NO170423B - Fremgangsmaate for fremstilling av et humanlymfokin, leukoregulin eller en subenhet derav - Google Patents

Description

Det er nu oppdaget et nytt humanlymfokin, leukoregulin eller en subenhet derav, som er i stand til direkte å lysere og å undertrykke proliferering av humantumorceller og å øke deres ømfintlighet overfor lysering som er mediert av naturlige dreperlymfocytter.

Disse antitumoraktiviteter har man tidligere tilskrevet lymfotoksin. Det er imidlertid nu funnet at humanlymfokinpreparater med disse antitumorcelleaktiviteter er biokjemisk separerbart fra lymfotoksin og andre tidligere isolerte lymfokiner inkludert interferon, interleukin 1 og 2 og makrofagaktiveringsfaktoraktiviteter.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et humanlymfokin, leukoregulin, eller en subenhet derav, som ikke er nøytralisert av antisera til lymfotoksin, tumornekrosefaktor, interferon eller cytolysiri, som har evnen til å regulere fysiologien og veksten av malignant tumorer uten å påvirke veksten av normale celler, evnen til å lysere human HT-29- og RPMI-2650-tumorceller men ikke evnen til å lysere muse a-L929-celler, evnen til å undertrykke hurtig generering av human cancer celler K562 og RPMI-2650, idet disse aktiviteter er sensitive mot protease, men ikke mot neuraminidase, og som har en molekylvekt på ca. 120 000 til 140 000, bestemt ved nativ gradient-polyakrylamid gelelektroforese, 50 000 til 70 000 ved gel-permeasjonskromatografi og isoelektriske fokuserings-punkter i pH-området 4,8 til 5,5 eller 7,5 til 8,3, og fremgangsmåten karakteriseres ved at leukoregulinet er oppnådd fra en blanding inneholdende lymfokiner ved separering av proteinene i henhold til både molekylstørrelse og molekylladning.

Figurene viser identifisering av leukoregulin som et unikt og tidligere ukjent lymfokin og viser dets effektivitet ved kontroll av veksten av humantumorceller.

Lymfokiner, hormonene i immunsystemet, kan potensielt influere utvikling av kreft for å uttrykke veksten av tumorigeniske celler, og sogar å ødelegge tumorer. Disse hormoner er glykoproteiner, fremstilt og utskilt av visse typer lymfoidceller og er innrettet på å samvirke med andre spesifikke celler. Spesielt er lymfokinene kjent for å bli produsert av og være i stand til å samvirke med mere enn en type celler. På tilsvarende måte er aktiviteten av de fleste lymfokiner kjent å være multifaseterte: Et spesielt lymfokin viser inhibering, stimulering, økning, kontravenering og andre aktiviteter med henblikk på forskjellige målceller og betingelser. Videre kan et spesielt lymfokin bevirke både inhibering og økning av karcinogenese under forskjellige omstendigheter. For eksempel er interferon kjent å inhibere viralkarcinogenese og øke strålingskarcinogenese. På den samme måte viser interferon antagonistiske aktiviteter med økning av NK-cellelysering av tumorceller mens den øker tumorcelleresistensen overfor NK-aktiviteten; det første fenomen opptrer tidligere efter eksponering til interferon enn det sistnevnte fenomen.

Lymfotoksin er et uttrykk som ble innført i 1968 for å angi det oppløselige produkt av antigen- eller mitogenstimulerte lymfocytter som medierer cytolytisk ødeleggelse av muse-L-celler (9). Flere laboratorier viste efterpå at . lymfokin.-preparater inneholdende lymfotoksin hadde direkte virkende cytolytisk og cytostatisk virkning mot en varietet av tumorceller (7, 30, 31), antikarcinogenvirkning mot celler som undergikk neoplastisk transformasjon (6, 25, 26), og evnen til å øke sensitiviteten av preneoplastiske og neoplastiske celler til NK-mediert ødeleggelse (23, 27).

Et antikreftlymfokin i hamsterlymfotoksinpreparater distinkt fra det som medierer muse L cellecytolytisk ødeleggelse ble senere identifisert på basis av molekylladningen (24). Dette 50 000 molekylvektsmolekyl med en isoelektrisk pH-verdi på 5,0 var cytostatisk for hamstertumorceller, inhiberte ikke veksten av normal hamsterfetalfibroblaster og inhiberte den kjemiske og strålingsinduserte neoplastiske transformasjon av hamsterfetalceller, både in vitro og ln vivo. Det unike antikreftlymfokin ble også identifisert til å være distinkt fra interferon, interleukin 1 og 2 og makrofagmigrerings-inhibitorfaktoraktiviteter. Denne oppdagelse førte til slutt til en ny retning for forskningen der humane lymfotoksin-preparater ble undersøkt for å fastslå hvorvidt humanlymfo-toksinpreparater inneholdt humanlymfokiner med unike antikarcinogene og antitumoregenskaper.

En oppgave for foreliggende oppfinnelse var biokjemisk og biologisk å karakterisere og å rense humanlymfokinet som var oppdaget og som hadde antitumoregenskaper med henblikk på direkte å lysere tumorceller, undertrykke deres proliferering og å øke deres ømfintlighet overfor naturlige drepercelle-lymfocyttmediert lysering, så vel som å inhibere den karcinogene transformering av normale celler. Dette ble oppnådd ved identifisering og isolering av leukoregulin, et lymfokin med molekylvekt ca. 120 000 til 140 000 med dissosiasjonssubenheter med molekylvekt ca. 30.000 til 35.000, som ble renset ved isoelektrisk fokusering ved pH-verdier på mellom ca. 4,8 og 5,5 eller mellom ca. 7,5 og 8,3.

En annen oppgave for oppfinnelsen var å identifisere de cellulære kilder for leukoregulin og å utvikle prosedyrer for å stimulere produksjon derav. Det ble funnet at perifere blodleukocytter,. en kilde for leukoregulin,. kunne stimuleres for å øke produksjonen av leukoregulin ved eksponering i et effektivt tidsrom til phytohemagglutinin. Den optimale eksponeringsperiode var 48 timer, lengere og kortere periode var fremdeles effektive om enn i mindre grad. Andre indusører ble også funnet å øke leukoregulinproduksjonen, for eksempel tetradedecanoylforbolacetat, konkanavalin A, og andre plantelektiner som er mitogene. I tillegg ble effektive leukoregulinproduserende celler fremstilt i enkelte tilfeller ved transformering av lymfocytter og dannelse av hybridomceller.

En annen oppgave for oppfinnelsen var å tilveiebringe en hurtig analyse for cellers ømfintlighet overfor leukoregulin, som ble gjennomført ved fremstilling av hybridomer eller transformerte leukocytter som produserte monoklonale antistoffer spesifikke for leukoregulincelleoverflate-reseptorer og kvantitere bindingen av antistoffene til målcellene som ble undersøkt.

Ytterligere gjenstander og bidrag ifølge oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse.

De ledsagende figurer 1 til 11 viser karakteristika og aktiviteter for leukoregulin til forskjell fra andre lymfokiner .

Det er nu oppdaget at humanlymfokinpreparater inneholder et unikt lymfokin med evnen til å inhibere veksten av humantumorceller ved direkte lysering, inhibere cellulær proliferering, og å øke ømfintligheten av tumorceller til NK-(naturllg drepercelle)mediert ødeleggelse. Man har benyttet uttrykket leukoregulin for dette lymfokin fordi det er et leukocyttprodukt og et cellevekstregulerende stoff som molekylært og biologisk er distinkt fra lymfotoksin, interferon, interleukin 1 og 2 samt makrofag aktiverings-faktoraktiviteter.

Leukoregulin har en molekylvekt på ca. 120.000 til 140.000, bestemt ved gradient-polyakrylamid-feltelektroforese og gelflltreringskromatografi, med dissosiasjonssubenheter med molekylvekt ca. 30 000 til ca. 35 000. Forbindelsen renses ved isoelektrisk fokusering ved pH-verdier på ca. 5,0 til 7,5. Leukoregulin fraksjonert i henhold til molekylvekt og isoelektrisk fokusering oppnås fri for påvisbart lymfotoksin, interferon, interleukiner 1 og 2 og makrofag aktiverings-faktoraktiviteter.

Et spesielt forsøk ble gjort på å sikre at egenskapene som ble tilskrevet leukoregulin er adskillbare fra de til lymfotoksin. Linjen av bevis viste at leukoregulin er distinkt fra lymfotoksin som følger: 1) lymfotoksin fra humanperifere blodleukocytter og meget godt renset lymfotoksin fra RPM-I- i 1788 humanlymfoblastoidceller og som lett lyserer murin-a-L929-tumorceIler, har ikke noe påvisbar antihuman tumorcelleaktivitet; 2) leukoregulinaktivitet sank efter protease- men ikke neuraminidasefermentering mens lymfotoksinaktiviteten sank efter både protease- og neurami-nidasebehandling; og 3) leukoregulin kunne separeres fra lymfotoksin ved isoelektrisk fokusering i arter som forårsaket lysering, vekstinhibering og forbedring av humantumorceller mot cytolyse med NK-celler men som ikke lyserte murin L-celler (aktiviteten til lymfotoksin). Således viste kombinasjonen av divergerende leukoregulin/lymfotoksinkonsentrasjoner i PBL-lymfokinpreparater, sensitivitet mot neuraminidase og protease, og differering av isoelektriske punkter, konklusivt at leukoregulin er forskjellig fra lymfotoksin.

Leukoregulin er også forskjellig fra interferon, et annet immunologisk hormon i stand til å inhibere cellulære proliferering. Interferon har vært vist å inhibere veksten av visse normale og tumorceller (2, 18). Imidlertid påvirker a-og "Y-interf eron ikke proliferering av noen av de her beskrevne leukoregulinsensitive tumorceller. Selv om visse humanlymfokinpreparater inneholder både leukoregulin og interferon, kan de to hormoner separeres ved molekylsikting. Interferonanrikede fraksjoner viser i tillegg ikke leukoregul inaktivitet .

I tillegg til inhibering av tumorcelleproliferering er rensede fraksjoner som er anriket på leukoregulin også vist å forbedre ømfintligheten av tumorceller mot NK-mediert cytotoksisitet. Denne aktivitet er motsatt den til interferon 33 og er unik for leukoregulin. Økningen av NK-mediert cytotoksisitet er antatt å være et viktig middel hvorved leukoregulin kontrollerer veksten av tumorer in vivo (27).

Et viktig aspekt ved mekanismen ved leukoregulinaktiviteten er forbindelsens evne til å endre celleoverflatemembran-konformasjonen og permeabiliteten til tumorceller. Strøm-ningscytometriske analyser ble benyttet for å måle disse endringer innen minutter efter målcelleeksponering til leukoregulin. Denne metode gir et stort potensiale for undersøkelser som krever korte analyseperioder som detek-tering av monoklonale antistoffer mot leukoregulin eller mot leukoregulinreseptoren.

