FI85867B - Foerfarande foer framstaellning av ett preparat berikat med en lymfokin kallad leukoregulin. - Google Patents

Description

1 85867

Menetelmä leukoreguliiniksi kutsutulla lymfokiinilla rikastetun valmisteen tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen uuden lym-5 fokiinin valmistamiseksi, jolla on kyky suoraan hajottaa ihmisen kasvainsoluja ja vähentää niiden lisääntymistä sekä lisätä niiden herkkyyttä luontaisten tappajalymfo-syyttien välittämälle hajoamiselle. Näitä kasvainten vastaisia vaikutuksia on aiemmin pidetty lymfotoksiinin ai-10 kaansaamina. Olemn.e kuitenkin havainneet, että ihmislymfo-kiinivalmisteet, joilla on nämä kasvainsolujen vastaiset vaikutukset, ovat biokemiallisesti erotettavissa lymfotok-siinista ja muista aiemmin eristetyistä lymfokiineistä interferoni, interleukiinit 1 ja 2 ja makrofageja aktivoi-15 va tekijä mukaan luettuina.

Piirrosten lvhvt kuvaus

Kuvat valaisevat leukoreguliinin identifioimista ainutlaatuiseksi ja aiemmin tuntemattomaksi lymfokiiniksi ja osoittavat sen tehon ihmisen kasvainsolujen kasvun hi-20 dastamisessa.

Keksinnön tausta

Lymfokiineillä, immuunijärjestelmän hormoneilla, on kyky vaikuttaa syövän kehittymiseen, hidastaa kasvainsolu-jen kasvua ja jopa tuhota kasvaimia. Nämä hormonit ovat 25 glykoproteiineja, niitä tuottavat ja erittävät tietyn tyyppiset imusolut, ja niiden tarkoituksena on vuorovaikutus muiden, spesifisten solujen kanssa. Tiettyjen lymfo-kiinien tiedetään olevan useamman kuin yhden solutyypin tuottamia ja olevan vuorovaikutuksessa useamman kuin yhden 30 solutyypin kanssa. Niinpä useimpien lymfokiinien vaikutus ten tiedetään olevan monipuolisia; tietyllä lymfokiinillä on estäviä, stimuloivia, edistäviä, vastustavia ja muita vaikutuksia erilaisten kohdesolujen ja tilojen suhteen. Lisäksi tietty lymfokiini saattaa sekä estää että edistää 35 syövän syntyä erilaisissa olosuhteissa. Esimerkiksi inter- 2 85867 feronin tiedetään estävän virusten aiheuttamaa syövän syntyä mutta edistävän säteilysyövän syntyä. Samoin on interferonilla toistensa vastaiset vaikutukset, NK-solujen aikaansaaman kasvainsolujen hajoamisen lisääminen ja samalla 5 kasvainsolujen kestävyyden lisääminen NK-solujen vaikutuk sia vastaan; ensin mainittu vaikutus ilmenee nopeammin interferonin vaikutukselle alttiiksi joutumisen jälkeen kuin jälkimmäinen.

Lymfotoksiini on vuonna 1968 käyttöön otettu termi, 10 jolla tarkoitetaan antigeenin tai mitogeenin stimuloimien lymfosyyttien, jotka ovat välittäjinä hiiren L-solujen sy-tolyyttisessa tuhoamisessa, liukenevaa tuotetta (9). Useat laboratoriot ovat myöhemmin osoittaneet, että lymfotoksiinpa sisältävillä lymfokiinivalmisteilla on suoria syto-15 lyyttisiä ja sytostaattisia vaikutuksia erilaisiin kas-vainsoluihin (7, 30, 31), antikarsinogeeninen vaikutus soluihin, joissa tapahtuu kasvainsoluiksi muuttumista (6, 25, 26), ja kyky lisätä esikasvain- ja kasvainsolujen herkkyyttä NK-välitteiselle tuhoutumiselle (23, 27).

20 Hamsterin lymfotoksiinivalmisteissa oleva syövän- vastainen lymfokiini, joka on erilainen kuin se, joka välittää hiiren L-solujen sytolyyttisen tuhoutumisen, identifioitiin myöhemmin molekyylin varauksen perusteella (24). Tämä molekyyli, jonka molekyylipaino on 50 000 ja 25 isoelektrinen pH 5,0, oli sytostaattinen hamsterin kas-vainsoluille, ei estänyt hamsterin sikiön normaalien fib-roblastien kasvua ja esti hamsterin sikiösolujen kemiallisesti ja säteilyllä indusoidun muuttumisen kasvainsoluiksi sekä in vitro että in vivo. Tämä ainutlaatuinen syövän-30 vastainen lymfokiini myös identifioitiin eri aineeksi kuin interferoni, interleukiinit 1 ja 2 ja makrofagien migraatiota estävä tekijä. Tämä havainto johti lopulta uuteen tutkimussuuntaan, jossa tutkittiin ihmislymfotoksiinival-misteita sen toteamiseksi, sisältävätkö ihmislymfotoksii-35 nivalmisteet ihmislymfokiinejä, joilla on ainutlaatuiset 3 85867 antikarsinogeeniset ja kasvainten vastaiset ominaisuudet.

Yhteenveto keksinnöstä Tämän keksinnön päämääränä oli karakterisoida ja puhdistaa biokemiallisesti ja biologisesti löytämämme ih-5 mislymfokiini, jolla on kasvainten vastaiset ominaisuudet kasvainsolujen suora hajotus, niiden lisääntymisen estäminen ja niiden herkkyyden luontaisten tappajalymfosyyttien välittämälle hajoamiselle lisääminen samoin kuin normaali-solujen karsinogeenisen muuttumisen estäminen. Tämä pää-10 määrä saavutettiin identifioimalla ja eristämällä leukore-guliini, lymfokiini, jonka molekyylipaino on noin 120 000 - 140 000, joka hajoaa alayksiköiksi, joiden molekyylipaino on noin 30 000 - 35 000, ja joka puhdistetaan iso-elektrisellä fokusoinnilla pH-alueella noin 4,8 - 5,5 tai 15 noin 7,5 - 8,3.

Toisena tavoitteena oli leukoreguliinin solulähtei-den identifioiminen ja menettelytapojen kehittäminen sen tuotannon stimuloimiseksi. Havaitsimme, että perifeerisiä veren leukosyyttejä, jotka ovat leukoreguliinilähde, voi-20 tiin stimuloida leukoreguliinin tuotannon edistämiseksi käsittelemällä niitä fytohemagglutiniinilla riittävän kauan vaikutuksen aikaansaamiseksi. Optimaalinen käsittelyaika oli 48 tuntia; pidemmätkin ja lyhemmätkin ajanjaksot saivat aikaan vaikutuksen, vaikkakin pienemmässä mää-25 rin. Myös muiden indusoijien, esimerkiksi tetradekanoyyli-forboliasetaatin, konkanavaliini A:n ja muiden kasvilek-tiinien, jotka ovat mitogeenisia, havaittiin edistävän leukoreguliinituotantoa. Lisäksi joissakin tapauksissa valmistettiin tehokkaita leukoreguliinia tuottavia soluja 30 transformoimalla lymfosyyttejä ja muodostamalla hybridoma-soluja. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.

Lisätavoitteena oli saada aikaan nopea koe solujen leukoreguliiniherkkyyden tutkimiseksi, mihin tarkoitukseen 35 päästiin valmistamalla hybridomia tai transformoituja leu- 4 85867 kosyyttejä, jotka tuottavat solupinnan leukoreguliinire-septoreille spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, ja mittaamalla kvantitatiivisesti näiden vasta-aineiden sitoutuminen tutkittavaan kohdesoluun.

5 Tämän keksinnön muut tavoitteet ja tunnusmerkit esitetään seuraavassa selostuksessa.

Piirrosten lvhvt kuvaus

Liitteenä olevat kuvat 1-11 valaisevat leukoregu-liinin muihin lymfokiineihin nähden erilaisia ominaispiir-10 teitä ja vaikutuksia.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Olemme havainneet, että ihmislymfokiinivalmisteet sisältävät ainutlaatuista lymfokiinia, jolla on kyky suoralla hajotuksella estää ihmisen kasvainsolujen kasvua, 15 kyky estää solujen proliferaatiota ja kyky lisätä kasvain-solujen herkkyyttä luontaisten tappajasolujen (NK-solujen) kautta tapahtuvalle tuhoutumiselle. Olemme alkaneet käyttää tästä lymfokiinistä nimitystä leukoreguliini, koska se on leukosyyttien tuote ja solujen kasvua säätelevä aine, 20 joka on molekulaarisesti ja biologisesti eri aine kuin lymfotoksiini, interferoni, interleukiinit 1 ja 2 ja mak-rofageja aktivoiva tekijä.

Leukoreguliinin molekyylipaino on noin 120 000 -140 000 määritettynä polyakryyliamidigeeligradienttielek-25 troforeesilla ja geelisuodatuskromatografiällä, ja sen hajoamisessa muodostuvien alayksiköiden molekyylipaino on noin 30 000 - 35 000. Se voidaan puhdistaa tekemällä iso-elektrinen fokusointi pH-arvoilla noin 5,0 ja 7,5. Mole-kyylipainon perusteella ja isoelektrisen fokusoinnin avul-30 la fraktioitu leukoreguliini saadaan vapaana havaittavista määristä lymfotoksiinia, interferonia, interleukiineja 1 ja 2 ja makrofageja aktivoivaa tekijää.

Erityisesti paneuduttiin sen varmistamiseen, että tunnusmerkit, joita me pidämme leukoreguliinille ominaisi-35 na, ovat erilaisia kuin lymfotoksiinin vastaavat ominai- 5 85867 suudet. Todisteiden, jotka osoittavat leukoreguliinin eri aineeksi kuin lymfotoksiini, pääpiirteet ovat seuraavat: (1) lymfotoksiini, joka on saatu ihmisen perifeerisistä veren leukosyyteistä, ja hyvin puhdas lymfotoksiini, 5 joka on saatu RPMI 1788-ihmisen lymfoblastoidisoluista, hajottaa helposti hiiren alfa-L929-kasvainsoluja, mutta sillä ei ole havaittavissa olevaa ihmisen kasvainsolujen vastaista vaikutusta; (2) leukoreguliinin aktiivisuus aleni proteaasi-10 mutta ei neuramidaasipilkkomisen jälkeen, kun taas lymfo- toksiinin aktiivisuus aleni sekä proteaasi- että neurami-daasikäsittelyn jälkeen; (3) leukoreguliini oli erotettavissa lymf©toksiinista isoelektrisen fokusoinnin avulla lajiksi, joka sai 15 aikaan ihmisen kasvainsolujen hajoamisen, niiden kasvun estymisen ja niiden herkistymisen luontaisten tappajasolujen toimesta tapahtuvalle sytolyysille, mutta ei hajottanut hiiren L-soluja (lymfotoksiinin vaikutus). Siten erilaiset leukoreguliini-/lymfotoksiinipitoisuudet PBL-lymfo-20 kiinivalmisteissa, neuramidaasi- ja proteaasiherkkyydet sekä erilaiset isoelektriset pisteet osoittivat lopullisesti, että leukoreguliini on eri aine kuin lymfotoksiini.

Leukoreguliini on myös eri aine kuin interferoni, toinen immunologinen hormoni, jolla on kyky estää solujen 25 proliferaatiota. Interferonin on osoitettu estävän joidenkin normaali- ja kasvainsolujen kasvua (2, 18). Alfa-ja gamma-interferoni eivät kuitenkaan vaikuttaneet yhdenkään tässä kuvatun leukoreguliiniherkän kasvainsolutyypin proliferaatioon. Vaikka jotkut ihmislymfokiinivalmisteet 30 sisältävät sekä leukoreguliinia että interferonia, voidaan nämä kaksi hormonia erottaa molekyyliseulojen avulla. Interferonin suhteen rikastuneilla fraktioilla ei lisäksi ole leukoreguliiniaktiivisuutta.

Kasvainsolu jen proliferaation estämisen lisäksi on 35 leukoreguliinin suhteen rikastuneiden fraktioiden osoitet- 6 85367 tu myös lisäävän kasvainsolujen herkkyyttä NK-välitteisel-le sytotoksisuudelle. Tämä vaikutus on päinvastainen kuin interferonilla (33), ja se on yksinomaan leukoreguliinil-la. NK-välitteisen sytotoksisuuden eristämisen otaksutaan 5 olevan tärkeä keino, jolla leukoreguliini säätelee kasvainten kasvua in vivo (27).

Tärkeä puoli leukoreguliinin vaikutusmekanismissa on leukoreguliinin kyky muuttaa kasvainsolujen pintakalvon rakennetta ja läpäisevyyttä. Virtaussytometristä analyysiä 10 käytettiin näiden muutosten mittaamiseksi muutamien minuuttien kuluessa kohdesolujen saattamisesta alttiiksi leukoreguliinin vaikutukselle. Tämä menetelmä antaa suuret mahdollisuudet tutkimuksille, joissa vaaditaan lyhyitä koeaikoja, kuten leukoreguliinin tai leukoreguliiniresep-15 torin monoklonaalisten vasta-aineiden detektoinnille.

Leukoreguliinin ja tuumorinekroositekijän, toisen kasvainsoluja estävän lymfokiinin, välistä sukulaisuutta tutkittiin myös. Ihmistuumorinekroositekijävalmisteet indusoivat joidenkin hiiren sarkoomien hemorragisen nekroo-20 sin in vivo. ja niillä on sama vaikutus in vivo kuin lym-fotoksiinilla (34). Koska puhdistetulla leukoreguliinilla ei ole samaa biologista vaikutusta kuin lymfotoksiinilla, on leukoreguliini eri aine kuin tuumorinekroositekijä.

Hamsterilymfokiinivalmisteet sisältävät lymfotok-25 siinia, leukoreguliiniaktiivisuutta (hamsterin kasvain- solujen, muttei normaalisolujen, kasvun estäminen) ja an-tikarsinogeenista aktiivisuutta. Leukoreguliiniaktiivisuus ja antikarsinogeeninen aktiivisuus puhdistuvat yhdessä; näillä kahdella aktiivisuudella on kuitenkin kaksi eri-30 laista isoelektristä pH-arvoa, joista toinen on eri kuin hamsterin lymfotoksiinilla ja toinen identtinen hamsterin lymfotoksiinin kanssa (24). Neuramidaasi hajottaa hamsterin lymfotoksiinia, kun taas leukoreguliini- ja antikarsi-nogeeniseen aktiivisuuteen sillä ei ole vaikutusta. Hams-35 terin leukoreguliini- ja antikarsinogeeninen aktiivisuus li 7 85867 ovat kuitenkin samalla tavalla alttiita proteaasipilkkou-tumiselle. Tästä seikasta yhdistettynä muihin biokemiallisiin tietoihin päättelemme, että myös hamsterin leukore-guliinilla on aktiivisuus. Koska ihmisen leukoreguliinil-5 la on osoitettu olevan samat biologiset ja biokemialliset ominaispiirteet kuin hamsterin leukoreguliinilla, pitäisi myös sen olla antikarsinogeeninen.

Kun saadaan viranomaisten lupa kliinisiin kokeisiin, joissa kokeillaan leukoreguliinin käyttöä ihmisen 10 syövän hoidossa, tehdään ensimmäisen vaiheen kliinisiä kokeita potilailla, joilla on pitkälle edenneitä kasvain-sairauksia. Potilaille annetaan leukoreguliinia seuraavas-sa kuvattavalla tavalla. Annoksia suurennetaan, jotta saataisiin määritetyksi suurin siedettävissä oleva annos kus-15 sakin terapiamuodossa tarkkailemalla toksisia reaktioita, joista ovat osoituksena ruuansulatuskanavan häiriöt, anemia, leukopenia, kuume tai muu osoitus elinten vaurioitumisesta tai toimintahäiriöstä. Otaksutaan leukoreguliinin olevan erittäin hyvin siedettyä, mikä tekee mahdolliseksi 20 korkeiden annosten antamisen. Hoitokokeilut, joissa käytettiin osittain puhdistettuja PHA-stimuloitujen perifeerisen veren lymfosyyttien supernatantteja, jotka epäilemättä sisälsivät leukoreguliinia, ovat viitanneet tällaisten materiaalien hyvin pieneen toksisuuteen (13).

