DK170781B1 - Human leukoregulin og biologisk aktive underenheder deraf, fremgangsmåde til fremstilling og til oprensning af human leukoregulin, biologisk aktivt materiale indeholdende human leukoregulin samt celle, som producerer human leukoregulin - Google Patents

Description

DK 170781 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt human polypeptid-lymfokin, benævnt leukoregulin, og biologisk aktive underenheder deraf. Opfindelsen angår endvidere fremgangsmåder til fremstilling og til oprensning af human leuko-5 regulin, et biologisk aktivt materiale indeholdende leukoregulin samt celler, som producerer human leukoregulin.

Nærmere bestemt angår opfindelsen en hidtil ukendt human lym-fokin, som er i stand til direkte at lyse og undertrykke formeringen af humane tumorceller og at forøge deres følsomhed 10 for lyse formidlet af naturlige dræberlymfocyter. Disse antitumorvirkninger har tidligere været tilskrevet lymfotok-sin. Det har imidlertid vist sig, at humane lymfokinpræpara-ter, der har disse antitumorcelleaktiviteter, kan adskilles biokemisk fra lymfotoksin og andre tidligere isolerede lymfo-15 kiner, herunder interferon, interleukiner 1 og 2 og makrofag-aktiverende faktoraktiviteter.

Tegningen illustrerer identifikationen af leukoregulin som en enestående og tidligere ukendt lymfokin og viser dens effektivitet til regulering af væksten af humane tumorceller.

20 Lymfokiner, immunsystemets hormoner, har muligheden for at påvirke udviklingen af cancer, at undertrykke væksten af tumorigene celler og endog at ødelægge tumorer. Disse hormoner er glycoprotei-ner, produceret og udskilt af visse typer lymfoidceller og målrettet til at samvirke med andre specifikke celler. Særlige lym-25 fokiner vides at blive produceret af og at være i stand til at reagere med mere end én type celler. På lignende måde vides aktiviteterne af de fleste lymfokiner at have flere facetter, idet en given lymfokin udviser hæmmende,stimulerende, fremmende, modvirkende og andre aktiviteter i forhold til de forskellige målceller 30 0g betingelser. Endvidere kan en given lymfokin virke både til at hæmme og fremme karcinogenese under forskellige omstændigheder. For eksempel vides interferon at hæmme viral karcinogenese, men fremme strålingskarcinogenese. På lignende måde udviser interferon de antagonistiske virkninger at forøge NK-celle- lysen af tumorceller, samtidig med at det forøger tumorcelle- modstandsevnen mod NK-celleaktivitet, idet førstnævnte forekommer før i tid efter udsættelse for interferon end sidstnævnte.

2 DK 170781 B1

Lymfotoksin er et udtryk, der blev indført i 1968 til betegnelse 5 for det opløselige produkt af antigen- eller mitogenstimulerede lymfocyter, som formidler den cytolytiske ødelæggelse af muse-L-celler (9). Flere laboratorier påviste derefter, at lymfokin-præparater indeholdende lymfotoksin havde direkte virkende cytolytiske og cytostatiske virkninger over for forskellige tumor-10 celler (7, 30, 31), antikarcinogen virkning mod celler, der undergår neoplastisk omdannelse (6, 25, 26) og evne til at forøge følsomheden af præneoplastiske og neoplastiske celler over for NK-formidlet ødelæggelse (23, 27).

En anticancerlymfokin i hamsterlymfotoksinpræparater, der er for-15 skellig fra den, der formidler muse-L-cellecytolytisk ødelæggelse, blev senere identificeret på basis af molekylær ladning (24). Dette molél^yle med en molekylvægt på 50.000 og med et isoelektrisk punkt på 5,0 var cytostatisk for hamstertumorceller, hæmmede ikke væksten af normale hamsterføtale fibroblaster og hæmmede 20 den kemiske og strålingsinducerede neoplastiske omdannelse af hamsterføtale celler, både in vitro og in vivo. Den enestående anticancerlymfokin blev også identificeret som værende forskellig fra interferon, interleukiner 1 og 2 og makrofag-vandringshæmningsfaktoraktiviteter. Denne opdagelse førte til sidst til 25 et nyt forskningsforløb, hvori humane lymfotoksinpræparater blev undersøgt for at bedømme, om humane lymfotoksinpræparater indeholdt humane lymfokiner, der har enestående antikarcinogene og antitumoregenskaber.

Et formål med den foreliggende opfindelse var biokemisk og bio-30 logisk at karakterisere og rense den humane lymfokin, som er opdaget ifølge opfindelsen, og som har antitumoregenskaberne direkte at lyse tumorceller, undertrykke deres formering og forøge deres følsomhed for lyse formidlet af naturlig dræberlymfocyt 3 DK 170781 B1 samt at hæmme den karcinogene omdannelse af normale celler. Dette formål blev opnået ved at identificere og isolere leukoregulin, en lymfokin med en molekylvægt på ca. 120.000 - 140.000, med underenheder ved dissociation med en molekylvægt på ca. 30.000 -5 35.000, som renses ved isoelektrisk fokusering ved pH mellem ca. 4,8 og 5,5 eller mellem ca. 7,5 og 8,3.

Et andet formål var at identificere de cellulære kilder til leukoregulin og udvikle fremgangsmåder til at stimulere dens 10 fremstilling. Det viste sig, at perifere blodleukocyter, en kilde til leukoregulin, kunne stimuleres til at forøge produktionen af leukoregulin ved i en effektiv periode at udsættes for fytohæmagglutinin. Den optimale eksponeringstid var 48 timer, og længere og kortere perioder var stadig effektive, om-15 end i mindre grad. Andre provokeringsmidler fandtes også at forøge leukoregulinproduktion, f.eks. tetradecanoylphorbol-acetat, concanavalin A og andre plantelectiner, som er mitogene. Desuden blev effektive leukoregulinproducerende celler fremstillet i nogle tilfælde ved omdannelse af lymfocyter og dannel-20 se af hybridomaceller.

Andre formål og ejendommeligheder ved opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse.

25 Tegningens fig.1-11 viser egenskaberne og aktiviteterne af leukoregulin, således som den adskiller sig fra andre lymfokiner.

Det er ifølge opfindelsen blevet opdaget, at humane lymfokin-præparater indeholder en enestående lymfokin med evne til at hæm-3 0 me væksten af humane tumorceller ved direkte lyse, hæmme celle formering og forøge følsomheden af tumorceller over for ødelæggelse formidlet af naturlig dræbercelle (NK). Udtrykket "leu- 35 4 DK 170781 B1 koregulin" er blevet anvendt til denne lymfokin, fordi den er et leukocytprodukt og et cellevækstregulerende stof, som molekylært og biologisk adskiller sig fra lymfotoksin, interferon, interleukin 1 og 2 og makrofag-aktiverende faktoraktivite-5 ter.

Leukoregulin har en molekylvægt på ca. 120.000 - 140.000, bestemt ved gradient-polyacrylamidgelelektroforese og gelfiltreringskromatografi, med underenheder ved dissociation med en molekylvægt på ca. 30.000 - 35.000. Det renses ved isoelektrisk fokusering ved pH-værdier på ca. 5,0 og 7,5. Leukoregulin fraktione-10 ret efter molekylvægt og isoelektrisk fokusering fås fri for påviselig lymfotoksin, interferon, interleukin 1 og 2 og makro-fag-aktiverende faktoraktiviteter.

En særlig bestræbelse blev gjort for at fastslå, at de egenskaber, som ifølge opfinderne tillægges leukoregulin, kan skelnes fra 15 egenskaberne af lymfotoksin. Bevisførelsen, der demonstrerer, at leukoregulin adskiller sig fra lymfotoksin, er følgende: 1) lymfotoksin fra humane perifere blodleukocyter og højt renset lymfotoksin fra RPMI 1788 humane lymfoblastoide celler lyser let murine a-L929-tumorceller, men har ingen påviselige anti-20 humane tumorcelleaktiviteter. 2) leukoregulinaktivitet aftog efter fordøjelse med protease, men ikke med neuraminidase, medens lymfotoksinaktivitet aftog efter både protease- og neu-raminidasebehandling. 3) leukoregulin kunne adskilles fra lymfotoksin ved isoelektrisk fokusering til arter, der forårsa-25 gede lyse, væksthæmning og forstærkelse af humane tumorceller over for cytolyse med naturlige dræberceller, men som ikke lyse-de murine L-celler (aktiviteten af lymfotoksin). Kombinationen af afvigende leukoregulin/lymfotoksinkoncentrationer i PBL-lymfokinpræparater, følsomhed over for neuraminidase og protea-30 ser og forskellige isoelektriske punkter viser afgørende, at leukoregulin er forskelligt fra lymfotoksin.

5 DK 170781 B1

Leukoregulin adskiller sig også fra interferon, et andet immunologisk hormon, der er i stand til at hæmme celleformering. Interferon er blevet påvist at hæmme væksten af nogle normale celler og tumorceller (2, 18). a- ogy-interferon påvirkede 5 imidlertid ikke formeringen af nogen af de leukoregulin- følsomme tumorceller beskrevet i den foreliggende ansøgning.

Selv om nogle humane lymfokinpræparater indeholder både leukoregulin og interferon, kan de to hormoner adskilles ved molekylær sigtning. Interferonberigede fraktioner udviser endvidere 10 ikke leukoregulinaktivitet.

Foruden hæmningen af tumorcelleformering er rensede fraktioner beriget på leukoregulin også blevet påvist at forøge følsomheden af tumorceller over for NK-formidlet cytotoksicitet. Denne aktivitet er modsat den af interferon (33) og er enestående for 15 leukoregulin. Forøgelsen af NK-formidlet cytotoksicitet menes at være et vigtigt middel, hvorved leukoregulin regulerer væksten af tumorer in vivo (27).

En vigtig side af mekanismen af leukoregulinaktiviteten er dens evne til at ændre celleoverflademembranens tilpasning og permea-20 biliteten af tumorceller. Strømningscytometrisk analyse blev anvendt til at måle disse ændringer inden for minutter efter målcellens udsættelse for leukoregulin. Denne metode giver stor mulighed for undersøgelser, der kræver korte bestemmelsestider, såsom påvisning af monoklonale antistoffer til leuko-25 regulin eller til leukoregulinreceptoren.

Slægtsskabsforholdet mellem leukoregulin og tumornekrosefaktor, en anden tumorcellehæmmende lymfokin, blev også undersøgt. Humane tumornekrosefaktorpræparater inducerer blødningsnekrose af nogle musesarcomaer in vivo og har samme in vitro aktivitet 30 som lymfotoksin (34). Da renset leukoregulin ikke formidler samme biologiske aktivitet som lymfotoksin, adskiller leukoregulin sig fra tumornekrosefaktoren.

6 DK 170781 B1

Hamsterlymfokinpræparater indeholder lymfotoksin, en leukoregulin aktivitet (væksthæmning af hamstertumorceller, men ikke normale hamsterceller) og en antikarcinogen virkning. Leukoregulin-aktiviteten og den antikarcinogene aktivitet renses sammen, men 5 disse to aktiviteter har to isoelektriske pH-værdier, hvoraf den ene adskiller sig fra hamsterlymfotoksin, og den anden er identisk med hamsterlymfotoksin (24). Hamsterlymfotoksin nedbrydes af neuraminidase, medens leukoregulinaktiviteten og den antikarcinogene aktivitet er upåvirket. Hamsterleukoregulin-10 og antikarcinogenaktivitet er imidlertid på samme måde følsomme for proteasefordøjelse. Ud fra dette og i forbindelse med de andre biokemiske data konkluderes ifølge opfindelsen, at hamster-leukoregulin også har antikarcinogen aktivitet. Da human leukoregulin har vist samme biologiske og biokemiske egenskaber 15 som hamsterleukoregulin, skulle den også være antikarcinogen.

Når godkendelse til kliniske prøver til eksperimentelt brug af leukoregulin til behandling af human cancer opnås, vil der blive udført fase I kliniske forsøg med patienter, der har et fremskredent stadium af neoplastiske sygdomme. Patienterne vil få 20 leukoregulin som beskrevet nedenfor. Doserne vil blive forøget for at konstatere den maksimalt tålelige dosis for hver terapiform ved at bedømme toksiske reaktioner manifesteret ved gastro-intestinale forstyrrelser, anæmi, leukopeni, feber eller andet tegn på organskade og dysfunktion. Det forventes, at leukoregu-25 lin vil tåles meget godt, således at administration af høje doser er mulige. Behandlingsbestræbelser under anvendelse af delvis rensede PHA-stimuleret perifer blodlymfocytsupernatanter, som utvivlsomt indeholdt leukoregulin, har vist meget ringe toksicitet med sådanne materialer (13).

30 Fase II kliniske forsøg vil fokusere på bedømmelse af leukoregulin hos patienter med begrænset sygdom, hos hvem terapeutiske DK 170781 Bl 7 fordele vil være mest tydelige. Indledende forsøg vil anvende leukoregulin som adjuvant til primær kirurgisk terapi, kemoterapi eller radioterapi, og senere forsøg kan bedømme leukoregulin som en primær behandlingsmodalitet.

5 Leukoregulin vil blive administreret systemisk ad den intravenøse eller intralymfatiske vej, lokalt ved intratumoral injektion eller peritoneal udskylning, eller som ex vivo terapi. Et eksempel på sidstnævnte er, hvor knoglemarvsceller fjernes fra patienten, behandles med leukoregulin for at fjerne tumorceller 10 og anvendes til at rekonstituere knoglemarven hos patienterne, efter at deres knoglemarv har modtaget meget høje doser af kemoterapi eller strålingsterapi.

