JP2562014B2 - 抗腫瘍性リンホカインの１種であるロイコレギユリン及びその治療用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1984年４月13日に出願された米国特許出願
第06/600,303号の一部継続出願である。

本発明は、ヒト腫瘍細胞を直接溶解し、またその増殖
を抑制することができ、かつナチュラルキラーリンパ球
が媒介する溶解に対するヒト腫瘍細胞の感受性を高める
ことができる新規なヒトリンホカインの発見に係る。こ
れらの抗腫瘍活性は、以前はリンホトキシンによると考
えられていた。しかしながら、我我は、これらの抗腫瘍
細胞活性を有するヒトリンホカイン試料が、リンホトキ
シン並びにその他の、インターフエロン、インターロイ
キン1,2及びマクロフアージ活性化因子活性を含めた既
に単離されているリンホカインから生化学的に分離され
ることを発見した。

図面の簡単な説明 図面は単一で未知のリンホカインとしてのロイコレギ
ユリン（leukoregulin）の同定を説明し、かつそのヒト
腫瘍細胞増殖抑制効果を示している。

発明の背景 免疫系のホルモンであるリンホカインは癌の発達に影
響を与え、腫瘍形成性細胞の増殖を抑制し、更に腫瘍を
破壊する能力を有している。これらのホルモンはある種
のリンパ球（様細胞）で産生分泌され、他の特異的な細
胞を標的としてこれと相互作用する糖蛋白質である。特
定のリンホカインは１種より多くの細胞で産生され、１
種より多くの細胞と相互作用することが知られている。
同様に、ほとんどのリンホカインの活性は多岐にわたる
ことが知られており、ある特定のリンホカインは種々の
標的細胞と条件に関し阻害、刺激、増強、反駁、その他
の作用を示す。また、ある特定のリンホカインは異なっ
た環境下での発癌の阻害と増強の両方を行うことができ
る。例えば、インターフエロンはウイルス発癌を抑制す
るが放射線発癌を増大することが知られている。同様
に、インターフエロンは腫瘍細胞のNK細胞溶解を増強す
る拮抗活性を示す一方、NK細胞作用に対する腫瘍細胞の
抵抗性を増大させる。インターフエロンに暴露した後、
前者は後者より早い時期に起る。

リンホトキシンは、マウスＬ細胞の細胞溶解性破壊を
媒介する、抗原又はマイトジエンで刺激したリンパ球の
可溶性産生物を表わすために1968年に導入された用語で
ある（９）。その後いくつかの研究所で、リンホトキシ
ン含有リンホカイン試料が種々の腫瘍細胞に対する直接
作用性の細胞溶解活性及び細胞増殖抑制活性（7,30,3
1）や、腫瘍性悪性変換（necplastic transformation）
を起こしている細胞に対する抗発癌活性（6,25,26）
や、NK−媒介破壊に対する腫瘍発現前細胞及び腫瘍細胞
の感受性を高める能力（23,27）を有することが示され
た。

マウスＬ細胞の細胞溶解性破壊を媒介するものとは異
なるハムスターリンホトキシン試料中の抗癌性リンホカ
インが後に分子の電荷に基づいて同定された（24）。こ
の等電点pHが5.0で分子量が50,000の分子はハムスター
の腫瘍細胞に対し細胞増殖抑制性であり、正常のハムス
ター胎児繊維芽細胞の増殖を阻害せず、インビトロ（in
vitro）及びインビボ（in vivo）の両者においてハム
スター胎児細胞の化学物質及び放射線照射による腫瘍性
悪性変換を抑制した。この単一の抗癌性リンホカインは
また、インターフエロン，インターロイキン１及び２並
びにマクロフアージ遊走阻止因子活性とは異なるものと
しても同定された。この発見によつて結局新しい研究の
道が開かれ、ヒトリンホトキシン試料が独特を抗発癌特
性及び抗腫瘍特性を有するヒトリンホカインを含有して
いるかどうかを評価するためにヒトリンホトキシン試料
が研究された。

発明の要約 本発明の目的は、腫瘍細胞を直接的に溶解し、その増
殖を抑制し、ナチユラルキラーリンパ球媒介溶解に対す
るその感受性を高めると共に正常細胞の発癌性変換（ca
rcinogenic transformation）を阻害するという抗腫瘍
特性を有する、我々が発見したヒトリンホカインを生化
学的及び生物学的に特性化し精製することであつた。解
離すると分子量約30,000〜35,000のサブユニツトになる
分子量約120,000〜140,000のリンホカインであり、等電
点電気泳動によつて約4.8〜5.5又は約7.5〜8.3のpHで精
製されるロイコレギユリン（leukoregulin）を同定単離
することによりこの目的を達成した。

もう１つの目的は、ロイコレギユリンの細胞起源を同
定し、その産生を刺激する手順を開発することであつ
た。ロイコレギユリンの起源である末梢血白血球をフイ
トヘマグルチニンに有効な時間暴露することにより刺激
してロイコレギユリンの産生を増強しうることが発見さ
れた。暴露の最適時間は48時間であり、程度は低くなる
が、これより長時間でもよい短時間でも有効であつた。
その他のインデユーサー、例えばテトラデカノイルホル
ボールアセテート，コンカナバリＡ及びその他の分裂を
促進する植物レクチン類もロイコレギユリン産生を増強
することを発見された。更に、ある場合には、リンパ球
の形質転換（transformation）及びハイブリドーマ細胞
の形成により有効なロイコレギユリン産生細胞を調製し
た。

本発明の更に別の目的は、ロイコレギユリンに対する
細胞感受性の迅速なアツセイを提供することであつた。
これはロイコレギユリン細胞表面レセプターに特異的な
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ又は形質
転換白血球を調製し、検査する標的細胞へのこの抗体の
結合を定量化することにより達成した。

本発明の更なる目的及び属性は以下の考察の中で明ら
かになろう。

図面の簡単な説明 添付の第１図〜第11図は他のリンホカインとは区別さ
れるロイコレギユリンの特性及び活性を示している。

好ましい実施態様の説明 我々は、ヒトリンホカイン試料（preparation）が、
直接溶解（direct lysis）によりヒト腫瘍細胞の増殖を
阻害し、細胞性増殖を阻害し、かつナチユラルキラー細
胞（NK）に媒介される破壊（destruction）に対する腫
瘍細胞の感受性を高める能力を有する単一独特のリンホ
カインを含有することを発見した。我我はこのリンホカ
インに対してロイコレギユリン（leukoregulin）という
名称を採用した。何故ならば、これは白血球（lenkocyt
e）の産物であり、しかもリンホトキシン，インターフ
エロン，インターロイキン１及び２、並びにマクロフア
ージ活性化因子活性とは分子的かつ生物学的に異なる細
胞増殖調節物質（cell growth regulatory substance）
だからである。

ロイコレギユリンは、勾配ポリアクリルアミドゲル電
気泳動及びゲル過クロマトグラフイで測定した分子量
が約120,000〜140,000であり、解離すると約30,000〜3
5,000の分子量のサブユニツトになる。これは、等電点
電気泳動によつて約5.0と7.5のpHで精製される。分子量
及び等電点電気泳動で分画したロイコレギユリンは、検
出可能なリンホトキシン，インターフエロン，インター
ロイキン１及び２、並びにマクロフアージ活性化因子活
性を含有しない形で得られる。

ロイコレギユリンの属性と思われる特性がリンホトキ
シンの特性とは異なることを確認するために特別な検討
を行なつた。ロイコレギユリンがリンホトキシンとは異
なることを示す証拠の概略は次の通りである。（１）ヒ
ト末梢血白血球由来のリンホトキシン及びRPMI 1788ヒ
トリンパ芽球細胞由来の高純度リンホトキシンはネズミ
のα L929の腫瘍細胞を容易に溶解するというものの検
出可能な抗ヒト腫瘍細胞活性は全く持つていない。
（２）リンホトキシン活性はプロテアーゼ及びノイラミ
ニダーゼ処理後の両方で減少したのに対し、ロイコレギ
ユリン活性はプロテアーゼ消化後に減少したがノイラミ
ニダーゼ消化後には減少しなかつた。（３）ロイコレギ
ユリンは、等電点電気泳動によりリンホトキシンから、
溶解、増殖阻害及びナチユラルキラー細胞によるヒト腫
瘍細胞の細胞溶解の増強を引き起こすがネズミＬ細胞を
溶解（リンホトキシンの活性）しない種（species）に
分離することができた。こうして、PBLリンホカイン試
料中の異なるロイコレギユリン／リンホトキシン濃度、
ノイラミニダーゼ及びプロテアーゼに対する感応性、及
び異なる等電点の組み合せによつて、ロイコレギユリン
がリンホトキシンとは異なることが最終的に示された。

ロイコレギユリンは細胞性増殖を阻害しうるもう１つ
の免疫性ホルモンであるインターフエロンとも異なる。
インターフエロンはある種の正常細胞及び腫瘍細胞の増
殖を阻害することが示されている（2,18）。しかしなが
ら、α及びγインターフエロンは本明細書中に記載のロ
イコレギユリン感受性腫瘍細胞のいずれの増殖にも作用
しなかつた。ある種のヒトリンホカイン試料（製剤）は
ロイコレギユリン及びインターフエロンの両方を含有し
ているが、この２つのホルモンは分子ふるいで分けるこ
とができる。更に、インターフエロンに富む画分はロイ
コレギユリン活性を示さない。

ロイコレギユリンに富む精製画分は腫瘍細胞増殖阻害
に加えて、NK−媒介細胞毒性に対する腫瘍細胞の感受性
を高めることも示された。この活性はインターフエロン
のものと反対であり（33）、ロイコレギユリンに特有の
ものである。NK−媒介細胞毒性の増強は、インビボ（in
vivo）でロイコレギユリンが腫瘍の増殖を抑制する重
要な手段と思われる（27）。

ロイコレギユリン活性のメカニズムの重要な面は、腫
瘍細胞の細胞表面膜の構造（conformation）と透過性を
変化させる能力である。流動細胞計測分析を用い、標的
細胞をロイコレギユリンに暴露した後の数分間の変化を
測定した。この方法は、ロイコレギユリン又はロイコレ
ギユリンレセプターに対するモノクローナル抗体を検出
するというような短いアツセイ時間を必要とする研究に
大きな力となる。

ロイコレギユリンともう１つの腫瘍細胞阻害性リンホ
カインである腫瘍壊死因子との関係も研究した。ヒト腫
瘍壊死因子製剤はインビボ（in vivo）においてある種
のマウス肉腫の出血性壊死を引き起し、リンホトキシン
と同じインビトロ活性を有する（34）。精製したロイコ
レギユリンがリンホトキシンと同じ生物学的活性を媒介
しないので、ロイコレギユリンは腫瘍壊死因子とは異な
る。

ハムスターのリンホカイン試料はリンホトキシン、ロ
イコレギユリン活性（ハムスターの腫瘍細胞の増殖は阻
害するが正常細胞の増殖は阻害しない）及び抗発癌活性
を有している。これらロイコレギユリン活性と抗発癌活
性は同時に精製される。しかしながら、これら２つの活
性は２つの等電点pHを持つ。すなわちハムスターリンホ
トキシンと異なるものとハムスターリンホトキシンと同
じものである（24）。このロイコレギユリン活性と抗発
癌活性はノイラミニダーゼの影響を受けないが、ハムス
ターリンホトキシンはノイラミニダーゼで分解される。
しかしがら、ハムスターのロイコレギユリン活性と抗発
癌活性はプロテアーゼ消化に対し同様の感受性を示す。
これと他の生化学的データとを合せると、ハムスターロ
イコレギユリンは抗発癌活性も有していると結論され
る。ヒトロイコレギユリンはハムスターロイコレギユリ
ンと同じ生物学的生化学的特性を示したのでやはり抗発
癌性であるはずである。

ヒトの癌の治療に実験的にロイコレギユリンを用いる
ための臨床試験に対する規制認可（regulatory approva
l）が得られれば、進行期の腫瘍病（neoplastic diseas
es）患者でのフエーズＩの臨床試験が実施されよう。ロ
イコレギユリンは下記の如く患者にと投与する。胃腸障
害，貧血，白血球減少症，発熱又はその他の臓器の損傷
及び機能不全の証拠として現れる毒性反応を評価するこ
とによつて各治療形態に対する最大許容（投与）量を確
定するために用量を増加する。ロイコレギユリンは寛容
性が非常に良好であり、大量投与が可能であると予想さ
れる。ロイコレギユリンを含有していることが確実な部
分的に精製したPHA刺激末梢血リンパ球の上清を用いて
治療してみたところ、この物質がほとんど毒性を有さな
いことが示された（13）。