25 Toisen vaiheen kliiniset kokeet kohdistuvat leuko reguliinin tutkimiseen potilailla, joilla on rajoittunut sairaus ja joilla terapian edut ovat ilmeisimpiä. Alkukokeissa käytetään leukoreguliinia apuaineena päähoitona olevalle kirurgiselle, kemo- tai radioterapialle, myöhem-30 missä kokeissa voidaan tutkia leukoreguliinia päähoitomuo-tona.

Leukoreguliinia annetaan systeemisesti laskimon-tai imukudoksensicäisesti, paikallisesti kasvaimensisäisi-nä ruiskeina tai vatsakalvohuuhteluna, tai ex vivo-hoito-35 na. Esimerkkinä viimeksi mainitusta on hoito, jossa poti- β 85367 laasta poistetaan luuydinsoluja, käsitellään ne leukore-guliinilla kasvainsolujen poistamiseksi ja käytetään niitä täydentämään potilaiden luuydintä, sen jälkeen kun heidän luuytimeensä on annettu hyvin suuria annoksia kemo- tai 5 radioterapiaa.

Leukoreguliinia annetaan jatkuvana infuusiona tai yksittäisinä ruiskeina sen mukaan, mitä vaaditaan tarpeellisten leukoreguliinitasojen ylläpitämiseksi verenkierrossa ja kudoksissa.

10 Vaihtoehtona suoralle antamiselle, olisi leukore guliinia koodaavien geenien kloonaaminen ihmisen imusolui-hin, joista on tehty lisääntymiskyvyttömiä, eräs lähestymistapa pysyvän in yivo-leukoreguliinipitoisuuden ylläpitämiseksi in vivo tapahtuvan tuotannon kautta. Solujen, 15 joilla on rajoitettu elinikä in vivo, käyttö takaisi sen, että leukoreguliinitasot olisivat säädeltävissä suhteellisen lyhyissä ajanjaksoissa.

Muihin vaihtoehtoisin annon ohjaamiseksi kuuluvat leukoreguliinia koodaavien geenien sijoittaminen viruksen 20 genomiin ja viruksen käyttäminen geenien viemiseen spesifiseen soluryhmään, jota tekevät geenien translaation leu-koreguliiniksi, jolloin vältetään normaalit säätävät tuotteet, jotka muuten rajoittaisivat leukoreguliinituotan-toa. Esimerkiksi Epstein-Barr-virus, joka infektoi vain 25 B-lymfosyyttejä ja saa tavallisesti aikaan rajoitetun, melko lievän infektion, voisi toimia sopivana virusvekto-rina leukoreguliinigeeneille, jos viruksen genomia muutetaan siten, että estetään virusinfektion aiheuttama taudin eteneminen.

30 Kiinteitä kasvaimia hoidetaan tehokkaimmin maksi moimalla leukoreguliinipitoisuus kasvaimen välittömässä läheisyydessä sen sijaan, että yritettäisiin pitää yllä hyvin korkea taso koko elimistössä. Ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat kvalitatiivisesti tai kvanti-35 tatiivisesti spesifisiä kasvainsolu jen pinta-antigeeneil- i.

9 85867 le, tarjoavat sopivan "koukun", johon leukoreguliini voidaan liittää kasvaimensisäisten suurten pitoisuuksien takaamiseksi. Toinen lähestymistapa on sulkea leukoreguliini liposomien sisään, joiden pinnoilla voi olla kasvainspesi-5 fisiä monoklonaalisia vasta-aineita. Liposomitriglyseri- dien asianmukaisella valinnalla saadaan liposomeja, jotka ovat resistenttejä verenkierrossa olevalle amylaasientsyy-mille ja joilla on kyky fuusioitua kasvainsolukalvoihin liposomien leukoreguliinisisällön kuljettamiseksi solun 10 sisään. Lipofiilisiä kantaja-aineita (dimetyylisulfoksi dia, boorihappojohdoksia) voidaan sisällyttää liposomiin sen sisällön kuljetuksen parantamiseksi liposomin membraa-nilipidin ja kohteena olevan kasvainsolun vastaavien aineiden parantuneen fuusioitumisen kautta.

15 Leukoreguliini näyttää suurentavan kemoterapeuttis- ten aineiden kasvaintenvastaisia vaikutuksia (19) lisäämättä niiden toksisia sivuvaikutuksia, jolloin saadaan aikaan paljon korkeampi tehokas annostaso. Leukoreguliinia käytetään siksi hoito-ohjelmissa erilaisten kemoterapeut-20 tisten aineiden ja radioterapian kanssa tämän kasvainten-vastaisuutta edistävän vaikutuksen arvioimiseksi.

Leukoreguliinin antikarsinogeeniset vaikutukset ovat yhtä tärkeitä kuin sen kasvaintenvastainen vaikutus, kun sitä käytetään yhdessä sytotoksisten terapeuttisten 25 aineiden tai radioterapiamenettelyjen kanssa. Erityisen salakavala tapahtumasarja, joka liittyy säteilytykseen ja kemoterapiaan, on uusien, hoidettavaan sairauteen liittymättömien kasvainten ilmaantuminen. Annettaessa samanaikaisesti leukoreguliinia, voidaan käyttää paljon suurempia 30 annoksia kemoterapiassa tai radiohoidossa, koska leukore guliini estää näiden aineiden tai tekijöiden karsinogeeniset vaikutukset. Leukoreguliini on samalla tavalla hyödyllinen käytettynä yhdessä immuunisuppressiivisten lääkkeiden kanssa hoidettaessa autoimmuunisairauspotilaita ja 35 siirrännäisten vastaanottajia.

10 85867

Leukoreguliini on päätekomponentti sytokiini-lymfo-kiiniketjussa, joka sisältää lymfosyyttien ja monosyyt-tien käyttöönoton ja immobilisoinnin, niiden aktivoitumisen tai erilaistumisen ilmentämään erilaisia efektori-5 funktioita ja tekijöiden, kuten leukoreguliinin, jotka toimivat sytotoksisesti, tuotannon. Erilaisten lymfokii-nien käytettynä seoksena tai, todennäköisemmin, annettuna sopivassa järjestyksessä pitäisi edistää kasvaimen lymfoi-disoluinfiltraatiota (makrofagien migraatiota estävä teki-10 jä, interleukiini 1), stimuloida niiden sytotoksista toimintaa (makrofageja aktivoiva tekijä, interleukiinit 1 ja 2, leukoreguliini ja interferoni), hyökätä suoraan kas-vainsoluja vastaan (leukoreguliini, NK-sytotoksinen tekijä ja interferoni) ja muuttaa kohteena olevat kasvainsolut 15 herkemmiksi sytotoksisille efektorisoluille (leukoreguliini). Tässä hoitomuodossa leukoreguliinilla on hyvin tärkeä osa.

Kasvainsolujen kasvua hillitsevien ja NK-soluvälit-teistä sytotoksisuutta edistävien vaikutusten lisäksi, 20 jotka yhdessä pysäyttävät kasvainten kasvun ja alkavat pienentää kasvainmassoja, on leukoreguliinilla myös anti-karsinogeenisia ominaisuuksia, jotka ovat erityisen hyödyllisiä käytettäviksi yhdessä materiaalien kanssa, joita käytetään biolääketieteellisissä diagnostisissa tutkimuk-25 sissa ja säteily- tai kemoterapiassa, jotka itse voivat indusoida syövän synnyn (26). Leukoreguliinihoito proseduurien, joilla on on on näitä mahdollisia sivuvaikutuksia, aikana estää karsinogeneesin kokeiden tai hoidon aikana (20).

30 Samalla tavalla voidaan potilaista arvioida immuu- nisuppressiotaso ja mahdollinen pahanlaatuisten kasvaimien muodostusriski mittaamalla potilaiden PBL-leukoreguliini-tuotanto stimuloinnin jälkeen.

Liitteenä leukoreguliinihoidolle potilaan syöpä-35 solujen leukoreguliiniherkkyyden määrittäminen antaisi 11 85867 ennusteen leukoreguliinihoidon tehosta. Potilaan kasvain-solujen viljeleminen leukoreguliinia sisältävän, puoli-kiinteän alustan läsnäollessa on keino määrittää se leuko-reguliinimäärä, joka tarvitaan kasvainsolujen kasvun täy-5 delliseen estämiseen. Nopeampi koe on sellainen, jossa määritetään kasvainsolujen reagoivuus mittaamalla kvantitatiivisesti kasvainsolun pinnalla olevien solupinnan leu-koreguliinireseptorien määrä. Tämä tehdään mittaamalla kasvainsoluihin sitoutuvan leukoreguliinireseptoriin suun-10 tautuvan monoklonaalisen vasta-aineen määrä käyttämällä entsyymiin liitetty immuunisorbentti-koetta, radioimmuuni-koetta tai immuunifluoresenssikoetta.

Esimerkki 1

Seuraavassa selostuksessa käytettävät lyhenteet 15 ovat: PBS, 0,14 mol/1 NaClsa, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,4; PEG, polyetyleeniglykoli, molekyylipaino 4000; FBS naudan sikiöseerumi; IEF. isoelektrinen fokusointi; HPLC, korkean erotuskyvyn nestekromatografia; NK, luontainen tappajalymfosyytti; dThd, tymidiini; MTT. 3-(4,5-dimetyy-20 litiatsolyyli-2 )-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi; FDA.

fluoreseiinidiasetaatti; VCN, Vibrio cholera-neuramidaasi; PHA. fytohemagglutiniini; PBL, perifeerinen veren leukosyytti; TPA, tetradekanoyyliforboliasetaatti; ELISA, entsyymiin kytketty immuunisorbentti-koe; RIA. radioimmuuni-25 koe.

Lvmfokiinin valmistus 10 - 20 ml sentrifugoidun, normaalin ihmisluovutta-jan veren vaalean pintakerroksen leukosyyttejä laitettiin lymfosyyttien erotusväliaineeseen (10 ml, LSM, Litton Bio-30 netics, Kensington, Maryland) ja sentrifugoitiin kiihty vyydellä 700 x g 20 min huoneen lämpötilassa. Yksitumaiset solut kerättiin LSM:n ja plasman rajapinnalta, pestiin kahdesti RPMI 1640-alustalla ja laskettiin mikroskooppi-sesti trypaanisinisen (0,04 %) läsnäollessa elävien solu-35 jen osuuden määrittämiseksi, joka oli aina yli 95 %.

i2 85867 20 miljoonaa solua siirrostettiin 20 ml saan RPMI 1640:a, joka sisälsi 10 μς PHAsta/ml (PHA, tyypin IV leukoaggluti-niini, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), 100 mm:n muovisessa kudosviljelymaljassa ja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5 % C02:a ja 96 % ilmaa.

24, 48 tai 72 tunnin kuluttua erittyneitä lymfo-kiinejä sisältävälymfosyyttiviljelyalusta kerättiin, ja sitä sentrifugoitiin 10 min kiihtyvyydellä 1000 x g solu-10 jen poistamiseksi. Lymfokiinialusta konsentroitiin 40- kertaisesti YMlO-kalvolla Amicon-kennossa (Amicon, Inc., Danvers, MA) ja dialyysisuodatettiin 0,1 % PEGstä sisältävää PBStää vastaan. Konsentroitu lymfokiini steriloitiin suodattamalla, jaettiin yhtä suuriksi annoksiksi, pakas-15 tettiin -30 °Csssa ja käytettiin 1 kksn kuluessa pakastamisesta (katso taulukko 1).

Lymfoblastoidisolulinjan RPMI 1788 tuottamaa hyvin puhdasta ihmislymfotoksiinia (1) luovutti jalomielisesti tri Bharat B. Aggarwal (Genentech, Inc., San Francisco, 20 CA) . 1788-solulinjän lymfotoksiini puhdistettiin tekemällä peräkkäin DEAE-selluloosakromatografia, preparatiivinen isoelektrinen fokusointi, virvilälektiini-Sepharose-kroma-tografia ja preparatiivinen polyakryyliamidigeelielektro-foreesi (1). Puhdistetun lymfotoksiinin molekyylipaino oli 25 20 000, isoelektrinen piste 5,8 ja ominaisaktiivisuus 4 x 107 yksikköä/mg proteiinia.

Syyriankultahamsterin lymfokiinia tuotettiin vatsa-kalvon leukosyyteistä samalla tavalla kuin edellä kuvattua ihmisen lymfokiiniä (24).

30 Kohdesolut

Ihmisen erytroleukemiasoluja K562 luovutti tri Julien Djeu (Bureau of Biologies, Food and Drug Administra-. . tion, Bethesda, MD). OST-solut, joita pidettiin yllä vil- ’·jelmässä laboratoriossamme, olivat peräisin juuri pois-35 tetusta ihmisen osteosarkoomasta, jonka ystävällisesti li i3 85867 lahjoitti tri Elizabeth Grimm (NTH Clinical Center, Bethesda, MD). Ihmisen ihon normaalit fibroblastit, CRL 1457 (20-vuotias nainen), CRL 1505 (21-vuotias mies), CRL 1537 (14-vuotias mies), normaalit paksusuolen limakal-5 von solut ja kaikki muut ihmisen kasvainsolulinjät saatiin the American Type Culture Collectionista (Rockville, MD).

Kaikkia soluja pidettiin yllä MEM-alustassa (Eagles minimal essential medium), jota oli täydennetty 10 %:lla FBSsä, ja jatkoviljeltiin kerran viikossa samaan alustaan, 10 poikkeuksena K562-solut, jotka pidettiin yllä 10 % FBSsä sisältävässä RPMI 1640sssä. Hiiren alfa-L929-solut lahjoitti tri Gale Granger (USC, Irvine, CA), ja niitä käytetään lymfotoksiinin kohteena (7). 7997-solut ovat syyrian-kultahamsterin bentso(aJpyreeni-indusoitu kasvainsolulin-15 ja (8).

Lvmfotoksiinimääritvs

Lymfotoksiiniaktiivisuus mitattiin hiiren alfa-L929-solujen hajoamisena käyttämällä radionuklidin vapau-tuskoetta (7) . Valmisteessa olevien sytolyyttisten lym-20 fotoksiiniyksiköiden lukumäärä määritettiin piirtämällä regressiosuora näytteen laimennussuhteen, joka aiheutti [3H]-dThd-merkkiaineen 50 %:sen vapautumisen 1 x 104 L929-solussa 3 vrk:n inkuboinnin aikana, käänteisluvun logaritmista (katso taulukko 2).

25 Leukoreauliinimääritvs

Ihmisen leukoreguliinin aktiivisuus mitattiin ihmisen kasvainsolujen kasvun estona (sytostaattinen vaikutus). Sytostaattisen vaikutuksen mittaamista varten siir-rostettiin 104 kasvainsolua 0,5 ml:ssa sopivaa kasvualustaa 30 24-syvennyksisiin viljelymaljoihin (Costar, Inc., Cambrid ge, MA). Joko alustaa tai 100-kertaiseen laimennukseen asti laimennettuja tutkittavia näytteitä 0,5 ml:ssa alus-. . taa lisättiin kolmena rinnakkaisnäytteenä, ja soluja inku- boitiin 37 °C:ssa kostutetussa kammiossa, joka sisälsi 5 % 35 C02:a ja 95 % ilmaa, 3 vrk. Kiinnittymättömät solut määri- i4 85867 tettiin kvantitatiivisesti suspendoimalla ne 9 ml:aan He-matalia ja tekemällä laskenta Coulter Counter, malli ZBI-laitteella (Coulter Instrumets, Inc., Hialeah, FL). Tarttuvat solut irrotettiin inkuboimalla 1 min 37 °C:ssa 5 0,02 % trypsiiniä sisältävässä PBS:ssä ennen laskentaa, joka tehtiin kuten edellä (katso taulukko 2).