Leukoregulin vil blive administreret som en kontinuerlig infusion eller som individuelle injektioner efter behov til at op-15 retholde de nødvendige mængder leukoregulin i cirkulationssystemet og vævene.

Som et alternativ til direkte administration ville kloning af leukoregulinkodende gener i humane lymfoide celler, der er blevet ude af stand til at formere sig, give en mulighed for at opret-20 holde konsekvent in vivo leukoregulinkoncentration gennem in vivo produktion. Brug af celler med en begrænset in vivo levetid ville sikre, at leukoregulinmængder ville være regulerbare inden for forholdsvis korte perioder.

Andre alternativer til direkte administration indbefatter indsæt-25 ning af leukoregulinkodende gener i et viralt genom og anvende virusen til at bære generne ind i en specifik gruppe celler, som translaterer generne til leukoregulin, og derved omgå normale reguleringsprodukter, som ellers ville begrænse leukoregulinproduk-tion. For eksempel kunne Epstein-Barr virusen, som kun inficerer 30 B-lymfocyter og i reglen frembringer en begrænset, ret mild infektion, fungere som passende viral vektor til leukoregulingener, hvis det virale genom ændres til at forhindre sygdommens fremad- 8 DK 170781 B1 skriden som følge af virusinfektionen.

Behandling af massive tumorer vil mest effektivt blive udført ved at maksimere leukoregulinkoncentrationen i de umiddelbare omgivelser af tumoren, i stedet for at prøve på at opretholde 5 en meget høj koncentration i hele legemet. Humane monoklonale antistoffer med kvalitativ eller kvantitativ specificitet for tumorcelleoverfladeantigener vil udgøre en passende "krog", hvorpå leukoregulin kan hænges for at sikre høje koncentrationer inde i tumorer. En anden mulighed er at indkapsle leukoregulin 10 i liposomer, der kan have tumorspecifikke monoklonale antistoffer på deres overflader. Passende valg af liposomale triglyce-rider giver liposomer, som er resistente over for cirkulerende amylaseenzym og er i stand til at smelte sammen med tumorcellemembraner til intracellulær transport af deres leukoregulin-15 indhold. Lipofile bærerstoffer (dimethylsulfoxid, borsyrederi-vater) kan inkluderes i liposomen for at forøge transport af dens indhold gennem forstærket fusion af dens membranlipid med lipiderne i tumormålcellen.

Leukoregulin synes at forøge antitumoraktiviteterne af kemo-20 terapeutiske midler (19) uden at føje noget til deres toksiske bivirkninger og giver således et meget højere effektivt dosisniveau. Leukoregulin vil derfor blive anvendt i behandlinger med forskellige terapeutiske stoffer og strålingsterapi for at bedømme denne antitumorforøgende virkning.

25 Leukoregulins antikarcinogene aktiviteter er lige så vigtige som dens antitumoraktivitet, når den anvendes sammen med cytotoksiske kemoterapeutiske midler eller radioterapeutiske metoder En særlig lumsk følge af strålingseksponering og kemoterapi er forekomsten af nye neoplasmer, som ikke har nogen relation til 30 den sygdom, der behandles. Med ledsagende administration af leukoregulin kan der anvendes meget højere doser i kemoterapi eller strålingsbehandling, fordi leukoregulin vil blokere de 9 DK 170781 B1 karcinogene virkninger af disse midler. Leukoregulin vil være nyttigt på lignende måde anvendt sammen med immunoundertrykkende lægemidler til behandling af patienter, der har autoimmunsygdomme, og som er modtagere af transplanter.

5 Leukoregulin er en terminal komponent af en cytokin-lymfokin-kaskade, som indbefatter tilgangen og immobiliseringen af lymfocyter og monocyter, deres aktivering eller differentiering til at udtrykke forskellige effektorfunktioner og produktionen af faktorer såsom leukoregulin, der udfører de cytotoksiske 10 funktioner. Forskellige lymfokiner anvendt som en cocktail eller, mere sandsynligt, administreret i en passende rækkefølge skulle forøge lymfoidcelle-infiltration af en tumor (makrofag-vandrings-hæmningsfaktor, interleukin 1), stimulere deres cytotoksiske funktion (makrofag-aktiverende faktor, interleukin 1 og 2, leuko-15 regulin og interferon), direkte angribe tumorceller (leukoregulin, NK-cytotoksisk faktor og interferon) og gøre tumormålceller mere følsomme for de cytotoksiske effektorceller (leukoregulin).

I denne form for terapi vil leukoregulin spille en meget vigtig rolle.

20 Foruden tumorcellevækstreguleringen og de NK-celleformidlede cytotoksicitetsforøgende aktiviteter, som tilsammen stopper væksten af og begynder at reducere tumormasser, udviser leukoregulin også antikarcinogene egenskaber, der vil være særligt nyttige til anvendelse sammen med materialer anvendt ved bio-25 medicinske diagnostiske bedømmelser og ved strålingsterapi eller kemoterapi, der selv kan inducere karcinogenese (26). Behandling med leukoregulin under procedurer, der kan have disse mulige bivirkninger, vil forhindre karcinogenese under varigheden af prøverne eller terapien (20).

30 På samme måde kan patienter bedømmes for deres niveau af immuno-undertrykkelse og potentiel risiko for dannelse af maligne tilstande ved at måle deres PBL-leukoregulinproduktion efter stimu- 10 DK 170781 B1 lering.

Som et supplement til leukoregulinterapi kunne bestemmelse af følsomheden af en patients cancerceller over for leukoregulin 5 forudsige effektiviteten af leukoregulinbehandling. Dyrkning af en patients tumorceller i nærværelse af leukoregulinholdigt halvfast medium er et middel til at kvantificere den mængde leukoregulin, som er nødvendig til fuldstændigt at hæmme væksten af tumorcellerne.

10 EKSEMPEL 1.

15

Forkortelserne anvendt i følgende diskussion er: PBS: 0,14 M

NaCl, 0,1 M natriumphosphat, pH 7,4. PEG: polyethylenglycol, molekylvægt 4000. FBS: kalvefosterserum. IEF: isoelektrisk fokusering. HPLC: højtydende væskekromatografi. NK: naturlig 20 dræber lymfocyt. dThd: thymidin. MTT:. 3-(4,5-dimethylthiazolyl- 2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid. FDA: fluoresceindiacetat.

VCN: Vibrio cholera neuraminidase. PHA: fytohæmagglutinin.

PBL: perifer blodleukocyt. TPA: tetradecanoylphorbolacetat.

ELISA: enzymbundet immunosorbansbestemmelse. RIA: radioimmun-25 bestemmelse.

Lymfokinfremstilling: 10 - 20 ml gulbrune hindeleukocyter fra centrifugeret humant 30 normalt donorblod blev lagt i et lag på 10 ml lymfocytadskillelses- 35 11 DK 170781 B1 medium (LSM, Litton Bionetics, Kensington, Maryland) og centrifugeret ved 700 xg i 20 minutter ved stuetemperatur. Mononukleare celler blev opsamlet ved grænsefladen mellem LSM og plasma, vasket to gange med RPMI 1640 medium og optalt mikro-5 skopisk i nærværelse af 0,04% trypanblåt for at bestemme levedygtigheden, som altid oversteg 95%. 20 millioner celler blev udpladet i 20 ml RPMI 1640 med 10 Mg PHA/ml (PHA-type IV leuko-agglutinin, Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri) i en 100 mm vævskulturskål af plast og inkuberet ved 37°C i 5% 10 CC>2: 95% luft, fugtet inkubator.

Efter 24, 48 eller 72 timer blev lymfocytkulturmediet indeholdende de udskilte lymfokiner opsamlet og centrifugeret i 10 minutter ved 1000 x g for at fjerne celler. Lymfokinmediet blev koncentreret 40 gange over en YM10 membran i en Amicon-celle (Amicon, 15 Inc., Danvers, MA) og diafiltreret over for PBS-0,1% PEG. Den koncentrerede lymfokin blev filtersteriliseret, opdelt i ali-quote portioner, frosset ved -30° og anvendt inden for en måned efter frysning (se tabel 1).

Højt renset human lymfotoksin, produceret af den lymfoblastoide 20 cellelinie RPMI 1788 (1) blev leveret rigeligt af dr. Bharat B. Aggarwal (Genentech, Inc., San Francisco, CA). 1788-cellelinie-lymfotoksinet blev renset i rækkefølge ved DEAE cellulolose-kromatografi, præparativ isoelektrisk fokusering, lentil-lectin-Sepharose-kromatografi og præparativ polyacrylamidgel-25 elektroforese (1). Det rensede lymfotoksin havde en molekylvægt på 20.000, et isoelektrisk punkt på 5,8 og en specifik ak- 7 tivitet på 4 x 10 enheder/mg protein.

Syrisk guldhamster-lymfokin blev produceret af peritoneale leu-kocyter på lignende måde som human lymfokin, således som tid-30 ligere beskrevet (24).

12 DK 170781 B1 Målceller: K562 humane erythroleukæmiceller blev leveret af dr. Julie Djeu (Bureau of Biologies, Food and Drug Administration, Bethesda, MD) OST-celler, etableret i kultur i opfindernes laboratorium, blev 5 afledt af en frisk udskåret human osteosarcoma, leveret af dr. Elizabeth Grimm (NIH Clinical Center, Bethesda, MD). Normale humane hudfibroblaster, CRL 1457 (20 år gammel kvinde), C KL 1505 (21 år gammel mand), CRL 1537 (14 år gammel mand), normale koloniske mukosale celler og alle andre humane tumorcellelinier 10 fremskaffedes fra The American Type Culture Collection (Rockville MD) .

Alle celler blev vedligeholdt og passeret én gang om ugen i Eagles minimale essentielle medium (MEM), suppleret med 10% FBS med undtagelse af K562-cellerne, som blev vedligeholdt i RPMI 15 1640 - 10% FBS. Murine a-L929-celler var en gave fra dr. Gale

Granger (USC, Irvine, CA) og anvendes som et mål for lymfotoksin (7). 7997-celler er en benzo(a)-pyren-induceret tumorcellelinie fra syrisk guldhamster (8).

Lymfotoksinbestemmelse: 20 Lymfotoksinaktivitet blev målt som lysen af murine a-L929-celler under anvendelse af radionuklid-frigørelsesbestemmelse (7). Antallet af cytolytiske lymfotoksinenheder i et præparat blev bestemt ved at aftegne regressionslinien af log af det reciprokke af prøvefortyndingen, som forårsagede en 50% frigørelse af [ H]-25 dThd-mærket i 1 x 10 a-L929-celler under 3 dages inkubation (se tabel 2).

Leukoregulinbestemmelse:

Human leukoregulinaktivitet blev målt som væksthæmningen (cyto- statisk aktivitet) af humane tumorceller. Til den cytostatiske 4 30 aktivitet blev 10 tumorceller i 0,5 ml passende kulturmedium 13 DK 170781 B1 udpladet i kulturplader med 24 fordybninger (Costar, Inc., Cambridge, MA). Enten medium eller forsøgsprøver fortyndet over et 100-dobbelt interval i 0,5 ml blev tilsat in triplo, og cellerne blev inkuberet ved 37°C i et 5% ^£ί95% luft, fugtigt 5 kammer i 3 dage. Ikke-vedhængende celler blev kvantificeret ved suspendering i 9 ml Hematal og tælling med en model ZBI Coulter tæller (Coulter Instruments, Inc., Hialeah, FL). Vedhængende celler blev frigjort ved inkubation ved 37°C i 1 minut i 0,02% trypsin i PBS før tælling ligesom med vedhængende celler (Se 10 tabel 2).

Ved nogle forsøg blev hæmning af cellevækst bestemt ved anvendelse 3 af en mikrobestemmelse. Ved denne bestemmelse blev 2 x 10 celler i 100 /il RPMI 1640 - 10% FBS udpladet i mikrotiterplader med 96 fordybninger. Derefter blev 100 ;ul medium, 0,5% SDS eller 15 lymfokinprøve tilsat in kvadruplo, og pladerne blev inkuberet ved 37°C i et fugtigt 95% luft: 5% CC^ kammer i 3 dage. Fladbundede plader blev anvendt til vedhængende celler og rundbundede til K562 ikke-vedhængende celler. 20 /il MTT (Sigma) (5 mg/ml PBS, opløst med kraftig omrøring og frisk fremstillet før brugen) 20 blev sat til hver fordybning. Pladerne blev inkuberet i yderligere 4 timer ved 37°C, og medierne blev fjernet ved forsigtig udsugning med en 18 g nål. Det reducerede MTT, et purpurfarvet formazanbundfald, blev opløseliggjort ved tilsætning af 100 /il 0,05 M HC1 i isopropanol. Absorbansen af farvestoffet blev 25 afløst ved 540 nm med en ARTEK automatiseret lodret strålingsaflæser (ARTER Systems, Inc., Farmingdale, New York). Prøvefordybningen indeholdende SDS blev anvendt som blindprøve og blev trukket fra alle andre prøveaflæsninger. Ved indledende forsøg blev celler podet med varierende tætheder, og mængden af 30 dannet reduceret bundfald fandtes at være direkte proportional med antallet af celler pr. fordybning. Mikrobestemmelsen var sammenlignelig i følsomhed med celletællingsbestemmelsen.