Forbindelsene mellom leukoregulin og tumornekrosefaktor, et annet tumorcelleinhiberende lymfokin, ble også undersøkt. Humantumornekrosefaktorpreparater induserer hemorrag nekrose av visse musesarkomer in vivo og har den samme .in vitro aktivitet som lymfotoksin (34). Da renset leukoregulin ikke medierer den samme biologiske aktivitet som lymfotoksin er leukoregulin distinkt fra tumornekrosefaktor.

Hamster-lymfokinpreparater inneholder lymfotoksin, en leukoregulinaktivitet (vekstinhibering av hamstertumorceller med ikke normale hamsterceller) og en antikarcinogenaktivi-tet.- Leukoregulinaktiviteten og den antikarcinogene aktivitet renses sammen; imidlertid har disse to aktiviteter to isoelektriske pH-verdier, en som er distinkt fra hamsterlymfotoksin og en som er identisk med hamsterlymfotoksin (24). Hamsterlymfotoksin brytes ned av neuraminidase mens leukoregulin- og antikarcinogene aktiviteter er upåvirket. Hamsterleukoregulin og antikarcinogene aktiviteter er imidlertid tilsvarende ømfintlige overfor proteasefermen-tering. Ut fra dette og i samhold med andre biokjemiske data, er konklusjonen at hamsterleukoregulin også har anti-karcinogenaktivitet. Da humanleukoregulin har vist de samme biologiske og biokjemiske karakteristika som hamsterleukoregulin skulle dette også være antikarcinogent.

Når regulatorisk godkjennelse for kliniske prøver for eksperimentell bruk av leukoregulin ved behandling av humankreft oppnås, vil fase 1 klinisk prøve med pasienter med fremskredne neoplastiske sykdommer gjennomføres. Pasientene vil gies leukoregulin som beskrevet ovenfor. Dosene vil økes for å påvise de maksimalt tolererbare doser for hver terapiform ved evaluering av toksiske reaksjoner manifestert ved gastrointestinalsykdommer, anemi, leukopeni, feber og andre tegn på organskade og misfunksjon. Det forventes at leukoregulin godt vil tolereres og tillate administrering i høye doser. Behandlingsforsøk ved bruk av delvis renset PHA stimulert perifere blodlymfocyttsupernatanter som utvilsomt inneholdt leukoregulin, har antydet meget liten toksisitet med slike stoffer (13).

Fase II-kliniske prøver vil fokusere på bedømmelse av leukoregulin hos pasienter med begrenset sykdom med hvilke terapeutiske fordeler vil være mest åpenbare. Initialprøver vil benytte leukoregulin som et hjelpemiddel til primær-kirurgisk kjemo- eller radioterapi, senere prøver kan evaluere leukoregulin som en primærbehandlingsmodalitet.

Leukoregulin- vil administreres systemisk ved intravenøs eller intralymfatisk vei, lokalt ved intratumoralinjeksjon eller peritonialvasking, eller som ex vivo terapi. Eksempel på det sistnevnte er der benmargceller fjernes fra pasienten, behandles med leukoregulin for å fjerne tumorceller og benyttes for å rekonstituere benmargen hos pasienten efter at benmargen har mottatt meget høye doser av kjemo- eller bestrålingsterapi.

Leukoregulin vil administreres som en kontinuerlig infusjon eller som individuelle injeksjoner efter behov for å opprettholde de nødvendige nivåer av leukoregulin i sirkulasjons-system og vev.

Som et alternativ til direkte administrering vil kloning av leukoregulinkodende gener gi humanlymfoidceller som er gjort ute av stand til proliferering, i en tilnærmelse til opprettholdelse av konsistent jln vi vo-leukoregul inkonsen-trasjon ved .in vivo-produksjon. Bruk av celler med en begrenset in vivo-levetid vil sikre at leukoregulin-nivåene er kontrollerbare over relativt korte tidsrom.

Andre alternativer for direkte administrering inkluderer å skyte inn leukoregulinkodende gener i et viralgenom og bruke dette virus for å bære genet inn i en spesifikk gruppe celler som translaterer genene til leukoregulin, for derved å omgå de vanlige regulatoriske produkter som ellers ville begrense leukoregulinfremst111 ingen. For eksempel kunne Epstein-Barr-viruset som infiserer kun B-lymfocytter og vanligvis gir en begrenset og heller mild infeksjon, virke som en egnet viralvektor for leukoregulingener hvis viralgenomet endres til å forhindre sykdomsprogresjon under virusinfeksjonen.

Behandling av faste tumorceller vil være mest effektivt gjennomført ved maksimalisering av leukoregulinkonsentra-sjonen i tumorens umiddelbare omgivelse heller enn å prøve å opprettholde en meget høy konsentrasjon i legemet. Humane monoklonale antistoffer med kvalitativ eller kvantitativ spesifisitet for tumorcelleoverflateantigener ville utgjøre en egnet "krok" til hvilken leukoregulin kan kobles for å sikre høye konsentrasjoner i tumorene. En annen vei er å inn-kapsle leukoregulin i liposomer som kan ha tumorspesifikke monoklonale antistoffer på overflatene. Egnet utvalg av liposomale triglycerider tilveiebringer liposomer som er resistente overfor sirkulerende amylaseenzym og er i stand til å smelte sammen med tumorcellemembraner for intracellulær transport av deres leukoregulininnhold. Lipofile bærere (dimetylsulfoksyd, borsyrederivater) kan inkluderes i liposomet for å øke transporten av innholdet ved forbedret fusjon av membranlipidet med de til tumormålcellen.

Leukoregulinet synes å forbedre antitumoraktivitetene for kjemoterapeutiske midler (19) uten å bidra til de toksiske bivirkninger, og gir således et meget høyere effektivt dosenivå. Leukoregulin vil derfor anvendes i behandlingsarter med forskjellige kjemoterapeutiske stoffer og strålingsterapi for å bedømme denne antitumorøkende virkning.

Leukoregulinets antikarcinogene aktiviteter er like viktige som antitumoraktiviteten i forbindelse med anvendelse som cytotoksiske kjemoterapeutiske midler eller radioterapeutiske prosedyrer. En spesielt lumsk sekvens i forbindelse med strålingseksponering og kjemoterapi er opptredenen av nye neoplasmer beslektet med sykdommen som behandles. Med den samtidige administrering av leukoregulin kan meget høyere doser benyttes ved kjemoterapi eller strålingsbehandling fordi leukoregulin vil blokkere de karcinogene virkninger av disse stoffer. Leukoregulin vil være brukbar på tilsvarende måte benyttet sammen med immunosuppressive medikamenter ved behandling av pasienter med autoimmune sykdommer og trans-plantmottagere.

Leukoregulin er en terminalkomponent av en cytokin-lymfokin-kaskade som inkluderer rekruttering og immobilisering av lymfocytter og monocytter, deres aktivering eller differ-ensiering for å uttrykke forskjellige effektorfunksjoner, og fremstilling av faktorer som leukoregulin som utøver de cytotoksiske funksjoner. Forskjellige lymfokiner benyttet som en cocktail eller, mere sannsynlig, administrert i en egnet sekvens, burde øke lymfoidcelleinfiltreringen av en tumor (makrofagmigrering inhibitorfaktoren, interleukin-1), stimulere deres cytotoksiske funksjon (makrofagaktiverende faktor, interleukinene 1 og 2, leukoregulin og interferon), direkte-angripertumorceller (leukoregulin, NK-cytotoksisk faktor og interferon), og gjøre tumormålcellene mere ømfintlige overfor de cytotoksiske effektorceller (leukoregulin). I denne terapiform vil leukoregulin spille en meget viktig rolle.

I tillegg til tumorcellevekstreguleringen og NK-celle-medierte cytotoksisitetsforbedringsaktiviteter, som sammen stanser veksten av og begynner å redusere tumormassen, viser leukoregulin også antikarcinogene egenskaper som vil være spesielt brukbar for anvendelse i forbindelse med materialer som benyttes ved biomedisinsk diagnosebedømmelse og ved strålings- eller kjemoterapi, som i seg selv kan indusere karcinogenese (26). Behandling med leukoregulin under prosedyrer som har disse mulige bivirkninger vil forhindre karcinogenese under varigheten av disse prøver eller terapi (20).

På samme måte kan pasienter bedømmes med henblikk på deres nivå av immunosupresjon eller potensial risiko for å utvikle maligniøse tilstander ved å måle deres PBL-leukoregulinproduksjon efter stimulering.

Som et tillegg til leukoregulinterapien vil bestemmelse av ømfintligheten av en pasients kreftceller mot leukoregulin være forutsigende for effektiviteten av leukoregulin-behandlingen. Dyrking av en pasients tumorceller i nærvær av et leukoregulinholdig halvfast medium er en metode for kvantifisering av mengden av leukoregulin som er nødvendig for helt å inhibere veksten av tumorcellen. En hurtigere analyse er en der responsiviteten av tumorcellene bestemmes ved kvantifisering av mengden av leukoregulincelleoverflate-reseptor som eksprimeres på tumorcellen. Dette skjer ved måling av mengden monoklonalt antistoff rettet mot leukoregul inreseptoren som binder til tumorcellene under anvendelse av en enzymbundet immunoabsorbantanalyse, radioimmunoanalyse eller immunofluorescentanalyse.

Eksempel 1

Forkortelsene som benyttes i løpet av den følgende diskusjon er: PBS, 0,14 M NaCl, 0,1 M natriumf osf at, pH 7,4; PEG, polyetylenglykol, molekylvekt 4000; FBS, fetal storfeserum; IEF. isoelektrisk fokusering; HPLC, høyydelsesvæskekromato-grafi; NK, naturlig dreperlymfocytt; dThd. tymidin; MTT. 3-(4,5-dimetyltiazolyl-2)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid; FDA, fluoresceindiacetat; VCN, Vibrio cholera neuraminidase; PHA. phytohemagglutinin; PBL, perifer blodleukocytt; TPA, tetradecanoylforbolacetat; ELISA. enzymbundet immunosorbant-analyse; RIA, radioimmunoanalyse.

LYMFOKINPREPARERING. Til 20 ml "buffy coat"-leukocytter fra sentrifugert humant normaldonorblod ble besjiktet på 10 ml lymfocyttsepareringsmedium (LSM, Litton Bionetics, Kensington, Maryland) og sentrifugert ved 700 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Mononukleære celler ble samlet ved grense-flaten mellom LSM og plasma, vasket to ganger med RPMI-medium og tellet mikroskopisk i nærvær av 0,04$ trypanblått for å bestemme levedyktigheten, som alltid overskred 95$. Tyve millioner celler ble bragt på plate i 20 ml RPMI-1640 med 10 pg PHA/ml (PHA type IV leukoagglutinin, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) i en 100 mm plastvevkulturskål og inkubert ved 37° C i en fuktet inkubator med 5$ C02 og 95% luft.