Joissakin kokeissa solujen kasvun esto määritettiin mikrokoetta käyttämällä. Tässä kokeessa siirrostettiin 2 x 103 solua 100 plrssa 10 % FBS:ää sisältävässä RPMI 10 1640:ssa 96-syvennyksisiin mikromaljoihin. Sitten lisät tiin 100 μΐ alustaa, 0,5 %:sta SDS:ää tai lymfokiininäy-tettä neljänä rinnakkaisnäytteenä, ja maljoja inkuboitiin 37 °C:ssa kostutetussa kammiossa, joka sisälsi 95 % ilmaa ja 5 % C02, 3 vrk. Tarttuville soluille käytettiin tasapoh-15 jäisiä maljoja ja tarttumattomille K562-soluille pyöreä-pohjäisiä maljoja. Kuhunkin syvennykseen lisättiin 20 μΐ MTT:tä (Sigma) (5 mg/ml PBS:ää - liuotettiin voimakkaasti sekoittamalla ja valmistettiin juuri ennen käyttöä). Levyjä inkuboitiin vielä 4 tuntia 37 °C:ssa ja alustat pois-20 tettiin imemällä varovasti neulalla nro 18 g. Pelkistynyt MTT, tummanpunainen formatsaanisakka, saatettiin liuokseen lisäämällä 100 μΐ isopropanolia, joka sisälsi 0,05 mol/1 HCl:a. Värin absorbanssi mitattiin aallonpituudella 540 nm automaattisella pystysädemittarilla ARTEK (ARTEK Systems, 25 Inc., Farmingdale, New York). SDS:ää sisältävää näytesy-vennystä käytettiin nollakokeena, ja sen antama arvo vähennettiin kaikkien näytteiden lukemista. Esikokeissa soluja siirrostettiin vaihtelevina tiheyksinä, ja muodostuneen pelkistyneen sakan määrän havaittiin olevan suoraan 30 verrannollinen solujen lukumäärään syvennystä kohden. Mik-rotutkimuksen herkkyys oli vertailukelpoinen solulaskenta-kokeen herkkyyden kanssa.

. . Solujen kasvun prosentuaalinen esto kussakin ko- ; keessa laskettiin jakamalla tutkittavan näytteen solujen 35 tai absorbanssiyksiköiden määrän keskiarvo alustavertailu- is 85867 syvennysten solujen tai absorbanssiyksiöiden määrän keskiarvolla, vähentämällä 1 ja kertomalla 100 %:lla. Sytos-taattiset leukoreguliiniyksiköt määritettiin piirtämällä regressiosuora, joka kuvaa näytteen laimennussuhteen kään-5 teisluvun logaritmia prosentuaalisen kasvun eston funktiona, ja se oli yhtä suuri kuin solukasvun 50 %:isen eston aikaansaavan laimennussuhteen käänteisarvo. Ihmisen pak-susuolikarsinoomasolulinja HT-29 on hyvin herkkä leuko-reguliinin kasvua estävälle vaikutukselle, ja sitä käy-10 tettiin leukoreguliinin mittauksessa standardina, johon muita soluja verrattiin.

Sytolyyttisen aktiivisuuden määrittämistä varten solu leimattiin ennalta [3]-dThd:llä (7) ja siirrostettiin 10* solua 0,5 ml:ssa/syvennys 24-syvennyksisiin maljoihin. 15 0,5 ml alustaa, 0,5 %:sta natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tai tutkittavaa näytettä laimennettuna 100-kertaiseen laimennukseen asti lisättiin kolmena rinnakkaisnäytteenä, ja soluja inkuboitiin 3 vrk.

Maljoja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 200 x g 10 20 min, ja poistettiin 200 μ1:η annokset supematantteja, suspendoitiin 2,8 ml:aan Ultrafluoria (NEW, Boston, MA) ja tehtiin laskenta LKB Scintillation Counter-laitteella (LKB Instruments, Inc., Rockville, MD). Prosentuaalinen [3H]-dThd-ominaisvapautus laskettiin seuraavasti: 25 pulssimäärän ka., näyte (min-1) -pulssimäärän ka., alusta (min'1) [ 3H]-ominaisvapautus(%)_ 30 pulssimäärän ka., SDS (min'1) - pulssimäärän ka., alusta (min"1)

Sytolyyttisten leukoreguliiniyksiköiden luku las-35 kettiin samalla tavalla kuin sytolyyttiset lymfotoksiini-: yksiköt.

ie 85867

Karsinoqeneesimääritvs

Syyriankultahamsterin lymfokiinivalmisteiden aikaansaama syyriankultahamsterin sikiösolujen kemiallisesti ja säteilyllä indusoidun muuttumisen estoa tutkittiin 5 käyttämällä aiemmin kuvattua (24, 25) in vivo - in vitro -istukan kautta tapahtuvaa transformaatio-koetta (katso taulukko 3).

Interferonimääritvs

Interferonia tutkittiin Biofluids, Inc.:n (Rock-10 ville, MD) menetelmällä määrittämällä puolimikrosytopaat-tisen vaikutuksen, jonka vastasyntyneen ihmisen esinahan fibroblastien tai WISH-solujen infektointi naudan rakkulaisella suutulehduksella aiheuttaa, esto. Ihmisen WISH-solulinja on 5 - 10 kertaa niin herkkä gammainterferonille 15 kuin ihmisen esinahkasolut. Havaitsemisraja tässä kokeessa on 1 yksikkö viruksenvastaista aktiivisuutta, joka standardoidaan referenssiaineena NIH-ihmisen fibroblasti-interferoni (katso taulukko 4).

Joissakin kokeissa määritettiin alfa- ja gammain-20 terferonin vaikutukset biologisilla solukokeilla. Alfa-interferoni (ostettu Sigmalta) tuotettiin Burkitt-lymfoo-masoluissa (Namalva) indusoimalla Sendai-viruksella, ja sen ominaisaktiivisuus oli 1,1 x 106 kansainvälistä refe-renssiyksikköä/mg proteiinia. Gammainterferonin, jonka 25 ominaisaktiivisuus oli 105 viruksenvastaista yksikköä/ml toimitti ystävällisesti tri Gary Thurman (NCI, Frederick Cancer Research Facility, Frederick MD), ja sen olivat valmistaneet Flow Laboratories, Inc. (McLean, VA) ja Meloy Laboratories (Springfield, VA) the Biological Responce 30 Modifiers Programia varten (NCI Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD) (katso taulukko 5).

Interleukiinit 1 1a 2 - Interleukiini 1 -aktiivisuus määritettiin mittaa malla PHA:han reagoivien C3H/HeJ-hiiren tymosyyttien pro-35 liferaation edistyminen lymfokiinin vaikutuksesta. Tymo- 1 17 85867 syyttien proliferaatio voi heijastaa interleukiini 2:n läsnäoloa; sen vuoksi lymfokiini tutkittiin myös interleukiini 2:n suhteen käyttämällä tavanomaista mikrokoetta (3, 22), joka perustuu ihmisen interleukiini 2:lle herkän 5 OH-1-marmosetin jatkuvan T-solulinjan interleukiini 2:sta riippuvaiseen proliferaatioon. Ihmisinterleukiini 2-stan-dardilla (toimittaja tri P. Jagannath, Litton Bionetics, Inc. Kensington, MD) oli puolet korkeimmasta proliferation edistämiskyvystä laimennuksena 1:1500. Ihmisinter-10 leukiinistandardi valmistettiin laboratoriossamme käyttämällä tässä kuvattua lymfokiinituotantomenetelmää (katso taulukko 4).

Makrofaqien aktivointi- 1a endotoksiinikokeet Nämä kaksi koetta teki ystävällisesti tri Gary 15 Thurman, NCI, Frederick Cander Research Facility, Frederick, MD. Makrofageja aktivoiva vaikutus mitattiin lymfo-kiinin kykynä edistää ihmisen monosyyttien sytotoksista vaikutusta ihmisen kasvainsoluihin (14). Endotoksiini määritettiin kromogeenikokeella (Endotoxin chromogenic assay 20 kit, M.A. Bioproducts, Walkerville, MD), jonka herkkyys-alue ulottuu noin 0,1 ng:aan. Endotoksiinin mahdollista osallistumista kasvainsolujen kasvun estoon tutkittiin myös. Endotoksiinia (lipopolysakkaridi), jonka serotyyp-pinumerot ovat 055:B5 ja 011:B4 (Sigma) käytettiin kas-25 vainsolusytostaattisuustestiin pitoisuuksina 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 ja 20 ng/ml. Vaikutus kasvainsolujen kasvuun mitattiin edellä kuvatulla tavalla (katso taulukko 4).

Isoelektrinen fokusointi

Konsentroitujen lymfokiinien isoelektrinen foku-30 sointi preparatiivisessa pylväässä tehtiin amfoliinigra-dientissa (LKB. Rockville, MD) pH 3,5-10 110 ml:n iso-elektriseen fokusointiin tarkoitetussa pylväässä (LKB) . . (28). Kerättiin kolmen millilitran fraktioita, ja mitat tiin kunkin fraktion pH. Valitut fraktiot yhdistettiin, 35 dialyysisuodatettiin 0,1 % PEG:tä sisältävää PBS:ää vas- ie 85867 taan, steriloitiin suodattamalla 0,22 μπι:η Millex-suodat-timella (Millipore Corp., Bedford, MA), ja tutkittiin biologinen aktiivisuus. (Katso taulukko 4 ja kuva 8).

HPLC

5 Molekyylikokoon perustuvat erotukset tehtiin käyt tämällä preparatiivista Toyasoda G3000 SWG-geeli-HPLC-ko-lonnia (markkinoija LKB). Eluoitiin isokraattisesti kahden millilitran näytteitä virtausnopeudella 4 ml/min 0,02 M natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 10 0,1 % PEGstä. Kerättiin neljän ml:n fraktioita, steriloi tiin ne suodattamalla, ja tutkittiin niiden biologinen aktiivisuus (katso kuva 4).

Molekyylin varaukseen perustuva HPLC-erotus tehtiin analyyttisessa anioninvaihtokolonnissa Toyasoda DEAE-545. 15 Näytteet, jotka olivat 20 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 % PEG:tä, eluoitiin käyttämällä lineaarista yhden tunnin gradienttia 0,5 M NaCl virtausnopeudella 0,75 ml/min. Kerättiin kahden minuutin aikana valuneita fraktioita, steriloitiin ne suodattamalla ja tutkittiin ne (kat-20 so kuva 9).

Polvakrvvliamidiaeelielektroforeesi

Konsentroidut leukoreguliininäytteet (joko frakti-oimattomat tai HPLC-geelisuodatuksella ja ioninvaihtokro-matografiällä erotetut) käsiteltiin elektroforeettisesti 25 polyakryyliamidigeeleillä, joissa vallitsi lineaarinen gradientti 4-30 %. Elektroforeesin jälkeen geelit viipa-loitiin 0,25 mm:n osiksi, ja viipaleita eluoitiin yön yli 10 % FBSsää sisältävässä väliaineessa. Eluaatit suodatettiin steriileiksi ja tutkittiin. (Katso kuva 5).

30 125I:llä leimattu puhdistettu leukoreguliini käsi teltiin elekroforeettisesti myös 15 %sisilla polyakryyliamidigeeleillä, jotka oli varustettu 5 %:isella latoamis-akryyliamidigeelillä, joka sisälsi 1 % natriumdodekyyli-sulfaattia (15). Näyte visualisoitiin autoradiografisesti 35 (katso kuva 7).

i9 85867

Puhdistetun leukoreauliinin radionuklidileimaus 25 yksikköä leukoreguliinia, joka oli puhdistettu peräkkäisillä HPLC:llä ja polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla, leimattiin 125I:llä käyttämällä kloramiini 5 Tmenetelmää (17) ja lisäämällä naudan seerumialbumiinia kantajaproteiiniksi leimatun leukoreguliinin erottamiseksi reagoimattomasta 125I:sta Sephadex G-10-kolonnilla. Geelisuodatuskolonnikromatoarafia 125I-leimattu puhdistettu leukoreguliini eluoitiin 10 S-300-kolonnilla (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Ruotsi) 10 mM NaPO^-puskurilla, joka sisälsi 1,0 mol/1 NaCl:a, pH 7,4. Kerättiin kahden ml sn fraktioita, ja tehtiin niille laskenta (katso kuva 6).

Entsvmaattinen pilkkominen 15 Ihmisen ja hamsterin leukoreguliini- ja lymfotok- siiniaktiivisuuksien alttius neuramidaasi- ja proteaasi-pilkkoutumiselle tutkittiin (29). Puoli ml konsentroitua ihmisen tai hamsterin lymfokiinivalmistetta lisättiin 50 ul:aan VCNsää (500 yksikköä/ml, Calbiochem-Behring 20 Corp., LaJolla, CA) ja 0,5 ml:aan 0,1 M natriumasetaatti-puskuria, pH 5,1. Vertailunäytteiksi lisättiin 0,1 ml lym-fokiiniä 0,5 ml:aan asetaattipuskuria, 0,5 ml:aan asetaat-tipuskuria, joka sisälsi 50 μΐ VCN:ää ja 50 μΐ 0,2 M sia-liinihappoa (Sigma) (tämä sialiinihappopitoisuus inaktivoi 25 entsyymin) tai 0,5 ml:aan väliainetta. Näytteitä inkuboi-tiin 60 min 37 °C:ssa, dialysoitiin PBS-PEG-liuosta vastaan YM10-kalvolla varustetussa Amicon-kennossa, ja säädettiin näytteiden tilavuudet 3 ml:ksi. Proteolyyttisten pilkkomisten tekemiseksi lisättiin 1 ml lymfokiininäyttei-30 tä 1 ml:aan trypsiinipitoista PBS:ää (32 yksikköä/ml, omi-naisaktiivisuus 195 yksikköä/mg, Worthington Enzymes Inc., Freehold, NJ), 1 ml:aan kymotrypsiinipitoista PBS:ää (6 yksikköä/ml, ominaisaktiivisuus 59 yksikköä/mg. Sigma) tai 1 ml:aan liuosta, joka sisälsi pronaasia (6 yksikköä/ml, 35 ominaisaktiivisuus 6 yksikköä/mg, Sigma) 0,1 M Tris-emäs- 20 85867 liuoksessa, joka sisälsi 3 mM CaCl2:a ja 3 % tolueenia. Pronaasi aktivoitiin inkuboimalla liuosta, joka sisälsi 10 mg pronaasia/ml 0,1 M trispuskurissa, joka sisälsi 15 mmol/1 CaCl2:a, pH 7,8, 30 min 37 °C:ssa juuri ennen 5 lisäämistä näytteeseen. Proteaasipitoisia näytteitä tai proteaasipuskurivertailunäytteitä inkuboitiin 60 min 37 °C:ssa. Kuhunkin näytteeseen lisättiin 1 ml FBS:ää, ja näytteet laimennettiin satakertaiseen laimennokseen asti ulottuvalle alueelle väliaineella koetta varten (katso 10 taulukko 3).