Den procentiske hæmning af cellevækst ved hver prøve blev bereg- 14 DK 170781 B1 net som forholdet mellem middeltallet af celler eller absorbans-enheder af prøven og antallet af celler eller absorbansenheder i mediumkontrolfordybninger minus 1 ganget med 100%. Leuko-regulin-cytostatiske enheder blev bestemt ved at aftegne re-5 gressionslinien af log til det reciprokke af prøvefortyndingen mod den procentiske væksthæmning og var lig med det reciprokke af fortyndingen, som bevirkede en 50% hæmning af cellevækst.

Den humane koloncarcinomacellelinie HT-29 er meget følsom for væksthæmmende aktivitet af leukoregulin og blev anvendt som 10 standard til måling af leukoregulin, hvormed andre celler blev sammenlignet.

Til den cytolytiske aktivitet blev tumorceller forud mærket med 3 4 [ H-]dThd (7) og udpladet med 10 celler i 0,5 ml/fordybning i plader med 24 fordybninger. 1/2 ml medium, 0,5% natrium-15 dodecylsulfat (SDS) eller prøve, fortyndet over et 100-dobbelt interval, blev tilsat in triplo, og cellerne blev inkuberet i 3 dage.

Pladerne blev centrifugeret ved 200 x g i 10 minutter, og ali-quote portioner på 200 μΐ af supernatanterne blev udtaget, 20 suspenderet i 2,8 ml Ultrafluor (NEW, Boston, MA) og talt i en LKB scintillationstæller (LKB Instruments, Inc., Rockville, MD).

3

Den procentiske frigjorte specifikke [ H]-dThd blev beregnet son følger: 2 middel CPM prøve - middel CPM mediv % specifik i H] frigørelse - - middel CPMooc, - middel CPM : SDS medium 25 Antallet af cytolytiske leukoregulinenheder blev beregnet på san me måde som lymfotoksin-cytolytiske enheder.

Karcinogeneseprøve: Hæmningen med syrisk guldhamsterlymfokinpræparater af den kemi- 15 DK 170781 B1 ske og strålingsinducerede omdannelse af syrisk guldhamster-fosterceller blev undersøgt under anvendelse af en in vivo -in vitro transplacental omdannelsesprøve som tidligere beskrevet (24, 25). (Se tabel 3).

5 Interferonprøve:

Interferon blev bestemt af Biofluids, Inc. (Rockville, MD) ved at bestemme hæmningen af den semimikrocytopatiske virkning, forårsaget af oksevesikulær stomatitis-infektion af humane neo-natale forhudsfibroplaster eller WISH-celler. Den humane WISH-10 cellelinie er 5 til 10 gange mere følsom for gamma-interferon end humane forhudsceller. Grænsen for påvisning med denne prøve er én enhed antiviral aktivitet, som er standardiseret over for NIH reference human fibroblast-interferon. (Se tabel 4).

Ved nogle forsøg blev virkningerne af a- og γ-interferon på 15 cellulære biobestemmelser bestemt. α-interferon (købt hos Sig ma) blev produceret i Burkitt lymphomaceller (Namalva) ved induktion med Sendai-virus og havde en specifik aktivitet på 1,1 x 10^ internationale referenceenheder/mg protein, γ-interferon 5 20 med en specifik aktivitet på 10 antivirale enheder/ml blev venligst leveret af dr. Gary Thurman (NCI, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD) og blev fremstillet af Flow Laboratories, Inc. (McLean, VA) og Meloy Laboratories (Spring-field, VA) til The Biological Response Modifiers Program 25 (NCI, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD). (Se tabel 5).

Interleukiner 1 og 2:

Interleukin 1-aktivitet blev bestemt ved at måle forstærkelsen med lymfokin af formeringen af C3H/HeJ-murine thymocyter, der 30 reagerer på PHA (18). Thymocytformering kan også afspejle tilstedeværelsen af interleukin 2. Lymfokin blev derfor også af- · 16 DK 170781 B1 prøvet for interleukin 2 under anvendelse af en standard-mikrobes temmelse (3, 22), baseret på den interleukin 2-afhængige formering af den OH-l-egernabe kontinuerlige T-cellelinie, der er følsom for human interleukin 2. En human interleukin 2-5 standard (leveret af dr. P.Jagannath, Litton Bionetics, Inc., Kensington, MD) havde 1/2 maksimal formeringsforøgelse ved en fortynding på 1:1500. En human interleukin 1-standard blev fremstillet i opfindernes laboratorium under anvendelse af den lym-fokin-produktionsmetode, som er beskrevet heri. (Se tabel 4).

10 Makrofagaktivering og endotoksinbestemmelser:

Disse to bestemmelser blev venligst udført af dr. Gary Thurman, NCI, Frederick Cancer Research Facility, Frederick, MD. Makrofag-aktiverings-aktivitet blev målt som lymfokins evne til at forstærke den cytotoksiske aktivitet af humane monocyter for humane 15 tumorceller (14). Endotoksin blev bestemt ved en kromogen prøve (Endotoxin chromogenic assay kit, M.A.Bioproducts, Walkerville, MD), der er følsom til ca. 0,1 ng. Det mulige bidrag af endotoksin til tumorcellevæksthæmning blev også undersøgt. Endotoksin (lipopolysaccharid) med serotype-numre 055:B5 og 0111:B4 20 (Sigma) blev sat til den cytostatiske tumorcellebestemmelse i koncentrationer på 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 og 20 ng/ml. Virkningen på tumorcellevækst blev målt som ovenfor. (Se tabel 4).

Isoelektrisk fokusering:

Præparativ søjle-isoelektrisk fokusering af de koncentrerede 25 lymfokinprøver blev udført med en pH 3,5 - 10 amfolin (LKB, Rockville, MD)-gradient i en 110 ml isoelektrisk fokuseringssøjle (LKB) (28). Fraktioner på 3 ml blev opsamlet, og pH^værdien af hver fraktion blev målt. Udvalgte fraktioner blev samlet, diafiltreret over for PBS - 0,1% PEG, filtersteriliseret med et 30 0,22 ^1 Millex filter (Millipore Corp., Bedford, MA) og undersøgt for biologisk aktivitet. (Se tabel 4 og figur 8).

17 DK 170781 B1 HPLC:

Adskillelser baseret på molekylstørrelse blev udført under anvendelse af en præparativ Toyasoda G3000 SWG gel-HPLC-søjle (forhandlet af LKB). 2 ml prøver blev isokratisk elueret med en strømningshastighed på 4 ml/min. med 0,02 M natriumphosphat-5 stødpude, pH 7,4, med 0,1% PEG. Fraktioner på 4 ml blev opsamlet, filtersteriliseret og undersøgt for biologisk aktivitet.

(Se figur 4) .

HPLC-adskillelse, baseret på molekylær ladning, blev udført i en Toyasoda DEAE-545-analytisk anionbyttersøjle. Prøver i 20 mil 10 Tris-HCl, pH 7,4, med 0,1% PEG blev elueret med en lineær 1 times gradient af 0,5 m NaCl med en strømningshastighed på 0,75 ml/min.

2 minutter fraktioner blev opsamlet, filtersteriliseret og bestemt. (Se figur 9) .

Polyacrylamidgelelektroforese: 15 Koncentrerede leukoregulinprøver (enten ufraktionerede eller adskilt ved HPLC-gelfiltrering og ionbytningskromatografi) blev elektroforeseret på 4-30% lineære gradient-polyacrylamidgeler (16). Efter elektroforese blev gelerne skåret i 0,25 mm stykker, og stykkerne blev elueret natten over i medium - 10% FBS. Eluater 20 blev filtersteriliseret og bestemt. (Se figur 5).

125

Renset leukoregulin mærket med I blev også elektroforeseret på 15% polyacrylamidgeler med en 5% acrylamid-stablingsgel indeholdende 1% natriumdodecylsulfat (15). Prøven blev visualiseret ved autoradiografi. (Se figur 7).

25 Radiomærkning af renset leukoregulin: 25 enheder af leukoregulin, der var renset ved HPLC og polyacryl- 125 amidgel-elektroforese i rækkefølge, blev mærket med I under 18 DK 170781 B1 anvendelse af chloramin T-metoden (17) og under tilsætning af okseserumalbumin som bærerprotein for at adskille den mærkede 125 leukoregulin fra ureageret I på en Sephadex G-10 søjle.

Gelfiltreringsøjlekromatografi: 125 5 I-mærket renset leukoregulin blev elueret på en S-300(Pharma cia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige)-søjle med 10 mM NaP04~ stødpude - 1,0 M NaCl, pH 7,4. Fraktioner på 2 ml blev opsamlet og talt. (Se figur 6).

Enzymatisk fordøjelse: 10 Følsomheden af human og hamster-leukoregulin- og lymfotoksin-aktiviteter over for neuraminidase- og proteasefordøjelse blev bedømt (29). 1/2 ml af et koncentreret humant eller hamster- lymfokinpræparat blev sat til 50 /il VCN (500 enheder/ml, Calbio-chem-Behring Corp., LaJolla, CA) og 0,5 ml 0,1 M natriumacetat-15 stødpude, pH 5,1. Som kontroller blev 0,5 ml lymfokin sat til 0,5 ml af acetatstødpuden, 0,5 ml af acetatstødpuden indeholdende 50 /il VCN og 50 /il 0,2 M sialinsyre (Sigma) (denne koncentration af sialinsyre inaktiverer enzymet) eller 0,5 ml medium. Prøver blev inkuberet i 60 minutter ved 37°C, dialyseret over for PBS-20 PEG i en Amicon-celle med en YMlO-membran, og prøverumfang blev indstillet til 3 ml. Til proteolytiske fordøjelser blev 1 ml lymfokinprøver sat til 1 ml trypsin i PBS (32 enheder/ml, specifik aktivitet 195 enheder/mg, Worthington Enzymes Inc., Freehold, NJ), 1 ml chymotrypsin i PBS (6 enheder/ml, specifik 25 aktivitet 59 enheder/mg, Sigma) eller 1 ml pronase (6 enheder/ml specifik aktivitet 6 enheder/mg, Sigma) i 0,1 M Tris-base med 3 mM CaCl2 og 3% toluen. Pronase blev aktiveret ved inkubering af 10 mg pronase/ml 0,1 M Tris - 15 mM CaCl2, pH 7,8, i 30 minut ter ved 37°C lige før tilsætning til prøven. Prøver med protea-30 ser eller proteasestødpudekontroller blev inkuberet i 60 minutt' ved 37°C. 1 ml FBS blev sat til hver prøve, og prøver blev for- 19 DK 170781 B1 tyndet over et 100-dobbelt interval i medium med henblik på bestemmelse. (Se tabel 3).

NK-cytotoksicitetsbestemmelse:

Forstærkelse af målcellefølsomhed efter leukoregulinbehandling 5 over for NK-formidlet cytotoksicitet blev bestemt i det væsentlige som tidligere beskrevet(23). Mononukleare celler fra normalt humant perifert blod, isoleret ved LSM-gradient-centrifugering, blev passeret gennem nylonuld for at fjerne makrofager og B-celler og samtidig berige med NK-celler. K562-målceller blev 10 mærket 18 timer ved tilsætning af 100 /u Ci 51Cr som natrium- chromat (NEN, Boston, MA). Målceller blev vasket tre gange med 1640 - 10% FBS og suspenderet til 2,5 x 10^celler/ml medium eller lymfokinprøve fortyndet i medium. Målcellerne blev så inkuberet i 30 minutter ved 37°C, centrifugeret ved 280 x g i 5 15 minutter og gensuspenderet i 1640 - 10% FBS i en koncentration på 10^ celler/ml. 100 /al celler blev sat til glas indeholdende 100 /il medium eller effektorceller i forhold mellem effektor- og målceller på 25:1, 10:1 eller 2,5:1. En 4 timers ^Cr-frigørelses-prøve blev så udført (23) . Spontan ^Cr-frigørelse lå fra 15 20 til 20%, hvadenten cellerne var inkuberet i medium eller lymfo-kin. Graden af lymfokinforstærkelse blev bestemt ved at sammenligne lytiske enheder af NK-cytotoksicitet af målceller inkuberet i medium med målceller inkuberet i lymfokin. En lytisk enhed defineret som antallet af lymfocyter, der forårsager en specifik 25 frigørelse af 15% ^Cr fra målcellerne, blev beregnet under anvendelse af VanKrough's ligning (21, 32). (Se tabel 6 og figur 3) .

Strømningscytometrisk analyse: 30 K562-celler blev gensuspenderet i en mængde af 4 x 10^/ml i RPMI 1640-10% FBS. I 12 x 75 mm plastglas blev dispenseret 250 /al cellesuspension med tilsætning af 250 /il lymfokinprøve. Glassene 20 DK 170781 B1 blev inkuberet ved 37°C i en 5% fugtet luft-atmosfære på en bordryster (Bellco Glass Co., Vineland, NJ) med 6 perioder pr. minut i 30 minutter til 6 timer.