Efter 24, 48 eller 72 timer ble lymf ocyttkul turmediet inneholdende sekreterte lymfokiner samlet og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 x g for å fjerne cellene. Lymfokinmediet ble konsentrert 40 ganger over et YMIO-membran i en Amiconcelle (Amicon, Inc., Danvers, MA) og diafiltrert mot PBS-0,1^ PEG. Det konsentrerte lymfokin ble filtersterilisert, veiet opp i mengder, frosset ved -30°C og benyttet innen en måned efter frysing (se tabell 1).

Meget renset humanlymfotoksin fremstilt av lymfoblastoid-cellelinjen RPMI-1788-1 ble generøst tilveiebragt av Dr. Bharat B. Aggarwal (Genentech, Inc., San Francisco, CA). 1788 cellelinjelymfotoksinet ble renset ved sekvensiell DEAE-cellulosekromatografi, preparativ isoelektrisk fokusering, lentil lektin Sepharose-kromatografi og preparative polyakrylamid gel elektroforese 1. Det rensede lymfotoksin hadde en molekylvekt på 20.000, et isoelektrisk punkt på 5,8 og en spesifikk aktivitet på 4 x 10^ enheter/mg protein.

Syrisk gullhamsterlymfokin ble fremstilt fra peritoneal leukocytter på en måte tilsvarende humanlymfokinet som beskrevet tidligere (24).

MÅLCELLER. K562-humanerytroleukemiceller ble tilveiebragt av Dr. Julie Djeu (Bureau of Biologica, Food and Drug Admini-stration, Bethesda, MD). OST-celler opprettet i kulturen i søkerens laboratorium ble oppnådd fra en nylig fjernet humanosteosarkom, vennlig tilveiebragt av dr. Elisabeth Grimm (NIH Clinical Center, Bethesda, MD). Normale human hudf ibroblaster, CRL 1457 (20 år kvinne), CRL 1505 (21 år mann), CRL 1537 (14 år mann), normale koloniske mukosale celler og alle andre humane tumorcellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Rockville, MD).

Alle celler ble opprettholdt og en gang i uken ført under Eagles minimale essensielle medium, MEM, supplert med 10% FBS bortsett fra K562-cellene som ble holdt i RPMI-1640 - 10% FBS- Murine a-L929-celler var en gave fra dr. Gale Granger (USC, Irvine, CA) og ble benyttet som et mål for lymfotoksin (7). 7997 celler er en benzo(a)-pyren-indusert tumorcelle-linje av syriske gullhamstere (8).

LYMFOTOKSINANALYSE. Lymfotoksinaktiviteten ble målt som lysering av murin a-L929 -eller ved bruk av en radionukleid frigjøringsanalyse (7). Antall cytolytiske lymfotoksinenheter i et preparat ble bestemt ved å plotte regresjonslinjen av logaritmen av den resiproke verdi av prøvefortynningen som forårsaket en 50 %- ig frigivelse av [<3>H]-dThd-merkelappen i 1 x IO<4> a-L929-celler under en tre dagers inkubering. (Se tabell 2).

LBUKOREGULINANALYSE. Humanleukoregulinaktivitet ble målt som vekstinhiberingen (cytostatisk aktivitet) av humantumorceller. For den cytostatiske aktivitet ble IO<4> tumorceller i 0,5 ml egnet kulturmedium platet ut i 24 brønners kultur-plater (Costar, Inc. Vambridge, MA). Hvert medium eller prøvene fortynnet over et hundre gangers område i 0,5 ml ble tilsatt i triplikat og cellene inkubert ved 37"C i et fuktet kammer med 5$ COg og 95$ luft i tre dager. Ikke-fastsittende celler ble kvantifisert ved en suspendering i 9 ml hematal og telling med en modell ZBI Coulter Counter (Coulter Instruments, Inc., Hialeah, FL). Fastsittende celler ble løsnet ved inkubering ved 37°C i 1 minutt i 0 ,0256 trypsin i PBS før telling som med de ikke-fastsittende celler. (Se tabell 2).

I enkelte forsøk ble inhibering av celleveksten bestemt ved å benytte en mikroanalyse. I denne analyse ble 2 x 10<3> celler i 100 pl RPMI-1640 - 1056 FBS platet ut i 96-brønners mikro-titerplater. Derefter ble 100 pl medium, 0,556 SDS eller lymfokinprøve tilsatt i kvadruplikat og platene inkubert ved 37"C i et fuktet kammer med 9556 luft og 556 C02 i 3 dager. Flatbunnplater ble benyttet for fastsittende celler og rund-bunns for K562 ikke-f astsittende celler. 20 pl MTT (Sigma)

(5 mg/ml PBS - oppløst under heftig omrøring og nyf remstil-t før bruk) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37° C og mediene så fjernet ved forsiktig suging med en 18 g nål. Det reduserte MTT, et purpurfarvet formazanprecipitat, ble oppløseliggjort ved tilsetning av 100 pl 0,05 M HC1 i isopropanol. Absorbansen av farvestoffet ble avløst med 540 nm med en ARTEK automatisert vertikalstråleleser (ARTEK Systems, Inc., Farmingdale, New York). Prøvebrønnen inneholdende SDS ble benyttet som blindprøve og trukket fra alle andre prøveavlesninger.

Ved preliminære forsøk ble celler podet i forskjellige densiteter og mengden redusert precipitat som ble dannet ble funnet å være direkte proporsjonal med antall celler pr. brønn. Mikroanalysen var sammenlignbar i sensitivitet med celletelleanalysen.

Den prosentvise inhiberingen av celleveksten i hver analyse ble beregnet som forholdet mellom det midlere antall celler eller absorbansenheter for prøven dividert med antall celler eller absorbansenheter i mediumkontrollbrønner, minus 1, multiplisert med 100$. Leukoregulincytostatiske enheter ble bestemt ved å plotte regresjonslinjen av logaritmen av den resiproke verdi av prøvefortynningen mot #-vekstinhibering og ekvaliserte den resiproke verdi av fortynningen som forårsaket en 50% inhibering av celleveksten. Humankolon-karcinomcellelinjen HT-29 er meget ømfintlig overfor vekstinhiberende aktivitet av leukoregulin og ble benyttet som standard for måling av leukoregulin, mot hvilke andre celler ble sammenlignet.

For den cytolytiske aktivitet ble tumorceller merket på forhånd med [<3>H]-dThd (7) og platet ut med IO<4> celler i 0,5 ml/brønn i 24-brønners plater. 0,5 ml medium, 0, 5% natrium-dodecylsulfat (SDS) eller prøven fortynnet over et hundre gangers område ble tilsatt i triplikat og cellene inkubert i 3 dager.

Platene ble sentrifugert ved 200 x g i 10 minutter og 200 jjI mengder av supernatantene ble fjernet, suspendert i 2,8 ml ultrafluor (NEW, Boston, MA), og tellet i en LKB-scintilla-sjonsteller (LKB Instruments, Inc., Rockville, MD). Prosent spesifikk [<3>H]-dThd som ble frigjort ble beregnet som følger: Antallet cytolytiske leukoregulinenheter ble beregnet på samme måte som lymfotokslncytolytiske enheter.

KARCINOGENESEANALYSE. Inhibering av syriske gullhamster-lymfokinpreparater av kjemisk og strålingsindusert transformering av syriske gullhamsterfetale celler ble studert ved bruk av en in vivo - in vitro transplasental transformerings-analyse som beskrevet tidligere (24, 25). (Se tabell 3).

INTERFERONANALYSE. Interferon ble analysert av Biofluids, Inc. (Rockville, MD) ved bestemmelse av inhiberingen av den semi-mikrocytopatiske effekt forårsaket av storf evesikluaer stomatittinfeksjon av humane neonatale forhudfibroblaster eller WISH-celler. Den humane WISH-cellelinje er 5 til 10 ganger mere sensitiv overfor •y-interf eron enn humanfor-hudceller. Detekteringsgrensen for denne analyse er en enhet antiviralaktivitet som er standardisert mot NIH-referanse-humanfibroblastinterferon. (Se tabell 4).

I enkelte forsøk ble virkningene av a- og -y-interf eron på cellulærbioanalyser bestemt, ot-interferon (oppnådd fra Sigma) ble oppnådd i Burkitt lyfomceller (Namalva) ved induksjon med Sendai-virus og hadde en spesifikk aktivitet på 1,1 x IO<6 >internasjonale referanseenheter/mg protein, -y-interferon med en spesifikk aktivitet på IO<5> antivirale enheter/ml ble generøst tilveiebragt av dr. Gary Thurman (NCI, Frederick Cancer Research- FacLLity.,. Frederik MD) og ble fremstilt av Flow Laboratories, Inc. (McLean, VA) og Meloy Laboratories (Springfield, VA) for Biological Response Modifiers Program (NCI Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD). (Se tabell 5).

INTERLEUKIN 1 og 2. Interleukin 1 aktiviteten ble bestemt ved måling av økningen av lymfokin fra prolifereringen av C3E/HeJ murin-tymocytter med respons på PHA (18). Tymocytt-prolifereringen kan også reflektere nærværet av interleukin 2; derfor ble lymfokin også prøvet på interleukin 2 ved bruk av en standard mikroanalyse (3, 22) basert på den interleukin 2 avhengige proliferering av OH-1 marmoset kontinuerlige T-cellelinje som er følsom overfor humaninterleukin 2. En humaninterleukin 2 standard (tilveiebragt dr. P. Jagannath, Litton Bionetics, Inc., Kensington, MD) hadde en halv maksimal prolifereringsforbedring ved en fortynning på 1:1500. En humaninterleukin 1 standard ble fremstilt i søkerens laboratorium ved bruk av den lymfokinproduksjons-metode som her er beskrevet (se tabell 4).

MAKRO FAGAKTIVERING OG ENDOTOKSINANALYSE. Disse to analyser ble generøst gjennomført av dr. Gary Thurman, NCI, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD. Makrofagaktiverings-aktiviteten ble målt som evnen for lymfokinet til å forbedre den cytotoksiske aktivitet av humanmonocytter for humantumorceller (14). Endotoksinet ble bestemt ved en kromogenanalyse (endotoksinkromogenanalysesett, M.A. Bioproducts, Walkers-ville, MD), følsom til ca. 0,1 ng. Det mulige bidrag av endotoksin til tumorcellevekstinhiberingen ble også under-søkt. Endotoksin (lipopolysakkarid) med serotype nummeret 055:B5 og 0111:B4 fra Sigma ble tilsatt til tumorcelle-cytostatanalysen i konsentrasjoner på 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 og 20 ng/ml. Virkningen på tumorcelleveksten ble målt som ovenfor (se tabell 4).

ISOELEKTRISK FOKUSERING. Preparativ kolonneisoelektrisk fokusering av de konsentrerte lymfokinprøver ble gjennomført innen et pH 3,5 - 10 amfolinje(LKB, Rockville, MD)gradient i en 110 ml isoelektrisk fokuseringskolonne (LKB) (28). 3 ml fraksjoner ble samlet og pH-verdien for hver fraksjon ble målt. Utvalgte fraksjoner ble slått sammen, diafUtrert mot PBS - 0, 1% PEG, filtersterilisert med et 0,22 pm Millex-filter (Millipore Corp., Bedford, MA) og analysert for biologisk aktivitet, (se tabell 4 og figur 8).