M-sytotoksisuuskoe

Kohdesolujen herkkyyden lisääntyminen leukoregu-liinikäsittelyn jälkeen NK-välitteiselle sytotoksisuudelle määritettiin suurin piirtein aiemmin kuvatulla tavalla 15 (23). LSM-gradienttisentrifugoinnilla eristetyt normaalit ihmisen perifeeriset veren yksitumasolut johdettiin nai-lonvillan läpi makrofagien ja B-solujen poistamiseksi ja NK-solujen rikastamiseksi samalla. K562-kohdesoluja leimattiin 18 tuntia lisäämällä 1000 pCi 51Cr:a 20 natriumkromaattina (NEN, Boston, MA). Kohdesolut pestiin kolmesti 10 % FBS:ää sisältävällä 1640:llä ja suspensoitiin pitoisuudeksi 2,5 x 105 solua/ml alustaa tai alustalla laimennettua lymfokiininäytettä. Kohdesoluja inkuboitiin sitten 30 min 37 eC:ssa, sentrifugoitiin 25 kiihtyvyydellä 280 x g 5 min ja suspendoitiin uudelleen 10 % FBS:ää sisältävään 1640:een pitoisuudeksi 105 solua/ml. 100 μΐ soluja lisättiin putkiin, jotka sisälsivät 100 μΐ alustaa tai efektorisoluja efektorisolurkohdesolu-suhteen ollessa 25:1, 10:1 tai 30 2,5:1. Sitten tehtiin 4 tuntia kestävä 51Cr-vapautumiskoe (23). Spontaani 51Cr-vapautuminen oli 15 - 20 %, kun soluja esi-inkuboitiin joko alustassa tai lymfokiinissä. Lymfo-kiinin aikaan saaman tehostumisen aste määritettiin vertaamalla alustassa inkuboitujen kohdesolujen NK-sytotoksi-35 suushajotusyksiköiden määrää lymfokiinissä inkuboitujen kohdesolujen vastaavaan arvoon. Hajotusyksikkö, joka mää- 2i 8 5 8 67 riteilaan siksi lymfosyyttien lukumääräksi, joka saa aikaan kohdesoluista ominaisvapautumisen 15 % 51Cr:sta, laskettiin käyttämällä Van Kroughin yhtälöä (21, 32), (katso taulukko 6 ja kuva 3).

5 Virtaussvtometrinen analyysi K562-solut suspendoitiin takaisin 10 % FBSsää sisältävään RPMI 1640seen pitoisuudeksi 4 x lOVml. Muoviputkiin (koko 12 x 75 mm) laitettiin 250 μΐ solususpensiota ja lisättiin 250 μΐ lymfokiininäytettä. Putkia inkuboitiin 10 37 °C;ssa atmosfäärissä, jossa oli 5 % C02sa ja 95 % kostu tettua ilmaa, lavakeinuttimella (Bellco Co., Vineland, NJ), jonka pyörimisnopeus oli 6 kierrosta minuutissa, 30 min - 6 tuntia.

Instrumentointi 15 Virtaussytometriset analyysit tehtiin käyttämällä fluoresenssiaktivoitua solulajittelijaa FACS IV, joka oli varustettu 5 W:n argonionilaserilla, joka toimii eksitaa-tiolähteenä, 256-kanavaisella pulssinkorkeusanalysaatto-rilla ja logaritmisilla vahvistimilla. Soluista analysoi-20 tiin pienessä kulmassa tapahtuva valon siroaminen eteenpäin ja fluoresenssi, kun ne oli johdettu suuttimen läpi, jonka läpimitta oli 70 μπι, suojanesteeseen, jona toimi MILLI-Q-suodatettu (Millipore Corp., Bedford, MA) vesi. Pienessä kulmassa tapahtuva valon siroaminen eteenpäin-25 signaaleja, solujen koon ja muodon indikaattoria, käytettiin liipaisusignaalina kaikissa analyyseissä. Kaikki optiset suodattimet toimitti Becton-Dickinson laitteen mukana, ellei toisin mainita.

FDA-fluorokromasia 30 FDAita käytettiin solukalvon läpäisevyyden mittaa miseen (5). FDAssta (Polyscience, Inc., Warrington, PA) valmistettiin varastoliuos liuottamalla kiteistä FDA:ta . . asetoniin pitoisuudeksi 5 mg FDA:ta/l. Käyttöliuos valmis tettiin juuri ennen käyttöä laimentamalla varastoliuos 35 10 % FBS:ää sisältävällä RPMI 1640:llä lopulliseen FDA- 22 85867 pitoisuuteen 6,25 μς/πιΐ. K562-solut pestiin lymfokiinikä-sittelyn jälkeen kerran 10 % FBSsää sisältävällä RPMI 1640sllä ja suspendoitiin 1 ml:aan käyttöliuosta, jonka FDA-pitoisuus oli 6,25 μς/πιΐ, inkuboitiin huoneen lämpöti-5 lassa 5 min ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä.

Propidiumiodidifluorokromasia

Myös propidiumjodidia käytettiin solukalvon läpäisevyyden mittaamiseen. Propidiumjodidista (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA) valmistettiin varastoliuos 10 liuottamalla propidiumjodidia PBSiään, pH 7,4 pitoisuudeksi 500 μς/ηιΐ. Käyttöliuos valmistettiin juuri ennen käyttöä laimentamalla varastoliuosta PBSsllä siten, että lopulliseksi propidiumjodidi-pitoisuudeksi tuli 0,2 μς/πιΐ. Lymfokiinikäsittelyn jälkeen solut pestiin kerran 10 % 15 FBSsää sisältävällä RPMI 1640sllä ja suspendoitiin 1 ml saan propidiumjodidikäyttöliuosta, inkuboitiin 5 min huoneen lämpötilassa ja analysoitiin sitten virtausytomet-rillä.

Fluoresenssimittaukset 20 Sekä FDAslle että propidiumjodidille käytetty eksi- taatioaallonpituus oli sama, 488 nm teholla 400 mW. Pidemmät aallonpituudet läpäisevät 515 ja 520 nmsn optiset lasisuodattimet asetettiin fluoresenssidetektorin valomo-nistinputken eteen. Analysoitaessa propidiumjodidileimat-25 tuja näytteitä sijoitettiin lisäksi punainen dikroinen lisäsuodatin (Corion Corp., Hollister, MA) valomonistin-putken eteen. Väliaineella käsiteltyjä K562-soluja käytettiin virtaussytometrin hienosäätöön ennen kutakin koetta. Virta ja valomonistinputken jännite säädettiin siten, että 30 90 % analysoiduista 1 x 10* solusta osui ennalta määrätylle • - kanava-alueelle koko 256 kanavan asteikolla. Tämä tehtiin kullekin 3 parametrille (valon sironta kapeassa kulmassa eteenpäin, fluoreseiinifluoresenssi ja propidiumjodidi-fluoresenssi), joita tutkittiin tässä tutkimuksessa. Väli-35 aineella käsitellyille vertailusoluille sironta ja fluore- 23 8 5 8 6 7 seiinifluoresenssi säädettiin kanava-alueen yläosaan ja propidiumjodidifluoresenssi alempaan osaan lymfokiinikäsi-tellyissä soluissa tapahtuvien vastaavien siirtymien mittaamiseksi. Kunkin K562-solunäytteen käsittelyn yhteydessä 5 analysoitiin 2 x 104 solua, ja laskettiin ennalta määrätylle markkerialueelle osuvien solujen prosenttiosuus. Tämä prosenttiosuus vähennettiin sitten väliaineella käsitellyille soluille saadusta prosenttiosuudesta (noin 90 %), jolloin tulokseksi saatin näytteen prosentuaalinen muutos. 10 Prosentuaaliset muutokset olivat alueella noin -5 - +70 %. Muutos positiiviseen suuntaan osoittaa lymfokiinikäsitte-lyn aikaansaamaa vaikutusta K562-soluihin mitattavan parametrin suhteen (katso kuva 10).

Esimerkki 2 15 Leukoreguliinia erittävien ihmisen B-solulinjojen ja hydridomien tuotanto

Syöpäpotilaat immunisoitiin ihonsisäisesti heidän omilla irrotetuilla kasvainsoluilla, jotka oli säteilytet-ty annoksella 20 000 rad ja sekoitettu 107 elävään BCG-20 soluun. Näiden potilaiden valtimoverestä preparoituja perifeerisiä veren lymfosyyttejä sekoitettiin hiiren NS-1-myeloomasoluihin suhteessa 3 PBLsää yhtä myeloomasolua kohden, sentrifugoitiin ja suspendoitiin 100 ul:aan seerumi tonta alustaa. Solupellettiin lisättiin pisaroittain 25 1 ml minuutissa polyetyleeniglykolia (50 %, m/V), joka oli esilämmitetty 37 °Csseen, liikuttaen putkea koko ajan. Kaksi kertaa edellä mainittu tilavuus esilämmitettyä seerumi tonta alustaa minuutissa lisättiin solususpensioon, kunnes 50 ml:n putki täyttyi. Soluja pelletoitiin 15 min 30 kierrosnopeudella 800 min-1. Sitten solut suspendoitiin varovasti HT-alustaan (DMEM, joka sisältää 20 % naudan sikiöseerumia, 13,6 pg/ml hypoksantiinia ja 3,9 pg/ml ty-midiiniä) pitoisuudeksi 2,5 x 106 solua/ml (solumäärä ennen fuusiota), ja laitettiin 100 μΐ seosta kuhunkin mikro-35 maljan syvennykseen. 24 tunnin kuluttua lisättiin kuhunkin 24 8 5 8 6 7 syvennykseen 100 μΐ HAT-alustaa (HT-alusta, joka sisältää 0,18 μς/ιηΐ aminopteriiniä). Puolet alustasta korvattiin joka kolmantena päivänä tuoreella HAT-alustalla. Kun soluja oli pidetty 14 vrk yllä Hat-alustassa, ylläpidettiin 5 niitä vielä kaksi viikkoa HT-alustassa, minkä jälkeen soluja kasvatettiin MEM-alustalla, joka sisälsi 20 % naudan sikiöseerumia.

PBL:ien viljelyä yhdessä myeloomasolujen kanssa voidaan vaihtoehtoisesti käyttää transformoitujen diploi-10 disten B-solujen kehittämiseen.

PBL- ja myeloomasolut sekoitettiin (suhteessa 3:1), pelletoitiin kierrosnopeudella 800 kierr./min ja valikoitiin HAT-alustassa edellä kuvatulla tavalla.

Hybridomien tai transformoitujen diploidisten B-15 solujen supernatanteista tutkittiin niiden erittämä leuko-reguliini käyttämällä mikrokoetta HT-29-solut kohdesolui-na. Leukoreguliinia sisältäviä soluja lisättiin 10 % FBSsää sisältävässä MEMsssä, ja kun saavutettiin riittävät solumäärät, tehtiin kokeita leukoreguliinin optimituotan-20 non olosuhteiden määrittämiseksi seerumittomassa alustas sa. Solut suspendoitiin pitoisuudeksi 2 x 105 solua/ml RPMI 1640:ä, ja inkuboitiin 3 vrk 37 °C:ssa. Joissakin kokeissa viljelmiin lisättiin 10 ng tetradekanoyyliforboliase-taattia/ml leukoreguliinituotannon stimuloimiseksi. Super-25 natantit kerättiin, sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 800 x g, ja niistä tutkittiin leukoreguliiniaktiivisuus.

Esimerkki 3

Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen solu- pinnan leukoreguliinireseptorille 30 Balb/c-hiiret immunisoitiin antamalla K-562-kalvoja ihonalaisesti 3 kertaa kahden viikon välein. Kukin hiiri sai 103 solua vastaavan määrän kalvoja, jotka preparoitiin homogenoimalla koneellisella tef lonhomogenaattorilla, kirkastettiin sentrifugoimalla pienellä nopeudella ja kerät-35 tiin sitten ultrasentrifugoimalla kiihtyvyydellä 100 000 x 25 8 5 8 6 7 g 1 tunti. Kalvot sekoitettiin Freundin täydelliseen apuaineeseen kutakin rokotetta varten. Kolme päivää ennen hybridisaatiota hiiriin injektoitiin vatsakalvonsisäisesti K562-solukalvoja PBS:ssä. Fuusiopäivänä poistettiin per-5 nat, erotettiin yksittäiset solut ja fuusioitiin ne suhteessa 3 pernasolua/1 myeloomasolu PEG:n avulla. Fuusion jälkeen valikoitiin hybridit viljelemällä niitä hypoksan-tiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä sisältävässä alustassa (10). Leukoreguliinireseptorin vasta-aineita tuottavat 10 pesäkkeet kloonattiin rajalaimennusmenetelmällä.

Biologista koetta, jolla mitataan leukoreguliinin ohjaaman HT-29-solujen kasvun hidastumisen estoa, käytettiin leukoreguliinireseptorien vasta-aineiden detektoin-tiin. 2000 HT-29-solua siirrostettiin 0,1 ml:aan 10 % 15 FBS:ää sisältävää MEMsää 96-syvennyksisen maljan syvennyksissä. Lisättiin sellainen leukoreguliinimäärä 0,1 mlsssa alustaa, joka sai aikaan HT-29-solujen kasvun 50 %:sen eston, ja sen jälkeen 25 μΐ tutkittavaa vasta-ainetta sisältävää supernatanttia. 3 vrk:n inkuboinnin jälkeen mi-20 tattiin esto laskemalla läsnäolevat solut MTT-värjäyksen avulla. Kaikkia näytteitä, joissa leukoreguliiniaktiivi-suuden esto oli 25 % tai suurempi, pidettiin positiivisina. Tämä koe perustuu siihen, että monoklonaalinen vasta-aine sitoutuu leukoreguliinireseptoriin, mikä estää leuko-25 reguliinin sitoutumisen ja sen myöhemmän kasvua estävän aktiivisuuden.

Leukoreguliinireseptori-ilmentymisen määrä mitattiin kolmella tavalla, joilla kaikilla saatiin leukoreguliinireseptoriin sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen 30 prosenttiosuus. Immuunifluoresenssikokeessa inkuboitiin 2 x 105 solua monoklonaalisen vasta-aineen kanssa 1 tunti 37oC:ssa. Solut pestiin kahdesti, lisättiin fluoresoivaan aineeseen liitettyä vuohen anti-hiiri-immunoglobuliinia Kirkegard and Peiry Labs, Rockville, MD) ja inkuboitiin 30 35 min 4 °C:ssa. Solut pestiin, suspendoitiin 0,5 ml:aan 26 8 5 867 PBS:ää ja analysoitiin EPICS 5-virtaussytometrillä (Coulter Instruments, Hialeah, FL) käyttämällä 488-laserlinjaa vihreän fluoresenssin herättämiseen. ELISA ja RIA tehtiin muuten samalla tavalla, mutta ELISA:ssa käytetty konju-5 gaatti oli piparjuuriperoksidaasi - vuohen anti-hiiri-im-munoglobuliini ja RIA:ssa 125-leimattu vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini. Kvantitatiivinen ELISA-määritys tehtiin kolorimetrisesti mittaamalla hydrolysoituneen substraatin määrä ARTEK-automaattimittarilla. Kvantitatiivinen RIA-10 määritys tehtiin mittaaemalla sitoutunut 125I-merkkiaine LKB-gammalaskurilla (LKB Instruments, Rockville, MD) (katso taulukko 8).

Esimerkki 4

Potilaan kasvainsolujen leukoreguliiniherkkyyden 15 mittaaminen klonogeenista agarkoetta käyttämällä

Kasvainsoluilla on normaalisoluihin verrattuna ainutlaatuinen kyky kasvaa puolikiinteässä alustassa. Tämä kasvainsolujen ominaisuus antaa keinon määrittää kvantitatiivisesti syöpälääkkeiden vaikutus ihmisten poistettu-20 jen kasvainten juuri erotettuihin soluihin. Leikkauksessa saadut paksusuolikasvaimet hienonnettiin ja hajo-tettiin kollagenaasilla ja DNA:aasilla, jolloin saatiin yksisolu-suspensio (11). Solut suspendoitiin 0,15 % agaria sisältävään alustaan muuten Kernin (12) menettelyä noudattaen, 25 mutta lisäten leukoreguliinia vaihteleviksi pitoisuuksiksi. Agar-alustaa suspendoituneina kasvavien kasvainsolu-pesäkkeiden kehittyminen tutkittiin kvantitatiivisesti 10-14 vrk:n inkuboinnin jälkeen (katso taulukko 9).