フエーズIIの臨床試験は、治療の有効性が最も明白な
限られた疾患の患者におけるロイコレギユンリンの評価
に向けられよう。初期の試験では主たる外科療法，化学
療法又は放射線療法のアジユバントとしてロイコレギユ
リンを用い、その後の試験では主なる治療様式（modali
ty）としてロイコレギユリンを評価することになろう。

ロイコレギユリンは、静脈内又はリンパ管内経路で全
身的に投与するか、腫瘍内注射又は腹膜潅流により局所
的に投与するか、あるいはまたエクス−ビボ（ex−viv
o）療法として投与する。この最後のものの１例は、患
者から骨髄細胞を取り出し、ロイコレギユリンで処理し
て腫瘍細胞を除去し、骨髄に大量の化学療法又は放射線
療法を施した後に患者の骨髄を再構成するのに用いるこ
とである。

ロイコレギユリンは、循環系及び組織内のロイコレギ
ユリンの必要量を維持するに要するだけ持続注入又は個
別注射で投与する。

直接投与の代りに、増殖不可能にしたヒトのリンパ球
様細胞中にロイコレギユリンをコードする遺伝子をクロ
ーニングすると、インビボ（in vivo）での産生によつ
てインビボ（in vivo）でのロイコレギユリン濃度を一
定に維持する道が開かれよう。インビボ（in vivo）で
の寿命が限られている細胞を使用すると比較的短期間に
亘りロイコレギユリン濃度を確実に調整できるようにな
ろう。

直接投与に代わるその他の方法としては、ウイルスゲ
ノムにロイコレギユリンをコードする遺伝子を挿入し、
このウイルスを用いてこの遺伝子をロイコレギユリンに
翻訳する特定の群の細胞に遺伝子を運び、こうしなけれ
ばロイコレギユリン産生を制限する正常な調節物質を遮
断する。例えば、エプスタイン−パール（Epstein−Bar
r）ウイルスはＢリンパ球のみに感染し、通常は限られ
たむしろ緩和な感染を起すものであるが、このウイルス
ゲノムを改変してウイルス感染による疾患の進展を防止
すると、これはロイコレギユリン遺伝子の適当なウイル
スベクターとして機能できるであろう。

固形腫瘍の治療は、体内全体に亘つて非常に高濃度に
維持しようとするよりは腫瘍の直接周囲の環境のロイコ
レギユリン濃度を最大にすることによつて最も効果的に
実施される。腫瘍細胞表面の抗原に対し定性的又は定量
的な特異性を有するヒトモクローナル抗体は、ロイコレ
ギユリンが結合して腫瘍内の高濃度を確保できる適切な
「留め金（hook）」となる。別の方法はリポソーム内に
ロイコレギユリンをカプセル化することであり、このリ
ポソームはその表面に腫瘍特異的モノクローナル抗体を
有していてもよい。リポソーム性トリグリセリドを適切
に選択すると、循環アミラーゼ酵素に抵抗性があり、腫
瘍細胞膜と融合して内部のロイコレギユリンを細胞内に
輸送させうるリポソームが得られる。腫瘍標的細胞の膜
脂質とリポソームの膜脂質との融合を増強することによ
り内容物の輸送を増大させるために親油性キヤリア物質
（ジメチスルフオキシド、ホウ酸（boronic acid）誘導
体）をリポソーム中に含有せしめてもよい。

ロイコレギユリンは毒性副作用を付加することなく化
学療法剤の抗腫瘍活性を上昇させるようであり（19）、
その結果有効投与レベルがずつと高くなる。従つて、こ
の抗腫瘍増強活性を評価するためにロイコレギユリンは
種々の化学療法物質や放射線療法と共に治療規制（regi
mens）に適用されるであろう。

細胞毒性のある化学療法剤又は放射線療法手段と共に
使用するときにはロイコレギユリンの抗発癌活性が抗腫
瘍活性と同様に重要である。放射線暴露や化学療法に伴
い特に潜行して起るのは治療している疾患とは無関係な
新しい腫瘍の出現である。ロイコレギユリンを併用投与
すると、ロイコレギユリンがこれら薬剤の発癌性作用を
ブロツクするために、化学療法又は放射線療法において
ずつと大量に投与することができる。自己免疫疾患患者
や臓器移植を受けた患者の治療において免疫抑制剤と共
にロイコレギユリンを併用すると同様に有用であろう。

ロイコレギユリンは、リンパ球や単球の補充や不動
化、種々のエフエクター機能を発現するための活性化や
分化、及び細胞毒性機能を果すロイコレギユリンのよう
な因子の産生を包含するサイトカイン−リンホカインカ
スケード（cytokine−lymphokine cascade）の端末要素
である。カクテルとして用いるか又はたいてい適当な順
序で投与される種々のリンホカインは、腫瘍のリンパ球
様細胞浸潤を増強し（マクロフアージ遊走阻止因子、イ
ンターロイキン−１）、その細胞毒性機能を刺激し（マ
クフアージ活性化因子、インターロイキン１及び２、ロ
イコレギユリン及びインターフエロン）、直接的に腫瘍
細胞を攻撃し（ロイコレギユリン、NK細胞毒性因子及び
インターフエロン）、細胞毒性エフエクター細胞に対す
る腫瘍標的細胞の感受性を高める（ロイコンレギユリ
ン）はずである。この治療形態ではロイコレギユリンが
非常に重要な役割を持つている。

ロイコレギユリンは、腫瘍細胞増殖調節活性及びNK細
胞媒介細胞毒性増強活性（共に腫瘍塊の発達を抑止し減
少させ始めるものである）とに加え、生物医学的診断法
及び放射線又は化学療法（これら自体が発癌を誘発す
る）に使用する物質と共に用いるのに特に有用な抗発癌
特性をも示す（26）。これらの起りうる副作用を持つ方
法を行う間のロイコレギユリンによる治療はテスト又は
治療期間中の発癌を防ぐであろう（20）。

同様に、刺激後のPBLロイコレギユリン産生を測定す
ることにより、患者の免疫抑制レベル及び悪性（腫瘍）
を形成する可能性のあるリスクを評価することもでき
る。

ロイコレギユリン療法に付随して、患者の癌性細胞の
ロイコレギユリンに対する感受性を測定するとロイコレ
ギユリン療法の有効性が予測できるであろう。ロイコレ
ギユリンを含有する半固形培地の存在下での患者の腫瘍
細胞の培養は、腫瘍細胞の増殖を完全に阻害するに必要
なロイコレギユリンの量を定量する手段である。腫瘍細
胞上で発現するロイコレギユリン細胞表面レセプターの
量を定量することにより腫瘍細胞の反応性を測定すると
より迅速なアツセイとなる。これは、酵素結合イムノソ
ルベントアツセイ、ラジオイムノアツセイ又は免疫螢光
アツセイを用いて腫瘍細胞に結合しているロイコレギユ
リンレセプターに対するモノクローナル抗体の量を測定
することによつて行われる。

実施例１ 以下の考察で用いる略号は次の通り。PBS、0.14M NaC
l,0.1M リン酸ナトリウム、pH7.4;PEG、ポリエチレン
グリコール、分子量 4000;FBS、ウシ胎児血清；IEF、
等電点電気泳動；HPLC、高速液体クロマトグラフイー；
NK、ナチユラルキラーリンパ球；dThd、チミジン；MT
T、３−（4,5−ジメチルチアゾリル−２）−2,5−ジフ
エニル−テトラゾリウム ブロマイト；FDA、フルオレ
セインジアセテート；VCN、コレラ菌（Vibrio choler
a）ノイラミニダーゼ；PHA、フイトヘマグルチニン；PB
L、末梢血白血球；TPA、テトラデカノイルボルボールア
セテート：ELISA、酵素結合イムノソルバントアツセ
イ；RIA、ラジオイムノアツセイ。

リンホカイン試料。遠心ヒト正常ドナー血液の軟膜白血
球10〜20mlをリンパ球分離培地〔LSM、リツトンバイオ
ネテイクス（Litton Bionetics）、ケンシングトン（Ke
nsington）、メリーランド（Maryland）〕10ml上に層に
し、室温にて20分間、700×ｇで遠心した。LSMと血漿と
の界面で単核細胞を集め、RPMI1640培地で２回洗浄し、
0.04％トリパンブルーの存在下で顕微鏡で計数して生存
率を測定した。生存率は常に95％を超えていた。100mm
のプラスチツク製組織培養皿中のPHA10μg/ml〔PHA IV
型白血球凝集素、シグマケミカル社（Sigma Chemical C
o.）、セントルルイス（St.Louis）、ミズーリ（Missou
ri）〕を含むRPMI 1640 20ml中に2,000,000個の細胞を
載せ、５％CO₂と95％空気の湿気を帯びたインキユベー
タ中37℃でインキユベートした。

24,48又は72時間後に、分泌されたリンホカインを含
有するリンパ球培地を集め、1000×ｇで10分間遠心して
細胞を除去した。アミコン（Amicon）セル〔アミコン社
（Amicon,Inc.）、ダンバース（Danvers）、MA〕中、YM
10膜上でリンホカイン培地を40培に濃縮し、PBS−0.1％
PEGに対し透析過した。濃縮したリンホカインを過
滅菌し、アリコートを取り、−30゜で凍結させ、凍結後
１カ月以内に使用した（第１表参照）。

リンパ芽球セルラインRPMI1788が産生する高純度ヒト
リンホトキシン（１）は、バーラツト ビー．アガーワ
ル（Bharat B.Aggarwal）博士〔ジエネンテク社（Genen
tech,Inc.）、サンフランシスコ（San Francicsco）,C
A〕が豊富に供給してくれた。この1788セルラインリン
ホトキシンを遂次DEAEセルロースクロマトグラフイー，
分取用（preparative）等電点電気泳動，レンズマメ
レクチン セフアロース（Sepharose）クロマトグラフ
イー及び分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製
した（１）。精製リンホトキシンの分子量は20,000、等
電点は5.8であり、蛋白質1mg当り４×10⁷単位の比活性
を有していた。

シリアンゴールデンハムスターのリンホカインは前述
のヒトリンホカインと同様にして腹膜白血球から製造さ
れた（24）。

標的細胞。K562ヒト赤白血病細胞はジユリー ジユー
（Julie Djeu）博士〔生物学、食物及び医薬品局（Bure
au of Biologics,Food and Drug Administration）、ベ
テスダ（Bethesda）、MD〕が供給してくれた。我々の研
究室で培養樹立したOST細胞は新たに切除したヒト骨肉
腫（osteosarcoma）由来のものであり、このイト骨肉腫
はエリザベス グリム（Elizabeth Grimm）博士〔NIH臨
床センター（NIH Clinical Center）、ベテスダ（Bethe
sda）、MD〕が親切にも提供してくれたものであつた。
正常なヒト皮膚繊維芽細胞、CRL 1457（20才、女）、CR
L 1505（21才、男）、CRL 1537（14才、男）、正常な結
腸粘膜細胞及び他の全てのヒト腫瘍セルラインはアメリ
カタイプカルチヤーコレクシヨン（American Type Cult
ure Collection〔ロツクビル（Rockville）,MD〕から入
手した。

K562細胞以外の細胞は、全て10％FBSを添加したイー
グルス（Eagles）最小必須培地（MEM）中に維持し、１
週間に１回継代（Subpass）した。K562細胞はRPMI 1640
−10％FBS中に維持した。ネズミαL929細胞はゲール
グランガー（Gale Granger）博士〔USC、イルビン（Irv
ine）、CA〕から贈られたものであり、リンホトキシン
の標的として用いた（７）。7997細胞はシリアンゴール
デンハムスターのベンゾ（ザ）−ピレン誘発腫瘍セルラ
インである（８）。

リンホトキシンアツセイ。放射性核種放出アツセイ（ra
dionuclide release assay）を用い（７）、ネズミαL9
29細胞の溶解としてリンホトキシン活性を測定した。試
料中の細胞溶解リンホトキシン単位数は、３日間のイン
キユベーシヨンの間に１×10⁴個のαL929細胞中で
〔³H〕−dThadラベルを50％放出させるサンプル希釈度
の逆数の対数の回帰直線（regression line）をプロツ
トすることにより測定した（第２表参照）。