HPLC. Separering basert på molekylstørrelse ble gjennomført ved bruk av en preparativ Toyasoda G3000 SWG gel HPLC-kolonne

(distribuert av LKB). 2 ml prøver ble isokratisk eluert ved en strømningshastighet på 4 ml/min. med 0,02 M natriumfosfat-buffer, pH 7,4 med 0,156 PEG. 4 ml fraksjoner ble samlet, filtersterilisert og analysert på biologisk aktivitet (se fig. 4).

HPLC-separering basert på molekylladning ble gjennomført i en Toyasoda DEAE-545 analytisk anionbyttekolonne. Prøver i 20 mM Tris HC1, pH 7,4 med 0,156 PEG ble eluert i en lineær 1 times gradient på 0,5 M NaCl ved en strømningshastighet på 0,75 ml/min. To minutts fraksjoner ble samlet, filtersterilisert og analysert (se fig. 9).

POLYAKRYLAMID GELELEKTROFORESE. Konsentrert leukoregulin-prøver (enten ufraksjonert eller separert ved HPLC gelfiltrering og ionebyttekromatografi) ble elektroforesert på 4-3056 lineær gradient polyakrylamidgeler (16). Efter elektroforesen ble gelene skåret til 0,25 mm segmenter og skivene eluert over natten i medium - 1056 FBS. Eluatene ble filtersterilisert og analysert. (Se fig. 5).

Renset leukoregulin merket med 125j ble også elektroforesert på 1556 polyakrylamidgeler med en 556 akrylamidlagergel inneholdende 156 natrium dodecylsulf at (15). Prøven ble visualisert ved autoradiografi. (Se fig. 7).

RADIOMERKING AV RENSET LEUKOREGULIN. 25 enheter leukoregulin, renset ved sekvensiell HPLC og polyakrylamid-gelelektroforese ble merket med 125j ved bruk av kloramin T-metoden (17) og tilsetning av storfeserumalbumin som bærerprotein for å separere det merkede leukoregulin fra ikke-omsatt 125j på en Sephadex G-10 kolonne.

GELFILTRERINGSKOLONNEKROMATOGRAFI. 125I-merket renset leukoregulin ble eluert på en S-300 (Pharmacia Fine Chemi-cals, Upsala, Sverige) kolonne med 10 mM NaPO^buffer - 1,0 M NaCl, pH 7,4. 2 ml fraksjoner ble samlet og tellet. (Se fig. 6).

ENZYMATISK NEDBRYTNING. Følsomheten for human- og hamsterleukoregulin- og lymfotoksinaktiviteter mot neuraminidase- og protease nedbrytning ble bedømt (29). 0,5 ml av et konsentrert human- eller hamsterlymfokinpreparat ble tilsatt til 50 pl VCN (500 enheter/ml, Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, CA) og 0,5 ml 0,1 M natriumacetatbuffer pH 5,1. Som kontrol-ler ble 0,5 ml lymfokin tilsatt til 0,5 ml av acetatbufferen, 0,5 ml av acetatbufferen inneholdende 50 pl VCN og 50 pl 0,2 M sialinsyre fra Sigma (denne konsentrasjon av syren inakti-verer enzymet), eller 0,5 ml medium. Prøver ble inkubert i 60 minutter ved 37°C, dialysert mot PBS-PEG i en Amiconcelle med et YMIO-membran, og prøvevolumene justert til 3 ml. For proteolytisk nedbrytning ble 1 ml lymfokinprøver tilsatt til 1 ml trypsin i PBS (32 enheter/ml, spesifikk aktivitet 195 enheter/mg, Worthington Enzymes Inc., Freehold, NJ), 1 ml kymotrypsin i PBS (6 enheter/ml, spesifikk aktivitet 59 enheter/ml, Sigma) eller 1 ml pronase (6 enheter/ml, spesifikk aktivitet 6 enheter/mg, Sigma) i 0,1 M Tris base med 3 mM CaCl2 og 3% toluen. Pronase ble aktivert ved inkubering av 10 mg pronase/ml 0,1 M Tris - 15 mM CaClg, pH 7,8, i 30 minutter ved 37°C akkurat før tilsetning til prøven. Prøver med proteaser eller proteasebufferkontroller ble inkubert i 60 minutter ved 37°C. 1 ml FBS ble tilsatt til hver prøve og prøvene ble fortynnet over et hundre gangers område i medium for analyse. (Se tabell 3).

NK- CYTOTOKSISITETSANALYSE. Forbedring av målcellefølsomheten efter leukoregulinbehandling overfor NK-mediert cytotoksisitet ble bestemt i det vesentlige som tidligere beskrevet (23). Normalhumanperiferblodmononukleaere celler, isolert ved LSM-gradientsentrifugering, ble ført gjennom nylonull for å fjerne makrofager og B-celler med anrikning av NK-celler. K562-målceller ble merket 18 timer ved tilsetning av 100 p Ci <51>Cr som natriumkromat (NEN, Boston, MA). Målcellene ble vasket 3 ganger med 1640-1056 FBS og suspenderte til 2,5 x IO<5 >celler/ml medium eller lymfokinprøve fortynnet i medium. Målcellene ble så inkubert i 30 minutter ved 37°C, sentrifugert ved 280 g i 5 minutter og resuspendert i 1640-1056 FBS ved en konsentrasjon av IO<5> celler/ml. 100 pl celler ble tilsatt til rør inneholdende 100 pl medium eller effektorceller ved celleforhold effektor:mål på 25:1, 10:1 eller 2,5:1. En fire timers 51cr frigi vningsanalyse- ble så gjennomført (23). Spontan 51Cr-frigivning lå fra 15 til 2056, uansett hvorvidt cellene var preinkuberte medium eller lymfokin. Graden av lymfokinforbedringer ble bestemt ved å samle lytiske enheter av NK-cytotoksisitet av målceller inkubert i medium til målceller inkubert i lymfokin. En lytisk enhet, bestemt som det antall lymfocytter som forårsaker en spesifikk frigivning av 1556 51cr fra målcellene, ble beregnet ved å benytte Van Krough-ligningen (21, 32) (se tabell 6 og fig. 3).

STRØMNINGSCYTOMETRISKE ANALYSER. K562-celler ble resuspendert til 4 x 10<6>/ml i RPMI-1640 - 1056 FBS. Til 12 x 75 mm plastrør ble det gitt 250 pl cellesuspensjon under tilsetning av 250 pl lymf okinprøve. Rørene ble inkubert ved 37 °C i en fuktet luf tatmosfære med 556 C02:9556 luft på en plattform-vugger (Bellco Glass Co., Vineland, NJ) ved 6 cykler/minutt i 30 minutter til 6 timer.

Instrumentering: Strømningscytometriske analyser ble gjennomført ved bruk av et FACS IV f luorescens-aktivert cellesorterer (Becton-Dickinson, Synnyvale, CA) utstyrt med en 5 W argon-ionelaser som eksitasjonskilde, en 256 kanal-pulshøydeanalysator og logaritmiske forsterkere. Cellene ble analysert på snever vinkel foroverlysspredning og fluorescens efter passasje gjennom et 70 p diameter dyse i et omhyllings-fluid av MILLI-Q filtrert (Millipore Corp., Bedford, MA) H20. Smalvinkelforoverlyssspredningssignaler, en indikasjon på cellestørrelsen og formen, ble benyttet som triggersignal for alle analyser. Alle optiske filtre ble oppnådd fra Becton-Dickinson sammen med. instrumentet hvis ikke annet ellers er sagt.

FDA fluorokromasi: FDA hie benyttet for å måle cellemembranpermeabiliteten (5). En utgangsoppløsning av FDA (Poly-science, Inc., Warrington, PA) ble fremstilt ved å oppløse krystallinsk FDA i aceton til en konsentrasjon av 5 mg FDA/ml. Umiddelbart før bruk ble en arbeidsoppløsning fremstilt ved fortynning av utgangsoppløsningen i RPMI-1640 - 1056 FBS for derved å gi en sluttkonsentrasjon på 6,25 pg FDA/ml. Efter lymfokinbehandling av K562-cellene ble disse vasket en gang i RPMI-1640 - 10$ FBS og resuspendert i 1 ml av arbeids-FDA-oppløsningen ved 6,25 pg/ml, inkubert ved romtemperatur i 5 minutter og så analysert på strømnings-cytometeret.

Propidiumjodidfluorkromasi: Propidiumjodid ble også benyttet for å måle cellemembranpermeabiliteten. En lageroppløsning av propidiumjodid (Calbiochem-Behring Corp., La Jolla, CA) ble fremstilt ved å oppløse propidiumjodid i PBS, pH 7,4, ved en konsentrasjon av 500 pg/ml. Umiddelbart før bruk ble en arbeidsoppløsning fremstilt ved fortynning av lageropp-løsningen i PBS for derved å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2 pg propidiumjodid pr. ml. Efter lymfokinbehandling ble cellene vasket en gang i RPMI-1640 - 10% FBS og resuspendert i 1 ml av arbeidsoppløsningen av propidiumjodid, inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og så analysert på strømnings-cytometeret.

Fluorescensmålinger: Eksiteringsbølgelengden som ble benyttet for både FDA og propidiumjodid var den samme, 488 nm ved 400 mW. Langpasserings 515- og 520 nm optiske glassfiltre ble plassert i front av fluorescensdetektorfotomultipliserings-røret. Under analyse av propidiumjodidmerkede prøver ble et ytterligere rødadditiv dikroisk filter (Corion Corp., Eollister, MA) anbragt foran fotomultipliseringsrøret. Mediumbehandlede K562-celler ble benyttet for fininnstilling av strømningscytometeret før hvert forsøk. Hovedkontrollene og fotomultipliseringsrørspenningen ble justert slik at 9056 av 2 x IO<4> celler som var analysert ville ligge innenfor et på forhånd bestemt område av kanaler innen en hel skala på 256 kanaler. Dette ble gjort for hver av de tre parametere (snever forovervinkellysspredning, fluorescein-fluorescens og propidiumjodidfluorescens) som ble undersøkt her. For mediumbehandlede kontrollceller ble spredning og fluorescein-fluorescens satt til det øvre område av kanalområdet og propidiumj odidf luorescens i den lavere del for å måle de egnede skift i lymfokinbehandlede celler. For hver K562-celleprøvebehandling ble 2 x IO<4> celler analysert og prosentandelen celler innenfor det på forhånd bestemte markerings-området ble beregnet. Denne prosentandel ble så trukket fra mediumbehandlet kontrollprosentandel (ca. 90%), noe som resulterte i prosentual forandring for prøven. Prosent-endringer lå fra ca. -5 til +70. En forandring i positiv retning antyder en virkning på K562-cellen forårsaket av lymfokinbehandlingen for den målte parameter ( se fig. 10).

