DK170423B1 - Monoklonalt antistof, der er specifikt for leukoregulincelleoverfladereceptorer, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, hybridoma, som producerer det monoklonale antistof, og prøve for tumorcellefølsomhed under anvendelse af det monoklonale antistof - Google Patents

Description

i DK 170423 B1

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer, der er rettet mod leukoregulinreceptoren på tumorcellers celleoverflade, en fremgangsmåde til fremstilling deraf, hy-bridoma, som producerer det monoklonale antistof, og en prøve 5 for tumorcellefølsomhed over for leukoregulin under anvendelse af det monoklonale antistof.

Leukoregulin er en hidtil ukendt human lymfokin, som er i stand til direkte at lysere og undertrykke formeringen af humane tumorceller og til at forøge deres følsomhed over for 10 lysering formidlet af naturlige dræberlymfocyter.

Lymfokiner, som er immunsystemets hormoner, har evnen til at påvirke udviklingen af cancer, at undertrykke væksten af tu-morigene celler og endog til at ødelægge tumorer. Disse hormoner er glycoproteiner, som produceres og udsondres af 15 visse typer af lymfoide celler og er bestemt til at reagere med andre specifikke celler. Særlige lymfokiner vides at blive produceret af og være i stand til at reagere med mere end én celletype. På lignende vis ved man, at de fleste lym-fokiners aktiviteter er flerfacetteret; en bestemt lymfokin 20 udviser inhiberende, stimulerende, modsat rettede og andre virkninger i forhold til forskellige målceller og tilstande. Endvidere kan en bestemt lymfokin virke både inhiberende og forøgende på carcinogenese under forskellige omstændigheder.

F.eks. er interferon kendt for at inhibere viral carcinoge-25 nese, men forøger strålingscarcinogenese. På lignende måde udviser interferon de antagonistiske virkninger i form af forøgelse af tumorcellers NK-cellelysering, medens tumorcel-lemodstandsevne over for NK-celleaktivitet forøges; idet førstnævnte forekommer tidsmæssigt tidligere efter udsættelse 30 for interferon end sidstnævnte.

Lymfotoksin er et udtryk, som i 1968 blev indført til at betegne det opløselige produkt af antigen- eller mitogen-stimulerede lymfocyter, der formidler den cytolytiske nedbrydning af musens L-celler (3). Flere laboratorier viste derefter, at DK 170423 B1 2 lymfokinpræparater indeholdende lymfotoksin havde direkte virkende cytolytiske og cytostatiske virkninger mod en række forskellige tumorceller (2, 10, 11), anti-carcinogen virkning over for celler, der undergår neoplastisk transformation (1, 5 7, 8) , samt evnen til at forøge præneoplastiske og neopla- * stiske cellers følsomhed over for NK-formidlet nedbrydning (5, 9) .

En anticancerlymfokin i hamster-lymfotoksinpræparater, der adskiller sig fra det der formidler cytolytisk nedbrydning af 10 musens L-celler, blev senere identificeret på basis af molekylær ladning (6). Dette molekyle med molekylvægt 50.000 og med en isoelektrisk pH-værdi på 5,0 var cytostatisk over for hamsterens tumorceller, inhiberede ikke væksten af normale hamsterfosterfibroblaster og inhiberede den kemiske og strå-15 lingsinducerede neoplastiske transformation af hamsterfosterceller, både in vitro og in vivo. Den unikke anticancerlymfokin blev også identificeret som værende forskellig fra interferon, interleukinerne 1 og 2 samt makrofag migrationsinhibe-rende faktor-aktiviteter. Denne opdagelse førte til sidst til 20 et nyt forskningsforløb, ved hvilket humane lymfotoksinpræpa-rater blev undersøgt med henblik på at fastslå, hvorvidt humane lymfotoksinpræparater indeholdt humane lymfotoksiner med unikke anticarcinogene egenskaber og antitumoregenskaber.

Det var formålet med opfindelsen at tilvejebringe en hurtig 25 analyse for cellefølsomhed over for leukoregulin, hvilket blev opnået ved fremstilling af hybridomaer eller transformerede leukocyter, som producerer monoklonale antistoffer, der er specifikke for leukoregulin-celleoverfladereceptorer, og ved at kvantificere bindingen af antistoffet til målcellen, ' 30 der undersøges.

I beskrivelsen til DK ansøgning nr.. 5622/85 er det omtalt, at bestemmelse af følsomheden af en patients cancerceller over for leukoregulin er forudsigende med hensyn til effektiviteten af leukoregulinbehandling. Dyrkning af en patients tumor- DK 170423 B1 3 celler i nærværelse' af leukoregulinholdige, halvfaste medium-former angives deri som et middel til kvantificering af mængden af leukoregulin, der er nødvendig til fuldstændig inhi-bering af væksten af tumorceller. En hurtigere analyse kan 5 imidlertid opnås, når tumorcellernes reaktionsevne bestemmes ved kvantificering af mængden af leukoregulin-celleoverfladereceptor, som udtrykkes på tumorcellen. Dette foretages ved måling af mængden af monoklonalt antistof rettet mod leukore-gulinreceptoren, der binder til tumorcellerne, ved anvendelse 10 af en enzymbundet immunosorbantanalyse, radioimmunanalyse eller immunofluorescentanalyse.

Eksempel

Fremstilling af monoklonale antistoffer til leukorequlin-celleoverfladereceptoren.