ロイコレギユリアツセイ。ヒトロイコレギユリン活性は
ヒト腫瘍細胞の増殖阻害〔細胞増殖抑制（cytostatic）
活性〕として測定した。細胞増殖抑制活性の場合は、0.
5mlの適当な培地中の10⁴個の腫瘍細胞を24−ウエルの培
養プレート〔コスター社（Costar Inc.）、ケンブリツ
ジ（Cambridge）、MA〕にのせた。培地又は100培の周囲
に亘つて希釈したテストサンプルのいずれか0.5mlを３
つずつ加え、その細胞を５％CO₂:95％空気の湿気を帯び
たチヤンバー中37℃で３日間インキユベートした。非付
着細胞は、9mlの血液（Hematal）中に懸濁し、モデルZB
Iコールターカウンター（Coulter Counter）〔コールタ
ーインストルメンツ社（Coulter Instruments,Inc.）、
ヒアリー（Hialeah）、FL〕で計数することにより定量
した。付着細胞は、付着細胞として計数する前にPBS中
0.02％のトリプシン中、37℃で１分間インキユベートし
てはがした（第２表参照）。

いくつかの実験では、マイクロアツセイを用いて細胞
増殖の阻害測定した。このアツセイでは、RPMI 1640−
10％FBS100μ中２×10³個の細胞を96−ウエルのマイ
クロタイタープレートにのせた。次いで、培地、0.5％S
DS又はリンホカインサンプル100μを４つずつ加え、
プレートを湿気のある95％空気:5％CO₂のチヤンバー
中、37℃で３日間インキユベートした。平底プレートは
付着細胞用に、丸底プレートはK562非付着細胞用に用い
た。各ウエルに20μのMTT〔シグマ（Sigma）〕（5mg/
mlPBS−激しく撹拌して溶解させ、使用前に新しく調製
した）を加えた。プレートを37℃でさらに４時間インキ
ユベートし、18gニードルで緩和に吸収することにより
培地を除去した。還元MTTである紫色の沈澱ホルマザン
はイソプロパノール中の0.05M HCl 100μを添加する
ことにより溶解した。アーテツク（ARTEK）自動垂直ビ
ームリーダー〔アーテツクシステムズ社（ARTEK System
s,Inc.）フアーミングダール（Farmingdale）、ニユー
ヨーク（New York）〕を用い染料の吸光度を540nmで読
み取つた。ブランクとしてSDSを含有するサンプルウエ
ルを用い、他の全てのサンプルの読み取つた値から差し
引いた。予備実験で、細胞を種々の密度でまき、形成し
た還元沈澱の量はウエル当りの細胞数と直接的に比例す
ることが判つた。このマイクロアツセイの感度は細胞計
数アツセイと同等であつた。

いずれかのアツセイでの細胞増殖のパーセント阻害
は、テストサンプルの平均細胞数又は吸光度単位を培値
コントロールウエルの細胞数又は吸光度単位で割つた比
から１を引き100％をかけて計算した。ロイコレギユリ
ンの細胞増殖抑制単位は、％増殖阻害に対するサンプル
の希釈度の逆数の対数の回帰直線をプロツトすることに
よつて決定し、細胞増殖の50％阻害を引き起こす希釈度
の逆数に等しくした。ヒト結腸癌セルラインHT−29はロ
イコレギユリンの増殖阻害活性に対して感受性が高く、
ロイコレギユリンを測定するスタンダードとしてこれを
用い、他の細胞はこれに対して比較した。

細胞溶解活性の場合は、腫瘍細胞を〔³H−）dThdで前
もつてラベルし（７）、24−ウエルプレートに0.5ml/ウ
エルで10⁴個の細胞をのせた。培地1/2ml、0.5％ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）、又は100培の周囲に亘つて希
釈したテストサンプルで３つずつ加え、細胞を３日間イ
ンキユベートした。

プレートを200×ｇで10分間遠心し、上清の200μア
リコートを取り、ウルトラフルワー（Ultrafluor）〔NE
W、ボストン（Boston）、MA〕2.8ml中に懸濁し、LKBシ
ンチレーシヨンカウンター〔LKBインストルメンツ社（L
KB Instruments,Inc.）、ロツクビル（Rockville）、M
D〕で計数した。放出された％比（特異的）〔³H〕−dTh
dは次のように計算した： リンホトキシンの細胞溶解単位と同様にして細胞溶解ロ
イコレギユリン単位数を計算した。

発癌アツセイ。化学物質及び放射線で誘発されたシリア
ンゴールデンハムスター胎児細胞の悪性変換（transfor
mation）のシリアンゴールデンハムスターリンホカンイ
ン試料による抑制を、前述の如くインビボ（in vivo）
−インビトロ（in vitro）経胎盤変換アツセイを用いて
研究した（24,25）。第３表参照） インターフエロンアツセイ。インターフエロンは、バイ
オフルイズ社（Biofluids,Inc.）〔ロツクビル（Rockvi
lle）、MD〕でヒト新生児包皮の繊維芽細胞すなわちWIS
H細胞の牛小包疱性口内炎感染によるセミ−マイクロ細
胞変性効果（semi−microcytopathic effect）の抑制を
測定することによつてアツセイした。このヒトWISHセル
ラインはγ−インターフエロンに対する感受性がヒト包
皮細胞より５〜10倍高い。このアツセイの検出限界はNI
H基準ヒト繊維芽細胞インターフエロンに対して規格化
した抗ウイルス活性１単位である（第４表参照）。

いくつかの実験では、細胞バイオアツセイに対するα
及びγ−インターフェロンの作用を測定した。〔シグマ
（Sigma）社から購入した〕α−インターフエロンはセ
ンダイ（Sendai）ウイルスでの誘発によりバーキツト
（Burkitt）リンパ腫細胞〔ナマルバ（Namalva）〕中で
産生されたもので、1.1×10⁶国際基準単位/mg蛋白質の
比活性を有していた。10⁵抗ウイルス単位/mlの比活性を
有するγ−インターフエロンは親切にもガーリー ター
マン（Gary Thurman）博士〔NCI、フレデリツク癌研究
所（Frederick Cancer Research Facility,フレデリツ
ク（Frederick）MD〕から供給されたもので、フローラ
ボラトリーズ社（Flow Laboratories,Inc.）〔マクリー
ン（McLean）、VA〕及びメロイラボラトリーズ（Meloy
Laboratories）〔スプリングフイールド（Springfie
d）、VA〕によつて生物学的反応モデイフアイヤーズプ
ログラム（Biological Respanse Modifiers Program）
〔NCIフレデリツク癌研究所（NCI Frederick Cancer R
esearch Facility）、フレデリツク（Frederick）、M
D〕用に調製されたものであつた。（第５表参照。） インターロイキン１及び２。インターロイキン１活性
は、PHAに反応するC3H/HeJネズミ胸線細胞の増殖のリン
ホカインによる増強を測定することにより決定した（1
8）。胸線細胞増殖は10⁵抗ウイルス単位/mlの存在も反
映し得る。これは親切にもガーリー ターマン（Gary T
hurman）博士〔NCI、フレデリツク癌研究社（Frederick
Cancer Research Facility）、フレデリツク（Frederi
ck）、MD〕から供給されたものであり、フローラボラト
リーズ社（Flow Laboratoriesh,Inc.）及びメロイラボ
ラトリーズ（Meloy Laboratories）〔スプリングフイー
ルド（Springfield）、VA〕によつて生物学的反応モデ
イフアイヤーズプログラム（Biological Response Modi
fiers Program）〔NCIフレデリツク癌研究社（NCI Fre
derick Cancer Research Facility）、フレデリツク（F
rederick）、MD〕用に調製されたものである。（第５表
参照。） インターロイキン１及び２。PHAに反応するC3H/HeJネズ
ミ胸線細胞増殖のリホカインによる増強を測定すること
によりインターロイキン１活性を決定した（18）。胸線
細胞増殖は又インターロイキン２の存在も反映するであ
ろう。従つて、ヒトインターロイキン２に感受性のOH−
１マーモセツト連続Ｔセルラインのインターロイキン２
依存性増殖に基づく標準マイクロアツセイを用い、リン
ホカインをインターロイキン２についてもテストした
（3,22）。ヒトインターロイキン２スタンダード〔ピ
ー．ジヤガナス（P.Jagannath）博士、リツトン バイ
オネテイツクス社（Litton Bionetics,Inc.）、ケンシ
ングトン（Kensington）、MDから提供された〕は1:1500
の希釈度で半最大増殖（half maximal proliferation）
増強を示した。ヒトインターロイキン１のスタンダード
は、本明細書中に記載のリンホカイン製造法を用いて我
々の研究室で調製した。（第４表参照。） マクロフアージ活性化及びエンドトキシンアツセイ。こ
の２つのアツセイは親切にもガーリー ターマン（Gary
Thurman）博士、NCI、フレデリツク癌研究所（Frederi
ck Cancer Research Facility）、フレデリツク（Frede
rick）、MDが実施してくれた。マクロフアージ活性化活
性は、リンホカインがヒト腫瘍細胞に対するヒト単球の
細胞毒性活性を増強する能力として測定した（14）。エ
ンドトキシンは、約0.1ngまでの感度の色素原アツセイ
〔エンドトキシ色素原アツセイキツト、M.A.、バイオプ
ロダクツ（Bioproducts）、ワーカーズビル（Walkersvi
lle）、MD〕で測定した。腫瘍細胞増殖阻害に対するエ
ンドトキシンの影響の可能性についても検討した。血清
型番号055:B5と0111:B4のエンドトキシン（リポポリサ
ツカライド）〔シグマ（Sigma）〕は0.01、0.1、1.0、1
0.0及び20ng/mlの濃度で腫瘍細胞の細胞増殖抑制アツセ
イに添加した。腫瘍細胞増殖に対する作用は上記の如く
測定した。（第４表参照。） 等電点電気泳動。濃縮リンホカインサンプルの分取用カ
ラム等電点電気泳動は110mlの等電点電気泳動カラム（L
KB）中、pH3.5−10のアンホリン（ampholine）〔LKB、
ロツクビル（Rockville）、MD〕勾配で行つた（28）。3
mlの画分を集め、各画分のpHを測定した。選んだ画分を
ピープルし、PBS−0.1％PEGに対し透析過し、0.22μ
ミレツクス（Millex）フイルター〔ミリポア社（Millip
ore Corp.）、ベツドフオード（Bedford）、MA〕で過
滅菌し、生物学的活性を測定した。（第４表と第８図参
照）。

HPLC。分取用トヤソーダ（Toya Soda）G3000SWGゲルHPL
Cカラム（LKBが販売）を用い、分子サイズによる分離を
行つた。0.1％PEG含有0.02Mリン酸ナトリウムバツフア
ー（pH7.4）を用い、4ml/分の流速で2mlのサンプルを均
等に（isocratically）溶出した。4mlの画分を集め、
過滅菌し、生物学的活性についてアツセイした。（第４
図参照。） 分子の電荷によるPHLC分離はトヤソーダ（Toyasoda）
DEAE−545分析用アニオン交換カラムで行つた。0.1％PE
G含有20mMトリスHCl（pH7.4）中のサンプルを0.75ml/分
の流速で0.5m NaClの直線１時間勾配で溶出した。２分
間の画分を集め、過滅菌し、アツセイした。（第９図
参照） ポリアクリルアミドゲル電気泳動。濃縮したロイコレギ
ユリンサンプル（未分画又はHPLCゲル過及びイオン交
換クロマトグラフイーで分離）を４〜30％直線勾配ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した（16）。電気泳動
後、ゲルを0.25mmの切片にスライスし、培地−10％FBS
中でスライスし１晩溶出した。溶出液を過滅菌し、ア
ツセイした。（第５図参照。） ¹²⁵Iでラベルした精製ロイコレギユリンも１％のドデ
シル硫酸ナトリウムを含有する５％アクリルアミド積層
ゲルを用いて15％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動
した（15）。オートラジオグラフイーでサンプルを可視
化した。（第７図参照）。

精製したロイコレギユリンの放射性標識（ラベル）。逐
次HPLC及びポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した
ロイコレギユリン25単位を、クロラミンＴ法（17）を用
い、かつセフアデツクス（Sephadex）Ｇ−10カラム上で
未反応¹²⁵Iからラベルしたロイコレギユリンを分離する
ためのキヤリア蛋白質としてウシ血清アルブミンを添加
して、¹²⁵Iでラベルした。