Esimerkki 5 30 Leukoreguliinigeenin kloonaus

Kun leukoreguliini on määritetty sekä biologisesti että biokemiallisesti, ja kun siten on saatu aikaan menetelmät leukoreguliinin identifioimiseksi ja eristämiseksi, kuten edellä esitettiin, tehdään leukoreguliinin kloonaus 35 ja ilmentäminen käyttämällä tavanomaisia, kirjallisuudessa 27 85867 laajasti kuvattuja lähestymistapoja ja toimintaohjelmia (esimerkiksi Maniatis et ai., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Nämä menettelyt ovat riippuvaisia herkästä bio-5 logisesta kokeesta, jota kuvattiin edellisissä esimerkeissä. Kun koe on kehitetty ja on määritetty leukoreguliini biologisesti ja biokemiallisesti, voidaan käyttää tavanomaisia yhdistelmä-DNA- ja kloonausmenetelmiä aminohappo-sekvenssiltään ja biologiselta aktiivisuudeltaan autent-10 tisen luonnon leukoreguliinin tai sen biologisesti aktiivisen alayksikön kanssa indenttisen proteiinin tuottamiseksi E.colissa tai muissa soveltuvissa isäntäorganis-meissa. Kloonausmenettelyn pääpiirteet esitetään kuvassa 11. Tämä menettely vastaa menetelmiä, joita on käytetty 15 monille biologisesti tärkeille eukaryoottigeeneille, erityisesti ihmisen lymfokiiniä, lymfotoksiinia, vastaavalle geenille, joka ilmennettiin bakteereissa käyttämällä samanlaista toimintaohjelmaa kuin se, jota kuvaavat Gray, P.W. et ai [Nature 312 (1984) 721]. Tämä artikkeli ja muut 20 tässä esimerkissä mainitut artikkelit mainitaan tässä viitteenä kokonaisuudessaan.

Kloonausesimerkkiä voidaan käsitellä kuutena erillisenä vaiheena (katso kuva 11). Seuraavassa kuvataan kunkin tällaisen vaiheen peruspiirteitä.

25 Vaihe 1

Biologinen tutkiminen, puhdistus ja biologinen karakterisointi Tämä analyysi täytyy tehdä ennen ryhtymistä mihinkään kloonauskokeisiin. Näiden tutkimusten yksityiskohdat 30 ovat tässä hakemuksessa esitettyjä tietoja. Kun nämä tiedot on saatu edellä esitetyllä tavalla, on mahdollista ryhtyä geeniteknisiin toimenpiteisiin.

Vaihe II

E.coli-geenikirjasto 35 Bakteerikloonien rakentaminen perustuu luonnon leu- 28 8 5 867 koreguliinilähteiden karakterisointiin. Koska tämä hakemus julkistaa menetelmän ihmisen perifeeristen veren leuko-syyttien (PBL) toimesta tapahtuvan leukoreguliinituotannon stimulointi seksi, täytyy näiden solujen sisältää leukoregu-5 liinisynteesiä varten tarvittavaa geneettistä informaatio ta, ja ne ovat ilmeinen leukoreguliinigeenien lähde. Käyttämällä stimuloituja solupolylaatioita eristetään mRNA, joka sisältää leukoreguliini-mRNA:ta. Tätä PBL-mRNA:ta käytetään cDNA-kirjastojen muodostamiseen esimerkiksi 10 E.colissa tai muissa isäntäorganismeissa.

Vaihe III

Biokemiallinen karakterisointi, aminohapposekvenssi

Kuten edellä kuvattiin, leukoreguliiniproteiini on karakterisoitu biokemiallisesti ja puhdistettu homogeeni-15 seksi. Seuraava ratkaiseva vaihe on leukoreguliiniproteii-nin aminohapposekvenssin määrittäminen tätä luonnonmateriaalia käyttämällä. Tämä työ, joka on välttämätön sen varmistamiseksi, että mahdollisesti saadut geenikloonit vastaavat autenttista leukoreguliinia, tehdään tavanomaisin 20 biokemiallisin sekventointimenetelmin.

Vaihe IV

Geenien eristäminen immuunitutkimuksin Tämä lähestymistapa geenien eristämiseksi voidaan aloittaa välittömästi vaiheen II loppuunsaattamisen jäl-25 keen. Tässä kokeessa on ratkaiseva reagenssi luonnon leu-koreguliinin vasta-aine antileukoreguliini, joka voidaan valmistaa sen jälkeen, kun on puhdistettu riittävästi luonnon leukoreguliinia eläimien immunisoimiseksi. Tätä menetelmää, jota on käytetty menestyksellisesti erilaisten 30 geenien etsimiseen E.coli-geenikirjastoista, kuvaavat Hel- fam, D.M. et ai [PNAS 80 (1983) 31-35], ja Young, R.A. ja R.W. Dawis [NAS 80 (1983) 1194-1198].

Vaihe V

Geenien eristäminen DNA-koettimen avulla 35 Tämä on vaihtoehtoinen, ja laajimmin käytetty, me- 29 85867 netelmä geenien eristämiseksi E.coli-yhdistelmä-DNA-kir-jastosta. Kuten Noyes et ai. [NAS 76 (1979) 1770-1774] alunperin esittivät, käytetään synteettistä olideoksinuk-leotidikoetinta eukaryoottisen mRNA:n eristämiseen ja ka-5 rakterisointiin. Koetin on pieni osa leukoreguliinia koo-daavasta DNA-jaksosta, joka valmistetaan määrittämällä ensin luonnon proteiinin jokin aminohappo-osasekvenssi ja syntetisoimalla sitten nukleotidisekvenssi, joka koodaa tätä aminohappo-osassekvenssiä. Synteettinen nukleotidi-10 sekvenssi voidaan valmistaa esimerkiksi kemiallisesti, kuten Itakura, K. et ai. [J.Am.Chem.Soc. 97 (1975) 7326] kuvaavat. Gastriinista peräisin olevaa aminohapposekvenssiä Trp-Met-Glu-Glu käytettiin esimerkiksi määrittämään dodekanukleotidi d(CTCCTCCATCCA), joka hybridisoituu spe-15 sifisesti gastriini-mRNAshan. Leukoreguliinin ollessa kyseessä käytetään samalla tavalla synteettistä DNA-frag-menttia koettimena, joka hybridisoituu leukoreguliinia tuottavista soluista saatuun luonnon mRNAihan. Käyttämällä esimerkiksi tunnistusjaksoa ja tavanomaisia menetelmiä 20 erotetaan esimerkiksi leukoreguliinia vastaava mRNA RNA-seoksista. Näissä menettelyissä käytettäviä menetelmiä käsitellään julkaisussa Maniatis et ai., supra; Goodman et ai., US-patenttijulkaisut 2 283 489 ja 4 363 877 sekä niissä annetuissa viitteissä.

25 Näiden tulosten laajennuksena on ollut tällaisten

koettimien käyttö cDNA-kirjastojen tutkimisessa [Crea, R. ja Horn, T., Nuc Acid Res 8 (1980) 2331-2348]. Vähän aikaa sitten käytettiin tetradekanukleotidiryhmää d(TC A CA A TA C TCCA), joka oli ennustettu aminohappo-30 G G T

venssin Trp-Glu-Tyr-Cys-Asp perusteella, ihmisen kudos-tyyppiplasminogeenin aktivaattoria vastaavan geenin cDNA:n kloonien havaitsemiseen E.colissa [Pennica, D. et ai., Nature 301 (1983) 214-220].

35 30 85867

Vaihe VI

Geenin kokoaminen, ilmentäminen mikrobissa

Kloonauksen viimeisenä vaiheena on eukaryootin ra-kennegeenin muuttamattoman kopion rutiininomainen kokoa-5 minen ja geenin luenta, jolloin syntyy leukoreguliinia tai sen biologisesti aktiivista alayksikköä. Menettely tämän geenin mikrobissa ilmentymisen aikaansaamiseksi geenitekniikan menetelmin etenevät erilaisia reittejä eri isännille. Vaikka erilaiset mahdollisuudet vektorin valmistami-10 seksi, isäntäsolun transformoimiseksi ja luennan ja ilmentymisen aikaansaamiseksi ovat liian lukuisat luetteloitaviksi, ovat menettelyt tavanomaisia, ja niitä on käsitelty lukuisissa katsauksissa kuten esimerkiksi Maniatis et ai., supra, Gene Amplification and Analysis: Expression of 15 Gloned Genes in Prokaryotic and Eukaryotic Cells, toim. Papas, T.S., Rosenberg, M. ja Chirigkjian, J.G., Elesevier Science Publishing Co., Inc., NY. 1983, Berman et al., US-patenttijulkaisu 4 503 142, sekä niissä annetuissa viitteissä.

20 Voidaan lisäksi syntetisoida leukoreguliinin tai sen biologisesti aktiivisen alayksikön muunnettu muoto, jonka molekyylirakenteessa voi olla modifikaatioita. Tällaisella muunnetulla leukoreguliinilla voi olla parantunut käyttökelpoisuus, kuten parantunut teho, pienentyneet si-25 vuvaikutukset tai parantunut stabiilisuus; tai sillä voi olla yhtä suuri aktiivisuus tai pienempi, mutta riittävä, aktiivisuus kuin leukoreguliinille on ominaista. Kuitenkin kaikissa tapauksissa, joissa molekyylirakenne ja aktiivisuus ovat suuremmalta osin samat kuin tässä määritellyllä 30 leukoreguliinilla, on tuotetta pidettävä sitä vastaavana tai sen normaalina muunnoksena.

Kuvien ja taulukoiden kuvaus . . Kuva 1

Ihmisen kasvainsolujen sytolyysi, jonka saavat ai-35 kaan leukoreguliinia sisältävä ihmisen PBL-lymfokiini i; si 85367 (O — O) ja puhdistettu 1788-solulinjän lymfotoksiini (· — ·) vastaavina lymfokiinipitoisuuksina. Näytteiden keskiarvojen standardipoikkeaxna oli korkeintaan 2 %.

Ihmisen lymfokiinilla ja lymfotoksiinilla oli kui-5 tenkin pieni tai olematon sytolyyttinen vaikutus ihmisen leukemia-, sarkooma- ja karsinoomasoluja kohtaan. Korkeintaan 50 %:inen RPMI 2650-karsinoomasolujen hajoaminen havaittiin lymfokiininäytteellä, joka sisälsi 1000 yksikköä lymfotoksiinia/ml.

10 Kuva 2

Ihmisen kasvainsolujen kasvun esto, jonka saivat aikaan leukoreguliinia sisältävä ihmisen lymfokiini (O — 0) ja puhdistettu 1788-solulinjän lymfotoksiini (· — C) yhtä suurina lymfotoksiinipitoisuuksia. Näyttei-15 den keskiarvojen keskihajonta oli korkeintaan 5 %. Prosentuaalinen kasvun esto määritettiin käyttämällä solulasken-takoetta.

Hyvin puhdas 1788-solulinjän lymfotoksiini ei onnistunut hajottamaan mitään näistä kolmesta kasvainsolu-20 tyypistä. Huolimatta alhaisesta lyyttisestä vaikutuksestaan ihmisen kasvainsoluihin, aiheutti ihmisen lymfokiini ihmisen kasvainsolujen kasvun merkittävän eston. Puhdistettu 1788-solulinjän lymfotoksiini inhiboi kuitenkin kasvua merkittävästi vain pitoisuuksina 500 ja 1000 lymfotok-25 siiniyksikköä/ml. Kasvun estyminen näillä pitoisuuksilla olisi lisäksi voinut hyvinkin aiheutua ammoniumkarbonaat-tipuskurin, pH 8,4, jossa puhdistettu lymfotoksiini valmistettiin, kasvua hidastavasta vaikutuksesta.

Kuva 3 30 Kohdesolujen herkkyyden NK-välitteiselle sytotoksi- suudelle lisääntyminen, jonka saa aikaan leukoreguliinia sisältävä ihmisen lymfokiini, mutta ei puhdistettu ihmisen lymfotoksiini. Ihmisen lymfokiiniä, joka sisälsi 40 lymfotoksiiniyksikköä/ml (0 — O), puhdistettua 1788-lym-35 fotoksiinia pitoisuutena 40 yksikköä/ml {· — ft) tai väli- 32 85867 ainetta (£.—£,), inkuboitiin 30 min kohdesolujen kanssa ennen NK-efektorisolujen lisäämistä. Näytteiden keskiarvojen keskipoikkeama oli korkeintaan 1 %.

Kasvainsolujen proliferaation eston lisäksi ihmisen 5 lymfokiini, mutta ei puhdistettu 1788-lymfotoksiini, lisäsi ihmisen karsinooma-, leukemia- ja sarkoomasolujen herkkyyttä NK-välitteiselle sytotoksisuudelle. Ihmisen lymfotoksiini aiheutti jopa RPMI 2650-karsinoomasolujen, jotka ovat resistenttejä NK-hajotukselle, hajoamisen. Puh-10 distettu 1788-lymfotoksiini ei edistänyt karsinooma-, leukemia- tai sarkoomasolujen herkkyyttä NKsn aiheuttamalle hajoamiselle. Fraktioimattoman, lymfokiiniä sisältävän, ihmisen PBL-lymfotoksiinin ja puhdistetun 1788-solulinjan lymfotoksiinin erilaiset biologiset vaikutukset viittaavat 15 siihen, että muu lymfokiini kuin lymfotoksiin! välittää kasvainsolujen vastaiset vaikutukset.

Kuva 4

Kahden erilaisen ihmislyrafokiinivalmisteen geelilä-päisevyys-HPLC. Kahden ml:n näytteitä eluoitiin isokraat-20 tisesti Toyasoda TSK G-3000 SWG-kolonnista 20 mM Na-fos-faattipuskurilla, pH 7,4, joka sisälsi 0,1 % PEGstä. Kerättiin neljän ml:n fraktioita, laimennettiin niitä satakertaiseen laimennukseen asti ulottuvalla alueella 10 % FBS:ää sisältävällä RPMI 1640:llä, ja tutkittiin alfa-25 L929-solujen lymfotoksiinisytolyysi ja ihmisen K562- ja 2650-kasvainsolujen leukoreguliinisytostaasi. Proteiinin absorbanssikäyrä aallonpituudella 280 nm eritetään alfa-L929-koetta kuvaavassa osassa.

Ihmisen PBL-lymfotoksiinin ja leukoreguliinin näen-30 näistä molekyylipainoa tutkittiin HPLC-molekyyliseulakro-matografiällä. Pääosa lymfotoksiiniaktiivisuudesta eluoi-tui fraktioissa, jotka olivat molekyylipainoalueella 30 000 - 40 000. Eri yksilöistä peräisin olevissa näytteissä esiintyi kuitenkin jonkin verran vaihtelua; jois-35 sakin näytteissä oli lymfotoksiiniaktiivisuutta myös mole- 33 85867 kyylipainoalueilla 50 000 - 70 000 ja 12 000 - 20 000. Leukoreguliiniaktiivisuus eluoitui fraktioissa, jotka olivat molekyylipainoalueella 50 000 - 70 000, vähäisen komponentin osuessa molekyylipainoalueella 10 000 - 15 000.

5 Kuva 5

Leukoreguliinin polyakryyliamidigeelielektroforee-si lineaarista gradienttia käyttäen. Tarkempi arvo leukoreguliinin molekyylipainolle määritettiin grafienttipoly-akryyliamidigeelielektroforeesilla. Yhtä millilitraa ih-10 misleukoreguliini-valmistetta käsiteltiin elektroforeet- tisesti yön yli. Sitten geeli viipaloitiin, ja viipaleita eluoitiin yön yli 10 % FBSsää sisältävällä MEMsllä 37 °C:ssa. Leukoreguliiniaktiivisuus (avoimet renkaat) mitattiin käyttämällä mikrokoetta, jossa kohteina olivat 15 HT-29-karsinoomasolut. Leukoreguliini kulki yhdessä pro teiinien kanssa, joiden molekyylipainot olivat alueella 110 000 - 140 000. Tässä kuvassa näkyy myös 125I-leimatun (täytetyt renkaat) leukoreguliinin, joka oli puhdistettu peräkkäisillä HPLC-geelisuodatuksella, ioninvaihtokromato-20 grafialla ja lineaarigradienttipolyakryyliamidigeelielekt- roforeesilla, elektroforeettinen käyrä.