Eksempel 2

FREMSTILLING AV HUMAN B- CELLELINJER OG HYBRIDOMER SOM

SEKRETERER LEUKOREGULIN. Kreftpasienter ble immunisert intradermalt med sine egne dissosierte tumorceller som var bestrålt med 20.000 rad og blandet med IO<7> levedyktig BCG. Periferblodlymfocytter fremstilt fra det venøse blod av disse pasienter ble blandet med murin NS-l-myelomceller i et forhold på 3 PBL pr. 1 myelom, sentrifugert og resuspendert i 100 pl serumfritt medium. 1 ml polyetylenglykol ( 5056 vekt/volum), på forhånd oppvarmet til 37°C, ble tilsatt dråpevis til cellepelleten i løpet av 1 minutt under konstant agitering av røret. To ganger det tidligere volum av det på forhånd oppvarmede serumfrie medium ble satt til celle-suspensjonen i løpet av 1 minutt inntil 50 ml røret var fylt opp. Cellene ble pelletisert ved 800 omdr./min. i 15 minutter. Cellene ble forsiktig resuspendert i HT-medium (DMEM Inneholdende 2056 fetalstorfeserum, 13,6 pg/ml hypoksantin og 3,9 pg pr. ml tymidin) ved en konsentrasjon av 2,5 x 10^ celler/ml (prefusjonstelling) og 100 pl ble satt til hver mikrotiterbrønn. 24 timer senere ble 100 pl HAT-medium (HT-medium inneholdende 0,18 pg/ml aminopterin), satt til hver brønn. Halvparten av mediet ble erstattet hver 3. dag med nytt HAT-medium. Efter opprettholdelse i HAT-medium i 14 dager ble cellene holdt på HT-medium i ytterligere 2 uker, i løpet av hvilket tidsrom cellene ble dyrket på et MEM-medium inneholdende 20% fetalstorfeserum.

Alternativt kan kokultivering av PBL med myelomceller benyttes for å generere transformerte diploide B-celler. PBL og myelomceller ble blandet (ved et forhold av 3:1), pelletisert ved 800 omdr./min. og selektert i HAT-medium som beskrevet ovenfor.

Supernatanter fra hybridomene eller transformerte diploide B-celler ble prøvet på sekretert leukoregulin ved bruk av mikroanalysen med HT-29-celler som mål. Cellene som fremstilte leukoregulin ble ekspandert i MEM-10& FBS, og når et tilstrekkelig antall ble oppnådd, ble forsøk gjennomført for å bestemme de optimale betingelser for leukoregulinproduksjon i serumfritt medium. Celler ble suspendert ved en konsentrasjon av 2 x 10<5>/ml RPMI-1640 og inkubert i 3 dager ved 37°C. I visse forsøk ble 10 ng tetradecanoylforbolacetat/ml tilsatt til kulturene for å stimulere leukoregulinproduksjonen. Supernatantene ble samlet, sentrifugert ved 800. g og analysert på leukoregul inakt i vi tet ...

Eksempel 3

FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER TIL LEUKOREGULINCELLEOVERFLATERESEPTOREN. Balb/c-mus ble immunisert ved 3 subkutane injeksjoner av K562-membraner to uker mellom hver. Hver mus mottok membraner ekvivalent med IO<7> celler fremstilt ved homogenisering med en motordrevet teflohomogenisør, klaret ved lavhastighetssentrifugering og så samlet ved ultrasentrifugering med 100 000 x g i 1 time. Membranene ble blandet med total-Freunds-næringsmiddel for hvert av skuddene. Tre dager før hybridisering ble musene injisert intraperitonealt med K562-cellemembranene i PBS. På fusjons-dagen ble miltene fjernet og enkelte celler oppnådd å fusert ved et forhold på 3 miltceller til 1 myelomcelle med PEG. Efter fusjon ble hybridene selektert ved dyrking i hypoksantin, aminopterin og tymidinholdig medium (10). Kolonier som ga antistoffer mot leukoregulinreseptoren ble klonet ved en begrensende fortynningsmetode.

En biologisk analyse som målte inhibering av leukoregulin-rettet vekstretardering av HT-29-celler ble benyttet for å detektere antistoffer mot leukoregulinreseptoren. 2000 HT-29-celler ble platert i 0,1 ml MEM-1056 FBS i brønner på en 96-brønners plate. Tilstrekkelig leukoregulin i 0,1 ml til å forårsake 5056 inhibering av HT-29-cellevekst ble tilsatt, fulgt av 25 pl av prøveantistoffholdig supernatant. Efter 3 dagers inkubering ble inkuberingen målt ved omrøring av celler til stede ved flekking med MTT som beskrevet ovenfor. En hvilken som helst prøve som viste en 25 56-Ig eller større inhibering av leukoregulinaktiviteten ble ansett som positiv. Den rasjonale oppførsel av denne analyse er at det monoklonale antistoff vil binde til leukoregulinreseptoren og derved inhibere leukoregulinbinding ved sin efterfølgende vekstinhiberende aktivitet.

Kvantifiseringen av leukoregulinreseptorekspresjonen ble målt på tre måter som alle kvantifiserte prosentandelen monoklonalt antistoff rettet mot leukoregulinresepten. I immunofluorescensanalysen ble 2 x IO<5> celler inkubert med det monoklonale antistoff i 1 time ved 37°C. Cellene ble vasket 2 ganger, et fluorescent konjugert gjeteantimusimmunoglobin (Kirkegård og Peiry Labs, Rockville, MD) ble tilsatt og inkubert i 30 minutter ved 4°C. Cellene ble vasket, resuspendert i 0,5 ml PBS og analysert på et EPICS 5 strøms cytometer (Coulter Instruments, Hialeah, FL) ved bruk av 488-laserlinjen for å eksitere den grønne fluorescens. ELISA og RIA ble gjennomført på tilsvarende måte bortsett fra at konjugatet som ble benyttet i ELISA var et pepperrot-peroksydase-gjeteantimuseimmunoglobulin og det som ble benyttet i RIA var <125>I-merket gjeteantimuseimmunoglobulin. ELISA analysen ble kvantifisert kolorimetrisk ved måling av mengden substrat som hydrolyserte på en ARTEK automatisert leser. RIA ble kvantifisert ved måling av <125>i-merkelapp som var bundet ved bruk av en LKB -y-teller (LKB Instruments, Rockville, MD) (se tabell 8).

Eksempel 4

MÅLING AV PASIENTTUMORCELLEFØLSOMHETEN FOR LEUKOREGULIN VED

BRUK AV EN AGARKLONOGEN ANALYSE. Tumorceller har den unike evne til at de dekker over normale celler for å vokse i halvfast medium. Dette karakteristikum for tumorceller gir et middel for kvantifisering av virkningen av cancerterapeutiske midler og nylig dissosierte celler av utskårne humantumorer. Colontumorer oppnådd ved en klinikk ble hakket opp og dissosiert med kollagenase og DNAase for å oppnå enkel cellesuspensjon (11). Cellene ble suspendert i 0,1556 agar i medium i henhold til prosedyren ifølge Kern (12), bortsett fra at leukoregulin ble tilsatt ved varierende konsentrasjoner. Utviklingen av tumorcellekoloniene som vokste suspendert i agarmediet ble kvantifisert efter 10 til 14 dagers inkubering (se tabell 9).

Eksempel 5

KLONING AV LEUKOREGULINET. Efter å ha definert leukoregulin både biologisk og biokjemisk og efter derved å ha tilveiebragt metoder for å identifisere og å isolere leukoregulin som angitt ovenfor, gjennomføres kloningen og ekspresjonen av leukoregulin ved bruk av konvensjonelle og kjente fremgangsmåter og protokoller (for eksempel Maniatis et al, " Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Disse prosedyrer stoler på den sensitive bioanalyse som beskrives i de foregående eksempler. Efter å ha utviklet analysen og biologisk og biokjemisk å ha definert leukoregulin, kan standard rekombinant DNA og kloningsteknikker benyttes for å produsere et protein identisk i aminosyresekvens og biologisk aktivitet til autentisk naturlig leukoregulin, eller en biologisk aktiv subenhet derav, i E. coli eller i andre egnede vertsorganismer. En skisse av kloningsprosedyren er vist i fig. 11. Denne prosedyre er ekvivalent med metodene som ble benyttet med mange biologisk relevante eukaryotiske gener, spesielt humanlymfokin, lyfotoksin, som ble ekspri-mert i bakterier ved bruk av en tilsvarende protokoll som angitt av Gray, P.W., et al, "Nature" 312, 721 (1984).

Kloningseksemplet kan diskuteres som seks distinkte faser (se fig. 11). Elementene i hvert av disse trinn er beskrevet nedenfor.

Fase I

Bloanalvse. rensing og biologisk karakterisering.

Denne analyse må gjennomføres før noe kloneforsøk kan gjennomføres. Detaljene av disse studier er de data som er presentert i søknaden. Efter utvikling av disse data som angitt ovenfor er det så mulig å fortsette med den genetiske konstruksjon.

Fase II

E. coll- genbibliotek. Konstruksjonen av bakterielle kloner er basert på karakterisering av de naturlige kilder for leukoregulin. Da foreliggende søknad beskriver en metode for stimulering av produksjon av leukoregulin av humanperifere lymfocytter (PBL), må disse celler inneholde den genetiske informasjon som er nødvendig for leukoregulinsyntese og er en fagmessig kilde for leukoregulingener. Ved bruk av stimulerte cellepopulasjoner blir mRNA isolert inneholdende leukoregulin-mRNA. Dette PBL mRNA benyttes til å konstruere cDNA-bibliotek i for eksempel E. coli eller andre vertsorganismer.

Fase III

Biokjemisk karakterisering, aminosyresekvens. Som diskutert ovenfor er leukoregulinproteinet karakterisert biokjemisk og renset til homogenitet. Det neste kristiske trinn er å definere aminosyresekvensen for leukoregulinproteinet ved bruk av dette naturlige materiale. Dette arbeid, som er nødvendig for å bekrefte at ethvert genklon som oppnås tilsvarer autentisk leukoregulin, gjennomføres ved konvensjonelle biokjemiske sekvensmetoder.

Fase IV

Genisolas. lon ved immunoundersøkelse. Dette forsøk på genisolering kan initieres umiddelbart efter fullføring av fase II. Det kritiske middel for dette forsøk er antileuko-regulinantistoff som er rettet mot det naturlige leukoregulin, som kan fremstilles efter rensing av tilstrekkelig naturlig leukoregulin til å immunisere dyr. Teknikken som har vært benyttet med hell for å undersøke E. coli-genbibliotek med henblikk på forskjellige gener er beskrevet av Helfman, D.M., et al, "PNA" 80, 31-35 (1983) og Young, R.A. og Davis, R.W., "PNAS" 80, 1194-1198, (1983).