Instrumentering: 5 Strømningscytometriske analyser blev udført under anvendelse af en FACS IV fluorescens-aktiveret cellesorterer (Becton-Dickinson, Sunnyvale, CA), udstyret med en 5W argonionlaser som stimuleringskilde, en 256 kanal pulserende højde-analysator og logaritmiske forstærkere. Cellerne blev analyseret for fremadgående lys-10 spredning i en snæver vinkel og fluorescens efter passage gennem en 70 /u diameter dyse i en afskærmningsvæske af MILLI-Q filtreret (Millipore Corp., Bedford, MA) I^O. Signaler på fremadgående lysspredning i en snæver vinkel, som er en indikator for cellestørrelse og form, blev anvendt som igangsætningssignal 15 for alle analyser. Alle optiske filtre blev leveret af Becton-Dickinson sammen med instrumentet, med mindre andet er anført.

FDA-f1uo rkromas i: FDA blev anvendt til at måle cellemembranpermeabilitet (5). En stamopløsning af FDA (Polyscience, Inc., Warrington, PA) blev 20 fremstillet ved at opløse krystallinsk FDA i acetone til en koncentration på 5 mg FDA/ml. Umiddelbart før brug blev en arbejds-opløsning fremstillet ved at fortynde stamopløsningen i RPMI 1640-10% FBS til dannelse af en slutkoncentration på 6,25 jug FDA/ml. Efter lymfokinbehandling af K562-celler blev cellerne vasket én 25 gang i RPMI 1640-10% FBS og gensuspenderet i 1 ml af arbejds-FDA-opløsningen i en mængde af 6,25 yug/ml, inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter og derpå analyseret på strømningscytometer .

Propidiumjodidfluorkromasi: 30 Propidiumjodid blev også anvendt til at måle cellemembranpermea- 21 DK 170781 B1 bilitet. En stamopløsning af propidiumjodid (Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, CA) blev fremstillet ved at opløse propidium-jodid i PBS, pH 7,4, i en koncentration på 500 jag/ml. Straks før brugen blev en arbejdsopløsning fremstillet ved at for-5 tynde stamopløsningen i PBS til dannelse af en slutkoncentration på 0,2 /ig propidiumjodid/ml. Efter lymfokinbehandling blev cellerne vasket én gang i RPMI 1640-10% FBS og gensuspenderet i én ml af arbejdsopløsningen af propidiumjodid, inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter analyseret på strømnings-10 cytometer.

Fluorescensmålinger:

Stimuleringsbølgelængden, anvendt til både FDA og propidiumjodid, var den samme, 488 nm ved 400 mW. Long pass 515 og 520 nm optiske glasfiltre blev anbragt foran fluorescensdetektorens fotomultipli-15 katorrør. Ved analysering af prøver mærket med propidiumjodid blev der yderligere anbragt et rødt additivt dikroisk filter (Corion Corp., Hollister, MA) foran fotomultiplikatorrøret. Mediumbehandlede K562-celler blev anvendt til fint at indtune strømningscytometeret før hvert forsøg. Forstærkningskontroller-20 ne og fotomultiplikatorrørets spænding blev indstillet således, 4 at 90% af 2 x 10 analyserede celler ville falde inden for et forudbestemt interval af kanaler inden for hele skalaen på 256 kanaler. Dette blev gjort for hver af de tre parametre (lysspredning i snæver vinkel, fluorescein-fluorescens og propidium-25 jodid-fluorescens), der blev undersøgt ved denne undersøgelse.

For mediumbehandlede kontrolceller blev spredning og fluorescein-fluorescens indstillet i den øvre del af kanalintervallet, og propidiumjodid-fluorescens i den nedre del for at måle de rigtige forskydninger i lymfokinbehandiede celler. For hver K562- 4 30 celleprøvebehandling blev 2 x 10 celler analyseret, og procenten af celler inden for det forudbestemte markørområde blev beregnet. Denne procent blev så trukket fra den mediumbehandlede kontrolprocent (ca. 90%), hvilket resulterer i den procentiske ændring for prøven. Procentændringer lå fra ca. -5 til +70. En ændring 22 DK 170781 B1 i positiv retning viser en virkning på K562-cellen forårsaget af lymfokinbehandlingen for den målte parameter. (Se figur 10).

EKSEMPEL 2.

Produktion af humane B-cellelinier og hybridomaer, der udskiller 5 leukoregulin:

Cancerpatienter blev immuniseret intradermalt med deres egne dissocierede tumorceller, som var blevet bestrålet med 20.000 rad 7 og blandet med 10 levedygtige BCG. Perifere blodlymfocyter, fremstillet af det venøse blod fra disse patienter,blev blandet 10 med murine NS-l-myelomaceller i et forhold på 3 PBL pr. liter myeloma, centrifugeret og gensuspenderet i 100 /al serumfrit medium. Én ml polyethylenglycol (50% w/v),forvarmet til 37°C, blev sat dråbevis til cellepillen i løbet af 1 minut under konstant omrøring af glasset. To gange blev det tidligere rumfang 15 af forvarmet serumfrit medium sat til cellesuspensionen i løbet af ét minut, indtil 50 ml-glasset var fyldt. Cellerne blev pel-leteret ved 800 omdrejninger pr. minut i 15 minutter. Cellerne blev forsigtigt gensuspenderet i HT-medium (DMEM indeholdende 20% kalvefosterserum, hypoxanthin, 13,6/ig/ml, og thymidin, g 20 3,9 Aig/ml) i en koncentration på 2,5 x 10 celler/ml (talt før fusion) og 100 alL blev sat til hver mikrotiterfordybning. 24 timer senere blev 100 Ail HAT-medium (HT-medium indeholdende 0,18/ig/inl aminopterin) sat til hver fordybning. Halvdelen af mediet blev hver tredie dag erstattet med frisk HAT-medium.

25 Efter vedligeholdelse i HAT-medium i 14 dage blev cellerne vedligeholdt på HAT-medium i yderligere 2 uger, på hvilket tidspunkt cellerne blev dyrket på et MEM-medium indeholdende 20% oksefosterserum.

Alternativt kan cokultivering af PBL med myelomaceller anvendes 30 til at udvikle omdannede diploide B-celler. PBL og myelomaceller blev blandet (i et forhold på 3:1), pelleteret ved 800 23 DK 170781 B1 RPM og selekteret i HAT-medium som ovenfor beskrevet.

Supernatanter fra hybridomaeme eller omdannede diploide B-celler blev afprøvet for udskilt leukoregulin under anvendelse 5 af mikrobestemmelsen med HT-29-celler som mål. Celler, der producerer leukoregulin, blev udviklet i MEM-10% FBS, og når der var opnået et tilstrækkeligt antal, blev der udført forsøg for at bestemme de optimale betingelser for leukoregulinproduktion i serumfrit medium. Celler blev suspenderet i en koncentra-10 tion på 2 x 105/ml RPMI 1640 og inkuberet i 3 dage ved 37°C.

Ved nogle forsøg blev 10 ng tetradecanoylphorbolacetat/ml sat til kulturerne for at stimulere leukoregulinproduktion. Supernatan-terne blev opsamlet, centrifugeret ved 800 x g og bestemt for leukoregulinaktivitet.

15 EKSEMPEL 3.

Måling af patienttumorcellefølsomhed for leukoregulin under an-20 vendelse af en agarklonogenbestemmelse:

Tumorceller har den særlige evne frem for normale celler, at de vokser i halvfast medium. Denne egenskab ved tumorceller giver et middel til at kvantificere virkningen af cancerterapeutiske 25 midler på frisk dissocierede celler af udskårne humane tumorer. Kolontumorer fremkommet ved kirurgi blev findelt og dissocieret med collagenase og DNAase for at få en enkelt cellesuspension (11). Cellerne blev suspenderet i 0,15% agar i medium ved fremgangsmåden ifølge Kern (12), med undtagelse af, at leukoregulin 30 blev tilsat i varierende koncentrationer. Udviklingen af tumor-cellekolonier, der vokser suspenderet i agarmediet, blev kvantificeret efter 10 - 14 dages inkubation. (Se tabel 8).

EKSEMPEL 4.

35 ...........

Kloning af leukoregulingenet: 24 DK 170781 B1

Efter at have defineret leukoregulin, både biologisk og biokemisk, og efter at have tilvejebragt fremgangsmåder til at identificere og isolere leukoregulin, således som anført ovenfor, udføres kloning og ekspression af leukoregulin under anvendelse 5 af sædvanlige almindeligt kendte fremgangsmåder og protokoller (f.eks. Maniatis m.fl., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1982). Disse fremgangsmåder er baseret på den følsomme biobestemmelse, der er beskrevet i de foregående eksempler. Efter at have udviklet 1° bestemmelsen og biologisk og biokemisk at have defineret leukoregulin kan standard rekombineret DNA og kloningsteknik anvendes til at fremstille et protein, der er identisk i aminosyre-sekvens og biologisk aktivitet med autentisk naturlig leukoregulin eller en biologisk aktiv underenhed deraf, i E.coli I5 eller en anden egnet værtsorganisme. En skitse af kloningsmetoden er vist på fig. 11. Denne fremgangsmåde er ækvivalent med de fremgangsmåder, der udføres med mange biologisk relevante eukaryote gener, især den humane lymfokin, lymfotoksin, som blev udtrykt i bakterier under anvendelse af en lignende protokol 20 som omtalt af P.W.Gray m.fl., Nature 312, 721 (1984). Denne artikel og de andre artikler citeret i dette eksempel skal betragtes som inkluderet i den foreliggende beskrivelse i deres helhed gennem denne henvisning.

25 Kloningseksemplet kan diskuteres som 6 adskilte faser. (Se figur 11). Elementerne i hvert af disse trin er beskrevet nedenfor.

Fase I.

30

Biobestemmelse, rensning og biologisk karakterisering:

Denne analyse må udføres, før der kan ske nogen kloningsforsøg. Enkelthederne om disse undersøgelser er de data, der er forelagt 35 i den foreliggende ansøgning. Efter udvikling af disse data, som angivet ovenfor, er det så muligt at skride til gensplejsning.

Fase IX.

25 DK 170781 B1 E.coli gensamling: 5 Konstruktionen af bakteriekloner er baseret på karakterisering af de naturlige kilder til leukoregulin. Da den foreliggende ansøgning beskriver en fremgangsmåde til stimulering af produktionen af leukoregulin med humane perifere blodlymfocyter (PBL), må disse celler indeholde den genetiske information, 10 der kræves til leukoregulinsyntese, og som er en indlysende kilde til leukoregulingener. Under anvendelse af stimulerede cellepopulationer isoleres mRNA, som indeholder leukoregulin mRNA. Dette PBL mRNA anvendes til at konstruere cDNA-samlinger i f.eks. E.coli eller andre værtsorganismer.

15

Fase III.

Biokemisk karakterisering, aminosyresekvens: 20 Som ovenfor nævnt, er leukoregulinproteinet blevet karakteriseret biokemisk og renset til homogenitet. Det næste trin er at definere aminosyresekvensen i leukoregulinproteinet under anvendelse af dette naturlige materiale. Dette arbejde, som er nødvendigt for at bekræfte, at fremkomne genkloner faktisk svarer 25 til autentisk leukoregulin, udføres ved sædvanlige biokemiske sekvensbestemmelsesmetoder.

Fase IV.

30 Genisolering ved immuno-screening:

Denne metode til genisolering kan igangsættes umiddelbart efter afslutning af fase II. Det afgørende reagens til dette forsøg er antileukoregulin-antistof rettet mod det naturlige leuko-35 regulin, som kan fremstilles efter rensning af tilstrækkelig meget naturligt leukoregulin til at immunisere dyr. Teknikken, der med held er blevet anvendt til at screene E.coli-gensamlin-ger for forskellige gener, er beskrevet af D.M.Helfman m.fl., 26 DK 170781 B1 PNAS 80, 31-35 (1983) og R.A.Young & R.W.Davis, PNAS 80, 1194-1198 (1983).

Fase V.

5

Genisolering med DNA-sonde:

Dette er et alternativ og den mest anvendte metode til genisolering fra en rekombineret DNA-E.coli-samling. Som oprin-10 deligt påvist af Noyes m.fl. (PNAS 76, 1770-1774 (1979)), anvendes en syntetisk oligodesoxynukleotidsonde til at isolere og karakterisere et eukaryot mRNA. Sonden er et lille udsnit af DNA-sekvensen for leukoregulin, fremstillet ved først at bestemme en delvis aminosyresekvens for det naturlige protein 15 og derefter syntetisere en nukleotidsekvens, som koder for den delvise aminosyresekvens. Den syntetiske nukleotidsekvens kan f.eks. fremstilles kemisk som beskrevet af K.Itakura m.fl., J.Am.Chem.Soc. 97, 7326 (1975). Som eksempel blev aminosyre-sekvensen Trp-Met-Glu-Glu fra gastrin anvendt til at definere et 20 dodecanukleotid d(CTCCTCCATCCA), som hybridiserer specifikt til gastrin mRNA. Til leukoregulin anvendes på lignende måde det syntetiske DNA-fragment som en sonde, der hybridiserer til det naturlige mRNA taget fra celler, som producerer leukoregulin. Under anvendelse af f.eks. et mærke og sædvanlige metoder 25 skilles mRNA for leukoregulin fra blandinger af RNA. Metoder anvendt til disse fremgangsmåder er diskuteret i Maniatis m.fl., supra, Goodman m.fl., US-patenterne 4.283.489 og 4.363.877 og de heri nævnte referencer.

30 En udvidelse af disse resultater har været at anvende sådanne sonder til screening af cDNA-samlinger (R.Crea & T.Horn, Nuc.