Kuva 6

Puhdistetun leukoreguliinin geelisuodatus Käytettiin vaihtoehtoista menetelmää molekyylipai-25 non määrittämiseksi, jossa käytettiin Pharmacia S-300- geelisuodatusta. HPLC-geelisuodatuksella, ioninvaihtokro-matografiällä ja lineaarigradienttipolyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla puhdistettu leukoreguliini leimattiin 125Islla ja eluoitiin S-300-kolonnilla käyttämällä 10 nM 30 NaP04-puskuria, pH 7,4, joka sisälsi 1,0 mol/1 NaClra. Puhdistetun leukoreguliinin näennäinen molekyylipaino oli 120 000 - 140 000 tällä menetelmällä määritettynä.

35 34 8 5 8 6 7

Kuva 7

Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeeli- elektroforeesi 125I:lla leimattu, puhdistettu leukoreguliini käsi-5 teltiin elektroforeettisesti natriumdodekyylisulfaattipo-lyakryyliamidigeelielektroforeesilla sen määrittämiseksi, hajoaisiko luontainen proteiinin alayksiköiksi ollessaan alttiina denaturoiville olosuhteille. Leukoreguliini liikkui elektroforeesissa yhdessä molekyylien kanssa, joiden 10 molekyylipaino oli 30 000 - 35 000, kuten tästä geelin autoradiogrammista näkyy.

Kuva 8

Kahden erilaisen ihmislymfokiinivalmisteen isoelek-trinen fokusointi. Kahden millilitran näytteitä fokusoi-15 tiin pH-gradientissa 3,5 - 10. Kerättiin kolmen millilitran fraktioita, määritettiin kunkin fraktion pH, yhdistettiin peräkkäiset 0,5 pH-yksikön sisään jäävät fraktiot, dialyysisuodatettiin ne PBS-PEG:tä vastaan, steriloitiin suodattamalla, laimennettiin satakertaiseen laimennukseen 20 asti ulottuvalla alueella, ja tutkittiin lymfotoksiinin sytolyyttinen vaikutus alfa-L929-soluihin (· -- ·) tai leukoreguliinin sytostaattinen vaikutus K562- (QJ- -□) ja OST- (0 — 0) soluihin.

Vaikka ihmisen lymfotoksiini- ja leukoreguliiniak-25 tiivisuudet olivat osittain päällekkäisiä tehtäessä erotus molekyyliseuloilla, voitiin nämä kaksi aktiivisuutta erottaa toisistaan molekyylien varauksien erojen perusteella. Lymfotoksiinin isoelektrinen pH oli 6,5 - 7,2. Leukoregu-liinilla oli kaksi isoelektristä pH:ta, toinen 5,0 - 5,8 30 ja toinen 7,5 - 8,3.

Kuva 9

Leukoreguliinin ja lymfotoksiinin HPLC-ioninvaihto-kromatografia. Kahden millilitran ihmislymfokiinivalmiste-näytteitä erotettiin DEAE-545-HPLC-kolonnilla eluoimalla 35 lineaarisella NaCl-gradientilla 0-0,5 mol/1. Fraktiot ste- 35 8 5 8 67 riloitiin suodattamalla ja niistä tutkittiin leukoregulii-ni käyttämällä mikrokoetta ja HT-29-kohdesoluja tai lymfo-toksiini. Leukoreguliini eluoitui NaCl-pitoisuudella 0,1 mol/1 ja erottui lymfotoksiinista, joka eluoitui NaCl-pi-5 toisuudella 0,15 mol/1.

Kuva 10

Leukoreguliiniaktiivisuuden virtaussytometrinen analyysi

Leukoreguliinin toista biologista vaikutusta, joka 10 voi liittyä sen toimintamekanismiin, arvioitiin virtaussy-tometrisellä analyysillä. K562-solujen tilavuuden tai kalvon läpäisevyyden muutokset, jotka ovat havaittavissa muutoksina pienessä kulmassa tapahtuvassa valon eteenpäin siroamisessa (0) tai fluoreseiinidiasetaatin (Q) tai pro-15 pidiumjodidin (Δ) fluorokromasiassa, arvioitiin käyttäällä 488 nm:n laseriinjaeksitaatiota FACS IV-virtaussytometris-sä. Ylemmässä kuvassa K-562-soluja käsiteltiin lymfokiini- valmisteella, joka sisälsi 10(---), 40(-*"-) tai 100(—*—) yksikköä dialyysisuodatettua lymfotoksiinia tai 20 500 (---) yksikköä alfainterferonia, 0-6 tuntia solujen lymfokiinivasteen selvittämiseksi.

Kun K562-soluihin lisättiin lymfokiiniä, aleni valon siroaminen eteenpäin pienessä kulmassa soluista, pro-pidiumjodidin fluorokromasia lisääntyi, ja FDA:n fluorok-25 romasia aleni. Muutos pienessä kulmassa tapahtuvassa valon eteenpäin siroamisessa heijasti muutosta solun koossa ja/-tai muodossa; solutilavuuden kasvu vahvistettiin tekemällä solutilavuusanalyysi Model ZB1 Coulter Counter-laitteella, johon oli lisätty Accucomp-solutilavuusanalyysiohjelma 30 (Coulter Instruments, Inc., Hialeah, FL). FDA:n fluorokro-masian pieneneminen heijasti kalvon läpäisevyyden lisääntymistä, koska fluoresoivaa solunsisäistä fluoreseiinia vapautuu solusta. Propidiumjodidin fluorikromasia lisääntyminen heijasti myös kalvon läpäisevyyden lisääntymistä, 35 koska propidiumjodidia tuli soluun ja liittyi nukleiini- 36 8 5 867 happoon. Ihmisen lymfokiinin aiheuttamat virtaussytomet-riset muutokset olivat havaittavissa 30 min:n kuluttua K562-solujen käsittelystä ja olivat suurimmillaan viimeistään kahden tunnin kuluttua. Alfainterferoni ei indusoinut 5 tämän ajan kuluessa mitään muutoksia solun pinnan rakenteessa tai plasmakalvon läpäisevyydessä. Alemmassa kuvassa K562-soluja käsiteltiin isoelektrisessä HPLC-fokusoinnissa saaduilla fraktioilla (näytteiden numerot taulukossa 4) 2 tuntia, ja mitattiin muutos valon siroamisessa ( -- ) ja 10 fluoreseiinidiasetaatin (- . - ) ja propidiumjodidin (...) fluorokromasiassa. Lymfokiinin vaikutusta solurakenteeseen ja kalvon läpäisevyyteen esiintyi vain niissä leukoregu-liinifraktioissa, jotka oli puhdistettu HPLCslla ja iso-elektrisellä fokusoinnilla. Fraktiot, jotka sisälsivät 15 runsaasti lymfotoksiinia tai interleukiineja ja interferonia, eivät saaneet aikaan havaittavissa olevia muutoksia solujen rakenteessa tai plasmakalvon läpäisevyydessä.

Kuva 11

Leukoreguliinigeenin kloonaus 20 Tämä juoksukaavio esittää leukoreguliinigeenin kloonauksen kuutta eri vaihetta (katso esimerkki 5).

Taulukko 1

Normaalien ihmisen perifeeristen veren leukosyyttien tai ihmisen B-solulinjojen, joita muodostui hiiren 25 myeloomasolujen kanssa tehdyn hybridisaation jälkeen tai transformoitui spontaanisti viljelmässä, leukoreguliini-tuotannon optimiolosuhteita tutkittiin. Suurimmat perifeeristen veren leukosyyttien tuottamat leukoreguliinitasot havaittiin, kun näitä soluja viljeltiin 48 tuntia alustas-30 sa, joka sisälsi 5 μg PHA:ta/ml. Ihmisen jatkuvat B-solu-linjat tai ihmisen B-solu-hiirenmyelooma-heterohybridomat tuottivat leukoreguliinia jatkuvasti kolmen vrk:n ajan, kun niitä kasvatettiin seerumivapaassa RPMI-1640-alustas-sa. Tetradekanoyyliforboliasetaatin lisääminen alustaan 35 pitoisuudeksi 10 μg/ml kasvatti leukoreguliinituotannon kolminkertaiseksi.

” 85867

Taulukko 2

Osoitus ainutlaatuisen kasvaintenvastaisen lymfo-kiinin, joka on eri aine kuin lymfotoksiini, läsnäolosta saatiin, kun verrattiin lymfotoksiinin (alfa-L929-syto-5 lyyttinen aktiivisuus) ja ihmisen kasvainsoluille syto-staattisen aktiivisuuden suhteellisia osuuksia 6 eri yksilöstä peräisin olevissa lymfokiinivalmisteissa. Sytolyyt-tinen vaikutus hiiren kasvainsoluihin ja sytostaattinen vaikutus ihmisen kasvainsoluihin vaihteli riippumattomasti 10 näissä valmisteissa, mikä osoittaa, että nämä kaksi biologista vaikutusta olivat selvästi erilaisten aineiden välittömiä. Kolmen yksilön leukosyyttien, joita ei stimuloitu PHA:11a tai joihin lisättiin PHA:ta viljelyn viimeisen puolituntisen ajaksi, tuottamat konsentroidut lymfokiinit 15 eivät hajottaneet mitään kasvainsoluja, eikä niillä ollut kasvua estävää vaikutusta. Kun samoja leukosyyttejä stimuloitiin PHA:11a 24 tuntia, ne erittivät kuitenkin merkittäviä määriä hajottavia ja kasvua estäviä aktiivisuuksia. Kasvainsolujen vastaisia vaikutuksia eivät siis saaneet 20 aikaan PHA, puskuri tai alustan ravintoaineiden loppuun kuluminen 24 tuntia kasvatettujen solujen ollessa kyseessä.

Taulukko 3

Lisätukea uuden lymfokiinin, josta tästedes käyte-25 tään nimitystä leukoreguliini ja joka on eri aine kuin lymfotoksiini, läsnäololle antoi sytolyyttisen aktiivisuuden ja kasvainsolujen kasvua estävän lymfokiiniaktiivisuu-den neuramidaasi- ja proteaasipilkkoutumisherkkyyden tutkiminen. Ihmisen lymfokiinin sytolyyttinen vaikutus alfa-30 L929-soluihin (lymfotoksiini) aleni 49 ja 92 % 0,2 ja 0,4 neuramidaasiyksikön vaikutuksesta ilman että esiintyi merkittävää lymfokiinin kasvainsolujen kasvua estävän (leuko-. . reguliini) vaikutuksen estymistä. Neuramidaasipilkkomisel- la sialiini-hapon (10 mmol/1) läsnäollessa ei ollut vaiku-35 tusta kumpaankaan aktiivisuuteen, mikä sulkee pois sen 38 8 5 8 6 7 mahdollisuuden että vaikutuksen lymfotoksiiniin olisi saanut aikaan neuramidaasissa esiintyvät kontaminoivat prote-aasit. Toisaalta proteaasit estivät sekä lymfotoksiini-että leukoreguliiniaktiivisuutta, vaikka eri asteisesti.

5 Kuusi yksikköä pronaasia tuhosi täydellisesti lymfotoksii-niaktiivisuuden, kun taas näytteen leukoreguliiniaktiivi-suudesta säilyi 52 %. Pilkkominen pronaasilla sai siis aktiivista ihmisen leukoreguliinia sisältävän näytteen vapaaksi lymfotoksiinista.

10 Syyriankultahamsterin lymfotoksiinivalmisteet si sälsivät myös leukoreguliinityyppistä aktiivisuutta hamsterin kasvainsolujen suhteen, ja antikarsinogeenista aktiivisuutta (24). Antikarsinogeenista aktiivisuutta ei ole mitattu ihmisten lymfokiinivalmisteista, koska ei ole saa-15 tavilla kvantitatiivista ihmissolujen muuttumiskoetta, joka olisi verrattavissa vastaavaan hamsterikokeeseen (4). Pyrimme määrittämään sen, olisivatko hamsterin lymfotok-siini- ja leukoreguliiniaktiivisuudet erotettavissa niiden neuramidaasi - ja proteaasipilkkoutumisherkkyyden perus-20 teella, kuten ihmisen lymfotoksiini ja leukoreguliini olivat. Määritimme myös sen, puhdistusko antikarsinogeeninen aktiivisuus yhdessä leukoreguliinin kanssa, jotta voitaisiin todeta, ovatko hamsterin antikarsinogeeninen aktiivisuus ja leukoreguliini identtisiä ja siitä syystä mahdol-25 lisesti identtiset myös ihmisissä. Samoin kuin ihmisen lymfotoksiinin ollessa kyseessä, neuramidaasi ja trypsiini hajottivat hamsterin lymfotoksiinia. Neuramidaasi ei pilkkonut antikarsinogeenista aktiivisuutta karsinogeenilla käsiteltyjen hamsterin solujen suhteen eikä hamsterin kas-30 vainsoluihin kohdistuvaa sytostaattista aktiivisuutta, kuten ei ihmisleukoreguliiniakaan, mutta mainitut aktiivisuudet heikkenivät 42 % trypsiinin vaikutuksesta, mikä osoittaa leukoreguliinin ja lymfotoksiinin samansuuntaisen keskenään erilaisen herkkyyden neuramidaasi- ja proteaa-35 sipilkkoutumiselle näissä kahdessa lajissa.

39 8 5 8 6 7

Taulukko 4

Tehtiin kaksivaiheinen fraktiointi, joka perustui molekyylikokoja poissulkevaan HPLC:hen ja isoelektriseen fokusointiin, sen määrittämiseksi, oliko ihmisen leuko-5 reguliinin syövänvastäinen aktiivisuus erotettavissa ja eri aine kuin monet muut lymfokiinit ja monokiinit. Kuten aiemmista tuloksista ennustettiin, lymfokiiniaktiivisuutta esiintyi korkeita (45 000 - 74 000), keskinkertaisia (30 000 - 38 000) ja pieniä (17 000 - 20 000) molekyyli-10 painoja sisältävissä fraktioissa, ja se rikastui fokusoinnin jälkeen pH-fraktioon 6,0 - 6,8. Leukoreguliinia esiintyi vain molekyylipainoltaan suuressa materiaalissa, ja se erottui kahdeksi lajiksi, joiden isoelektriset pH:t olivat 4,2 - 5,6 ja 7,1 - 8,4. Vaikka fraktiot, joihin leukoregu-15 liini oli rikastunut, sisälsivät jonkin verran lymfotok-siiniaktiivisuutta, sisälsivät fraktiot 1 ja 3 enemmän kuin 170 lymfotoksiiniyksikköä, mutta ei leukoreguliiniak-tiivisuutta. Siksi stimuloiduista ihmisen PBLsistä peräisin oleva lymfotoksiiniaktiivisuus voidaan erottaa leuko-20 reguliinista. Pienten molekyylipainojen fraktio sisälsi interleukiini 1 ja interleukiini 2 -aktiivisuudet kokonaan ja pääosan interferoniaktiivisuudesta. Missään fraktiossa ei havaittu makrofageja aktivoivaa aktiivisuutta. Kaikki fraktiot sisälsivät myös endotoksiinia. Endotoksiinin mää-25 rä ei korreloinut leukoreguliiniaktiivisuuden kanssa. Lisätodisteena siitä, että endotoksiniini ei ole leukoreguliiniaktiivisuuden välittäjä, oli se, että lipopolysak-karidiserotyyppien 0,55jB5 ja Olli.B4 lisääminen jopa pitoisuuksina 20 ng/ml ei estänyt K562-solujen kasvua.