ゲル過カラムクロマトグラフイー。¹²⁵Iでラベルした
精製ロイコレギユリンをＳ−300〔フアルマシア フア
イン ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）、ウプ
サラ（Upsala）、スウエーデン（Sweden）〕カラム上で
pH7.4の10mM NaPO₄バツフアー1.0M NaClで溶出した。2m
lの画分を集め、計測（カウント）した。（第６図参
照） 酵素的消化。ノイラミニダーゼ及びプロテアーゼ消化に
対するヒト及びハムスターロイコレギユリン及びリホト
キシン活性の感受性を評価した（29）。50μのVCN〔5
00単位/ml、カルビオケム−ベーリング社（Cal−bioche
m−Behring Corp.）、ラジヨラ（LaJolla）、CA〕及び
0.5mlのpH5.1の0.1M酢酸ナトリウムバツフアーに、0.5m
lの濃縮ヒト又はハムスターリホカイン試料を添加し
た。コントロールとして、同じ酢酸塩バツフアー0.5m
l、50μのVCN及び0.2Mのシアル酸50μ〔シグマ（Si
gma）〕（この濃度のシアル酸は酸素を不活性化する）
を含有する同酢酸塩バツフアー0.5ml、又は0.5mlの培地
に0.5mlのリンホカインを添加した。サンプルを37℃で6
0分間インキユベートし、YM10メンブレンを持つアミコ
ン（Amicon）セル中でPBS−PEGに対して透析し、サンプ
ル容量を3mlに調整した。蛋白質分解的消化には、PBS中
のトリプシン1ml〔32単位/ml、比活性195単位/mg、ワー
チングトン酵素社（Worthington Enxymes Inc.）、フリ
ーホールド（Freehold）、NJ〕、PBS中のキモトリプシ
ン1ml〔６単位/ml、比活性59単位/mg、シグマ（Sigm
a）〕、又は3mM CaCl₂及び３％トルエン含有0.1Mトリス
塩基中のプロナーゼ1ml〔６単位/ml、比活性６単位/m
g、シグマ（Sigma）〕にリンホカインサンプル1mlを加
えた。プロナーゼは、サンプルに添加する直前に、10mg
プロナーゼ/ml0.1Mトリス−15mM CaCl₂（pH7.8）を37℃
で30分間インキユベートして活性化した。プロテアーゼ
を含むサンプル又はプロテアーゼバツフアーコントロー
ルは37℃で60分間インキユベートした。1mlのFBSを各サ
ンプルに加え、アツセイ用にサンプルを100培の範囲に
亘つて培地で希釈した。（第３表参照。） NK細胞毒性アツセイ。NK−媒介細胞毒性に対するロイコ
レギユリン処理後の標的細胞感受性の増強は主として前
述の如く測定した（23）。LSM勾配遠心分離で単離した
正常ヒト末梢血単核細胞をナイロンウールに通してマク
ロフアージとＢ細胞を除去し、NK細胞を多くした。100
μ Ciの⁵¹Crをクロム酸ナトリウム〔NEN、ボストン（Bo
ston）、MA〕として添加することにより、K562標的細胞
を18時間ラベルした。標的細胞を1640−10％FBSで３回
洗浄し、培地又は培地中に希釈したリンホカイサンプル
1ml当り2.5×10⁵細胞となるよう懸濁した。次いで、標
的細胞を37℃で30分間インキユベートし、280×ｇで５
分間遠心し、10⁵細胞/mlの濃度で1640−10％FBS中に再
懸濁した。100μの培地又は標的細胞に対するエフエ
クターの比、25:1、10:1もしくは2.5:1でエフエクター
細胞を含有する試験管に100μの細胞を添加した。次
に、４時間の⁵¹Cr放出アツセイを行つた（23）。細胞を
培地でプレインキユベートしてもリンホカイン中でプレ
インキユベートしても自然に起る⁵¹Crの放出は15〜20％
の範囲であつた。培地中でインキユベートした標的細胞
とリンホカイン中でインキユベートした標的細胞とのNK
細胞毒性の溶解単位を比較してリンホカインの増強の程
度を測定した。標的細胞から⁵¹Crを15％特異的に放出さ
せるリンパ球数として定義される１溶解単位はバン ク
ローグ（Van Krough）式を用いて計算した（21,32）。
（第６表及び第３図参照。） 流動細胞計測分析。K562細胞をRPMI1640−10％FBS中に
４×10⁶/mlで再懸濁した。250μの細胞懸濁液を12×7
5mmのプラスチツク製チユーブ中に入れると共に250μ
のリンホカイサンプルを加えて処方した。６サイクル／
分のプラツトホーム ロツカー〔ベルコ グラス社（Be
llco Glass Co.）、バインランド（Vineland）、NJ〕
上、５％CO₂:95％湿潤空気雰囲気下、37℃でチユーブを
30分〜６時間インキユベートした。

装置：流動細胞計測分析は、励起源として5Wアルゴン−
イオンレーザー、256チヤンネルのパルス高アナライザ
ー、及び対数増幅器を備えたFACS IV 螢光活性化セル
ソーター〔ベクトン−デイキンソン（Becton−Dickinso
n）、サニーバイル（Sunnyvale）、CA〕を用いて行つ
た。細胞は、MILLI−Ｑ過した〔ミリポア社（Millipo
re Corp.）、ベツドフオード（Bedford）、MA〕H₂Oのシ
ース流体中で直径70μのノズルを通して通貨させた後の
小角前方光散乱（narrow angle forward light scatte
r）及び螢光について分析した。小角前方光散乱シグナ
ルは細胞の大きさ及び形状の指標であり、全ての分析の
トリガーシグナルとして用いた。他に特記しない限り、
全ての光学フイルターは機器と共にベクトン−デイキン
ソン（Becton−Dickinson）から得た。

FDA螢光染色（fluorochromasia）：細胞膜透過性を測
定するためにFDAを用いた（５）。5mgFDA/mlの濃度でア
セトン中にFDAの結晶を溶かしてFDA〔ポリサイエンス社
（Polyscience、Inc.）、ワーリングトン（Warringto
n）、PA〕の保存溶液（stock solution）を作製した。
使用直前に、最終濃度6.25μg FDA/mlとなるように保存
溶液をRPMI1640−10％FBSで希釈して使用溶液（working
solution）を調製した。K562細胞をリンホカインで処
理した後、細胞をRPMI1640−10％FBSで１回洗浄し、6.2
5μg/mlの使用FDA溶液1ml中に再懸濁し、室温で５分間
インキユベートし、次いで流動細胞計測計で分析した。

ヨウ化プロピジウム（propidium iodide）螢光染色：
ヨウ化プロピジウムも細胞膜透過性測定に使用した。50
0μg/mlの濃度でpH7.4のPBS中にヨウ化プロピジウム
〔カルビオケム−ベーリング社（Calbiochem−Behrig C
orp.）、ラジヨラ（La Jolla）、CA〕を溶かしてヨウ化
プロジウムの保存溶液を作製した。使用直前に、0.2μ
ｇヨウ化プロピジウム/mlの最終濃度となるように保存
溶液をPBSで希釈して使用溶液を調製した。リンホカイ
ン処理後に、細胞をRPMI1640−10％FBSで１回洗浄し、
ヨウ化プロジウムの使用溶液1mlに再懸濁し、室温で５
分間インキユベートし、次いで流動細胞計測系で分析し
た。

蛍光測定:FDA及びヨウ化プロピジウムの両者に使用する
励起波長は同じで、40mWで488nmであつた。螢光検出電
子倍増管の正面に長いパスの515及び520nmの光学ガラス
フイルターを置いた。ヨウ化プロピジウムでラベルした
サンプルを分析するするときには、電子倍増管の正面に
更に赤色付加二色フイルター〔コリオン社（Corion Cor
p.）、ホリスター（Hollister）、MA〕を置いた。各実
験の前に、培地で処理したK562細胞を使つて流動細胞計
測器を微調整した。ゲインコントロールと電子倍増管電
圧とを調整して、分析した２×10⁴細胞の90％が、256チ
ヤンネルの全スケール内の予め決めた範囲のチヤンネル
に入るようにした。この研究では、調べる３つのパラメ
ータ（前方小角光散乱、フルオレセイン螢光及びヨウ化
プロピジウム螢光）の各々についてこれを行つた。培地
処理したコントロール細胞については、散乱及びフルオ
レセイン螢光はチヤンネル範囲の上部に、ヨウ化プロピ
ジウム螢光は下部にセツトして、リンホカイン処理細胞
中の適切なシフトを測定するようにした。各K562細胞サ
ンプルの処理では、２×10⁴細胞を分析し、予め決めた
マーカー領域内にある細胞のパーセントを計算した。次
いで、培地処理したコントロールのパーセント（約90
％）から前記のパーセントを引いて、サンプルのパーセ
ント変化を得た。パーセント変化は−５〜＋70であつ
た。プラスの方向への変化は測定するパラメータについ
てリンホカイン処理で起つたK562細胞に対する効果を示
す（第10図参照。） 実施例２ ヒトＢセルラインとロイコレギユリンを分泌するハイブ
リドーマの生成。癌患者を、20,000radの照射によつて
解離して10⁷個のBCG生菌と混合した自分自身の腫瘍細胞
で皮内免疫した。これらの患者の静脈血から調製した末
梢血白血球を、骨髄腫１当りPBL3の比で、ネズミNS−１
骨髄腫細胞と混合し、遠心し、100μの無血清培地に
再懸濁した。37℃に予熱したポリエチレングリコール
（50％w/v）1mlを、チユーブを常に撹拌しながら１分間
に亘り細胞ペツトに滴加した。50mlのチユーブが一杯に
なるまで、１分間に亘り細胞懸濁液に前量の２倍量の予
熱した無血清培地を加えた。800RPM、15分間で細胞はペ
レツトになつた。2.5×10⁵細胞/ml（融合前のカウン
ト）の濃度でHT培地（20％胎児ウシ血清、ヒポキサンチ
ン13.6μg/ml及びチミジン39.9μg/mlを含有するDMEM）
中に細胞を緩やかに再懸濁し、100μをマイクロタイ
ターの各ウエルに加えた。24時間後に、各ウエルにHAT
培地（.18μg/mlアミノプテリン含有HT培地）100μを
加えた。３日毎に培地の半量を新しいHAT培地と取り替
えた。HAT培地中に14日間維持した後、更に２週間細胞
をHT培地上に維持した。この時点で、20％胎児ウシ血清
を含有するMEM培地で細胞を増殖した。

又、PBLを骨髄腫細胞と共培養したものを用い形質転
換した二倍体Ｂ細胞を創成してもよい。前述の如く、PB
Lと骨髄腫細胞とを（3:1の比で）混合し、800RPMでペレ
ツト化し、HAT培地中で選択した。

標的としてHT−29細胞を用いるマイクロアツセイで、
ハイブリドーマ又は形質転換した二倍体Ｂ細胞の上清中
の分泌ロイコレギユリンをテストした。ロイコレギユリ
ンを産生する細胞をMEM−10％FBS中に拡げ、十分な数が
得られたときに、無血清培地中でのロイコレギユリン産
生の最適条件を決定するための実験を行つた。２×10⁵/
mlRPMI1640の濃度で細胞を懸濁し、37℃で３日間インキ
ユベートした。いくつかの実験では、ロイコレギユリン
産生を刺激するために培養物にテトラデカノイルホルボ
ールアセテート10ng/mlを添加した。上清を集め、800×
ｇで遠心し、ロイコレギユリン活性についてアツセイし
た。

実施例３ ロイコレギユリン細胞表面レセプターに対するモノクロ
ーナル抗体の調製。２週間隔で３回、K562膜を皮下注射
してBalb/cマウスを免疫した。モーター駆動テフロン製
ホモジナイザーで均一にして調製し、低速遠心で清澄化
し、次いで100,000×ｇで１時間超遠心して集めた10⁷個
の細胞と同等の膜を各々マウスに与えた。各ブースター
用には膜を完全にフロインドアジユバントと混合した。
ハイブリツト形成の３日前に、PBS中のK52細胞膜をマウ
スに腹腔内注射した。融合の日に脾臓を取り出し、単個
細胞を得、脾臓細胞：骨髄種細胞が3:1の割合でPEGを用
いて融合した。融合後、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含有する培地で培養することによりハ
イブリツドを選択した（10）。ロイコレギユリンレセプ
ターに対する抗体を産生するコロニーを限界希釈法でク
ローン化した。

HT−29細胞のロイコレギユリン指向増殖遅滞の阻害を
測定する生物学的アツセイを用い、ロイコレギユリンレ
セプターに対する抗体を検出した。96−ウエルプレート
のウエル中の0.1mlのMEM−10％FBS中に2000個のHT−29
細胞を載置した。HT−29細胞の増殖を50％阻害するに十
分な0.1ml中のロイコレギユリンを加え、次にテスト抗
体含有上清25μを加えた。３日間インキユベートした
後、前述の如くMTTで染色して存在する細胞の量を測定
した。ロイコレギユリン活性を25％以上阻害するサンプ
ルを陽性と考えた。このアツセイの原理は、モノクロー
ナル抗体がロイコレギユリンレセプターと結合し、それ
により、ロイコレギユリンの結合及びその後の増殖阻害
活性を抑制するということである。