Acid Res. 8, 2331-2348 (1980)). Fornylig blev et sæt tetra- decanukleotider d(TC A CA A TA C TCCA),forudsagt af aminosyre-

G G T

sekvensen Trp-Glu-Tyr-Cys-Asp, anvendt til at påvise kloner af 35 det humane vævstypeplasminogen-aktivatorgen cDNA i E.coli (D.Pennica m.fl., Nature 301, 214-220, 1983).

Fase VI.

27 DK 170781 B1

Gensamling, mikrobiel ekspression:

Slutfasen i kloning er den rutinemæssige samling af en intakt kopi af det eukaryote strukturelle gen og translationen af 5 genet til fremstilling af leukoregulin eller en biologisk aktiv underenhed deraf. Fremgangsmåder til genetisk styring af mikrobiel ekspression af dette gen vil forløbe ad forskellige veje med forskellige værter. De forskellige valg for fremstilling af en vektor, omdannelse af en værtscelle og udførelse af transit) lation og ekspression er for talrige til at anføre, men fremgangsmåderne er konventionelle og er blevet diskuteret i talrige artikler såsom Maniatis m.fl., supra, Gene Amplification and Analysis, Expression of Cloned Genes in Prokaryotic and Eukaryotic Cells, T.S.Papas, M.Rosenberg & J.G.Chirigkjian, Elsevier 15 Science Publishing Co.,Inc. NY 1983, Berman m.fl., US-patent 4.503.142 og de deri omtalte referencer.

Det ligger endvidere inden for opfindelsen tanke, at der kan syntetiseres en modificeret form af leukoregulin eller en biologisk aktiv underenhed deraf, som kan have modifikationer i 20 molekylstrukturen. En sådan modificeret leukoregulin kan udvise forøget nytte såsom forøget effektivitet, reducerede bivirkninger eller forøget stabilitet, eller den kan udvise ækvivalent aktivitet eller en mindre, men tilstrækkelig aktivitet som den, hvormed leukoregulin defineres. I alle tilfælde, hvor 25 molekylstrukturen og den biologiske aktivitet for størstedelen er det samme som leukoregulin, defineret i den foreliggende beskrivelse, skal den anses for at være ækvivalent eller en normal modifikation deraf og derfor som en del af den foreliggende opfindelse.

28 DK 170781 B1

Beskrivelse af tegninger og tabeller:

Figur 1:

Cytolyse af humane tumorceller med human PBL-lymfokih indeholdende leukoregulin (O — O) og renset 1788 cellelinielymfotoksin 5 (· — ·) i ækvivalente lymfotoksinkoncentrationer. Standard afvigelsen af prøvegennemsnit var maksimalt 2%.

Human lymfokin og lymfotoksin havde imidlertid ingen eller ringe cytolytisk virkning over for humane leukami-,sarcoma- og karcinoma-celler. Maksimalt 50% lyse af RPMI 2650 karcinomacellerne blev 10 iagttaget med en lymfokinprøve indeholdende 1000 enheder af lymfotoksin/ml.

Figur 2: Væksthæmning af humane tumorceller med human lymfokin indeholdende leukoregulin (O — O) og renset 1788 cellelinielymfotoksin 15 (· — ·) i ækvivalente lymfotoksinkoncentrationer. Standard afvigelsen af prøvegennemsnit var maksimalt 5%. Den procentiske væksthæmning blev bestemt ved anvendelse af en celletællingsmetode .

Den højt rensede 1788 cellelinielymfotoksin kunne ikke lyse 20 hver af de tre typer tumorceller. Trods lav lytisk aktivitet over for humane tumorceller bevirkede human lymfokin betydelig væksthæmning af humane tumorceller. Den rensede 1788 cellelinielymfotoksin udviste imidlertid kun betydelig væksthæmning i koncentrationer på 500 og 1000 lymfotoksinenheder/ml. Vækst-25 hæmningen i disse koncentrationer kunne endvidere godt skyldes den vækstforhalende indflydelse af ammoniumcarbonatstødpuden med pH-værdi 8,4, hvori den rensede lymfotoksin blev tilberedt.

Figur 3: 29 DK 170781 B1

Forstærkelse af målcellefølsomhed for NK-formidlet cytotoksicitet med human lymfokin indeholdende leukoregulin, men ikke med renset human lymfotoksin. Human lymfokin med 40 lymfotoksin-enheder/ml (O — 0), renset 1788 lymfotoksin med 40 enheder/ml 5 (· — ·) eller medium (A—A) blev inkuberet i 30 minutter med målceller før tilsætning af NK-effektorceller. Standardafvigelsen af prøvegennemsnit var maksimalt 1%.

Foruden at hæmme tumorcelleformering forstærkede human lymfokin (men ikke renset 1788 lymfotoksin) følsomheden af humane karci-10 noma-, leukæmi- og sarcomaceller for NK-formidlet cytotoksicitet. Human lymfokin forårsagede endog lyse af RPMI 2650 karci-nomaceller, som er resistente over for NK-lyse. Renset 1788 lymfotoksin kunne ikke forstærke følsomheden af karcinoma-, leukæmi- eller sarcomaceller over for lyse med NK. De indbyrdes 15 afvigende biologiske aktiviteter af ufraktioneret human PBL lymfotoksin indeholdende lymfokin og renset 1788 cellelinie-lymfotoksin antyder, at en anden lymfokin end lymfotoksin formidler anti-tumorcelleaktiviteterne.

Figur 4: 20 Gelpermeation-HPLC af to forskellige humane lymfokinpræparater.

2 ml prøver blev fortyndet isokratisk fra en Toyasoda TSK G-3000 SWG-søjle med 20 mM Na-phosphatstødpude, pH 7,4, indeholdende 0,1% PEG. 4 ml fraktioner blev opsamlet, fortyndet over et 100-dobbelt interval med RPMI 1640-10% FBS og undersøgt for lymfo-25 toksincytolyse af a-L929-celler og leukoregulincytostase af humane K562- og 2650-tumorceller. Proteinabsorbansprofilen ved 280 nm er vist i a-L929-prøvepanelet.

30 DK 170781 B1

Den tilsyneladende molekylvægt af human PBL lymfotoksin og leuko-regulin blev undersøgt ved HPLC-molekularsigtekromatografi. Størstedelen af lymfotoksinaktiviteten eluerede i fraktioner inden for molekylvægtsintervallet 30.000 - 40.000. Der var imid-5 lertid nogen variation i prøver fra forskellige individer, idet nogle også havde lymfotoksinaktivitet i molekylvægtsintervallerne 50.000 - 70.000 og 12.000 - 20.000. Leukoregulinaktivitet eluerede i fraktioner i molekylvægtsintervallet 50.000 - 70.000 med en mindre komponent i molekylvægtsintervallet 10.000 - 15.000.

10 Figur 5:

Lineær gradient polyacrylamidgel-elektroforese af leukoregulin.

En mere nøjagtig bestemmelse af molekylvægten af leukoregulin blev foretaget ved gradientpolyacrylamidgel-elektroforese. 1 ml af et humant leukoregulinpræparat blev elektroforeseret natten 15 over. Gelen blev så skåret i skiver, og skiverne blev elueret natten over med MEM-10% FBS ved 37°C. Leukoregulinaktivitet (åbne cirkler) blev målt ved anvendelse af mikrobestemmelsen med HT-29-karcinomaceller som mål. Leukoregulin vandrede med proteiner med molekylvægt på 10.000 - 140.000. På denne figur er og- 125 20 så vist det elektroforetiske mønster af I-mærket (udfyldte cirkler) leukoregulin renset ved HPLC-gelfiltrering, ionbytningskromatografi og lineær gradient-polyacrylamidgel-elektroforese i rækkefølqe.

Figur 6: 25 Gelfiltrering af renset leukoregulin. En alternativ metode til molekylvægtsbestemmelse under anvendelse af Pharmacia S-300 gelfiltrering blev anvendt. Leukoregulin renset ved HPLC-gelfiltrering, ionbytningskromatografi og lineær gradientpolyacrylamidqel- 125 elektroforese blev mærket med I og elueret på en S-300 søjle 30 med 10 mM NaPO^ stødpude, pH 7,4, 1,0 M NaCl. Den rensede leukoregulin havde en tilsyneladende molekylvægt på 120.000 - 140.000 31 DK 170781 B1 ifølge denne metode.

Figur 7:

Natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese. Renset 125 leukoregulin mærket med I blev elektroforeseret på en natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel for at bestemme, om det 5 naturlige protein ville dissociere til underenheder ved udsættelse for denaturerende betingelser. Leukoregulin elektrofore-serede med molekyler med molekylvægt 30.000 - 35.000, som vist af denne autoradiograf af gelen.

Figur 8: 10 Isoelektrisk fokusering af to forskellige humane lymfokinpræpa-rater. 2 ml prøver blev fokuseret i en pH 3,5-10 gradient.

3 ml fraktioner blev opsamlet, pH-værdien af hver fraktion blev bestemt og på hinanden følgende fraktioner med 0,5 pH-enheder forenet, diafiltreret over for PBS-PEG, sterilfiltreret, fortyn-15 det over et 100-dobbelt interval og undersøgt for lymfotoksin- cytolytisk aktivitet på a-L929-celler (· — ·) eller leukoregulin-cytostatisk aktivitet på K562(0—D)-og OST (O — 0)-celler.

Selv om human lymfotoksin- og leukoregulin-aktiviteter overlappede, når de var adskilt ved molekularsigtning, kunne de to aktivi-20 teter adskilles baseret på forskelle i molekylær ladning. Lymfotoksin havde en isoelektrisk pH mellem 6,5 og 7,2. Leukoregulin havde to isoelektriske pH-værdier, én mellem 5,0 og 5,8 og én mellem 7,5 og 8,3.

Figur 9: 25 HPLC-ionbytningskromatografi af leukoregulin og lymfotoksin.

2 ml prøver af humant lymfokinpræparat blev skilt på en DEAE-545 HPLC-søjle ved eluering med en lineær 0-0,5 M NaCl-gradient.

32 DK 170781 B1

Fraktioner blev filtersteriliseret og bestemt for leukoregulin ved anvendelse af en mikroprøve og HT-29-målceller eller for lymfotoksin. Leukoregulin eluerede ved en 0,1 M NaCl-koncentra-tion og blev skilt fra lymfotoksin, som eluerede ved en 0,15 M 5 NaCl-koncentration.

Figur 10:

Strømningscytometrisk analyse af leukoregulinaktivitet. En andei biologisk aktivitet af leukoregulin, der kan sættes i relation til dens virkningsmekanisme, blev bedømt ved strømningscytometrisk analyse. Ændringer i K562-cellerumfang eller membran-10 permeabilitet, der kunne påvises ved ændringer i fremadgående lysspredning i en snæver vinkel (0), eller med fluorescein-diacetat(D) eller propidiumjodid(Δ )-fluorkromasi, blev bedømt ved anvendelse af 488 nm argonlaserlinie-stimulering i et FACS I1 strømningscytometer. I det øverste diagram, blev K562-celler be- 15 handlet med et lymfokinpræparat indeholdende 10 (---), 40 (-···- eller 100 (-·-) enheder af diafiltreret lymfotoksin eller 500 (—) enheder af a-interferon i 0 - 6 timer for at konstatere cellernes reaktion på lymfokinen.

Når lymfokin blev sat til K562-celler, faldt den fremadgående ly 20 spredning i en snæver vinkel fra cellerne. Propidiumjodid- fluorkromasi voksede, og FDA-fluorkromasi aftog. Ændringen i fremadgående lysspredning i en snæver vinkel afspejlede en ændring i celleform og/eller -størrelse med en stigning i cellerumfang bekræftet ved cellerumfangsanalyse på en Model ZBl 25 Coulter tæller med tilføjet Accucomp cellerumfangsanalyse- programmering (Coulter Instruments, Inc.,Hialeah, FL). Faldet i FDA-fluorkromasi afspejlede forøget membranpermeabilitet, efterhånden som det fluorescerende intracellulære fluorescein undveg fra cellen. Stigningen i propidiumjodid-fluorkromasi afspejlede 30 også en stigning i membranpermeabilitet, efterhånden som propidiv: jodid kom ind i cellen og interkalerede med nukleinsyre. Strøm-ningscytometriske ændringer forårsaget af human lymfokin kunne 33 DK 170781 B1 påvises 30 minutter efter behandling af K562-celler og var maksimale efter 2 timer, α-interferon inducerede ingen ændringer i denne tidsperiode i celleoverfladekonformation eller permeabilitet af plasmamembran. I det nederste diagram blev K562-celler 5 behandlet med de HPLC-isoelektrisk fokuserende fraktioner (prøvenumre fra tabel 4) i 2 timer, og ændringen i lysspredning (—) og i fluoresceindiacetat (---) og propidiumjodid (•••)-fluor- kromasi blev målt. Lymfokincellekonformation og membranpermeabi-litetsaktivitet fandtes kun i HPLC- og isoelektrisk fokuserende 10 rensede leukoregulinfraktioner. Fraktioner beriget på lymfotok-sin eller på interleukinerne og interferon frembragte ingen påviselig ændring i cellekonformation eller permeabilitet af plasmamembran.

Figur 11: 15 Kloning af leukoregulingenet. Dette diagram viser de seks adskilte faser i kloningen af leukoregulingenet. (Se eksempel 4).