Fase V

Genisolas. lon ved DNA- probe. Dette er en alternativ og ytterst utstrakt brukt metode for genisolasjon fra et rekombinant DNA E. coli-bibliotek. Som opprinnelig vist av Noyes et al. ["PNAS" 76, 1770-1774 (1979)] blir en syntetisk oligodeoksynukleotidprobe benyttet for å isolere og karakterisere et eukaryotisk mRNA. Proben er et lite utsnitt av DNA-sekvensen for leukoregulin fremstilt ved først å bestemme en partiell aminosyresekvens for det native protein og så å syntetisere en nukleotidsekvens som koder for denne spesielle aminosyresekvens. Den syntetiske nukleotidsekvens kan for eksempel fremstilles kjemisk som beskrevet av Itakura, K., et al., "J.Am.Chem.Soc." 97, 7326 (1975). Som et eksempel ble aminosyresekvensen trp-met-glu-glu fra gastrin benyttet til å definere et dodecanukleotid d(CTCCTCCATCCA) som spesifikt hybridiseres til gastrin-mRNA. For leukoregulin blir på samme måte det syntetiske DNA-fragment benyttet som probe som hybridiseres til det naturlige mRNA som taes fra cellene som produserer leukoregulin. Ved bruk for eksempel av en merkelapp og konvensjonelle metoder blir mRNA for leukoregulin separert fra blandinger av RNA. Metoder som benyttes i disse prosedyrer er beskrevet av Maniatis et al, supra; Goodman et al, US-PS 4 283 489 og 4 363 877 og i de deri angitte referanser.

En utvidelse av disse resultater har vært å benytte slike prober ved bedømmelse av cDNA-bibliotek [Crea, R. og Horn, T. "Nuc Acid Res" 8, 2331-2348 (1980)]. Nylig ble et sett av tetradecanukleotider d(TC A CA A TA C TCCA) bestemt av

G G T

aminosyresekvensen trp-glu-tyr-cys-asp benyttet for å detektere kloner av humanvevtypen plasminogenaktivatorgenet cDNA I E. coli (Pennica, D., et al., "Nature" 301, 214-220, 1983).

Fase VI

Gensammensetnlng. mikrobiell ekspresjon. Den siste fase av kloningen er rutinesammensetningen av en intakt kopi av det eukaryotiske strukturelle genet og translasjonen av genet for å gi leukoregulin eller en biologisk aktiv subenhet derav. Prosedyrer for genetisk å konstruere mikrobiell ekspresjon av dette genet vil skje langs forskjellige veier med forskjellige verter. Selv om de forskjellige muligheter for fremstilling av en vektor, transformering av en vertscelle og gjennomføring av translasjon og ekspresjon, er for tallrike og oppsummere, er prosedyrene konvensjonelle og har vært diskutert i tallrike oversikter slik som Maniatis et al, supra, "Gene Amplification and Analysis: Expression of Cloned Genes in Prokaryotic and Eukaryotic Cells", Papas, T.S., Rosenberg, M. , og Chirigkjian, J.G. (eds.), Elsevier Science Publishing Co., Inc., NY, 1983, Berman et al, US-PS 4 503 142 og i de deri angitte referanser.

Det ansees videre innenfor rammen av oppfinnelsen at en modifisert form av leukoregulin eller en biologisk aktiv subenhet derav kan syntetiseres, som har modifikasjoner innen molekylstrukturen. Slikt modifisert leukoregulin kan vise øket brukbarhet som øket effektivitet, reduserte bivirkninger og øket stabilitet, eller kan vise ekvivalent aktivitet eller en mindre, men tilstrekkelig aktivitet med hvilken leukoregulin er definert. I alle tilfelle skal det, der molekylstrukturen og den biologiske aktivitet for det meste er den samme som leukoregulin slik det her er definert, ansees å være den ekvivalent eller en normal modifikasjon derav, og derfor en del av oppfinnelsen.

BESKRIVELSE AV FIGURER OG TABELLER

Figur 1

Cvtolvse av humantumorceller med human PML-lymfokinholdig leukoregulin (0--0) og renset 1788 cellelinjelymfotoksin (•—•) ved ekvivalente lymfotoksinkonsentrasjoner. Standardavviket av prøvemidlet var maksimalt 2%.

Humanlymfokin og lymfotoksin hadde imidlertid liten eller ingen cytolytisk aktivitet overfor humanleukemi-, sarkom- og karcinomceller. Et maksimum på 50% lysering av RPMI-2650-karcinomcellene ble observert med en lymfokinprøve inneholdende 1000 enheter lymfotoksin/ml.

Figur 2

Vekstinhibering av humantumorceller på grunn av humanlymf okinholdig leukoregulin (0--0) og renset 1788 cellelinjelymfotoksin (8—•) ved ekvivalente lymfotoksinkonsentrasjoner. Standardavviket for prøvemidlet var maksimalt 5%. Den prosentuelle vekstinhibering ble bestemt ved bruk av en celletellingsanalyse.

Det meget rensede 1788-cellelinjelymfotoksin kunne ikke lysere noen av de tre typer tumorceller. På tross av lav lytisk aktivitet mot humantumorceller forårsaket humanlymfokin vesentlig vekstinhibering av humantumorcellene. Det rensede 1788-cellelinjelymfotoksin viste imidlertid signifikant vekstinhibering kun ved konsentrasjoner på 500 og 100 lymfotoksinenheter/ml. Vekstinhiberingen ved disse konsentrasjoner kunne videre godt ha skyldtes den vekstretarderende påvirkning av pH 8,4-ammoniumkarbonatbufferen hvori det rensede lymfotoksin ble fremstilt.

Figur 3

Økning av målcelleømfintllgheten overfor NK- mediert cytotoksisitet ved humanlymfokinholdig leukoregulin men ikke ved renset humanlymfotoksin. Humanlymfokin med 40 lymfotoksin enheter/ml (0—0), renset 1788 lymfotoksin med 40 enheter/ml (•—•) eller media (a—a) ble inkubert i 30 minutter med målceller før tilsetning av NK-effektorceller. Standardavviket for prøvemidlet var maksimalt 156.

I tillegg til Inhibering av tumorcelleproliferering øket humanlymfokin, men ikke renset 1788 lymfotoksin, følsomheten av humankarcinom, leukemi og sarkomceller mot NK-mediert cytotoksisitet. Humanlymfokin forårsaket sogar lysering av RPMI-2650-karcinomceller som er resistente mot NK-lysering. Renset 1788-lymfotoksin kunne ikke øke følsomheten for karcinom, leukemi eller sarkomceller mot lysering med NK. De divergerende biologiske aktiviteter for ikke fraksjonert human PBL lymfotoksinholdig lymfokin og renset 1788-cellelinje lymfotoksin antyder at et lymfokin forskjellig fra lymfotoksin medierer antitumorcelleaktlvitetene.

Figur 4

Gelpermerlngs- HPLC av to forskjellige humanlymfokinpreparater . 2 ml prøver ble fortynnet isokratikalt fra en Toyasoda TSK G-3000 SWG-kolonne med 20 mM Na-fosfatbuffer pH 7,4 inneholdende 0,156 PEG. 4 ml fraksjoner ble samlet, fortynnet over et hundre gangers område med RPMI-164 0 -

1056 FBS og analysert på lymfotoksincytolyse av oc-L929-celler og leukoregulincytostase av human K562- og 2650-tumorceller.

Proteinabsorbansprof ilen ved 280 nm er vist i a-L929-analysepanelet.

Den tilsynelatende molekylvekt for human PBL-lymfotoksin og leukoregulin ble undersøkt ved HPLC-molekylsiktkromatografi. Majoriteten av lymfotoksinaktiviteten eluerte i fraksjoner innen molekylvektsområdet 30 000 - 40 000. Det var imidlertid visse variasjoner i prøvene fra forskjellige individer med noen som også hadde lymfotoksinaktivitet innen molekyl-vektsområdene fra 50 000 til 70 000 og 12 000 til 20 000. Leukoregulinaktivitet eluerte i fraksjoner innen molekylvektsområdet 50 000 - 70 000 med en mindre komponent innen molekylvektsområdet 10 000 til 15 000.

Figur 5

Lineær gradient- polvakrvlamid- gelelektroforese av leukoregulin. En nøyaktigere bedømmelse av molekylvekten for leukoregulin ble bestemt ved gradient-polyakrylamid-gelelektroforese. 1 ml av et humanlekoregulinpreparat ble elektroforesert over natten. Gelen ble så skåret opp og skivene ble eluert over natten med MEM-105é FBS ved 37" C. Leukoregulinaktiviteten (åpen cirkel) ble målt ved bruk av mikroanalyse med ET-29-karcinomceller som mål. Leukoregulin migrerte med proteiner med molekylvekt 110 000 - 140 000. Også vist i denne figur er det elektroforetiske mønster av 125j-merket (lukkede cirkler) leukoregulin, renset ved sekvensiell" HPLC-gelfiltrering, ionebyttekromatograf i og lineær-gradient polyakrylamidgel-elektroforese.

Figur 6

Gelfiltrering av renset leukoregulin. Det ble benyttet en alternativ metode for molekylvektsbestemmelse ved bruk av Pharmacia S-300-gelfiltrering. Leukoregulin, renset ved HPLC-gelf iltrering , ionebyttekromatografi og lineær-gradient polyakrylamidgel-elektroforese ble merket med 125j og eluert på en S-300 kolonne med 10 nM NaP04-buffer, pH 7,4 - 1,0 M NaCl. Det rensede leukoregulin hadde en tilsynelatende molekylvekt på 120 000 - 140 000 ved denne prosedyre.

Figur 7

Natriumdodecvlsulfatpolvakrvlamid- gelelektroforese. Renset leukoregulin merket med 125j ble elektroforesert på et natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgel for å bestemme hvorvidt det native protein ville dissosiere til subenheter når det ble underkastet denatureringsbetingelser. Leukoregulin elektroforeserte med molekyler med molekylvekt 30 000 - 35 000 slik som vist ved dette autoradiogram av gelen.

Figur 8

Isoelektrisk fokusering av to forskjellige humanlymfokinpreparater . 2 ml prøver ble fokusert i en pH 5,5 - 10 gradient. 3 ml fraksjoner ble samlet, pE-verdien for hver fraksjon bestemt og efterfølgende fraksjoner med 0,5 pE-enheter slått sammen, diafiltrert mot PBS-PEG, steril-filtrert, fortynnet over et hundre gangers område og analysert på lymfotoksincytolytisk aktivitet på a-L929-celler (i—•) eller leukoregulincytostatisk aktivitet på K562-(Q—O) og OST- (0—0)celler.

Selv om humanlymfotoksin- og leukoregulinaktiviteten overlappet når de ble separert ved molekylsikting, kunne de to aktiviteter separeres basert på forskjeller i molekylladning. Lymfotoksin hadde en isoelektrisk pH-verdi på mellom 6,5 og 7,2. Leukoregulin hadde to isoelektrisk pE-verdier: en mellom 5,0 og 5,8 og den andre mellom 7,5 og 8,3.