ロイコレギユリンレセプターの発現の定量を３つの方
法で行つたが、いずれもロイコレギユリンレセプターに
対するモノクローナル抗体のパーセントを定量した。免
疫螢光アツセイでは、２×10⁵個の細胞をモノクローナ
ル抗体と共に37℃で１時間インキユベートした。細胞を
２回洗浄し、螢光結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン〔キ
ルケガード及びペイリーラボス（Kirkegard and Peiry
Labs）、ロツクビル（Rockville）、MD〕を添加し、４
℃で30分間インキユベートした。細胞を洗浄し、PBS0.5
ml中に再懸濁し、緑色螢光を励起するための488レーザ
ー線を用いるEPICS 5流動細胞計測計〔コールター イ
ンストルメンツ（Coulter Instruments）、ヒアリー（H
ialeah）、FL〕で分析した。結合体（conjugate）とし
てELISAではホースラデイツシユのペルオキシダーゼヤ
ギ抗−マスス免疫グロブリンを用い、RIAでは¹²⁵I−ラ
ベルヤギ抗−マウス免疫グロブリンを用いたことを除い
ては、ELISA及びRIAは同様の方法で行つた。ELISAアツ
セイでは、ARTEK自動読み取り機で水解された基質量を
測定することにより比色定量した。RIAではLKBガンマカ
ウンター〔LKBインストルメンツ（LKB Instrument
s）、ロツクビル（Rockville）、MD〕を用い結合した
¹²⁵I−ラベルを測定して定量した。（第８表参照。） 実施例４ 寒天クロノジエニツクアツセイ（agar clonogenic assa
y）を用いた、患者腫瘍細胞のロイコレギユリンに対す
る感受性の測定。腫瘍細胞は正常細胞に比べ、半固形培
地で増殖する独特の能力を有している。この腫瘍細胞の
特性により、切除したヒト腫瘍の解離したばかりの細胞
に対する癌治療剤の作用を定量する手段が提供される。
手術で得られた結腸腫瘍を細切し、コラゲナーゼ及びDN
A分酵素（DANase）で解離して単個細胞懸濁物を得た（1
1）。ロイコレギユリンを種々の濃度で加えること以外
はケルン（Kern）の方法（12）に従つて、細胞を培地内
の0.15％寒天に懸濁した。寒天培地中に懸濁して増殖す
る腫瘍細胞コロニーの発達を10〜14日のインキユベーシ
ヨン後に定量した。（第９図表参照。） 実施例５ ロイコレギユリン遺伝子のクローニング。上記の如く、
生物学的及び生化学的の両者でロイコレギユリンが定義
され、従つて、ロイコレギユリンを同定し単離する方法
が得られたので、従来の広く公表されているアプローチ
及びプロトコール〔例えば、マニアチス（Maniatis）
ら、分子クローニング：実験マニユアル（Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual）、コールド スプリング
ハーバー出版（Cold Spring Harbor Press）、コール
ド スプリング ハーバー（Cold Spring Harbor）、N
Y、1982年〕を用いて、ロイコレギユリンのクローン化
及び発現が行われる。これらの手順は前記実施例に開示
された感度のあるバイオ−アツセイに基く。アツセイを
開発し、ロイコレギユリンを生物学的及び生化学的に定
義したので、大腸菌（E.coli）又は他の適切な宿小生物
中で、アミノ酸配列と生物学的活性が真正天然ロイコレ
ギユリンと同等である蛋白質又はその生物学的に活性な
サブユニツトを産生するために、標準的な組換えDNA及
びクローニング手法を用いることができる。クローニン
グ手順の概観を第11図に示す。この方法は、グレイ、ピ
ー．ダブリユ．（Gray,P.W.）らがネイチヤー（Natur
e）312巻、721頁（1984年）に報告したものと同様のプ
ロトコールを用いて細菌内で発現した多くの生物学的に
関連する真核性遺伝子、特にヒトリンホカイン、すなわ
ちリンホトキシンで行つた方法と等価である、この実施
例で引用したこの論文及び他の論文はその全体を参考文
献として本明細書中に含むものとする。

クローン化の例は６つの異なる段階とて検討できる。
（第11図参照。）これら各ステツプの原理を下記に示
す。

第Ｉ段階 バイオアツセイ、精製及び生物学的特性化。この分析
は、クローン化実験を行う前に必ず行わなければならな
い。この研究の詳細は本出願で示すデータである。上記
の如くこのデータを解明した後、次に遺伝子工学を続け
ることができる。

第II段階 大腸菌（E.coli）の遺伝子ライブラリー。天然起源のロ
イコレギユリンの特性化に基き細菌のクローンを構築す
る。本出願はヒト末梢血リンパ球（PBL）によるロイコ
レギユリン産生の刺激方法を開示しているので、これら
の細胞はロイコレギユリン合成に必要な遺伝情報を持つ
ていなければならず、明らかにロイコレギユリン遺伝子
の起源である、刺激した細胞集団を用いて、ロイコレギ
ユリンのmRNAを含有するmRNAを単離する。このPBLmRNA
を使用して、例えば大腸菌（E.coli）又は他の宿主生物
中でcDANライブラリーを構築する。

第III段階 生化学的特性化、アミノ酸配列。上記で検討したよう
に、ロイコレギユリン蛋白質は生化学的に特性化され、
均質に精製された。次の重要なステツプはこの天然材料
を用いてロイコレギユリン蛋白質のアミノ酸配列を明ら
かにすることである。この研究は、得られた遺伝子クロ
ーンが真正ロイコレギユリンに対応することを確認する
ために必要であり、従来の生化学的配列決定法で行う。

第IV段階 免疫スクリーニングによる遺伝子の単離。遺伝子単離の
このアプローチは第II段階完了直後に開始できる。この
実験用の重要な試薬は天然ロイコレギユリンに対する抗
−ロイコレユリン抗体であり、これは動物を免疫するに
充分な天然ロイコレギユリンを精製した後に調製でき
る。この技術は種々の遺伝子に関して大腸菌（E.Coli）
遺伝子ライブラリーをスクリーンするのに用いてうまく
いつており、ヘルフマン，ディー．エム．（Helfman,D.
M.）ら、PNAS、80巻、31〜35頁（1983）及びヤング、ア
ール．エー．（Young R.A.）及びアール．ダブリユ．デ
イビス（R.W.Davis）、PNAS、80巻、1194〜1198頁（198
3年）に教示されている。

第Ｖ段階 DNAブローブによる遺伝子の単離。これはもう１つの最
も広く使われている、組換えDNA大腸菌（E.coli）ライ
ブラリーからの遺伝子単離方法である。ノイエス（Noye
s）ら〔PANS、76巻、1770〜1774頁（1979年）〕が最初
に示したように、真核性mRNAを単離し特性化するために
合成オリゴデオキシヌクレオキドプローブを用いる。こ
のプローブは、天然の蛋白質の部分的なアミノ酸配列を
先ず決定し、次いでこの部分的なアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列を合成することにより調製したロ
イコレギユリン用のDNA配列の小部分である。この合成
ヌクレオチド配列は、例えばイタクラ ケー．（Itakur
a K.）らがジエー．アム．ケム．ソク．（J.Am.Chem.So
c.）、97巻、7326頁（1975年）に記載したように、化学
的に調製できる。１例として、アストリンmRNAと特異的
にハイブリダイズするドデカヌクレオチドｄ（CTCCTCCA
TCCA）を特定するためにガストリンからのアミノ酸配列
Trp−Met−Glu−Gluを用いた。同様に、ロイコレギユリ
ン用にはロイコレギユリン産生細胞からの天然のmRNAと
ハイブリダイズするプローブとして合成DNA断片を用い
る。例えば、放射性同位元素（tag）と従来の方法を用
い、ロイコレギユリン用のmRNAをRNA混合物から分離す
る。これらの手順に用いる方法はマニアチス（Maniati
s）ら、上掲；グツドマン（Goodman）ら、米国特許第4,
283,489号及び第4,363,877号及びそこに引用されている
参考文献中で論じられている。

これらの結果を拡張してcDANライブラリーのスクリー
ニングにこのようなプローブが用いられた〔クレア，ア
ール．（Crea,R.）及びホーン，テイー．（Horn,T.）、
ヌク．アシツド リス（Nou Acid Rse）８巻、2331〜23
48頁（1980年）〕。最近、アミノ酸配列Trp−Glu−Tyr
−Cys−Aspで予期されるテトラデカヌクレオチドのセツ
ト を用いて、大腸菌（E.coli）中でヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子遺伝子cDNAのクローンを検出した〔ペ
ニカ、デイー．（Pennica,D.）ら、ネイチヤー（Natur
e）301巻、214〜220頁、1983年〕。

第VI段階 遺伝子の組み立て、微生物発現。クローン化の最後の段
階は真核生物構造遺伝子の完全なコピーの慣用の組み立
てと、ロイコレギユリン又は生物学的に活性なそのサブ
ユニツトを産生する遺伝子の翻訳である。この遺伝子を
遺伝子工学的に微生物で発現させる手順は種々の宿主に
より異なる方法で行う。ベクターの調製、宿主細胞の形
質転換及び翻訳や発現の実施には種々の選択があり、リ
ストするには多すぎるが、手順は従来のものであり、多
数の総説、例えばマニアチス（Maniatis）ら、上掲、遺
伝子増幅及び分析：原核及び真核細胞におけるクローン
化遺伝子の発現（Gene Amplification and Analysis:Ex
pression of Cloned Genes in Prokaryotic and Eukary
otic Cells）、パパス、テイー、エス．（Papas,T.S.）
ローゼンベルグ、エム．（Rosenberg,M.）、及びキリグ
キジイアン，ジエー．ジー．（Chirigkjian,J.G.）編、
エルセビア、サイエンス出版社（Elsevier Science Pub
lishing Co.,Inc.）.NY、1983年、バーマン（Berman）
ら、米国特許第4,503,142号及びそこに引用されている
参考文献中に述べられている。

分子構造に修飾をもつ可能性のあるロイコレギユリン
の修飾型又は生物学的に活性なそのサブユニツトを合成
できるということも本発明の範囲内と考えられる。この
ような修飾ロイコレギユリンは効果が増強され、副作用
が減少し安定性が増加するというように高まつた有用性
を示すことができる。又はこのような修飾ロイコレギユ
リンは、それによつてロイコレギユリンが特定されてい
る同等な活性又はそれ以下だが適当な活性を示し得る。
しかしながら、分子構造や生物学的活性の大部分が本明
細書中に定義したロイコレギユリンと同じである全ての
場合、これは均等又は正常な修飾であると考えるべきで
あり、それ故、本出願の一部と考えるべきである。

図面及び表の説明 第１図 ヒト腫瘍細胞の細胞溶解、リンホトキシン濃度が等価で
あるときの、ロイコレギユリン含有ヒトPBLリンホカイ
ンによるもの 及び精製1788セルラインリンホトキシンによるもの サンプル平均の標準偏差は最大２％であつた。

しかしながら、ヒトリンホカインとリンホトキシンと
はヒトの白血病、肉腫及び癌細胞に対する細胞溶解活性
をほとんど又は全く持つていなかつた。1000単位のリン
ホトキシシ/mlを含有するリンホカインサンプルで、最
大のRPMI2650癌細胞の50％の溶解が観察された。

第２図 ヒト腫瘍細胞の増殖阻害、等価のリンホトキシン濃度で
の、ロイコレギユリン含有ヒトリンホカインによるもの 及び精製1788セルラインリンホトキシンによるもの サンプル平均の標準偏差は最大で５％であつた。細胞計
数アツセイを用いて％増殖阻害を測定した。

高純度の1788セルラインリンホトキシンは３種の腫瘍
細胞の各々を溶解しなかつた。ヒト腫瘍細胞に対する溶
解活性は低いにもかかわらず、ヒトリンホカインはヒト
腫瘍細胞の増殖を有意に阻害した。しかしながら、精製
1788セルラインリンホトキシンは500及び1000リンホト
キシン単位/mlの濃度でのみ有意に増殖を阻害した。更
に、これらの濃度での増殖阻害は、そこで精製リンホト
キシンを調製したpH8.4の炭酸アンモニウムバツフアの
増殖抑制の影響によるものであつただろう。