15 Balb/c-mus blev immuniseret ved hjælp af tre subkutane injektioner af K 562-membraner med to ugers mellemrum. Hver mus modtog membraner ækvivalent med 107 celler, der var fremstillet ved hjælp af homogenisering med en motordrevet teflon-homogenisator, klaret ved hjælp af centrifugering ved lav ha-20 stighed og derpå opsamlet ved hjælp af ultrafugering ved 100.000 gange g i en time. Membraner blev blandet med Freund's komplette hjælpestof ved hver af injektionerne. Tre dage før hybridisering fik musene intraperitonealt injiceret K 562-cellemembranerne i PBS. På fusionsdagen blev miltene 25 udtaget, og enkelte celler blev tilvejebragt og sammensmeltet i et forhold på 3 miltceller til 1 myelomacelle med PEG. Efter sammensmeltning eller fusion blev hybrider udvalgt ved dyrkning i medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin (4) . Kolonier, der producerer antistoffer til leu-30 koregulinreceptoren, blev klonet ved hjælp af en begrænsende fortyndingsmetode.

En biologisk analyse, der måler inhiberingen af leukoregulin-dirigeret vækstretardering af HT-29-celler, blev benyttet til DK 170423 B1 4 påvisning af antistoffer til leukoregulinreceptoren. To tusind HT-29-celler blev udpladet i 0,1 ml MEM-10% FBS i fordybninger i en plade med 96 fordybninger. Tilstrækkelig meget i leukoregulin i 0,1 ml til at bevirke en 50% inhibering af 5 HT-29-cellevækst blev tilsat efterfulgt af 25 μΐ af superna-tanten indeholdende testantistoffet. Efter 3 dages inkubation måltes inhibering ved kvantificering af tilstedeværende celler ved farvning med MTT som tidligere beskrevet. Enhver prøve, der udviser en 25% eller større inhibering af leukore-10 gulinaktiviteten, blev anset for positiv. Den logiske begrundelse for denne analyse er, at det monoklonale antistof vil binde til leukoregulinreceptoren, som derved inhiberer leuko-regulinbinding og dens efterfølgende vækstinhiberende aktivitet .

15 · Kvantificering af leukoregulinreceptor-ekspression blev målt på tre måder, der alle kvantificerede procentdelen af mono-klonalt antistof rettet mod leukoregulinreceptoren. Ved immu-nofluorescentanalysen blev 2 x 105 celler inkuberet sammen med det monoklonale antistof i 1 time ved 37°C. Cellerne blev 20 vasket 2 gange, en fluorescentkonjugeret ged anti-mus immunoglobulin (Kirkegård and Peiry Labs, Rockville, MD) blev tilsat, og der blev inkuberet i 30 min. ved 4°C. Cellerne blev vasket, gensuspenderet i 0,5 ml PBS samt analyseret på et EPICS 5 strømningscytometer (Coulter Instruments, Hialeah, 25 FL) under anvendelse af 488 laserlinien til excitering af den grønne fluorescens. ELISA og RIA blev udført på en lignende måde med den undtagelse, at det til ELISA benyttede konjugat var en peberrodsperoxidase-ged anti-mus immunoglobulin, og at det til RIA benyttede konjugat var 125I-mærket ged anti-mus 30 immunoglobulin. ELISA-analysen blev kvantificeret kolorime- ' trisk ved måling af mængden af substrat, der var hydrolyseret på en automatiseret ARTEK-aflæser. RIA-analysen blev kvanti- ; ficeret ved måling af bundet 125I-mærke ved anvendelse af en LKB-gammatæller (LKB Instruments, Rockville, MD).

DK 170423 B1 5

TABEL

Strømningscytometrisk analyse af bindingen af monoklonalt antistof til leukoregulin-celleoverfladereceptoren.

5 Monoklonalt _Procent positive celler antistof HT-29 K 562

LrR-MP28 23 2

LrR-M2 15 2 10 _

Litteratursteder: 1. C.H. Evans og J.A. DiPaolo, "Lymphotoxin: an anticar- cinogenic lymphokine as measured by inhibition of chemical carcinogen or ultraviolet-irradiation-induce trans- 15 formation of Syrian hamster cells", Int. J. Cancer.

27:45-49, 1981.

2. C.H. Evans og J.A. Heinbaugh, "Lymphotoxin cytotoxicity, a combination of cytolytic and cytostatic cellular responses", Immunopharm, 2:347-359, 1981.

20 3. G.A. Granger og W.P. Kolb, "Lymphocyte in vitro cytotoxi city: mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction", J. Immunol.. 101:111-116, 1968.

4. M.V. Haspel et al., Science. 220:304-306. 1983.

25 5. J.H. Ransom og C.H. Evans, "Lymphotoxin enhances the sus ceptibility of neoplastic and preneoplastic cells to na-

Claims (4)

1. Monoklonalt antistof, der er specifikt for leukoregulin-celleoverfladereceptorer. DK 170423 B1

2. Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale antistoffer, der er specifikke for leukoregulin-celleoverfladerecep-torer, kendetegnet ved, at man immuniserer et dyr med celler, der reagerer på leukoregulin, eller med dele af 5 cellemembranen fra celler, der reagerer på leukoregulin, ekstraherer antistofproducerende celler fra det immuniserede dyr, sammensmelter de antistofproducerende celler med myelo-maceller og udvælger hybridomaer, som udsondrer monoklonale antistoffer, der er specifikke for leukoregulin-celleoverfla-10 dereceptorer.

3. Hybridoma, som producerer det monoklonale antistof ifølge krav 1.

4. Prøve for tumorcellefølsomhed over for leukoregulin under anvendelse af det monoklonale antistof ifølge krav 1, k e n - 15 detegnet ved, at man kvantificerer monoklonalt antistofs binding til målcellen.