のアクセス可能
    な神経細胞から、動物の血液脳関門により保護された中枢神経系組織内に完全に位置する
    少なくとも１種類の神経細胞へ、関連遺伝子物質を、神経細胞を通して輸送することを促
    進することが示されたポリペプチドを含む、請求項３０の遺伝子ベクター。
  44. 下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項３０の遺伝子ベクター：
    （ａ）キメラポリペプチドを発現する神経細胞内で、キメラポリペプチドの順行性輸送を
    実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  45. 下記配列を含むキメラポリペプチドをコードする、請求項３０の遺伝子ベクター：
    （ａ）動物の血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に位置する神経細胞末端
    においてキメラポリペプチドの分泌を実行または促進するリーダー配列；および
    （ｂ）血液脳関門にまたがるアクセス可能な神経細胞によって血液脳関門内に分泌された
    後、脳神経関門により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応する
    ことによって、治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  46. 高等動物において、血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に、神経活性ポ
    リペプチド分子を非侵襲的に送達する神経細胞工程を開始するように、および開始するこ
    とができるように設計された遺伝子ベクターであって、下記配列を含むキメラポリペプチ
    ドをコードする遺伝子ベクター：
    （ａ）下記の群から選択された少なくとも１つの活性を実行または促進するリーダー配列
    、
    (i) キメラポリペプチドを発現する神経細胞内におけるキメラポリペプチドの順行
    性輸送、および
    (ii)動物の血液脳関門により保護されている中枢神経系組織内に位置する神経細胞
    末端におけるキメラポリペプチドの分泌、
    および、
    （ｂ）血液脳関門にまたがる神経細胞によって血液脳関門内に分泌された後、脳神経関門
    により保護されている中枢神経系組織内に完全に位置する細胞と反応することによって、
    治療効果を生み出すことができる神経活性配列。
  47. ポリペプチドの神経活性配列が、神経栄養因子、内分泌因子、増殖因子、傍分泌因子、
    視床下部放出因子、神経伝達物質ポリペプチド、神経栄養因子に結合する抗体、神経栄養
    因子受容体に結合する抗体、中枢神経系細胞により発現される受容体のポリペプチドアン
    タゴニスト、アゴニスト、およびリソソーム蓄積症に関与するポリペプチドからなる群か
    ら選択される、請求項４６の遺伝子ベクター。
  48. 下記成分を含む分子複合体：
    （ａ）選択を行うために神経細胞内へのエンドサイトーシスによる取り込みが必要とされ
    る生体内(in vivo)選択方法によって同定された少なくとも１つのリガンド成分；および
    （ｂ）リガンド成分が特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を有する少なくとも
    １種の標的動物細胞内に輸送された後に、所望の効果を生じることができる少なくとも１
    つの運送物(passenger)成分。
  49. 分子複合体が、下記標的動物細胞を有する動物に投与された場合、リガンドを介したエ
    ンドサイトーシスによって、リガンドが特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を
    有する少なくとも１種の標的動物細胞内に、運送物成分を輸送することができる、請求項
    ４８の分子複合体。
  50. リガンド成分が、生体内で神経細胞から収集された分子または分子複合体に由来する、
    請求項４８の分子複合体。
  51. 分子複合体が、リガンドを介したエンドサイトーシスによって下記細胞内に輸送された
    場合に、運送物成分が、少なくとも１種の標的哺乳動物細胞内に入ることができるように
    、運送物成分をリガンド成分に連結する少なくとも１つの連結成分をさらに含む、請求項
    ４８の分子複合体。
  52. リガンド成分の生体内選択方法において、リガンド成分がエンドサイトーシスによって
    神経細胞内に取り込まれ後、神経細胞線維内に細胞内輸送されることがさらに必要である
    、請求項４８の分子複合体。
  53. 生体内選択方法が下記工程を含む、請求項４８の分子複合体：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが接触するように、複数の候補リガンド成分を
    、生きた動物の配置部位(emplacement site)内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  54. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項５３の分子複合体。
  55. 候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方法により生産された、請求項５３の
    分子複合体。
  56. 生体内選択方法の前に、候補リガンド成分が、親和性結合工程により処理された、請求
    項５３の分子複合体。
  57. リガンド成分が、低親和性神経成長因子受容体に特異的に結合する、請求項４８の分子
    複合体。
  58. 下記成分を含む分子複合体：
    （ａ）生体内選択を行うために、標的とする種類のエンドサイトーシス表面分子を介した
    エンドサイトーシスによる取り込みが必要とされる生体内選択方法によって選択された少
    なくとも１つのエンドサイトーシスリガンド成分；および
    （ｂ）標的とする種類のエンドサイトーシス表面分子を有する少なくとも１種の哺乳動物
    細胞内に輸送された後に、所望の効果を生じることができる少なくとも１つの運送物成分
    。
  59. 分子複合体が、リガンドを介したエンドサイトーシスによって下記細胞内に輸送された
    場合に、運送物成分が、少なくとも１種の標的哺乳動物細胞内に入ることができるように
    、運送物成分をリガンド成分に連結する少なくとも１つの連結成分をさらに含む、請求項
    ５８の分子複合体。
  60. リガンド成分の生体内選択方法において、リガンド成分がエンドサイトーシスによって
    神経細胞線維内に入ることが必要である、請求項５８の分子複合体。
  61. 生体内選択方法が下記工程を含む、請求項５８の分子複合体：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが接触するように、複数の候補リガンド成分を
    、生きた動物の配置部位内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  62. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項６１の分子複合体。
  63. 候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方法により生産された、請求項６１の
    分子複合体。
  64. 生体内選択方法の前に、候補リガンド成分が、親和性結合工程により処理された、請求
    項６１の分子複合体。