第３図 NK−媒介細胞毒性に対する標的細胞の感受性の増強、ロ
イコレギユリン含有ヒトリンホカインによるもので精製
ヒトリンホトキシによるものではない。40リンホトキシ
ン単位/mlのヒトリンホカイン 40単位/mlの精製1788リンホトキシン を、NKエフエクター細胞添加前に、標的細胞と共に30分
間インキユベートした。サンプル平均の標準偏差は最高
１％であつた。

腫瘍細胞増殖阻害に加え、精製1788リンホトキンシで
なくヒトリンホトキシンはヒトの癌、白血病、及び肉腫
細胞のNK−媒介細胞毒性に対する感受性を高めた。ヒト
リンホカインは、NK溶解に耐性のRPMI2650癌細胞の溶解
さえ生じさせた。精製1788リンホトキシンは癌、白血病
又は肉腫細胞のNKによる溶解に対する感受性を増強しな
かつた。未分画のヒトPBLリンホトキシン含有リンホカ
インと精製1788セルラインリンホトキシンの生物学的活
性がばらばらに異なるということは、リンホトキシン以
外のリンホカインが抗腫瘍細胞活性を媒介していること
を示している。

第４図 ２種の異なるヒトリンホカイン試料のゲル浸透HPLC。2m
lのサンプルを、0.1％PEG含有0mMリン酸Naバツフアー
（pH7.4）を用いてトヤソーダ（Toyasoda）TSKG−3000S
WGカラムから均等に（isocratically）希釈した。4mlの
画分を集め、RPMI1640−10％FBSで100培の範囲に亘つて
希釈し、αL929細胞のリンホトキシン細胞溶液及びヒト
K562及び2650腫瘍細胞のロイコレギユリン細胞増殖抑制
についてアツセイした。280nmでの蛋白質吸収プロフイ
ールをαL929アツセイパネルに示す。

ヒトPBLリンホトキシン及びロイコレギユリンの見か
けの分子量をHPLC分子ふるい（モレキユラーシーブ）ク
ロマトグラフイーで検討した。リンホトキシン活性の大
部分は30,000〜40,000の分子量範囲内の画分に溶出し
た。しかしながら、異なる個体からなサンプルでは多少
変化があり、またいくつかの場合には50,000〜70,000及
び12,000〜20,000の分子量範囲内にもリンホトシン活性
がみられた。ロイコレギユリン活性は50,000〜70,000の
分子量範囲内の画分に溶出したが、少量の成分が10,000
〜15,000の分子量範囲内に溶出した。

第５図 ロイコレギユリンの直線勾配ポリアクリルアミドゲル電
気泳動。勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、
ロイコレギユリンの分子量をより正確に決定した。ヒト
ロイコレギユリン試料1mlを一晩電気泳動した。次いで
ゲルをスライスし、MEM−10％FBSで37℃にてスライスを
１晩溶出した。標的としてHT−29癌細胞を用いるマイク
ロアツセイでロイコレギユリン活性を測定した（白
丸）。ロイコレギユリンは分子量110,000〜140,000の蛋
白質と共に移動した。逐次HPLCゲル過、イオン交換ク
ロマトグラフイー及び直線勾配ポリアクリルアミドゲル
電気泳動で精製した¹²⁵I−ラベルしたロイコレギユリン
の電気泳動パターンもこの図に示す（黒丸）。

第６図 精製ロイコレギユリンのゲル過。フアルマシア（Phar
macia）Ｓ−300ゲル過を用いるもう１つ別の方法で分
子量を測定した。HPLCゲル過、イオン交換クロマトグ
ラフイー及び直線勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で精製したロイコレギユリンを¹²⁵Iでラベルし、Ｓ−30
0カラム上で10mM NaPO₄バツフアー（pH7.4）−1.0M NaC
lで溶出した。この手法では精製ロイコレギユリンの見
掛け上の分子量は120,000〜140,000であつた。

第７図 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動。変性条件においたとき天然の蛋白質がサブユニツト
に解離するかどうかを決定するために、¹²⁵Iでラベルし
た精製ロイコレギユリンをドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。このゲルのオー
トラジオグラフで示されているように、ロイコレギユリ
ンは30,000〜35,000の分子量の分子と共に電気泳動し
た。

第８図 ２種の異なるヒトリンホカイン試料の等電点電気泳動。
2mlのサンプルをpH3.5〜10の勾配で電気泳動した。3ml
の画分を集め、各画分のpHを測定し、0.5pH単位の連続
する画分をプールして、PBS−PEGに対して透析過し、
過滅菌し、100培の範囲に亘つて希釈し、αL929細胞
に対するリンホトキシンの細胞溶解活性 及びOST 細胞に対するロイコレギユリンの細胞増殖抑制活性につ
いてアツセイした。

分子ふるいで分けた時にはヒトリンホトキシン及びロ
イコレギユリン活性は重り合つた水にもかかわらず、２
つの活性は分子電荷の違いに基いて分離できた。リンホ
トキシンの等電点pHは6.5〜7.2であつた。ロイコレギユ
リンは２つの等電点pHを持ち、１つは5.0と5.8の間であ
り、２番目は7.5と8.3の間であつた。

第９図 ロイコレギユリン及びリンホトキシンのHPLCイオン交換
クロマトグラフイー。ヒトリンホカイン試料の2mlのサ
ンプルを０〜0.5M NaClの直線勾配で溶出することによ
りDEAE−545HPLCカラムで分離した。画分を過滅菌
し、マイクロアツセイとHT−29標的細胞を用いロイコレ
ギユリンについて、又はリンホトキシンについてアツセ
イした。ロイコレギユリンは0.1M NaCl濃度で溶出し、
0.15M NaCl濃度で溶出したリンホトキシンと分れた。

第10図 ロイコレギユリン活性の流細胞計測分析。作用機作に関
連し得るロイコレギユリンのもう１つの生物学的活性を
流動細胞計測分析で評価した。小角前方光散乱の変化
（○）又はフルオレセインジアセテード（□）もしくは
ヨウ化プロピジウム（△）螢光染色（fluorochromasi
s）で検出できるK562細胞容量又は膜透過性の変化をFAC
S IV流動細胞計測形で488nmのアルゴンレーザー線励起
（line excitation）を用いて評価した。上のチヤート
では、細胞のリンホカインに対する反応を確立するため
に、10（−−−）、40（−…−）、又は100（−・−）
単位の透析過したリンホトキシン又は500（−）単位
のαインターフエロンを含有するリンホカイン試料でK5
62細胞を０〜６時間処理した。

リンホカインをK562細胞に加えると、細胞からの小角
前方光散乱は減少し、ヨウ化プロピジウム螢光染色は増
加し、FDA螢光染色は減少した。小角前方光散乱の変化
は、アクコンポ（Accucomp）細胞容量分析プログラミン
グを加えたモデルZB1コールターカウンター（Coulter C
ounter）〔コールターインストルメンツ社（Coulter In
struments,Inc.,ヒアリー（Hialeah）、FL〕での細胞容
量分析で確認された細胞容量の増加に伴う細胞の形状及
び／又は大きさの変化を反映していた。FDA螢光染色の
減少は、螢光性の細胞内フルオレセインが細胞から出て
しまうのであるから膜透過性の増加を反映していた。ヨ
ウ化プロピジウム螢光染色の増加も、ヨウ化プロピジウ
ムが細胞内に入り、核酸の間に入り込んだのて、膜透過
性の増加を反映していた。ヒトリンホカインによる流動
細胞計測の変化は、K562細胞処理30分後には検出可能で
あり、２時間まで最高であつた。この期間には、α−イ
ンターフエロンは細胞表面の構造又は血漿膜透過性の変
化を引き起こさなかつた。下のチヤートでは、HPLC−等
電点電気泳動画分（サンプル番号は第４表から）でK562
細胞を２時間処理し、光散乱（−）、フルオレシンジア
セテート（−−−）及びヨウ化プロピジウム（・・・・
・・）の螢光染色の変化を測定した。リンホカインの細
胞構造及び膜透過性活性はHPLCと等電点電気泳動で精製
したロイコレギユリン画分にのみ存在した。リンホトキ
シン又はインターロイキンとインターフエロンとの多い
画分では検出しうる細胞構造又は血漿膜透過性の変化を
生じなかつた。

第11図 ロイコレギユリン遺伝子のクローニング。このフローチ
ヤート図はロイコレギユリン遺伝子のクローン化で行な
う６つの異なる段階を現わしている。（実施例５参照） 第１表 正常ヒト末梢血白血球による、又はネズミ骨髄腫とハ
イブリダイゼーシヨンした後に形成されたかもしくは培
養中に自然に形質転換したヒトＢセルラインによるロイ
コァレギユリン産生の最適条件を決定した。末梢血白血
球で産生するロイコレギユリンは、培地1ml当たりPHA5
μｇの存在下で48時間培養したときに最大レベルとなつ
た。血清を含まないRPMI−1640培地中で培養すると、連
続ヒトＢセルライン又はヒトＢ−マウス骨髄種のヘテロ
ハイブリドーマは３日間に亘り構成的に（constitutive
ly）ロイコレギユリンを産生した。培地1mlに10μｇの
テトラデカノイルホボールアセテートを添加するとロイ
コレギユリンの産生は３倍になつた。

第２表 リンホトキシンとは異なる独得な抗腫瘍性リンホカイ
ン存在の証拠が、別々の６人からのリンホカイン試料に
おけるリンホトキシン（αL929細胞溶解活性）とヒト腫
瘍細胞増殖抑制活性との相対割合を比較したときに示さ
れた。試料中でネズミ腫瘍細胞細胞溶解活性とヒト腫瘍
細胞増殖抑制活性とは各々独立して変化し、２つの生物
学的活性は各々異なる実体によつて媒介されていること
が示された。PHAで刺激しなつたか又は培養の最後の30
分間にPHAを添加した、３人の個体の白血球からの濃縮
リンホカインは腫瘍細胞を全く溶解せず、増殖阻害活性
はなかつた。しかしながら、同じ白血球をPHAで24時間
刺激すると、顕著な量の溶解及び増殖阻害活性を分泌し
た。このように、抗腫瘍細胞活性は24時間培養した細胞
の倍地栄養の不足PHA、又はバツフアーによるものでは
なかつた。

第３表 リンホトキシンとは異なる新規なリンホカイン（以下
ロイコレギユリンと称する）の存在を更に支持する証拠
は、ノイラミニダーゼ及びプロテアーゼ消化に対するリ
ンホカインの細胞溶解及び腫瘍細胞増殖阻害活性の感受
性を調べることにより得られた。0.2及び0.4単位のノイ
ラミニダーゼでは、リンホカインの腫瘍細胞増殖阻害
（ロイコレギユリン）活性は顕著には抑制されず、αL9
29細胞に対するヒト細胞溶解リンホカイン活性（リンホ
トキシン）が49及び92％減少した。10mMのシアル酸の存
在下でのノイラミニダーゼ消化ではいずれの活性にも影
響がなく、ノイラミニダーゼにプロテアーゼが混在する
ことによるリンホトキシンに対する作用の可能性が除外
された。一方、程度は異なるがリンホトキシン及びロイ
コレギユリン活性は双方ともプロテアーゼで阻害され
た。６単位のプロナーゼでリンホトキシン活性は完全に
破壊されたが、ロイコレギユリン活性はサンプル中に52
％残存した。従つて、プロナーゼ消化により活性イトロ
イコレギユリンサンプルはリンホトキシンを含まない状
態になつた。

シリアンゴールデンハムスターのリンホトキシン試料
もハムスター腫瘍細胞に対するロイコレギユリン型の活
性と抗発癌活性を有していた（24）。ハムスターにおけ
るのと比較してヒト細胞の定量的変換アツセイが利用で
きないので、ヒトリンホカイン試料の抗発癌活性は測定
されたことがない（４）。ヒトリンホトキシン及びロイ
コレギユリンと同様に、ハムスターのリンホトキシン及
びロイコレギユリン活性は、ノイラミニダーゼ及びプロ
テアーゼ消化に対する感受性に基いて分離されるかどう
かを決定しようと試みた。ハムスターの抗発癌活性とロ
イコレギユリンとが同一であり、従つて多分１つであり
ヒトと同じであるかどうかを評価するために、抗発癌活
性がロイコレギユリンと共に精製されるかをも測定し
た。ヒトリンホトキシンと同様に、ハムスターリンホト
キシンはノイラミニダーゼ及びトリプシンで分解され
た。ヒトロイコレギユリンと同様に、発癌物質に暴露し
たハムスター細胞に対する抗発癌活性とハムスター腫瘍
細胞に対する細胞増殖抑制活性とはノイラミニダーゼで
分解されなかつたが、トリプシンでは42％減少し、２つ
の種においてノイラミニダーゼ及びプロテアーゼ消化に
対するロイコレギユリン及びリンホトキシンの感受性が
平行して異なる（分化）ことを示していた。