Figur 9

EPLC - ionebyttekromatograf1 av leukoregulin og lymfotoksin. 2 ml-prøver av et humanlymfokinpreparat ble separert på en DEAE-545 EPLC-kolonne ved eluering med en lineær 0-0,5 M NaCl-gradient. Fraksjoner ble filtersterilisert og analysert på leukoregulin ved bruk av en mikroanalyse og ET-29-målceller eller på lymfotoksin. Leukoregulin eluerte ved en 0,1 M NaCl-konsentrasjon og ble separert fra lymfotoksin som eluerte ved 0,15 M NaCl-konsentrasjon.

Figur 10

Strømningscytometrisk analyse av leukoregulinaktiviteten.

En annen biologisk aktivitet av leukoregulin som kan relateres dens virkningsmekanisme ble fastslått ved strøm-ningscytometrisk analyse. Endringer i K562-cellevolumet eller membranpermeabilitet, detekterbar ved endringer i snever vinkelforoverlysspredning (0) eller ved fluoresceindiacetat (O) eller propidiumjodid (a) fluorkromasi ble fastslått ved bruk av 488 nm argon laser linjeeksitasjon i et FACS IV-strømningscytometer. I det øvrige diagram ble K562-celler behandlet med et lymfokinpreparat inneholdende 10 ( ), 40 (——) eller 100 (—•—) enheter diafiltrert lymfotoksin eller 500 ( ) enheter a-interf eron i 0-6 timer for å påvise responsen av cellene mot lymfokin.

Når lymfokin ble tilsatt til K562-celler, ble snevervinkel-foroverlysspredningen fra cellene redusert, propidiumjodid-fluorkromasien øket og FDA-fluorkromasien redusert. Endringen i snevervinkellysspredningen reflekterte en endring i celle-formen og/eller størrelsen med en økning i cellevolumet bekreftet av en cellevolumanalyse på en modell ZB1 Coulter Counter med en tilsatt Accucomp-cellevolumanalyseprogrammer (Coulter Instruments, Inc.,, Hialealr, FL)\ Reduksjonen i FDA-fluorkromasi reflekterte øket membranpermeabilitet, efter hvert som fluorescent fra cellulært fluorescein slapp ut fra cellen. Økningen i propidiumjodidfluorkromasin reflekterte også en økning i membranpermeabiliteten efter hvert som propidiumjodid trengte inn i cellen og interkalerte med nukleinsyre. Strømningscytometriske endringer forårsaket av humanlymfokin var detekterbar 30 minutter efter behandling av K562-celler og var maksimale efter 2 timer, a-interferon induserte ikke noen endringer i løpet av dette tidsrom i celleoverflatekonformasjonen eller plasmamembranpermea-biliteten. I det nedre diagram ble K562-celler behandlet med HPLC-isoelektrisk fokuserende fraksjoner (prøvetall fra tabell 4) i 2 timer og endringen i lysspredningen ( ), og i fluoresceindiacetat- (— —) og propidiumjodid (...)fluorkromasi målt. Lymfokincellekonformasjon og membranpermeabi-litetsaktivitet var til stede kun i HPLC- og isoelektrisk fokuserende rensede 1eukoregulinfraksjoner. Fraksjoner anrikede på lymfotoksin eller i interleukiner og interferoner ga Ingen påvisbare cellulære konformasjonelle eller plasma-membran permeabilitetsendringer.

Figur 11

Kloning av leukoregulingenet. Dette flytdiagram viser skjematisk de seks distinkte faser ved kloning av leukoregul ingenet (se eksempel 5).

Tabell 1

De optimale betingelser for leukoregulinfremstilling ved normalhumanperiferblodleukocytter eller med human B-cellelinjer dannet efter hybridisering med et murinmyelom eller spontant transformert i kultur ble bestemt. Maksimale nivåer av leukoregulin fremstilt ved perifer blodleukocytter ble funnet når disse celler ble dyrket i 48 timer i nærvær av 5 pg PHÅ/ml medium. Kontinuerlige human B-cellelinjer eller human B-musemyelomheterohybridomer fremstilte leukoregulin konstitutivt over en tredagers periode når de ble dyrket i serumfritt RPMI-1640-medium. Tilsetningen av 10 pg tetra-decanoylfobolacetat/ml medium øket leukoregulinfremstillingen til det tredobbelte.

Tabell 2

Bevis for nærværet av et unikt antitumorlymfokin distinkt fra lymfotoksin ble vist når de relative andeler lymfotoksin (a-L929-cytolytisk aktivitet) og humantumorcellecytostatisk aktivitet i lymfokinpreparater fra 6 forskjellige individer ble sammenlignet. Murintumorcellecytolytisk aktivitet og humantumorcellecytostatisk aktivitet varierte uavhengig i preparatene og antydet at de to biologiske aktiviteter var mediert av distinkt forskjellige enheter. Konsentrerte lymfokiner fra tre individuelle leukocytter som ikke var stimulert med PHA eller hadde PHA tilsatt den siste halve dyrkingstime lyserte ingen tumorceller og hadde ingen vekstinhiberende aktivitet. Når imidlertid de samme leukocytter ble stimulert med PHA i 24 timer, sekreterte de signifikante mengder lytiske og vekstinhiberende aktiviteter. Således skyldtes antitumorcelleaktivitetene ikke PHA, buffer eller en utarming av mediumnæringsmidler av de 24 timers dyrkede celler.

Tabell 3

Ytterligere støtte for eksistensen av et nytt lymfokin, herefter kalt leukoregulin, distinkt fra lymfotoksin, ble tilveiebragt ved undersøkelse av følsomheten av cytolytiske og tumorcellevekstinhiberende lymfokinaktiviteter mot neuraminidase- og proteasenedbrytning. Humancytolytisk lymfokinaktivitet for a-L929-celler (lymfotoksin) ble redusert 49 og 9256 med 0,2 og 0,4 enheter neuraminidase uten noen signifikant inhibering av lymfokintumorcellevekst-inhiberende (leukoregulin) aktivitet. Neuraminidase-nedbrytning I nærvær av 10 mM sialinsyre hadde ingen virkning på noen av aktivitetene og utelukket muligheten for at effekten på lymfotoksin var forårsaket av forurensende proteaser i neuraminidasen. Alternativt ble både lymfotoksin- og leukoregulinaktiv!tetene inhibert av proteaser selv om i forskjellig grad. Seks enheter av protease ødela totalt all lymfotoksinaktivitet mens 5256 av leukoregulinaktiviteten forble i prøven. Således gjorde proteasenedbrytninger leukoregulinprøven lymfotoksinfri.

Syriske gullhamsterlymfotoksinpreparater inneholdt også en leukoregulintype av aktivitet for hamstertumorceller, og en antikarcinogen aktivitet (24). Den antikarcinogene aktivitet ble ikke målt i humanlymf okinpreparater på grunn av util-gjengeligheten av en kvantitativ humancelletransformerings-analyse sammenlignet med den for hamstere (4). Det ble søkt å bestemme hvorvidt hamsterlymfotoksinsk- og leukoregulin-aktiviteter basert på deres følsomhet mot neuraminidase- og proteasenedbryting som humanlymfotoksin og leukoregulin. Det ble også bestemt hvorvidt den antikarcinogene aktivitet ble renset sammen med leukoregulin for å fastslå om hamster-antikarcinogenaktivitet og leukoregulin er identiske og derfor eventuelt en og samme hos mennesker. Som med humanlymfotoksin ble hamsterlymfotoksin nedbrutt av neuraminidase og trypsin. Den antikarcinogene aktivitet for hamsterceller eksponert til karcinogen- og cytostatisk aktivitet rettet mot hamstertumorceller som for humanleukoregulin, ble ikke nedbrutt av neuraminidase men ble redusert med 42$ av trypsin, noe som viste en parallell differensiell følsomhet for leukoregulin og lymfotoksin mot neuraminidase- og proteasenedbrytning i to arter.

Tabell 4

En totrinns fraksjoneringsprosedyre, basert på EPLC-mole-kylstørrelseseksklusjonkromatografi og isoelektrisk fokusering, ble gjennomført for å bestemme hvorvidt antikreft-aktiviteten for human leukoregulin var separerbar og distinkt fra flere andre lymfokiner og monokiner. Som forutsagt fra de tidligere data, ble lymfotoksinaktivitet funnet i de høye (45 000 - 74 000), de midlere (30 000 - 38 000) og lavere (17 000 - 20 000) molekylvektsf raks joner og ble anriket L pH. 6,0 - 6,8 fraksjonen efter fokusering. Leukoregulin var til stede kun i høymolekylvektsmateriale og ble separert i to arter med isoelektriske pH-verdier ved 4,2 til 5,6 og 7,1 til 8,4. Selv om de leukoregulin-anrikede fraksjoner inneholdt en viss lymfotoksinaktivitet inneholdt fraksjonene 1 og 3 mer enn 170 lymfotoksinenheter, men ingen leukoregulinaktivitet. Derfor kan en lymfotoksinaktivitet avledet fra stimulert human PBL separeres fra leukoregulin. Lav-molekylvektsfraksjon inneholdt alt interleukin 1- og interleukin 2- og hovedandelen av interferonaktivitetene. Ingen makrofagaktiverende aktivitet ble påvist i noen fraksjon. Alle fraksjonene Inneholdt også endotoksin. Mengden endotoksin korrelerte ikke med leukoregulinaktiviteten. Ytterligere hevis som indikerte at endotoksin ikke medierte leukoregulinaktivitet var at tilsetningen av opptil 20 ng/ml lipopolysakkaridserotyper 055:B5 og 0111.B4 ikke inhiberte veksten av K562-celler.

Tabell 5

Da de leukoregulin-anrlkede fraksjoner inneholdt lave nivåer av interferon, ble et ytterligere forsøk gjennomført for å bestemme i hvilken grad interferon kunne bidra til inhibering av tumorcellevekst. "y-interferon fra en kilde (ML) lyserte hverken a-1929-celler eller inhiberte veksten av human K562-tumorceller. -y-interferon fra en annen kilde F(FL) inneholdt 2000 lymfotoksinenheter pr. ml, men inneholdt ikke leukoregulinaktivitet. a-interferon inneholdt hverken lymfotoksin eller leukoregulin. Leukoregulinaktiviteten er derfor ikke mediert av a- eller -y-interferon og heller ikke er den et resultat av den synergistiske virkning av lymfotoksin og

•y—interferon.