  65. リガンド成分が、低親和性神経成長因子受容体に特異的に結合する、請求項６１の分子
    複合体。
  66. 生体内選択を行うために神経細胞内へのエンドサイトーシスによる取り込みが必要とさ
    れる生体内選択方法によって同定された分子構造を有する複数のエンドサイトーシスリガ
    ンドを含み、
    該リガンドが、該リガンドが特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を有する少
    なくとも１種の標的細胞内に運送物成分を輸送することができる分子複合体を生じるよう
    に、該リガンドが運送物成分に連結されることに適している、
    エンドサイトーシスリガンドの精製調製品。
  67. 該エンドサイトーシスリガンドが特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子に結合
    することができない別のリガンド候補を実質的に含まない、請求項６６の精製調製品。
  68. 生体内選択方法において、候補リガンド成分がエンドサイトーシスによって神経細胞線
    維内に取り込まれ後、神経細胞線維内で細胞内輸送されることがさらに必要である、請求
    項６６の精製調製品。
  69. 生体内選択方法が下記工程を含む、請求項６６の精製調製品：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが接触するように、複数の候補リガンド成分を
    、生きた動物の配置部位内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  70. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項６６の精製調製品。
  71. 生体内選択方法によって選択される候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方
    法により生産された、請求項６６の精製調製品。
  72. 生体内選択方法の前に、生体内選択方法によって選択される候補リガンド成分が、親和
    性結合工程により処理された、請求項６６の精製調製品。
  73. リガンド成分が、低親和性神経成長因子受容体に特異的に結合する、請求項６６の精製
    調製品。
  74. エンドサイトーシスリガンドが特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を有する
    標的細胞内に、運送物成分に連結されたエンドサイトーシスリガンドを含む分子複合体を
    、エンドサイトーシスによって取り込むことができる、エンドサイトーシスリガンドを単
    離するための下記工程を含む生体内選択方法：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが生体内で接触するように、複数の候補リガン
    ド成分を、生きた動物の配置部位内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  75. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項７４の生体内選択方法。
  76. 候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方法により生産された、請求項７４の
    生体内選択方法。
  77. 生体内選択方法の前に、候補リガンド成分が、親和性結合工程により処理された、請求
    項７４の生体内選択方法。
  78. 生体内選択方法の前に、低親和性神経成長因子受容体の発現が増加するように、神経細
    胞線維を処理する、請求項７４の生体内選択方法。
  79. 標的動物細胞を、下記成分：
    （ａ）選択を行うために神経細胞内へのエンドサイトーシスによる取り込みが必要とされ
    る生体内選択方法によって同定された少なくとも１つのリガンド成分；および
    （ｂ）リガンド成分が特異的に結合するエンドサイトーシス表面分子を有する標的哺乳動
    物細胞内に輸送された後に、所望の効果を生じることができる少なくとも１つの運送物成
    分
    を含む少なくとも１つのエンドサイトーシス分子複合体と接触させる工程を含む、外来
    分子を選択した種類の標的細胞に導入する方法。
  80. エンドサイトーシス分子複合体が、リガンドを介したエンドサイトーシスによって下記
    細胞内に輸送された場合に、運送物成分が標的哺乳動物細胞内に入ることができるように
    、運送物成分をリガンド成分に連結する少なくとも１つの連結成分をさらに含む、請求項
    ７９の方法。
  81. 生体内選択方法が下記工程を含む、請求項７９の方法：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが接触するように、複数の候補リガンド成分を
    、生きた動物の配置部位内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  82. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項３１の方法。
  83. 候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方法により生産された、請求項３２の
    方法。
  84. 生体内選択方法の前に、候補リガンド成分が、親和性結合工程により処理された、請求
    項３２の方法。
  85. 生体内選択方法の前に、低親和性神経成長因子受容体の発現が増加するように、神経細
    胞線維を処理した、請求項７９の方法。
  86. リガンド成分が、低親和性神経成長因子受容体に特異的に結合する、請求項７９の方法
    。
  87. 少なくとも１つのコート蛋白質において、少なくとも１つの候補リガンド配列を表示す
    る複数のファージを含み、
    ライブラリー中に含まれるファージ粒子を選択するために、動物細胞上でエンドサイト
    ーシス活性を有することが知られているポリペプチドに結合する親和性を利用した親和性
    結合工程によって事前に選別された、
    ファージディスプレイライブラリー。
  88. 選択を行うために神経細胞内へのエンドサイトーシスによる取り込みが必要とされる生
    体内選択方法によって同定されたエンドサイトーシスリガンド配列を含むポリペプチド配
    列をコードする精製した遺伝子ベクター。
  89. 生体内選択方法が下記工程を含む、請求項８８の精製遺伝子ベクター：
    （１）候補リガンド成分と神経細胞表面とが接触するように、複数の候補リガンド成分を
    、生きた動物の配置部位内に配置する工程；および
    （２）神経細胞によって取り込まれ、神経細胞線維によって輸送されたリガンド成分を含
    む神経細胞線維の部域を、配置部位から離れている収集部位において、収集する工程。
  90. 生体内選択方法の間に、候補リガンド成分が、ファージディスプレイライブラリー中の
    ファージ粒子の表面上に露出された、請求項８８の精製遺伝子ベクター。
  91. 候補リガンド成分が、コンビナトリアル化学合成方法により生産された、請求項８８の
    精製遺伝子ベクター。
  92. 生体内選択方法の前に、候補リガンド成分が、親和性結合工程により処理された、請求
    項８８の精製遺伝子ベクター。
  93. リガンド成分が、低親和性神経成長因子受容体に特異的に結合する、請求項８８の精製
    遺伝子ベクター。
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