Tabel 1:

De optimale betingelser for leukoregulinproduktion af normale humane perifere blodleukocyter eller af humane B-cellelinier, 20 dannet efter hybridisering med en murin myeloma eller spontant omdannet i kultur, blev målt. Maksimale mængder leukoregulin, produceret af perifere blodleukocyter, fandtes, når disse celler blev dyrket i 48 timer i nærværelse af 5 /ag PHA/ml medium. Kontinuerlige humane B-cellelinier eller humane B-musemyeloma-25 heterohybridomaer producerede leukoregulin konstitutivt i en 3 dages periode, når de blev dyrket i serumfri RPMI-1640 medium. Tilsætning af 10 ,ug tetradecanoylphobolacetat/ml medium forøgede leukoregulinproduktionen 3 gange.

Tabel 2: 30 Bevis for tilstedeværelse af en enestående antitumorlymfokinf 34 DK 170781 B1 ^er adskiller sig fra lymfotoksin, fandtes, når de relative mængder af lymfotoksin (a-L929-cytolytisk aktivitet) og human tumorcelle-cytostatisk aktivitet i lymfokinpræparater fra seks forskellige individer blev sammenlignet. Murin tumorcelle-5 cytolytisk aktivitet og human tumorcelle-cytostatisk aktivitet varierede uafhængigt i præparaterne, hvilket viser, at de to biologiske aktiviteter blev formidlet af tydeligt forskellige stoffer. Koncentrerede lymfokiner fra tre individers leukocy-ter, som ikke blev stimuleret med PHA eller fik PHA tilsat i 10 den sidste halve kulturtime, lysede ingen tumorceller og havde ingen væksthæmmende virkning. Når de samme leukocyter derimod blev stimuleret med PHA i 24 timer, udskilte de betydelige mængder lytisk og væksthæmmende aktivitet. Antitumorcelleaktivite-terne skyldtes således ikke PHA, stødpude eller en udtømning af 15 mediets næringsstoffer af de i 24 timer dyrkede celler.

Tabel 3:

Yderligere understøttelse for eksistensen af en hidtil ukendt lymfokin (i det følgende omtalt som leukoregulin), der adskiller sig fra lymfotoksin, blev tilvejebragt ved at undersøge følsom-20 heden af de cy toly tiske og tumorcellevæksthæmmende lymfokin- aktiviteter over for neuraminidase- og proteasefordøjelse. Human cytolytisk lymfokinaktivitet for a-L929-celler (lymfotoksin) blev formindsket 49 og 92% med 0,2 og 0,4 enheder neuraminidase uden nogen større hæmning af lymfokin tumorcellevæksthæmmende 25 (leukoregulin)-aktivitet. Neuraminidasefordøjelse i nærværel se af 10 mM sialinsyre havde ingen virkning på nogen af aktiviteterne, hvilket udelukker muligheden af, at virkningen på lymfotoksin forårsages af forurenende proteaser i neuraminidasen. Alternativt blev både lymfotoksin- og leukoregulinaktiviteterne 30 hæmmet med proteaser, omend i forskellig grad. 6 enheder pro-nase ødelagde fuldstændigt hele lymfotoksinaktiviteten, medens 52% af leukoregulinaktiviteten forblev i prøven. Pronasefordøjelse gjorde således en aktiv human leukoregulinprøve lymfotoksin-fri.

35 DK 170781 B1

Syrisk guldhamster-lymfotoksinpræparater indeholdt også en leukoregulintype af aktivitet for hamstertumorceller og en anti-karcinogen aktivitet (24). Den antikarcinogene aktivitet er ikke blevet målt i humane lymfokinpræparater på grund af mange-5 len på en kvantitativ human celleomdannelsesprøve sammenlignet med den for hamster (4). Ifølge opfindelsen blev det søgt at bestemme, om hamsterlymfotoksin- og leukoregulinaktiviteter kunne adskilles på basis af deres følsomhed for neuraminidase-og proteasefordøjelse, således som human lymfotoksin og leuko-10 regulin. Det blev også bestemt, om den antikarcinogene aktivitet rensedes sammen med leukoregulin for at bedømme, om hamster-antikarcinogen aktivitet og leukoregulin er identiske og derfor muligvis ét og det samme i mennesker. Som med human lymfotoksin blev hamsterlymfotoksin nedbrudt med neuraminidase og trypsin.

15 Den antikarcinogene aktivitet for hamsterceller udsat for karci-nogen og cytostatisk aktivitet rettet mod hamstertumorceller, som for human leukoregulin, blev ikke nedbrudt af neuraminidase, men blev formindsket 42% med trypsin, hvilket viser en parallel differentiel følsomhed af leukoregulin og lymfotoksin over for 20 neuraminidase- og proteasefordøjelse i de to arter.

Tabel 4:

En totrins-fraktioneringsmetode baseret på HPLC molekularstørrel-ses-udelukkelses-kromatografi og isoelektrisk fokusering blev udført for at bestemme, om anticanceraktiviteten af human leuko-25 regulin kunne skilles fra og skelnes fra flere andre lymfokiner og monokiner. Som forudsagt ud fra de tidligere data, fandtes lymfotoksinaktivitet i fraktioner med høj molekylvægt (45.000 -74.000), middelmolekylvægt (30.000 - 38.000) og lav molekylvægt (17.000 - 20.000) og var beriget i pH-fraktionen 6,0 - 6,8 30 efter fokusering. Leukoregulin fandtes kun i det højmolekylære materiale og blev skilt i to typer med isoelektriske pH-værdier på 4,2 - 5,6 og 7,1 - 8,4. Selv om de leukoregulinberigede fraktioner indeholdt nogen lymfotoksinaktivitet, indeholdt frak- 36 DK 170781 B1 tionerne 1 og 3 mere end 170 lymfotoksinenheder, men ingen leuko-regulinaktivitet. En lymfotoksinaktivitet afledt af stimuleret human PBL kan derfor skilles fra leukoregulin. Den lavmolekylære fraktion indeholdt alt interleukin 1 og interleukin 2, og stør-5 stedelen af interferonaktiviteten. Der blev ikke påvist nogen makrofagaktiverende aktivitet i nogen fraktion. Alle fraktionerne indeholdt også endotoksin. Mængden af endotoksin korrelerede ikke med leukoregulinaktiviteten. Yderligere bevis for, at endotoksin ikke formidler leukoregulinaktivitet var, at til-10 sætning af op til 20 ng/ml lipopolysaccharid-serotyper 055.B5 og 0111.B4 ikke hæmmede væksten af K562-celler.

Tabel 5:

Da de leukoregulinberigede fraktioner indeholdt lave mængder interferon, blev der udført et yderligere forsøg for at be-15 stemme, i hvilket omfang interferon kunne bidrage til hæmningen af tumorcellevækst. Gamma-interferon fra én kilde (ML) hverken lysede a-L929-celler eller hæmmede væksten af humane K562-tumor-celler. Gamma-interferon fra en anden kilde (FL) indeholdt 2000 lymfotoksinenheder/ml, men indeholdt ikke leukoregulin-20 aktivitet. Alfa-interferon indeholdt hverken lymfotoksin eller leukoregulin. Leukoregulinaktivitet formidles derfor ikke af alfa- eller gamma-interferon, og den er heller ikke et resultat af den synergistiske virkning af lymfotoksin og gamma-interferon.

Tabel 6: 25 Ufraktionerede lymfokinpræparater indeholder en aktivitet, som forstærker følsomheden af tumorceller over for NK-formidlet cytotoksicitet. Forbindelsen mellem den sensibiliserende aktivitet over for målceller og leukoregulin og lymfotoksin blev undersøgt efter fraktionering i rækkefølge med HPLC og iso-30 elektrisk fokusering af human lymfokin. Leukoregulinberigede fraktioner indeholdt betydelig tumorcelle-NK-cytotoksicitets-forstærkende aktivitet. Fraktioner beriget på lymfotoksin og 37 DK 170781 B1 de, der indeholder de lavmolekylære lymfokiner såsom interferon forstærkede ikke følsomheden af K562-leukæmiceller over for NK-formidlet cytotoksicitet. NK-forstærkende aktivitet renses derfor sammen med eller er identisk med leukoregulin.

5

Tabel 7:

Et panel af humane tumorceller og normale celler blev undersøgt for deres følsomhed for leukoregulin. Gastrointestinale kar-cinomaer som gruppe fandtes at være meget følsomme for leukoregulin. Leukoregulin påvirkede ikke væksten af hverken de normale koloniske mukosalceller eller hudfibroblasterne.

Tabel 8: 15

For at bestemme den potentielle in vivo effektivitet af leukoregulin på humane cancere blev frisk dissocierede kolontumor-celler fremstillet og dyrket i halvfast agarmedium indeholdende leukoregulin. Koloncancer blev valgt som mål for bestemmelse 20 på grund af den høje følsomhed af koloncancercellelinierne over for leukoregulin. Tumorceller fra alle fire afprøvede patienter blev væksthæmmet på en dosisafhængig måde af leukoregulin, om-end i varierende grad. En patients celler blev hæmmet 98% af 50 enheder leukoregulin, medens en anden patients blev hæmmet 25 42% med 4.000 enheder leukoregulin. Dette antyder, at leuko regulin har mulighed for at regulere væksten af humane koloncancere.

30 35 DK 170781 B1 38

Referencer: 1. B.B.Aggarwal, B.Moffat & R.N.Harkins, "Human lymphotoxin, production by a lymphoblastoid cell line, purification and initial characterization", J.Biol.Chem. 259, 686-691, 1984.

2. P.Brouty-Boye, "Inhibitory effects of interferon on cell multiplication", Lymphokine Reports 1, 99-112, 1980.

3. R.L.Brown, R.L.Griffith, R.H.Neubauer & H.Rabin, "The effects of T-cell growth factor on the cell cycle of primate T cells", J.Immunol. 129, 1849-1853, 1982.

4. J.A.DiPaolo, "Relative difficulties in transforming human and animal cells in vitro", J.Natl.Cancer Inst. 70, 3-8, 1983.

5. F.A.Dolbeare & R.E.Smith, "Flow cytoenzymology, Rapid enzyme analysis of single cells", M.R.Melamid, P.F.Mullaney & M.L. Mindelsohn (red.), Flow Cytometry and Sorting, side 317-334, New York, John Wiley & Sons, 1979.

6. C.H.Evans & J.A.DiPaolo, "Lymphotoxin, an anticarcinogenic lymphokine as measured by inhibition of chemical carcinogen or ultraviolet-irradiation-induced transformation of Syrian hamster cells", Int.J.Cancer 27, 45-49, 1981.

7. C.H.Evans & J.A.Heinbaugh, "Lymphotoxin cytotoxicity, a combination of cytolytic and cytostatic cellular responses", Immunopharmacology 3, 347-359, 1981.

8. C.H.Evans, J.A.Heinbaugh & J.A.DiPaolo, "Comparative effectiveness of lymphotoxin anticarcinogenic and tumor cell growth inhibitory activities", Cell.Immunol. 76, 295-303, 1983.

9. G.A.Granger & W.P.Kolb, "Lymphocyte in vitro cytotoxicity, mechanisms of immune and non-immune small lymphocyte mediated target L cell destruction", J.Immunol. 101, 111-116, 1968.

10. M.V.Haspel m.fl., Science 220, 304-306, 1983.

11. H.C.Hoover m.fl., Cancer Res., april 1984.

12. Kern m.fl., Int.J.Cancer 30, 725-729, 1982.

13. A.Khan m.fl., Human Lymphokines, side 621-629, Academic Press, New York,1982.

39 DK 170781 B1 14. E.S.Kleinerman, A.J.Schroit, W.E.Fogler & I.J.Fidler, "Tumoricidal activation of human monocyte activity in vitro by free and liposome encapsulated human lymphokines", J.Clin.Invest. 72, 304-315, 1983.

15. V.Laemmli, Nature 227, 680-685, 1970.

16. P.Lambin & J.M.Fine, Anal.Biochem. 98, 160-168, 1979.

17. P.J.McConahey & F.J.Dixon, Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.

29, 185-189, 1966.

18. S.B.Mizel, J.J.Oppenheim & D.L.Rosenstreich, "Characterization of lymphocyte-activating factor produced by the macrophage cell line P388D1.I.Enhancement of LAF production by activated T lymphocytes", J.Immunol. 120, 1497-1505,1978.

19. B.W.Papermaster m.fl., "Lymphokines and Thymic Hormones", Academic Press, New York, side 789-799.

20. I.Penn, "Depressed Immunity and the Development of Cancer", "Clinical Experimental Immunology" 46, 459, 1981.

21. H.F.Pross, M.G.Baines, P.Rubin, P.Shragge & M.S.Patterson, "Spontaneous human lymphocyte-mediated cytotoxicity against tumor target cells. IX. The quantitation of natural killer cell activity", J.Clin.Immunol. 1, 51-63, 1981.

22. H.Rabin, R.F.Hopkins, F.W.Ruscetti, R.H.Neubauer, R.L.Brown & T.G.Kawakami, "Spontaneous release of a factor from a continuous line of primate tumor T cells", J.Immunol. 127, 1852-1856, 1981.

23. J.H.Ransom & C.H.Evans, "Lymphotoxin enhances the susceptibility of neoplastic and preneoplastic cells to natural killer cell mediated destruction", Int.J.Cancer 29, 451-458, 1982.