第４表 HPLC分子サイズ排除クロマトグラフイー及び等点電気
泳動による２段階での分画手順を実施して、ヒトロイコ
レギユリンの抗癌活性が他のいくつかのリンホカイン及
びモノカイン（monokines）から分離できかつ異なるも
のであるかどうかを決定した。以前のデータから予想さ
れたように、リンホトキシン活性は高分子量（45,000〜
74,000）、中間分子量（30,000〜38,000）、及び低分子
量（17,000〜20,000）画分で認められ、電気泳動後には
pH6.0〜6.8の画分に濃縮された。ロイコレギユリンは高
分子量物質中にのみ存在し、等電点がpH4.2〜5.6及び7.
1〜8.4の２つの種に分れた。ロイコレギユリンに富む画
分がリンホトキシン活性をいくらか含有していたとはい
うものの、画分１及び３は170単位より多いリンホトキ
シンを含有していたがロイコレギユリン活性は全くなか
つた。従つて、刺激したヒトPBL由来のリンホトキシン
活性はロイコレギユリンから分離しうる。低分子量画分
はインターロイキン１及びインターロイキン２の全活性
及びインターフエロン活性の大部分を含有していた。ど
の画分でもマクロフアージ活性化活性は検出されなかつ
た。画分は全てエンドトキシンも含有していた。エンド
トキシンの量はロイコレギユリン活性と相関していなか
つた。エンドトキシンがロイコレギユリン活性を媒介し
ないことを示す別の証拠は、リポポリサツカライド血清
型055:B5及び0111.B4を20ng/mlまで添加するK562細胞の
増殖を阻害しなかつたことである。

第５表 ロイコレギユリンに富む画分は少量のインターフエロ
ンを含んでいたので、インターフエロンが腫瘍細胞の増
殖阻害に寄与する度合を測定するためにもう１つ別の実
験を行つた。１つの出所（ML）からのγ−インターフエ
ロンはαL929細胞を溶解せず、ヒトK562腫瘍細胞の増殖
を阻害しなかつた。もう１つの起源（FL）からのγ−イ
ンターフエロンは2000リンホトキシン単位/mlを有して
いたが、ロイコレギユリン活性は持たなかつた。α−イ
ンターフエロンはリンホトキシンもロイコレギユリンも
含有しなかつた。従つて、ロイコレギユリン活性はα又
はγ−インターフエロンによつて媒介されるものではな
く、リンホトキシンとγ−インターフエロンとの相乗作
用の結果でもない。

第６表 未分画リンホカイン試料は、NK−媒介細胞毒性に対す
る腫瘍細胞の感受性を高める活性を含有している。ヒト
リンホカインのHPLC及び等電点電気泳動による逐次分画
の後、ロイコレギユリン及びリホトキシンに対する標的
細胞感作活性の相関々系を検討した。ロイコレギユリン
の多い画分は有意な腫瘍細胞NK−細胞毒性増強活性を有
していた。リンホトキシンの多い画分及びインターフエ
ロンの如き低分子量リンホカインを含有する画分はNK−
媒介細胞毒性に対するK562白血病細胞の感受性を増高し
なかつた。従つて、NK増強活性はロイコレギユリンと共
に精製され又は同一である。

第７表 ヒト腫瘍と正常細胞のパネルをロイコレギユリンに対
する感受性について検討した。消化器癌の群はロイコレ
ギユリンに対して感受性が高いことが判明した。ロイコ
レギユリは正常の結腸粘膜細胞又は皮膚繊維芽細胞のい
ずれの増殖にも影響を与えなかつた。

第８表 ロイコレギユリン細胞表面レセプターに対するモノク
ローナル抗体の結合の定量から、ロイコレギユリンの増
殖阻害作用に対する細胞の相対的感受性が予測される。
この間接的免疫螢光流動（フロー）細胞計測アツセイに
おいて、抗ロイコルギユリンレセプター抗体は15〜23％
のHT−29細胞に有意に結合したが、K562細胞については
２％と10分の１の結合だけだつた。

第９表 ヒト癌に対するロイコレギユリンのインビボ（in viv
o）での強力な効果を測定するために、解離したばかり
の結腸腫瘍細胞を調製し、ロイコレギユリンを含有する
半固形寒天培地で培養した。結腸癌セルラインはロイコ
レギユリンに対して感受性が高いので結腸癌を評価の標
的対象とした。テストした４人の患者からの腫瘍細胞は
全て、種々な程度にではあるが、ロイコレギユリンの用
量依存性で増殖阻害された。１人の患者の細胞は50単位
のロイコレギユリンで98％阻害されたが、もう１人の患
者では4000単位のロイコレギユリンで42％阻害された。
このことは、ロイコレギユリンがヒト結腸癌の増殖を抑
制する能力を持つことを示唆している。

参考文献 1. アガーワル，ビー．ビー（Aggarwal,B.B.），モフ
アツト，ビー（Moffat,B.）及びハーキンズ，アール．
エヌ．（Harkins,R.N.），「ヒトリンホトキシン：リン
パ芽球セルラインによる産生、精製及び最初の特性化
（Human lymphotoxin:production by a lymphoblastoid
cell line,purification and initial characterizati
on）ジエー．バイオール・ケム．（J.Biol.Chem.）259:
686−691,1984。

2. ブルーテイーボイエ，ビー．（Brouty−Boye,
P.）、「細胞増殖に対するインターフエロンの阻害作用
（Inhibitory effects of interferon on cell multipl
ication）」、リンホカインレポーツ（Lymphokine Rep
orts）、１:99−112,1980。

3. ブラウン，アール・エル，（Brown,R.L.）、グリフ
イス，アール．エル．（Griffith,R.L.）、ノイパウワ
ー，アール．エイチ、（Neubauer,R.H.）及びラビン，
エイチ．（Rabin,H.）、「原始Ｔ細胞の細胞サイクルに
対するＴ−細胞成長因子の作用（The effect of T−cel
l growth factor on the cell cycle of primate T cel
ls）」、ジエー．イムノール．（J.Immunol.），129:18
49−1853,1982。

4. デイパロオ，ジエー．エー．（DiPaolo,J.A.）、
「インビトロでのヒト及び動物細胞の形質転換における
相対的難易性（Relative difficulties in transformin
g human and animal cells in vitro）」、ジエー．ナ
トル．キヤンサー インスト．（J.Natl.Cancer Ins
t.），70:3−8,1983。

5. ドルベア，エフ．エー．（Dolbeare,F.A.）及びス
ミス，アール．イー．（Smith R.E.）、「流動細胞酵素
学：単細胞の迅速な酵素分析（Flow cytoenzymology:Ra
pid enzyme analysis of single cells）」、In，エ
ム．アール．メラミツド（M.R.Melamid）、ピー．エ
フ．ムラネイ（P.F.Mullaney）、及びエム．エル．ミン
デルソーン（M.L.Mindelsohn）編、フロー サイトメト
リー アンド ソーテイング（Flow Cytometry and Sor
ting、317〜334頁、ニユーヨーク（New York）、ジヨン
ウイレイ アンド サンズ（John Wiley＆Sons）、19
79。

6. エバンス，シー．エイチ．（Evans,C.H.）及びデイ
パオロ，ジエー．エー．（DiPaolo,J.A.）、「リンホト
キシン：シリアンハムスター細胞の化学的発癌物質又は
紫外線照射による変換の阻害で測定した抗発癌性リンホ
カイン（Lymphotoxin:an anticarcinogenic lymphokine
as measured by inhibition of chemical carcinogen
or ultraviolet−irradiation−induced transformatio
n of Syrian hamster cells）」、イント．ジエー・キ
ヤンサー（Int.J.Cancer）、27：、45〜49、1981。

7. エバンズ，シー．エイチ．（Evans,C.H.）及びハイ
ンバウ，ジエー．エー．（Heinbaugh,J.A.）、「リンホ
トキシン細胞毒性：細胞溶解性及び細胞増殖抑制性細胞
反応の組み合せ（Lymphotoxin cytotoxicity;a combina
tion of cytolytic and cytostatic cellular response
s）」、イムノフアーマコロジー（Immunopharmacolog
y）３:347−359,1981。

８、 エバンス，シー、エイチ．（Evans,C.H.），ハイ
ンバウ，ジエー、エー．（Heinbaugh,J.A.）及びジパロ
オ，ジエー．エー．（DiPaolo,J.A.）、「リンホトキシ
ン抗発癌性活性と腫瘍細胞増殖阻害活性の比較効果（Co
mparative effectiveness of lymphotoxin anticarcino
genic and tumor cell growth inhibitory activitie
s）」、セル・イムノール．（Cell.Immunol.）76:295〜
303、1983。

9. グランガー，ジー．エー．（Granger,G.A.）及びコ
ルブ，ダブリユー．ピー．（Kolb,W.P.）、「インビト
ロのリンパ球細胞毒性：免疫及び非免疫小リンパ球媒介
標的Ｌ細胞破壊の機構（Lymphocyte in vitro cyto−t
oxicity:mechanisms of immune and non−immune small
lymphocyte mediated target L cell destructio
n）」、ジエー・イムノール．（J.Immunol.）101:111〜
116,1968。

10. ハスペル，エム．ブイ．（Haspel,M.V.）ら、サイ
エンス（Science）220:304〜306,1983。

11. フーバー，エイチ．シー．（Hoover,H.C.）ら、キ
ヤンサー リス．（Cancer Res.）、1984年４月。

12. ケルン（Kern）ら、イント．ジエー．キヤンサー
（Int.J.Cancer）、30:725〜729,1982。

13. カーン，エー．（Kahn,A.）ら、ヒユーマンリンホ
カインズ（Human Lymphokines）、621〜629頁、アカデ
ミツクプレス（Academic Press）、ニユーヨーク（New
York）、1982。

14. クライナーマン，イー．エス．（Kleinerman,E.
S.）、シユロワ，エー．ジエー．（Schroit,A.J.）、フ
オグラー，ダヴリユ．イー．（Fogler,W.E.）、及びフ
イドラー，アイ．ジエー．（Fidler,I.J.）、「遊離及
びリポソーム内包ヒトリンホカインによるインビトロで
のイト単球活性の殺腫瘍活性化（Tumoricidal activati
on of human monocyte activity in vitro by free and
liposome encapsulated human lymphokines）」、ジエ
ー．クリン．インベスト．（J.Clin.Invest.），72:304
〜315、1983。

15. レムリ，ヴイ．（Laemmli V.）ネイチヤー（Natur
e），227:680〜6851970。

16. ランビン，ピー（Lambin,P.）及びフアイン，ジエ
ー．エム．（Fine,J.M.）、アナル．バイオケム．（Ana
l.Biochem.），98:160〜168,1979。

17. マクコナヘイ，ピー．ジエー．（McConahey,P.
J.）及びデイクソン，エフ．ジエー．（Dixon,F.J.）、
イント．アーク．アレルギー アプル イムノール．
（Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.）、29:185〜189,19
96。

18. ミゼル，エス．ピー（Mizel,S.B.）、オペンハイ
ム，ジエー．ジエー．（Oppenheim,J.J.）及びローゼン
ストライヒ，デイー・エル．（Rosenstreich,D.L.）、
「マクロフアージセルラインP388D1が産生するリンパ球
活性化因子の特性化（characterization of lymphocyte
−activating facor produced by the macrophage cell
line P388D1）I.活性化リンパ球によるLAF産生の増強
（Enhancemet of LAF production by activated Tlymph
ocytes）、ジエー．イムノール．（J.Immunol.）、120:
1497〜1505,1978。

19. ペーパーマスター，ビー、ダヴリユー．（Paperma
ster,B.W.）ら、「リンホカイン及び胸腺ホルモン（Lym
phokines and Thymin Hormones）、アカデミツクプレス
（Academic Press）、ニユーヨークー（New York）、78
9〜799頁。

20. ペン，アイ．（Penn,I.）、「免疫抑制と癌の発達
（Depressed Immuntiy and the Development of Cance
r」、クリニカルエクスペリメンタル イムノロジー（C
linical Experimental Immunology）、46:459,1981。