Tabell 6

Ikke-fraksjonerte lymfokinpreparater inneholdt en aktivitet som øket følsomheten for tumorceller mot NK-mediert cytotoksisitet. Forbindelsen mellom målcellesenstiviserende aktivitet mot leukoregulin og mot lymfotoksin ble undersøkt ved å følge HPLC- og isoelektrisk fokuseringssekvenslell fraksjonering av humanlymfokin. Leukorégulin-anrikede fraksjoner Inneholdt signifikant tumorcelle-NK-cytotoksi-sitetforbedrende aktivitet. Fraksjoner anriket på lymfotoksin og de som inneholdt de lavere molekylvektslymfokiner som interferon øket ikke følsomheten for K562-leukemiceller mot NK-mediert cytotoksisitet. Således renses den NK-forbedrende aktivitet sammen med eller er identisk med leukoregulin.

Tabell 7

Et panel av humantumor- og normale celler ble undersøkt med henblikk på deres følsomhet mot leukoregulin. Gastroin-testinale karcinomer som en gruppe ble funnet å være sterkt sensitivt overfor leukoregulin. Leukoregulin påvirket ikke veksten hverken av de normale koloniske mukosalceller eller hudfibroblaster.

Tabell 8

Kvantifisering av bindingen av monoklonale antistoffer rettet mot leukoregulincelleoverflatereseptoren er prediktive for den relative følsomhet for cellen mot den vekstinhiberende virkning av leukoregulin. Antileukoregulinreseptorantistoffer bandt signifikant til 15 til 23% av HT-29-cellene mens de bandt kun til 2% av de to ganger mindre responsive K562-celler i denne indirekte immunofluorscenterstrømnings-cytometriske analyse.

Tabell 9

For å bestemme den potensielle ln vivo-effektivitet av leukoregulin og humancancer ble nydissosiert colontumorceller preparert og dyrket i halvfast agarmedium inneholdende leukoregulin. Coloncancer ble plukket ut for bedømmelse på grunn av den høye følsomhet for coloncancercellelinjene mot leukoregulin. Tumorceller fra alle fire pasienter som ble prøvet ble vekstinhibert på doseavhengig måte mot leukoregulin om enn i varierende grad. En pasients celler ble inhibert 98% av 50 enheter leukoregulin mens en annen pasient ble inhibert 42% med 4 000 enheter leukoregulin. Dette antyder at leukoregulin har potensiale til å kontrollere veksten av humancoloncanceret.

HENVISNINGER

1. Aggarwal, B.B., Moffat, B., og Harkins, R.N., "Human lymphotoxin: production by a lymphoblastoid cell line, purification and initial characterization", J. Biol.

Chem.. 259:686-691. 1984. 2. Brouty-Boye, P. "Inhibitory effeets of interferon on cell multiplication", L<y>m<p>hokine Reports. 1:99-112, 1980. 3. Brown, R.L., Griffith, R.L., Neubauer, R.H. og Rabin, H. , "The effect of T-cell growth factor on the cell cycle of primate T cells", J. Immunol.. 129:1849-1853. 1982. 4. DiPaolo, J.A., "Relative difficulties in transformin human and animal cells ln vitro", J. Nati. Cancer Inst.. 70:3-8,1983. 5. Dolbeare, F.A., og Smith, R.E., "Flow cytoenzymology: Rapid enzyme analysis of single cells", ln, M.R. Melamid, P.F. Mullaney, and M.L. Mindelsohn (eds.), Flow cytometry and sorting, pp. 317-334, New York, John Wiley & Sons, 1979. 6. Evans, C.H., og DiPaolo, J.A., "Lymphotoxin: an anticarcinogenic lymphokine as measured by inhibition of chemical carcinogen or ultraviolet-irradiation-induced transformation of Syrian hamster cells", Int. J. Cancer. 27:45-49, 1981. 7. Evans, C..H. og Heinbaugh, J.A., "Lymphotoxin cytotoxicity, a combination of cytolytic and cytostatic cellular responses", Immunopharmacology. 3:347-359, 1981. 8. Evans, C.H., Heinbaugh, J.A., and DiPaolo, J.A., "Comparative effectiveness of lymphotoxin anticarcinofenic and tumor cell growth inhibitory activities", Cell. Immunol.. 76 :295- 303. 1983. 9. Granger, G.A. og Kolb, W.P., "Lymphocyte ln vitro cytotoxicity: mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction", J.

Immunol.. 101:111-116, 1968.

10. Haspel, M.V., et al., Science 220:304-306. 1983.

11. Hoover, H.C., et al, Cancer Res.. April, 1984.

12. Kern, et al., Int. J. Cancer. 30:725-729. 1982.

13. Khan, A., et al., In Human Lymphokines. pp. 621-629,

Academic Press, New York, 1982.

14. Kleinerman, E.S., Schrolt, A.J., Fogler, W.E., og Fidler, I.J., "Tumoricidal activation of human monocyte activity jLn vitro by free and liposome encapsulated

human lymphokines", J. Clln. Invest.. 72:304-315. 1983.

15. Laemmll, V., Nature. 227:680-685. 1970. 16. Lambin, P., og Fine, J.M., Anal. Blochem.. 98: 160-168, 1979. 17. McConahey, P.J., og Dixon, F.J., Int. Arch. Allergy

Appl. Immunol.. 29:189, 1966.

18. Mizel, S.B., Oppenheim, J.J., og Rosenstreich, D.L., "characterization of lymphocyte-activating factor produced by the marcrophage cell line P388D1. I. Enhancement of LAF production by activated T

lymphocytes", J. Immunol.. 120:1497-1505. 1978.

19. Papermaster, B.W., et al., In Lymphokines and thymic hormones, Academic Press, New York, pp. 789-799. 20. Penn, I., "Depressed Immunity and the Development of

Cancer", Clinlcal Experimental Immunology. 4jb:459, 1981. 23. Ransom, J.H. og Evans, C.H., "Lymphotoxin enhances the susceptibility of neoplastic and preneoplastic cells to natural killer cell mediated destruction", Int. J.

Cancer. 29:451-458, 1982.

24. Ransom, J.H. og Evans, C.H., "Molecular and biological characterization of Syrian hamster lymphotoxin's anticarcinogenic and tumor cell growth inhibitory

activities", Cancer Res.. 43:5222-5227. 1983.

25. Ransom, J.H., Evans, C.H., og DiPaolo, J.A., "L<y>mphotoxin prevention of diethylnitrosamine carcinogenesis jln vivo", J. Nati. Cancer Inst.. 69:741-744, 1982. 26. Ransom, J.H., Evans, C.H., Jones, A.E., Zoon, R.A. , DiPaolo, J.A., "Control og the carcinogenic potential of

<99m>technetium ty the immunologic hormone lymphotoxin",

Cancer Immunol. Immunother.. 1J5:126-130 , 1983.

27. Ransom, J.H., Pintus, C, og Evans, J.H. "Lymphotoxin amplification of tumor cell growth inhibition is spesific for natural killer cells but not for macrophages", Int.

J. Cancer. 32:93-97, 1983.

28. Ransom, J.H., Rundell, J.O., Heinbaugh, J.A., og Evans, C.H., "Biological and physiocochemical characterization of keyhole limpet hemocyanin-induced guinea pig

lymphotoxin", Cell. Immunol.. 67:1-13. 1982.

29. Remold, H.G., og Mednis, A.D., "Two migration inhibitory factors differ in density and susceptibility to neuraminidase and proteinases", J. Immunol.. 122:1920-1925, 1978. 30. Rosenberg, S.A., Henrichon, M. , Coyne, J.A., og David, J. A., " In vitro studies of LT produced in response to antigen stimulation of lymphocytes", J. Immunol. 6:1623-1629, 1973. 31. Sawada, J., Shiori-Nakano, K., Osawa, T., "Cytotoxic activity of purified guinea pig lymphotoxin against various cell lines", Jpn. J. Exp. Med.. 4:263-271. 1976. 32. Trinchieri, G. , DeMarchi, M. , Mayer, W., Savi, M. , og Ceppelline, R., "Lymphocyte antibody lymphocytolytic interaction (LALI) with special emphasis on HLA",

Transplant. Proe.. 5:1631-1646, 1973.

33. Trinchieri, G., og Santoli, D., "Anti-viral activity induced by culting lymphocytes with tumor-dertved" or virus-transformed cells", J. Exp. Med.. 147:1314-1333. 1978. 34. Villiamson, B.D., Carswell, E.A., Rubin, B.Y., Prendergast, J.S., og Old, L.J., "Human tumor necrosis factor produced by human B-cell lines: synergistic cytotoxic interation with human interferon", Proe. Nati. Acad. Sei.. 80:5397-5401, 1983.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et humanlymfokin, leukoregulin, eller en subenhet derav, som ikke er nøytralisert av antisera til lymfotoksin, tumornekrosefaktor, interferon eller cytolysin, som har evnen til å regulere fysiologien og veksten av malignant tumorer uten å påvirke veksten av normale celler, evnen til å lysere human HT-29- og RPMI-2650-tumorceller men ikke evnen til å lysere muse a-L929-celler, evnen til å undertrykke hurtig generering av human cancer-celler K562 og RPMI-2650, idet disse aktiviteter er sensitive mot protease, men ikke mot neuraminidase, og som har en molekylvekt på ca. 120 000 til 140 000, bestemt ved nativ gradient-polyakrylamid-gelelektroforese, 50 000 til 70 000 ved gel-permeasjonskromatografi og isoelektriske fokuserings-punkter i pH-området 4,8 til 5,5 eller 7,5 til 8,3, karakterisert ved at leukoregulinet er oppnådd fra en blanding inneholdende lymfokiner ved separering av proteinene i henhold til både molekylstørrelse og molekylladning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at leukoregulinet oppnås fra blandingen ved bruk av, i en hvilken som helst rekkefølge, isoelektrisk fokusering eller anionbyttekromatografi og gelfiltrering eller gradient polyakrylamidgelelektroforese.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den isoelektriske fokusering gjennomføres ved en pH-verdi fra 4,8 til 5,5 eller 7,5 til 8,3.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at leukoregulinet eluerer mellom 0,07 og 0,12 M NaCl saltkonsentrasjon ved ionebyttekromatografi.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at blandingen inneholdende lymfokiner er konsentrert kulturmedium fra en kultur av perifere blodmononukleære celler som er eksponert til phytohemagglutinin for å stimulere produksjonen av leukoregulin.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av en celle som produserer humanleukoregulin ifølge krav 1, karakterisert ved at cellen velges fra gruppen bestående av transformerte diploide B-celler og hybridomceller, fremstilt fra human B-celler oppnådd fra perifert blod fra en kreftpasient som er inokulert med en vaksine omfattende levedyktige celler fra pasientens egen tumor eller en kultur derav.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonale antistoffer, spesifikke for celleoverflatereseptorer av human leukoregulin ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene oppnås ved immunisering, av et dyr med leukoregulinresponsive celler eller deler av cellemembranet fra leukoregulinresponsive celler, ekstrahering av antistoffproduserende celler, fra det immuniserte dyr, fusjonering av antistoffproduserende celler med myelom celler og selektering av hybridomer som skiller ut monoklonale antistoffer som inhiberer den leukoregulinrettede vekst retardering av HT-29-celler.