30 Taulukko 5

Koska fraktiot, joihin leukoreguliini oli rikastunut, sisälsi pieniä pitoisuuksia interferonia, tehtiin li-säkoe sen määrittämiseksi, missä määrin interferoni saattaisi edesauttaa kasvainsolujen kasvun estoa. Eräästä läh-35 teestä (ML) saatu gammainterferoni ei hajottanut alfa- 40 85867 L929-soluja eikä estänyt ihmisen K562-kasvainsolujen kasvua. Eräästä toisesta lähteestä (FL) saatu gammainterferoni sisälsi 2000 lymfotoksiiniyksikköä/ml, mutta ei leuko-reguliiniaktiivisuutta. Alfainterferoni ei sisältänyt lym-5 fotoksiinia eikä leukoreguliinia. Leukoreguliiniaktiivi-suus ei siis ole alfa- tai gammainterferonin välittämä eikä tulos lymfotoksiinin ja gammainterferonin synergisti-sestä vaikutuksesta.

Taulukko 6 10 Fraktioimattomat lymfokiinivalmisteet sisältävät aktiivisuutta, joka edistää kasvainsolujen herkkyyttä NK-välitteiselle sytotoksisuudelle. Kohdesoluja leukoregulii-nille ja lymfotoksiinille herkistävien aktiivisuuksien suhdetta tutkittiin ihmisen lymfokiinillä, joka oli frak-15 tioitu peräkkäin HPLC:llä ja isoelektrisellä fokusoinnilla. Fraktiot, joihin leukoreguliini oli rikastunut, sisälsivät merkittävää kasvainsolujen vastaista NK-sytotoksi-suutta edistävää aktiivisuutta. Fraktiot, joihin lymfotok-siini oli rikastunut, ja ne, jotka sisälsivät molekyyli-20 painoltaan pienempiä lymfokiinejä, kuten interferonia, eivät lisänneet K562-leukemiasolujen herkkyyttä NK-välit-teiselle sytotoksisuudelle. Siten NK:ta tehostava aktiivisuus puhdistuu yhdessä leukoreguliinin tai on identtinen sen kanssa.

25 Taulukko 7

Joukosta ihmisen kasvain- ja normaalisoluja tutkittiin herkkyys leukoreguliinille. Ruuansulatuskanavan kar-sinoomien todettiin olevan ryhmänä hyvin herkkiä leukoreguliinille. Leukoreguliini ei vaikuttanut haitallisesti 30 normaalien paksusuolen limakalvosolujen eikä ihon fibro-blastien kasvuun.

Taulukko 8

Solupinnan leukoreguliinireseptorien monoklonaalis-ten vasta-aineiden sitoutumisen kvantitatiivinen määrittä-35 minen antaa ennusteen solun suhteellisesta herkkyydestä I: 41 85367 leukoreguliinin kasvua estäville vaikutuksille. Anti-leu-koreguliinireseptorin vasta-aineet sitoutuivat merkittävästi 15 - 23 %:iin HT-29-soluista, mutta vain 2 %:iin kymmenen kertaa heikommin reagoivista K562-soluista, tässä 5 epäsuorassa virtaussytometrissä immuunitluoresenssikokees-sa.

Taulukko 9

Jotta saataisiin määritetyksi leukoreguliinin mahdollinen teho in vivo ihmisen syöpiin, preparoitiin juuri 10 erotettuja paksusuolisyöpäsoluja ja viljeltiin niitä puo-likiinteässä, leukoreguliinia sisältävässä agaralustassa. Paksusuolisyöpä valittiin tutkimuskohteeksi paksusuolisyö-päsolulinjojen suuren leukoreguliiniherkkyyden takia. Kaikista neljästä potilaasta saatujen kasvainsolujen kasvu 15 estyi annoksesta riippuvalla tavalla leukoreguliinin vaikutuksesta, vaikkakin vaihtelevassa määrin. 50 yksikköä leukoreguliinia esti 98 %:isesti erään potilaan soluja, kun taas 4000 yksikköä leukoreguliinia esti 42 %:isesti erään toisen potilaan soluja. Tämä viittaa siihen, että 20 leukoreguliinilla on kyky hillitä ihmisen paksusuolisyö-pien kasvua.

Kirjallisuusviitteet 1. Aggarwal, B.B., Moffat, B. ja Harkins, R.N., "Human lymphotoxin: production by a lymphoblastoid cell line, 25 purification and initial characterization", J. Biol.

-/ Chem., 259 (1984) 686-691 2. Brouty-Boye, P., "Inhibitory effects of interferon on cell multiplication", Lymphokine Reports 1 (1980) 99-112 30 3. Brown, R.L., Griffith, R.L., Neubauer, R.H. ja Rabin, H., "The effect of T-cell growth factor on the cell cycle of primate T cells", J.Immunol. 129 (1982) 1849-.-. : 1853 4. DiPaolo, J.A., "Relative difficulties in transforming 35 human and animal cells in vitro", J. Natl. Cancer Inst.

70 (1983) 3-8 42 85867 5. Dolbeare, F.A. ja Smith, R.E., "Flow cytoenzymology:

Rapid enzyme analysis of single cells", teoksessa Flow Cytometry and Sorting, toim. M.R. Melamid, P.F. Mylla-ney ja M.L. Ilindelsohn, John Wiley & Sons, New York, 1979, s. 317-334 6. Evans, C.H. ja DiPaolo, J.A., "Lymphotoxin: an anti-carcinogenic lymphokine as measured by inhibition of chemical carcinogen or ultraviolet-irradiation-induced transformation of Syrian hamster cells", Int. J. Cancer 27 (1981) 45-49 7. Evans, C.H. ja Heinbaugh, J.A., "Lymphotoxin cytotoxicity, a combination of cytolytic and cytostatic cellular responses", Immunopharmacology 3 (1981) 347-359 8. Evans, C.H., Heinbaugh, J.A. ja DiPaolo, J.A., "Comparative effectiveness of lymphotoxin anticarcinogenic and tumor cell growth inhibitory activities", Cell.Immunol. 76 (1983) 295-3Q3 9. Granger, G.A. ja Kolb, W.P., "Lymphocyte in vitro cytotoxicity: mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction", J.Immunol. 101 (1968) 111-116 10. Haspel, M.V., et al., Science 220 (1983) 304-306 11. Hoover, H.C., et al., Cancer Res., huhtikuu 1984 12. Kern et al., Int.J.Cancer 30 (1982) 725-729 13. Khan, A., et al., teoksessa Human Lymphokines, Academic Press, New York, 1982, s. 621-629 14. Kleinerman, E.S., Schroit, A.J., Fogler, W.E., ja Fidler, I.J., "Tumoricidal activation of human monocyte activity -·· in vitro by free and liposome encapsulated human lympho kines", J. Clin. Invest. 72 (1933) 304-315 15. Laemmli, V., Nature 227 (1970) 680-685 16. Lambin, P., ja Fine, J.M., Anal. Biochem. 98 (1979) 160-168 17. McConahey, P.J. ja Dixon, F.J., Int. Arch. Allergy Appi. Immunol. 29 (1966) 185-189 43 85867 18. Mizel, S.B., Oppenheim, J.J., ja Rosensteich, D.L., "Characteization of lymphocyte-activating factor produced by macrophage cell line P388D1. I. Enhancement of LAF production by activated T lymphocytes", J.Immunol. 120 (1978) 1497-1505 19. Papermaster, B.W., et ai., teoksessa Lymphokines and Thymic Hormones, Academic Press, New York, s. 739-799 20. Penn, I., "Depressed Immunity and the Development of Cancer", Clinical Experimental Immunology 46 (1981) 459 21. Pross, H.F., Haines, M.G., Rubin, P., Shragge, P. ja Patterson, M.S., "Spontaneous human lymphocyte-mediated cytotoxicity against tumor target cells. IX. The quantitation of natural killer cell activity", J.Clin. Immunol. 1 (1981) 51-63 22. Rabin, H., Hopkins, R.F., Ruscetti, F.W., Neubauer, R.H., Brown, R.L. ja Kawakami, T.G., "Spontaneous release of a factor from a continuous line of primate tumor T cells", J. Immunol. 127 (1981) 1852-1856 23. Ransom, J.H. ja Evans, C.H., "Lymphotoxin enhances the susceptibility of neoplastic and preneoplastic cells to natural killer cells mediated destrucktion", Int. J.

Cancer 29 (1982) 451-458 24. Ransom, J.H. ja Evans, C.H., "Molecular and biological characterization of Syrian hamster lymphotoxin's anti-carcinogenic and tumor cell growth inhibitory activities", Cancer Res. 43 (1983) 5222-5227 25. Ransom, J.H., Evans, C.H. ja DiPaolo, J.A., "Lymphotoxin prevention of diethylnitrosamine carcinogenesis in vivo", J. Natl. Cancer Inst. 69 (1982) 741-744 26. Ransom, J.H., Evans, C.H., Jones, A.E., Zoon, R.A. ja DiPaolo, J.A., "Control of the carcinogenic potential

Q Q

of technetium by the immunologic hormone lympho toxin", Cancer Immunol. Immunother. 15 (1983) 126-130 27. Ransom, J.H., Pintus, C. ja Evans, C.H., "Lymphotoxin 44 85867 amplification of tumor cell growth inhibition is specific for natural killer cells but not for macrophages", Int. J. Cancer 32 (1983) 93-97 28. Ransom, J.H., Rundell, J.O., Heinbaugh, J.A. ja Evans, C.H., "Biological and physiococnemical characterization of keyhole limpet hemocyanin-induced guinea pig lympho-toxin", Cell Immunol. 67 (1982) 1-13 29. Remold, H.G. ja Medhis, A.D., "Two migration inhibitory factors differ in density and susceptibility to neuraminidase and proteinases", J.Immunol. 122 (1978) 1920-1925 30. Rosenberg, S.A., Henrichon, M., Coyne, J.A. ja David, J.A., "In vitro studies of LT produced in response to antigen stimulation of lymphocytes", J.Immunol. 6 (1973) 1623-1629 31. Sawada, J., Shiori-Nakano, K., Osawa, T., "Cytotoxic activity of purified guinea pig lymphotoxin against various cell lines", Jpn.J.Exp.Med. 4 (1976) 263-271 32. Trinchieri, G., DeMarchi, M. , Mayer, W. , Savi, M. ja Cep-pelline, R., "Lymphocyte antibody lymphocytolytic interaction (LALI) with special emphasis on HLA", Transpaint. Proc. 5 (1973) 1631-1646 33. Trinchieri, G. ja Santoli, D., "Anti-viral activity induced by culturing lymphocytes with tumor-derived or virus-transformed cells", J.Exp.Med. 147 (1978) 1314-1333 34. Williamson, B.D., Carswell, E.A., Rubin, B.Y., Prender-gast, J.S. ja Old, L.J., "Human tumor neurosis factor produced by human-B-cell lines: synergistic cytotoxic interation with human interferon", Proc.Nat1.Acad.Sci.

80 (1983) 5397-5401 li 45 85867

H

G

•H

P

i—I

3 tn di p o λ; ~ 3 ή α> e >-h \ m m :3 3 3 :0 (N o r-i .n

-P x rH (O O

4J x in in dl -h in i -P in ·· cq

O M CJ

P 3 >i O G

ιί Γ' dl •n ro 3 -PC -3 dl -H .X Ό

dl .H p -P

•P 3 >0

id Ή ^ H

3 0 X3 Ή CO a

03 in I £ -H

O I -H -P + \ » Ί3 H ffl +J (U O O O < 3 O G dl ^ ^ θ' Λ 33 c-H-p toin to te ^ -p -p G <u o x; r-thrPrH tn -p o in X) 3 i i i en 3 0 C -H 3 03 HdPHM3 >H £ e £ .x o s s g \ 3p 3 X! G Ή (XOfXCUO 0 -p H H 0 PS rH Ci DS I—I rH 4-j rH o £ 03

3 \ G

0 -P 3 3

,Χ ·Ρ 3 3 P

Xi C -ro rH 4->

3 -H C O

rH -H -H 03 C

3 rH rH o dl 3 3 3 rH ro in in

EH tn rH 1 00 03 O -P

dl O ro 00 00 rH £ pm 3 vo vo X ,2

O VO rH rH OH H

,X Xl Ό 3 dl -P I 3 i—i *P o £

-P -X -— O

C >1 3 rH O

d) >1 d) £ Ό

10 UI H \ -P

P O -P :3 P

H X 3 e :0 rH

3 3 4J'P'r! «. >1 3 <D -P -p .X oo m o ooino o x:

£ P UJH-P OOH 'TO

•P-P303 (NrHVOP

-p e o tn,x rH q)

O. dl C dl >1 -P

O P B Pw H dl dl g X3

> P -P

r- PS P

C 3 .(rt rH -P

d) I e rH 1—I £ ·* rH -p 03 -P 4J 03 rH £ £ \ :3 :3 :3 £ X! p-Pdi \ \ <; e n en cm \ i

P G UI -P 1 < < to -P 03 -P 03 *P 03 ι-l G

QJ-p-p e . a sm chc>ic:>ic:>h m m dl O X! G >, S (XIX CrHCrHCrH (X e

P Λ 3 3Ή ^ 3 dl G dl 3 dl -P

•P 3 03 -P 01 tr tntn 3-Ρ·η-Ρ·η·Ρ·η vo £

P .X O *ΓΡ ^ 3 3 \ Ή rH rH o X

dl CP ZJ oN \ \ O rr -P 00 -P ΓΗ -P rH H

Pi HO (N>Ch in «H H N > vf > h > 3 O

46 85867

Taulukko 2

Sytolyyttisten ja sytostaattisten aktiivisuuksien suhteelliset määrät eri yksilöistä saaduissa ihmislymfo-kiinivalmisteissä

Valmiste Alfa L929 K562 syto- 3uhdea sytolyytti- staattisia siä yksi- yksiköitä/ml _ köitä/ml________ ___ HU-4 1 600 95 17 HU-8 10 000 8 1 250 HU-11 970 42 23 HU-12 5 000 4 1 250 HU-13 1 500 93 16 HU-17 5 400 20 270 aSytolyyttisten yksiköiden suhde sytostaattisiin yksiköihin 47 85867 -H 6 i! ! 5 S 5

J tn :rd -M

ri M -H -H ^ -¾ fd tn :0 r-, cn O X. -h ,5 tn ^ (0 UH -H C -rH ' ^

•n C -P S U) 00 O >H CN

F c φ ,y in in oo on l ,π <Cr>>i H H com

•H

mc _, to -h ‘ d ^ ^ tn \ cn Ό QJ t— q · * m <3* •h 4-J σ> -p tn -- -- g tn σι ί>ιΛί '»n o r-

J3 g U) >i CN IN ID CN

m δ 3 Λ

CL) ON 4J

C C tN S Q

W -H ^ ° £ >1 M (0 Q · ·—· oo '— ϊ>ί >1 m-Ptn ocn to ή 3 & 3 Sr£ 3 S S3

P

0) Λ +j 'ä S o ^ ίο S in -p tn ^ c m S, C; oo r»

•H CN CO >1 rH rH

[1 m M cn o ^ in tl) id -P tn ^ o LQ ?Ί^ί o ON to χ G « tn >i cn rH tn

Pi <u .2 3 -P Oi 3

Ή tn CN rH

3 Ai M ON H r-N 3 (03 m *-3 · .£ £* m

Ph H ^ d \ ON _

^ Ξ m td Q · O — O

tn QJm-ptno o -P

•h 0 H «3· m tn > « <! tn> m rr 0) p c •H -H \ ?Π -PC | ? £

M -h 4-> tn -H

(0 -H M r4

•H * ^ ~ ~ S

~ CQ 05 — CN ^ 00 3 o ro ro -p •h ε <x> -P w ^ w-w-'w-q r—I >, LO >ι·Η rH o o mr^voro q] ^ ,—{ W 4-* S Ή p—I (ΝηΗιΗιΗ ui