21. ブロス，エイチ．エフ．（Pross,H.F.）、バイン
ズ，エム．ジー．（Baines,M.G.）、ルビン，ピー，（R
ubin,P.）、シユラーグ，ピー．（Shragge,P.）、及び
パターソン，エム．エス．（Patterson M.S.）、「腫瘍
標的細胞に対する自然のヒトリンパ球媒介細胞毒性.IX.
ナチユラルキラー細胞活性の定量（Spontaneous human
lymphocyte−mediated cytotoxicity against tumor tr
aget cells.IX.The quantitation of natural killer c
ell activity）」、ジエー．クリン．イムノール．（J.
Clin.Immunol.），１:51〜63,1981。

22. ラビン，エイチ．（Rabin,H.）、ホプキンズ，ア
ール．エフ．（Hopkins,R.F.）、ラセツテイ，エフ．ダ
ブリユ．（Ruscetti,F.W.）、ノイバウワー，アール・
エイチ．（Neubauer,R.H.）、ブラウン，アール・エ
ル．（Brown R.L.）及びカワカミ，テイー．ジー．（Ka
wakami,T.G.）、「原発癌Ｔ細胞の連続ラインからの因
子の自然放出（Spontaneous release of a factor from
a continuous line of primate tumor T cells）」、
ジエー．イムノール．（J.Immunol.）、127:1852〜185
6,1981。

23. ランソン，ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）及び
エバンズ，シー．エイチ．（Evans,C.H.）、「リンホト
キシはナチユラルキラー細胞媒介破壊に対する癌及び前
癌細胞の感受性を増大させる（Lymphotoxin enhances t
he susceptibility of necplastic and preneoplastic
cells to natural killer cell mediated destructio
n）」、イント．ジエー．カンサー（Int.J.Cancer）、2
9:451〜458,1982。

24. ランソン、ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）及び
エバンズ，シー．エイチ．（Evans,C.H.）、「シリアン
ハムスターリンホトキシンの抗発癌活性及び腫瘍細胞増
殖阻害活性の分子的及び生物学的特性化（Molecular an
d biological characterization of Syrian hamster iy
mphotoxin's anticarcinogenic and tumor cell growth
inhibitory activities）」、キヤンサー リス．（Ca
ncer Res.）、43:5222〜5227,1983。

25. ランソン，ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）、エ
バンズ，シー．エイチ．（Evans,C.H.）及びジパロオ，
ジエー．エー．（DiPaolo,J.A.）、「インビボにおけ
る、ジエチルニトロソアミン発癌性のリンホトキシンに
よる予防（lymphotoxin prevention of diethylnitrosa
mine carcinogenesis in vivo）」、ジエー．ナトル．
キヤンサー インスト．（J.Natl.Cancer Inst.）、69:
741〜744,1982。

26. ランソン，ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）、エ
バンズ，ジー．エイチ．（Evans,C.H.）、シヨーンズ，
エー．イー．（Jones,A.E.）、ズーン，アール．エイ．
（Zoon,R.A.）、ジパオロ，ジエー．エイ．（DiPaolo,
J.A.）、「免疫ホルモンリンホトキシンによるテクネチ
ウム99mの発癌能の調整（Control of the carcinogenic
potential of 99m technetium by the immunologic ho
rmone lymphotoxin）」、キヤンサー イムノール．イ
ムノテル．（Cancer Immunol.Immunother.）、15:126〜
130,1983。

27. ランソン，ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）、ピ
ンタス，シー．（Pintus,C.）及びエバンズ，ジエー．
エイチ．（Evans,J.H.）、「腫瘍細胞増殖阻害のリンホ
トキシンによる増幅はナチユラルキラー細胞に特異的で
あり、マクロフアージに特異的ではない（Lymphotoxin
amplification of tumor cell growth inhibition is s
pecific for natural killer cells but not for macro
phages）」、イント．ジエー．キヤンサー（Int.J.Canc
er）、32:93〜97,1983。

28. ランソン，ジエー．エイチ．（Ransom,J.H.）、ラ
ンデル，ジエー．オー、（Rundell,J.O.）、ハインバツ
フ，ジエー．エー．（Heinbaugh,J.A.）、及びエバン
ズ，シー．エイチ．（Evans,C.H.）、「アオガイヘモシ
アニンによるモルモツトリンホトキシンの生物学的及び
物理化学的特性化（Biological and physiocochemical
characterization of keyhole limpet hemocyanin−ind
uced gninea pig lymphotoxin）」、セル．イムノー
ル．（Cell.Immunol.）、67:1〜13,1982。

29. リモールド，エイチ．ジー．（Remold,H.G.）及び
メドニス，エー．デー．（Mednis,A.D.）、「密度及び
ノイラミニダーゼとプロテイナーゼに対する感受性が異
なる２個の遊走阻止因子（Two migration inhibitory f
actors differ in density and susceptibility to neu
raminidase and proteinases）」、ジエー、イムノー
ル．（J.Immunol.）、122:1920〜1925,1978。

30. ローゼンベルグ，エス．エー．（Rosenberg,S.
A.）、ヘンリコン，エム．（Henrichon,M.）、コイネ，
ジエー．エー．（Coyne,J.A.）及びデビツド，ジエー．
エー．（David,J.A.）、「リンパ球の抗原刺激に応答し
て産生されたLTのインビトロの研究（In vitro studie
s of LT produced in response to antigen stimulatio
n of iymphocytes）」、ジエー．イムノール．（J.Immu
nol.）６:1623〜1629,1973。

31. サワダ，ジエー．（Swawada,J.）、シオリ−ナカ
ノ，ケー．（Shiori−Nakano,K.）、オサワ，テイー．
（Osawa,T.）、「種種のセルラインに対する精製モルモ
ツトリンホトキシンの細胞毒性活性（Cytotoxic activi
ty of purified guinea pig lymphotoxin against vari
ous cell lines）」、ジプン．ジエー．エクスプ．メ
ド．（Jpn.J.Exp.Med.）、４:263〜271,1976。

32. トリンキエリ，ジー．（Trinchieri,G.）、ドマル
チ，エム．（DeMarichi,M.）、メイヤー，ダブリユー．
（Mayer,W.）、サビ，エム．（Savi,M.）及びセツペリ
ン，アール．（Cappelline,R.）、「HLAに対する特異的
増強とリンパ球抗体のリンパ溶解性相互作用（Lymphocy
te antiboby lymphocytolytic interaction（LALI）wit
h special emphasis on HLA）、トランスプラント．プ
ロク．（Transplant.Proc.）、５:1631〜1646,1973。

33. トリンキエイ，ジー．（Trinchieri,G.）、及びサ
ントリ，デー．（Santoli,D.）、「腫由来又はウイルス
−形質転換した細胞と一緒にリンパ球を培養することに
より誘導される抗ウイルス活性（Anti−viral activity
induced by culturing lymphoytes with tumor−deriv
ed or virus−transformed cells）」、ジエー．エクス
プ．メド．（J.Exp.Med.）、147:1314〜1333,1978。

34. ウイリアムソン，ビー．デイー．（Williamson,B.
D.）、カースウエル，イー．エー．（Carswell,E.
A.）、ルビン．ビー．ワイ．（Rubin,B.Y.）、プレンダ
ーガスト，ジエー．エス．（Prendergast,J.S.）、及び
オールド，エル．ジエー．（Old,L.J.）、「ヒトＢ−セ
ルラインが産生するヒト腫瘍壊死因子：ヒトインターフ
エロンとの細胞毒性の相乗的相互作動（Human tumor ne
crosis factor produced by human B−cell lines:syne
rgistic cytotoxic interaction with human interfero
n）、プロク・ナトル．アガド．サイ．（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）、80:5397〜5401,1983。

本発明の範囲は以下の請求の範囲で定義されており、
その均等物，変形，及び改良，修正及び変異も全て含む
ことを意図しているので、上述の実施態様は本発明を説
明するためのものであり、限定を意図するものではな
い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハスペル，マーテイン・ヴイ アメリカ合衆国、メアリーランド・ 20902、シルヴアー・スプリング、ケン プ・ミル・ロード・11804 (72)発明者 ポマト，ニコラス アメリカ合衆国、メアリーランド・ 21701、フレデリツク、ミルストリー ム・ドライヴ・1809

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】単離され濃縮されたリンホカインすなわち
   ヒトロイコレギュリンであって、ヒトHT−29およびRPMI
   2650腫瘍細胞を直接溶解し且つマウスαL929細胞を溶解
   せず、K562ヒト腫瘍細胞の増殖を抑制し、NK細胞媒介溶
   解に対するK562腫瘍細胞の感受性を高め、K562腫瘍細胞
   表面の構造および透過性を変え、リンホトキシン腫瘍壊
   死因子、インターフェロンまたはサイトリシンに対する
   抗血清によって中和されず、従来の勾配ポリアクリルア
   ミドゲル電気泳動により決定される分子量が約120,000
   〜140,000、分子サイズ排除クロマトグラフィーによる
   分子量が50,000〜70,000であり、4.8〜5.5または7.5〜
   8.3のpH範囲の等電点電気泳動点を有することを特徴と
   する前記ヒトロイコレギュリン。
2. 【請求項２】プロテアーゼで部分的に消化されるがノイ
   ラミニダーゼでは消化されず、約30,000〜35,000の分子
   量のサブユニットに解離する請求の範囲１に記載のヒト
   ロイコレギュリン。
3. 【請求項３】ヒトHT−29およびRPMI2650腫瘍細胞を直接
   溶解し且つマウスαL929細胞を溶解せず、K562ヒト腫瘍
   細胞の増殖を抑制し、NK細胞媒介溶解に対するK562腫瘍
   細胞の感受性を高め、K562腫瘍細胞表面の構造および透
   過性を変え、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、インター
   フェロンまたはサイトリシンに対する抗血清によって中
   和されず、従来の勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   により決定される分子量が約120,000〜140,000、分子サ
   イズ排除クロマトグラフィーによる分子量が50,000〜7
   0,000であり、4.8〜5.5または7.5〜8.3のpH範囲の等電
   点電気泳動点を有するリンホカインすなわちヒトロイコ
   レギュリンを、リンホカイン含有混合物から得る方法で
   あって、 分子サイズおよび分子の電荷の両者によって前記蛋白質
   を分離することからなる方法において、分子量約120,00
   0〜140,000を有する前記蛋白質をゲル瀘過またはポリア
   クリルアミドゲル電気泳動によって前記混合物中の他の
   蛋白質から分離し、pH4.8と5.5の間または7.5と8.3の間
   で等電点電気泳動する方法と0.07と0.12Mの間のNaCl塩
   濃度で溶出するアニオン交換クロマトグラフィーとから
   選択した少なくとも１つの方法で電荷によって蛋白質を
   分離し、サイズおよび電荷での分離ステップはどんな順
   序で行なってもよい、ことを特徴とする前記方法。
4. 【請求項４】リンホカイン含有混合物が、、ロイコレギ
   ュリンの産生を刺激するためにフィトヘマグルチニンに
   暴露したヒト末梢血単核細胞の培養物からの濃縮培地で
   ある請求の範囲３記載の方法。
5. 【請求項５】ヒトHT−29およびRPMI2650腫瘍細胞を直接
   溶解し且つマウスαL929細胞を溶解せず、K562ヒト腫瘍
   細胞の増殖を抑制し、NK細胞媒介溶解に対するK562腫瘍
   細胞の感受性を高め、K562腫瘍細胞表面の構造および透
   過性を変え、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、インター
   フェロンまたはサイトリシンに対する抗血清によって中
   和されず、従来の勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   により決定される分子量が約120,000〜140,000、分子サ
   イズ排除クロマトグラフィーによる分子量が50,000〜7
   0,000であり、4.8〜5.5または7.5〜8.3のpH範囲の等電
   点電気泳動点を有するヒトロイコレギュリンの有効量を
   含んでなる抗腫瘍活性を有する組成物。
6. 【請求項６】腫瘍細胞増殖阻害能、癌、白血病および肉
   腫からなる群から選択される腫瘍細胞を直接溶解する能
   力、NK細胞毒性に対する細胞の感受性を高める能力、腫
   瘍細胞表面の構造および透過生を変化させる能力、並び
   に正常細胞の発癌生変換を阻害する能力からなる群から
   選択される少なくとも１つの機能特性を有することを特
   徴とする請求の範囲５に記載の組成物。
7. 【請求項７】希釈剤またはキャリヤーを含む請求の範囲
   ５に記載の組成物。
8. 【請求項８】補足的または相補的機能を有する１つ以上
   の成分を更に含んでいる請求の範囲６に記載の組成物。
9. 【請求項９】ロイコレギュリンがリン脂質小胞中にカプ
   セル化されている請求の範囲５に記載の組成物。
10. 【請求項１０】リン脂質小胞がモノクローナル抗体と結
    合している請求の範囲９に記載の組成物。