24. J.H.Ransom & C.H.Evans, "Molecular and biological characterization of Syrian hamster lymphotoxin's anticarcinogenic and tumor cell growth inhibitory activities", Cancer Res.

43/ 5222-5227, 1983.

25. J.H.Ransom, C.H.Evans & J.A.DiPaolo, "Lymphotoxin prevention of diethylnitrosamine carcinogenesis in vivo", J.Natl.Cancer Inst. 69, 741-744, 1982.

26. J.H.Ransom, C.H.Evans, A.E.Jones, R.A.Zoon & J.A.DiPaolo, "Control of the carcinogenic potential of 99m technetium by the immunologic hormone lymphotoxin", Cancer Immunol. Immunother. 15, 126-130, 1983.

40 DK 170781 B1 27. J.H.Ransom, C.Pintus & J.H.Evans, "Lymphotoxin amplification of tumor cell growth inhibition is specific for natural killer cells but not for macrophages", Int.J. Cancer 32, 93-97, 1983.

28. J.H.Ransom, J.O.Rundell, J.A.Heinbaugh & C.H.Evans, "Biological and physiocochemical characterization of keyhole limpet hemocyanin-induced guinea pig lymphotoxin", Cell.Immunol. 67, 1-13, 1982.

29. H.G.Remold & A.D.Mednis, "Two migration inhibitory factors differ in density and susceptibility to neuraminidase and proteinases", J.Immunol. 122, 1920-1925, 1978.

30. S.A.Rosenberg, M.Henrichon, J.A.Coyne & J.A.David, "In vitro studies of LT produced in response to antigen stimulation of lymphocytes", J.Immunol. 6, 1623-1629, 1973.

31. J.Sawada, K.Shiori-Nakano &T.Osawa, "Cytotoxic activity of purified guinea pig lynphotoxin against various cell lines" ,

Jpn.J.Exp.Med. 4, 263-271, 1976.

32. G.Trinchieri, M.DeMarchi, W.Mayer, M.Savi & R.Ceppelline, "Lymphocyte antibody lymphocytolytic interaction (LALI) with special emphasis on HLA", Transplant.Proc. 5, 1631-1646 1973.

33. G.Trinchieri & D.Santoli, "Anti-viral activity induced by culturing lymphocytes with tumor-derived or virus-transforme cells", J.Exp.Med. 147, 1314-1333, 1978.

34. B.D.Williamson, E.A.Carswell, B.Y.Rubin, J.S.Prendergast & L.J.Old, "Human tumor necrosis factor produced by human B-cell lines, Synergistic cytotoxic interation with human interferon", Proc.Natl.Acad.Sci. 80, 5397-5401, 1983.

41 DK 170781 B1

I C — I I

I ·Η i—I I I

I H +1 g I I

I C Φ \ I in m I

I tn Η Η I *· I

I QJ CD 0) I tN o i—I I

I Η O Ό I Η I

i o c o i i

I Αί V X! I I

I 3 O C I I

I O H O I I

U I d ft — I I

<D I I I

•Hil I

C I I i

•Hil I

rH I I I

0) I I I

rH I I I

Ή I I I

Oli I

Oli I

I — I Ό I

I I ΙΛ I Φ «Η I

CQ I W Η I g g I

I C 0) I I \ I

ci o oi i o o o <; i

Q I ΉΗ I ^ >» I

gi .μα) i iDcn^>ioEH i

Cl ¢¢1 I Hfi Η H\ I

ffil Λ C I I fe I I tn I

I c -Η I Η Η H C I

I -P I S# S S ' I

I Cd) I ft O ft ft O I

I Η Λ I 8 H ffi S Η I

I I I

I I I

.. I φ Φ I *0 rø I

. I C I Η -Η I H 00 00 I

rH I -Η I rH C I I 00 00 I

I H I Φ -H i n IO tf I

iC I C I O rH I (C H rH I

Η i tn »xi I

m i φ i ·

<C I Η I U

EH i o 10 i r- C I ro

Φ I

I Ό I Φ mil i >

(0 I C5 —' I I

I -Η Η I I Φ C I rH -P g I I tffil O I C Φ \ I rH I (ΰ Φ

•Η I tn Η Η I - I Ό rH

-P H l Φ Φ Φ l co m o oomoi H

Μ Φ I Η O Ό I H- O <N I co Φ C -P I O C Φ I CNrHl »o

Ό >il ΛΙΌΛ I I - Ο I

O O I C O G I I g g CQ

Η O I Φ U Φ I I CO

(fe Μ I iC ft — I I ·Η Ό Ό

Cl I I · Ό -Η -H

rH φ I I I O Φ Sh O

(0 rH I I I H- g Λ H

g Ό I I ·· I vo >, ft •Η o I I Ό I Η Η Λ ri +J rH I I Φ I g O Ό

ft Λ I I E I H \ U

0 1 ·· I g Η Φ -P

ΦΙ IH ΌΗΗΜΙ Pr Φ 4i Φ

HHI IC ΦCCClBrHΦC

ΟΦΙ I +> g -p -P -P I rH.CC

mmi —S I H H rH rH I rH φ φ φ •Hl I O ICrHrHrH rHCCCI g O 0) Ό HHI W Η I g g g g Λί Λί Αί I \ Cg Φ Φ I CO I \\\ \ I in go tn ft ι o in i t n < < < < cn tn in i no

rn I -HH I H ffi ffi ffi ffiMHHI ft Η C C

φ i -P o i o ft ft ft ft o o o i om tn i m tn i g g g g i vo x g g

C i λ c i -H tn tn tn tn -η -η ·η i o c C

•Η I C -Η I 4-> C C C B+J+)+)| rH CN ffi ffi +> i x -p i ^ ^ ^ ^ i Φ i CO I o in rH O'S'oocni — — — ^ ffi I ΗΛ I CN rH rH CN Η* Γ'' I Ο Λ O T3 TABEL 2.

42 DK 170781 B1

Relative mængder af cytolytisk og cytostatisk aktivitet i human lymfokinpræparater fra forskellige individer:

Alfa L929 cytolytiske K562 cytostatiske .

Præparat enheder/ml enheder/ml Forhold3 HU-4 1.600 95 17 HU-8 10.000 8 1.250 HU-11 970 42 23

Hu-12 5.000 4 1.250 HU-13 1.500 93 16 HU-17 5.400 20 270 a) Forhold mellem cytolytiske enheder og cytostatiske enheder.

43 DK 170781 B1 ! έ H ! ^ 04 ! I t <\ © s |

I ro S I 00 o H CN I

I ^2 , Ό I IT) LD 00 O i c i 3(ii|| η H to ro j "o ! <£ σ S ! ί

«11 I

i. i 1 1

Ti ! t ί - '

il ! I

tn φ | w ~ i

Ir'Q+J®1^· ro o r-~ i

I m i3 («£ I tN 04 Ό <N I

O I o S-P Έ I I

«4-1 A2 i o tn Φ i i .Ώ i i i

U Π I I Λ I

Φ pi, I η I Λ — * > (n i σι gi ~ ή i

0 jS j £ S I

Φ I (0 X -Η φ I O On] t£> Γ" I

+J I y-ι +J i) p I m ro rj< ri* I

0) i d S i ^ h · i 4J j 1¾ ϋ Ή Φ I tN j

•H I I

> I I

•Η I I

+> . i i

,J2 I di I

(0 I Φ 'C I Λ I

C 1 ^4 Μ" I to I

-η i in ω i ^ i , j 'rt } o i +3 Φ j oo [

ro ! g, ! s^jg-g! H H I

I Φ I cm u t n φ I i

ι-q I M I I I

W I O I . I I

pq i a: w i lå i i < I 3 h 1 Φ \ i ^ i in EH I Φ I λ; h 1 m I Φ rH σ i tn φ i w i -y

ζτ> w J 04 £) d 13 | o σι ! S

f s stal - - s 1 _ « ty m S & C ·· C I 1 I .

•Η φ ’Η I I I -H

S Jj o I σ Is ! ri j bl

λ H lu I fsj \ I cti 'C

ΟΦΕίσφ&ΐ ^ l-H

j L 3 4) ίο O i I

e *E s ! ^ £ 5.S ! * ^ ! 1

>, O I 3 551 ' ^ · t»P

rH m 3 i i Φ æ , i i m tn i di i ”0 (0(0 1 φ ^ ^ _ 1 " φ 1 x u i —. 04 to 00 1 d +j i tn Φ I o ro ro rr 1 •c 2 ! n 8¾¾! ~ “ “ j I o. H sfisl s s a 3 33 O tn i « o in Φ 1 1 tn tn -s 1 1 1 u ή o gi . 1 o· 10 £ . ρ'σ^Ι ~ ~ ~ £ ^ I, 6 η \ σ vo σ o [ Φ I σ φ p l ^ σ σ o l d Η 10 I J , ί j) I ^ ^ rH I Φ •wd J (0 4 ·11 ! » h ° 10 ^ ° ί ξ S aeftl ss s s C G I < ETr^T φ I iH H i -3 φ -r| I φ φ I 4-i

Si - I g S S 85 1.5 |S I c ® 8 Jj^on ! ! 1 ϊ ϊ&Ιέ&Ιδ''® ΊΑ S i §5! I ΐΐδ t’SB 8 mIs? s.i& ®8 ! ~ QG (ΟΛΗ 1 SoS>oa5>p4ro®4JVDt)4JOOj| (0 44 DK 170781 B1

O I -PI I

O I <1) I I ^

O I Ml I

• i <u i i tn cm i tn i i +j

(NI Cl I P

i A! I lo iioih m oooo o o in o i in .. i m i o in o m i —

O I I CM H O CM I

m o i o i · i

Dl o I Ai I VD I

C · I X I I

ri 0* I HI I

P Ή I I I

ω i i

(/) I 1 I

C 1*1 I

Μ I 00 I I

O i i i cm m oooo o o o m i

UH I r—I I CM H I

I k I I

a; i o* i i

W O I I I

•rH O I I 1

P O I I I

P · I 00 I I

Ai 00 I * I I

0) ml ίο I I

rH I lim ID OOOO O O rH in I

tu I I O I 0* rH I

0 I - I rH I

CO O I ml I

•Η O I I I

Oli I

01 · I I I

O O i i i

mi id i I

U I - I I

PI I m I I

Pn llin1 m oooo o o o i æ i cm i rH i

• | I * I I

Μ* I Ό I Μ* I I

i o i i

PI I > I I

W I I I

CQ I tn I I

< I C I -«r I I

E-I I -rH i * I I

Ih i oo i i <D i i i m m on r-~ o o o oooi

C I rH I CM H CO 00 Η Η I

0 1*1 I

•ri I O' I I

-Pil I

Αί o I I I

rd o i i i

Poll I

UH · I 00 I I

Ν’ I * I I

P O' I ID I I

Q) I I I vo ro CM CO O O O O OO O I

-P I I O I l£> CM rH I

m 1*1 h i

Φ ο I mi I

Oli I

•Poll I

<D · I I I

-P m i i i •Η η· i m i i >1*1 1 •ri i in i i -P i iio* id incnoo o o o m i

Al I CM I H CM H CM CM I

m i*i o i

C I Μ1 I I

•P i i

Αί I .. rH CM I

o Ai i · υ c ·—. i m -p m i p *-* c h cd 4h i

g Oi-HICXJ-HrH H -H UH OifiCI

>i W P I HJinC— -»ΑίΑίιΰΙ IC-rHOl rH >+> i caiAJU'Oocc tr> &> ct>-h ω p i ha; i o -p o <dcno<d<d om c ro p a; <di

>1 CD I Η -Η -p PlOinHH C UH -H UH (D O *W I

C ΑίΗ i -P > o OiniOPP-rHOP O > -P PI

m οι <d i a;-hmha;ik;cm<d(d cpo p-ho <di

é HO ira-Ρε^ -p-PSAiCAi-P'd-PI

3 o M S3 l P ,¾ >1 <D »rO ·ι0 C C SfdnJ ro a; c Cl ffi S Η O, I (P < P3 PiaDuHH Κ ε > SCW Hl TABEL 4 (forts.) 45 DK 170781 B1 a) 2 ml humantlymfokinpræparat indeholdende 750 lymfotoksin-enheder og 55 K562 cytostatiske leukoregulinenheder blev skilt ved gelpermeationskromatografi i fraktioner med molekylvægte på 45.000 - 74.000, 30.000 - 38.000 og 17.000 - 22.000.

5 17.000 - 22.000-fraktionen blev holdt ved 4°C, medens de to højmolekylære fraktioner blev skilt yderligere ved isoelek-trisk fokusering i fraktioner med pH-værdier på 7,2 - 8,4, 6,1 - 6,9 og 4,2 - 5,6. Fraktionspuljerne efter fokusering blev dialyseret over for PBS-PEG og filstersteriliseret før 10 bestemmelse.

b) Alle aktiviteter er udtrykt i enheder/ml.

c) Lyse af alfa-L929-celler.

d) Væksthæmningsenheder.

e) Lytiske enheder.

15 f) Ng/ml.

TABEL 5.

46 DK 170781 B1

Bestemmelse af interferon antitumor-celleaktivitet:

Human interferon, Antivirale Lymfotoksina Leukoregulin type og kilde enheder/ml enheder/ml enheder/ml

Gamma-(FL) 5 x 10^/ml 2.000 0

Gamma-(ML) 5 x 105/ml 0 0

Alfa-(S) 1.000/ml 0 0 a) Lyse af alfa L929-celler.

b) Væksthæmning af K562-celler.