01 P

O) <u c £ . . P -H φ o ή tn i h il 3 S) g σι +j < Λ p “i g cn -P · n <D "H £ ON >i tn -h Ή g H M Pl 5iV ON ^ 3 _ -P >1 ^ NO '— o (0-P m <o Q ^ — ON ON o .r->rH A Ή -p »0 00 H O '-" ON Ή (0 o v 3 S-ή in oo id in * ' tn ! o ►*<<; tn tn rorH m cn o tn -h x β C rH C) •p -H :2 £

'H Λ rt :ι0 :io H

» Ή >i :0 :0 :nj -H -H

ϋ Μ H X ,ϊξ :ö :t0 :(0 -H :cö -P

o to o) -¾ 3 '8 ί Ώ S :S 3 S

s s s « ^ }a f 3 3 s s s " I, S 3 1 «g tB S *§, *1 11 rfj o > o> Λ m-P no ^ no CP (0 48 85867

G

G

<U

Q) $

:rO

•r-i

G

P

G

G

•H

O

tn

G

O

m o

o G G o -P

Q) · -H

tn (N o H CN UI LD o o

G I G O ko O

•P o λ; 1-1 cn o o I—I o o o m o

X o O LQ

Q) O tn 01 i—I *

0) Γ- -P

0 Ή W

tn

•H

m •n .P ar

^ *" " uo O

•g r'OOrsi (N oooo o oi—lm

-'T G

G O

O -H O

X O OI

X -H - O 00 V£> G -P oo * *· r- i—i i—i ,*; ro ό ko i—i oooo o οΉιη G <d l

G P O

E-< MP o

1 O I

U *· CN kO

iG O * - ^ Λ tn tn oooo o oi-ho

P

0) I

T3 iH

2 ' ' LO (N Γ"· o OO

G t^· oo ld (n i—i n o o oo o·—I·—i tn

•H O

> O

PO •P - I

-P kf O00 χ - * fn

Trt I .n in ko O O

ro ^kOkOyj rp (N 00 O O <N OOOrP

G O

•p o i G *· rg ko

•2 ^2—T,^· VO kO ro -T OLD

•p kt kf m r- .H cn rp o o ό ocvjcn λ; 0

li I ·· r—| (N

e - o -g .p .L §

>7 I S pXlG-PrtJtdGGG G G -P

•H -p^ G M ϋ} ‘H *H iH r-H *H *H 33 φ *H C ·Η rH ·Η C h ·Η rH i—I iH *rH ·Η *H C Ή E ·Η m S ^ 5 s u> i2 jr>u3" oi" 18 S’·8 ίί-μ ui 8

! ίοΐ 5?« jjgjjjjj 5'g « I

•p Φ G i—i -p-POOinvopporo o > -P P

1 ΪΪ 8 -g Jj 1 -¾ s ~ 2 S b B,s bji | I

S a S. S ii !s S 8 S S 1^8 li S S

t.

49 8 5 8 6 7 (Taulukko 4, jatkoa) a = Kaksi ml ihmisen lymfokiinivalmistetta, joka sisälsi 750 lymfotoksiiniyksikköä ja 55 K562-sytostaattista leukoreguliiniyksikköä, erotettiin geeliläpäisy-kromatografiällä fraktioiksi, joiden molekyylipaino-alueet olivat 45 000- 74 000, 30 000-38 000 ja 17 000-22 000. Fraktio 17 000-22 000 pidettiin 4°C:ssa, kun taas kaksi korkeamman molekyylipainon fraktiota erotettiin edelleen isoelektrisella fokusoinnilla pH-fraktioiksi 7,2-8,4, 6,1-6,9 ja 4,2-5,6. Fokusoinnin jälkeen yhdistetyt fraktiot dialysoitiin PBS-PEG:tä vastaan ja steriloitiin suodattamalla ennen koetta, b = Kaikki aktiivisuudet ilmoitetaan yksikköinä/ml. c = Alfa-L929-solujen hajoaminen d = Kasvua estäviä yksiköitä e = Hajottavia yksiköitä f -- ng/ml.

50 8 5 8 6 7

Taulukko 5

Interferonin kasvainsolujen vastaisen aktiivisuuden määrittäminen

Ihmisinterferoni Virusten Lymfotoksiini- Leukoreguliini- tyyppi & lähde vastaisia yksiköitä/ml yksiköitä/ml 5 yksiköitä/ -------------ml t- —--------------------------------------------------------

Ganma-(FL) 5 x ΗΓ /ml 2000 0

Ganna-(ML) 5 x loVml 0 0

Alfa-(S) 1000/ml 0 0 a = Alfa-L929-solujen hajoaminen b = K562-solujen kasvun esto

Taulukko 6 NK-kasvainsolujen vastaista sytotoksisuutta edistävän 15 aktiivisuuden molekulaarinen karakterisointi

Molekyylipaino 45,000-74,000 17,000-22,000 NK-alusta-

Isoelektrinen pH 4,5- 6,0- 7,4- Ei fokusoitu vertailu ______________ ...5,5 6,7.......8a5................................ ....

Lymfotoksiini^ 0 151 0 70

Q

Leukoreguliini 813 0 20 NK:ta hajottavia f yksiköitä*3 548£ 356 477r 253 276 per 104 solua . . NK-edistäminene 2,0 1,3 1,7 0,9 25 a = Kaksi ml ihmisen lymfokiinivalmistetta erotettiin mo-lekyyliseula-HPLC:llä fraktioiksi, joiden molekyylipaino-alueet olivat 45,000-74,000 ja 17,000-22,000. Korkeamman molekyylipainon fraktio erotettiin isoelektrisellä fokusoinnilla fraktioiksi, joiden isoelektriset pH:t olivat 30 4,5-5,5, 6,0-6,7 ja 7,4-8,5. Kaikki yhdistetyt fraktiot dialysoitiin PBS-PEG:tä vastaan ja steriloitiin suodattamalla ennen koetta.

b = Alfa-L929-solujen hajotus, yksikköä/ml. c = K562-solujen kasvun esto, yksikköä/ml.

35 d = K562-soluja 1 ml:ssa suhteessa 1:5 laimennettua tut- l 51 85867 kittavaa fraktiota tai alustaa inkuboitiin 1 tunti ja 51 tutkittiin sitten 4 tuntia kestäneessä Cr-vapautus-kokeessa NK-soluja käyttäen.

e = Käsittelyryhraän hajottavien NK-yksiköiden määrän/10^ 5 solua suhde NK-alustavertailunäytteen vastaavaan arvoon, f = Tilastollisesti merkittävästi erilainen kuin vertai-lunäyte (p < 0,05) Studentin t-testin mukaan.

52 85867

P

3 c ίο O 'd •H § P p "id P G ·Η : rH o 00 O ID (Ί if) in O 00 r-f CD -4-) i oo ^ cm cm cm oo ^ cn m

3 Ό C I

&-S3 I

ft A? - !

I

C -H •H :0 ^ 8,¾ i 3 $$ ; •5 ! 3 g?£ ; p (d i cm cm

σ' p p i oo n U

S g S i 0 .2 P :<d

Is i i in ,

P I

0) — ! t3 P ! ^ K C~ i o t B:2 ' X "3 w :S : λ; <u qj :(d p '· p Λ c g -P ί ,_i ^ -P --'ί ^ ij ci c φ 3 2 o 53 φ p —ί

P w -H -n in I

Η -Ή ,ϋ :0 -H :P o r- cm cm m ^ s si 11 " " " H a "8 8 8 ! <j

W w fp 4-1 I P

td > m ί uj c m p g p

<U _ (0 -H O ID CM (Τι O P

•n C ffl O ' ' ' ^ ' 3 P <D C -Η i rH rH rH CM ID ^OO O ID Ο Λί

H TO p 4-> 00 CM CO ΓΝ ID H H

Ο P P ,V ί—I Γ— 00 <d 10 HV i > •H Q P >4 ί H ffl (|J Cl I ·Η 3 j Q)

1 i rH

Q O p

G 1 P P rH

ί *H W *H *H id 0

fO j rH W rH *H i—I g to C

•Γ^ I 5 O -H O rH o 0 :¾ Q]

>33 3 3 0 3 O g G

q §3 3 3 § 3 -5 § '3 11 s I =' «* =' -s I s* ö -s B· is 3=’ =' § «S 3 ft ι ι i ft ft i ft ft i .¾ ω ι i w P p p Ό G »H Q ^ O P Q O H id Ö) WC O 00 00 M1 pt^ ft H c-Hcn οΟ'ΤίσΐΓ' ω oo ty g P Piflcgjj^aiPimiHcooOPP^cM-^m flrH d H I Ό J J p J I id > <_) P I I coin 2

u & sl g H 5 n s s <3 sb^S

j 53 85 867 s I Sm 3 ί ~ ! to fr % tj .2 ! °» 3 - •i is § 1 id □ if 3 .ρ ί—I tn Η Ί-1 H ΑΛί'-' CM <aidc e c * s a a 5« s « :0 -H ί> & S’3¾ o 6 3 § S* g ca x <ΰ 3 cd m

P r* > H +J (C

ω m m o -p m ,¾ S m m pc

^ w [Λ I w M

•He ΟΊ rH

p .. ία :(d c n| ·* <u <#> m p ro τα i m c t o^i S 3 3 hh £ " 10 ä «η « ϋ li

3 S 3 3 :S:S

m ω m * | χ SS

O 3 w (N O CO CO

x e p m x x 4J+JO:m e 03 en >i tn m cd -Ρ P m in o o o w „ v r°S§ ^ ·Η 0) .m p m H qj ή c e -p -p m ν' j- Γ" m p .p ^ uj Γ <d :m :rn

nimenin p fd O M M M

n m w m ij β -P rä 2 m m m ° co ._j m -p ^ 3 tn cl -h ;m :;d * -p 03 i H os ρ p λ; X! :θ -H :m VO H I I I m _ 0) :g :m p p λ; tj m * m =, =, =, ·# 12 8 :g :g ή u3 o Λί x ;m ° > 1 1 * .o izl N ε ε

P in -H 3 :rd . 03 -H -H

metflOig w - 03 O Ρ P

H Cl CM :rn -H P -P -P

•n P >1 C H :3 -P X Ä 3 1 S m jljl o m > (d ill ρ <μ .ρ .ρ

«ime » q=ricQ3-H

•H (d-H M 00 CO O O m I le o &.M H -H

ή C to ° Min >-P 1 -O e ^ S, 5,

m 03 e -H -H P 5 · -S g, £ K

m η m -p rj n 3 cd *h *h m m

Semi ^d-p'doo p m i 3 , 05 <4 -ki '3 r £

2 £ m t ££$ ΰ 1 M

c M m h tdP :m 03 -h e * h la 3¾ s s , s . , 1 « a & f & .5 5

h n Q 6 C ‘8< £; ^ iQJradPdP

CDj O P (3 :y ® -H C X3 3 -n -H >i m ^ S -5 -8 *g fr 3 :jd| I ^ 2¾ -Sr > * g -a λ Äl B-p S-p 12 S. § i s * .. | « f» s ϊ§ s na aa la a* aa * a i § ia i -g a a s s 3 s , . a s s * aa e ^ω^ΌαίίΡΛΟ^οΗΜίί ·η3ομο)ο3 ä :5 2Μ«5ίΜ«Ι1)0ΐ(ΐι>Ο I I P-PiMii

ri >i -H :<n 3 m P P

05 to Μ ffl (M M H Q O

-H3 mm gR pp ««

Em -Po (d (N I idMr~Lnr~ 3n pm t-iioaeMvoofnii n nil H 5 54 85867

Taulukko 8

Virtaussytometrinen analyysi monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumisesta solun pinnan leukoreguliinireseptoriin

Monoklonaalinen Positiivisia soluja (%) vasta-aine_____________HT-29_K562_

LrR-MP28 23 2

LrR-M2 15 2 l· 55 85867

rH

I 6 •H \ I—I lid

O -P

d -H c

W :0 <D

d Jrf to U) -Η -Η Λί (Λ Λ ^ _ JO ^ m ^ α >ι «.

rj O O O <* 9

CC TT «r »O

O) -H

to -rt £ •H Ή VO ΓΟ O O d e d «o > λ σ' « •HO) to

u M

c o •H ^ ^ u j—L £ x; d »n o o e d

HO) o o ro rH

d -H *» TT o -p o i (U +J CO 00 O ro av

4J 0) VO <N rH (N

tO d) I

Π) Eh

•ro 3 · K

i—I 0) S

id c or 07 cr rr -H ro

rv -rt O O O m -HO

H to rH

•H Id Ξ 5 ·*

P id . . . . . . 7*ί X

d d g £ oo «n co in g " o " S ·> * " ~ g s M - tn >i id ,x c o r-, tn id d -h u λ -* Ή -H P-i ·—· C ·Η d > · (d id id <-t E-· ί> -— E -h tn id <d 3 --'id m tn λ; -h tn 3 C id <0 5Ö -H ·Η Ή rH G H -H 3

rH 3 H -P -H

•H Q) 3 vo ^ vo ^r -ΡΉ p > tj> d) Ή

Id >1 d) +1 H-l +1 H-l -p d tr> tn P tn tp id\0 im cm Tr o OO) :td ,χ r\i r- ·*τ vo p p

tn 4J d PO

d -h 0) -rt .X

-P 0) rH -h d 3 x tn o) «d M M G Ή tn h 5d id W td tn id tn g w d :0 ·· > d) rH I-H Ai Λ1 0« ·Η + I ΟΛίΡ 3 tn -h > •h tn C 3 -H LO M ro •H -rt £ O >1 . . -H JS -rl rH 3

- · rH -rt C O -HO

ddP xtn-p turned) ^ . S -x tn £ ° g i m £ £ rsi >, 0) O rH 3 S S S V »Il 3 :0 +J -H o Tr — —

Φ O 1¾ r> cz> GO CO fOpQ

Claims (3)

56 85 867

1. Menetelmä leukoreguliiniksi kutsutulla lym-fokiinilla rikastetun valmisteen tuottamiseksi, jolla 5 proteiinilla on seuraavat ominaisuudet: (i) kyky säätää pahanlaatuisen kasvaimen fysiologia ja kasvu vaikuttamatta normaalien solujen kasvuun, (ii) kyky suoraan hajoittaa ihmisen HT-29- ja RPMI 2650-kasvainsolut, 10 (iii) kykenemättömyys hajoittaa hiiren aL 929 solu ja, (iv) kyky vaimentaa ihmisen kasvainsolujen K 562 ja RPMI 2650 jakautumista, (v) jolloin kohtien (i) - (iv) mukaiset aktiivi- 15 suudet ovat herkkiä proteiinin proteaasi- mutta ei neur- aminidaasi-käsittelylle, (vi) molekyylipaino 120 000 - 140 000 Daltonia, (vii) isoelektrinen piste alueella 4,8 - 5,5 ja/tai alueella 7,5 - 8,3, 20 (viii) eluoitavissa ioninvaihtokromatografiässä välillä 0,07 ja 0,12 mol/1 NaCl, tunnettu siitä, että a) viljellään lymfokiinia tuottavia soluja, b) lymfokiinia tuottavista soluista vapautetaan 25 lymfokiinia sisältävä proteiinifraktio, c) proteiinifraktion proteiinit erotetaan molekyy-lipainonsa ja/tai molekyylivarauksensa perusteella, ja d) jokaisen kohdan (c) mukaisen erotusvaiheen jälkeen valitaan proteiinifraktio, jolla on mainitut ominai- 30 suudet.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohta (c) käsittää vähintään yhden seuraavista erotustoimenpiteistä: (aa) HPLC . 35 (bb) ioninvaihtokromatografia li 57 8 5 8 6 7 (cc) elektroforeesi (dd) geelisuodatus (ee) isoelektrinen fokusointi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että lymfokiiniä sisältävä proteiinifraktio on konsentroitu kasvualusta, joka saadaan ihmisen perifeerisen veren yksitumaisten solujen, jotka on käsitelty fytohemagglutiniilla leukoreguliinin tuotannon stimuloimiseksi, viljelmästä. 10 58 85867