TABEL 6.

47 DK 170781 B1

Molekylær karakterisering af tumorcelle NK-cytoksicitets- 3 ) forstærkende aktivitet :

Molekylvægt 45.000 - 74.000 17.000 - 22.000

Isoelektrisk -------------------------- ------------- NK-medie- isoeiejccrisK 4 5 _ 5j5 6#0 _ 6#7 7f4 - s,5 Ikke fokuseret kontrol ph

Lyrfctcksta1» 0 151 0 70 c)

Leukoregulin 8 13 0 NK-lytiske enheder d) pr. 104 celler 5481 356 4771 253 276 NH-forstærkelsee^ 2,0 1,3 1,7 0,9 a) 2 ml af et humant lymfokinpræparat blev skilt ved molekular-sigtnings-HPLC-kromatografi i fraktioner med molekylvægte på 45.000 - 74.000 og 17.000 - 22.000. Den højmolekylære fraktion blev skilt ved isoelektrisk fokusering i fraktioner med isoelektriske pH-værdier på 4,5 - 5,5, 6,0 - 6,7 og 7,4 - 8,5. Alle fraktionspuljer blev dialyseret over for PBS-PEG og filstersteriliseret før bestemmelse.

b) Lyse af alfa-L929-celler i enheder/ml.

c) Væksthæmning af K562-celler i enheder/ml.

d) K562-celler i 1 ml af en prøvefraktion fortyndet 1:5, eller medierne blev inkuberet i en time og derpå målt ved en 4 timers ^Cr frigørelsesprøve med NK-celler.

4 e) Forholdet mellem de NK-lytiske enheder/10 celler af behandlingsgruppen og af NK-mediekontrollen.

Statistisk signifikant forskellig fra kontrollen (p<0,05) ved Students t-test.

48 DK 170781 B1

c ! 'T

Oli t/3 •h tn i jj +j tr> — i ρ

3 C P I Η o n o to oo ld mon H O

H h <di n -¾ cn η η n -er n η m m 3 ι η E i ~

ft P Λ Ό Η I

0 0 O H 4> l

ft 4H Ό -P I

I I

- P i

P 3 I

<U t n Q> I

Ό ifl B I

• 3 t n >i i

C Λ P Η I

•rH fiolt O I Λ Λ r—I <υ S-ι 4-) I (N (N U n't 3 O >1 I n m

G) H 4-1 u I

(1) (0 I

S-l 4> S-l ϋΡ I

O C (DO I

X < Ό m i

3 I

O I

>—I I

P I

O 'Τ' I

4-1 +J |Λ I

tn i 4J i

P X I (1) I

qj Witni or^tNtNin ^ ό H > I C I ' ' ' - k - *· .Η qj i qj i i—i t—i (N c4 <—i n no o • I Q) H I K I rH σι r- I o rHll n i 0) i i

3 I 3 * O 1 I

Η I H ' II

CQ I 3 3 S-l 4h I 4> I G

< I E s-l 0) 3 I QJ I C

EH I S-l 0) ti I >-l I H

O TJ Π3 G) I 0) I C

B ««fil Cl X

j3 4 ·Η I Ol ototNCTio S-ι

G) C »G Cl -Hl - - - - H

O QJ S-l E I -PI Η Η HM (Q O O O tO O > H OD 00 O O

O fli I Λί I co (N η m vo H Hin

Si η ή jfi i 3 1 h i n c

QJ 3 I S-l I QJ

H 4> Si c*P I 4-1 I G>

H C 3 O I D I C

QJ < t n I I H

υ i

Si i

O I

g I Si

3 I <U

-pi υ Ό

I C H

φ I ·· 3 0

C I Si 3 Ό O E

3 13 3 E Η I H Si E 13 Η O O Η E 3 3 ΙΕ H C E 3 tø Ό

X I O 3 H Sh 4) X -H

IC O u 3 -H 3 ft 4h 31 -H « Si 3 ft 3 3

3 ft I 3 E Gss 3H3H

>ι I SH 3 C -P Λ! ft O ^

Sh E-t I m C E 33 3 X S J<

0) I S3 3 C 3 C GH Η * H ,C C

Ό I O ΌΟ-ΡΟ Sh H 3 t > 4» >i QJ I 3H= = =0H=UH= .· 3 tø W C P >i Si X I H O 3 0 3 0 P > X 3 3 3 P 3

E I 3 « Q« « « 3 O CO S S U W X

O IC 3 ·· tn IH E 3

Η I 4> OP

Όι IN C 3

4H 13 H O

I 4) O C

3 IC P 3

> IH O 3 to O

-H 10 00000¾1 Αί t" Pfi

4) Q) I P (Ti (OV I ovh Qjn W3 CM

(0 Hl -PMP^ODnHnOO PH^tN^m PO 3 CN I

h HitniOiiEHiito> uWiiootNCtm P) to ft 3 31 3 E-i-iHSSDISW^OB H Eh E-i I IU C to PO 3 tn 3 « ui o kswwkophpu n a«bHtn < 49 DK 170781 B1

n I I

3 i IIP

Oli i σ> « •h w i i «Ν 3

P t n I I I C

HJ C Ml I E-ι H

Η H 3 I I ffi rH

3 I i—I HI I _ ΛΜΛΌ-Η I I (Λ tn O O O Η P I I O o

ft m Ό 4-1 ^ I IH

I I H

I I X Ή - l-ι I I ro 1-4 O I I ΓΊ l-l 3 tn o) i i tn

Ό 3 3 I I *P O

CL> CO >i I I 3 P

Λ l-l Η I I (0 c·« o i i tn g <U S-ι -Μ I 13 0

O >1 I I Η P

Η H U I I 3 Ί4 3i i ε co 4J li # i l « tn 3 0) o I I Λ 3

<Όιη I i P H

I I CO 3 i i x p i i « tp I I > Λ — I 13 Λ i tn i cw> o

P I P I 3 I O H

3 I O I -H I m X I 3 I 3 3 I «3 «13 1 Ojy: : : I P O.· > i cd i tn P i cd P o dj i Pi i 3 η i tn <l) tn

Hil Η > 1 3 Ό H

Hil I 3 ·©.

oil ip -m ·

ν o I I I ort) tn 3 Η H

-i il tn I p β χ ε & 3PIPI-PI 3 I O H Ai \ \

P 3 3 I 3 1 H IH P«PP

3tnlPI 3 I 3 P 3 3 Ό 3 tn I 0) I AC = = = I P P o o 3W3I3I P I 3 P -H 3 3 -3PHI0I Η IT3 Η ΛΛ 3 «3 3 I Η I > I H 3 C 3 3 P £ I P I I - H 3 3 3 O « I X I 3 I 3 H 3

ΗΉ£ I 3 1 3 I Ό 3 P O O

3 ipi tn=ssi tn tn o m o 4J P # I Ή I 3 I 3

3 3 0 I 3) I Η I « U O

< Ό in I I I £ P P 3 3 I I (ft P 3 3 i i c te x e & I 13 3 I P I Ό Ό H 3 3

I 3 I 3 3 P P

I 3 3 13 >13 3

I HH 10 Η X X

I 3 Λ IH P 3 3 3 I 3 0 I P 3 tn I O Pssl H 3TJ33 I X Λ 13 3 H 3 3 I 3 H IH 3 £ >i >i

I S *P I ip P 3 Η H

3 1 T3 13 H O O

Cft| 33 I Ό >>iPP

>i I X A I 3 P >i >i

E-ι I 3 I · H O O O

I Η P 3 I P Λ 3 .. I 333 I (ft > # # — I 0 H 3 I BH ^ Λ

• I μ Η H )C 5 ! I P H O '—I CN

3 I P 0 3 O I 3 H Qi

P I3WU> I 3 P P

P IH I Ό tn P H H

O IH I 3 · 3 3 3 3 IP 13 I ,3 P P 3 £ £

"" I O I C 3 0 Η Η H

I I 3 Η X Ό 3 3

r- 13 I H 3 3 X X

IH I 3 3 3 P 3 3

J 313 I ' W O t n S S

W Hl g Η ΓΊΛ i

£0 Hl pH O O Η I

«i 31 o 3 ifinin i « -- ^ E-ι Ul Z (S HHHI 3 Λ O Ό 50 DK 170781 B1 »« P «3 ro —I — — — — I ft

tP Λ I lo I

<0 I I P

H I O O O 'S· I d) •H 6 I 'r -*r i h

\ | w w w w i H

P P I 10 CO O O I 0) a) <d i n i υ

tn 33 I II

X d) I I <n

O S I I CM

> C I II

d) I IH

V-l I I IS

d> C I I

33 -π i ^ ^ -N -v i co rH i m o o co i o

- 3 1 o o ro I rH

P tn i ·*τ rr I

φ 0) I — ' I X

H P i co co o ro i

Η O I <0 OH Hl <N

φ λ: i i o 3 1 i m S-i 0) I 13

0 Η I I

g ^ i ic 3 1 I d>

-P tP I I -P

1 C i ^ i tn C -Η I o o o in I ΛΙ O C I m o o r- i ft! H g I o o co i >

O ft! I Η* Η I

x si —' w ^ '-'i m I oo (N co in i 3

• I d) C#P I 00 TT CO CM I

CO I 3 I I tP

13 I IC

t-3 I g Cl I -H

W I 3 Φ I I · C

mis 33 i i p g

Cl 3 1 I 0) «

Hid) i i cp s

C (3 I IC

P Cl I Η &P

•3 -Hl ICO

X Cl I s in to S I I >1 33 >1 I I 33 d) 3 33 I I P 33 p I vo *3· vø I O d)

x o w i i m tP

tn mh w i +i +i +i +i i 3 •H I I H tn P ^-+11 CM CN Η O I g p 4-t 3 I OH Γ" «a1 10 I »3

• C I I H P

•3 P -Η I I O

ft ft Η I I Η MH

3 I I

C P Cp I I S 33 •iH d) 0) I I QJ CL)

Η -Η P I I 33 S

3 C O I I O C

tp o pc i i ft d)

0) H 3 I I C

P O 0) I I P H

O «HI I d) H

X I I H 3 3 I I H tn 0) I I d) d)

Η I I O P

I I o tp Cl I m X · 3 > · I I O 3 0)

3 P I I H d) tP

tP C C I (NI H 3 C Sil h in I X 33 H Cl (N σι I c C (DPI C o σι Hl oh ih co

X -H d) I <D ΓΗ Η II

p S Η I S I I in I

•H 3 H~ I O ^ TT τγ I — r-,

> ft d) I U oo 00 00 I 3 S

Claims (16)

1. Human polypeptid-lymfokin, benævnt leukoregulin, der har evnen til at regulere fysiologien og væksten af maligne 5 tumorer uden at påvirke væksten af normale celler, og som har evnen til direkte at lysere humane HT-29 og RPMI 2650 tumorceller, men ikke til at lysere murine aL929 celler, samt evnen til at undertrykke formeringen af de humane tumorceller K562 og RPMI 2650, idet disse aktiviteter er følsomme for 10 protease-, men ikke for neuraminidase-fordøj else af polypep-tidet.

2. Polypeptid-lymfokin ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har en molekylvægt på omkring 120.000 - 140.000 og et isoelektrisk fokuseringspunkt i pH-området 4,8 til 5,5 15 eller 7,5 til 8,3, som eluerer under anionbytterkromatografi ved mellem 0,07 og 0,12 M NaCl-koncentration, og som producerer underenheder ved dissociation med molekylvægte omkring 30.000 - 35.000 D.

3. Biologisk aktiv underenhed af human leukoregulin ifølge 20 krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den har samme biologiske effekt som human leukoregulin.

4. Fremgangsmåde til oprensning af human leukoregulin ifølge krav 1 eller 2 ud fra en blanding omfattende lymfokiner, kendetegnet ved, at man separerer proteiner efter 25 både molekylstørrelse og molekylladning, hvor proteiner, der har molekylvægte på ca. 120.000 - 140.000, skilles fra andre proteiner i blandingen på sædvanlig måde, og proteiner separeres efter ladning ved hjælp af mindst én metode valgt blandt isoelektrisk fokusering ved pH-værdier mellem 4,8 og 30 5,5 eller mellem 7,5 og 8,2 og anionbytterkromatograf i med eluering mellem 0,07 og 0,12 M NaCl-saltkoncentration, idet størrelsesseparationen og ladningsseparationen kan ske i vilkårlig rækkefølge. DK 170781 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at proteinerne separeres efter molekylstørrelse ved hjælp af en eller flere metoder valgt blandt gelfiltrering og gradi-entpolyacrylamidgel-elektroforese.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at blandingen indeholdende lymfokiner er et koncentreret kulturmedium fra en kultur af humane perifere blod-monokerne-celler, som har været udsat for fytohæmagglutinin til stimulation af produktionen af leukoregulin.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af leukoregulin ifølge krav 1 eller en biologisk aktiv underenhed ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den omfatter sekvensopdeling af en del af leukoregulinmolekylet eller underenheden, fremstilling af en sonde af denne delsekvens, isolering af genet 15 for leukoregulin fra en celle, som producerer leukoregulin, inkorporering af genet i en overføringsvektor, transformation af en celle med vektoren og dyrkning af den transformerede celle til ekspression af leukoregulin.

8. Biologisk aktive underenheder af human leukoregulin 20 ifølge krav 3, kendetegnet ved, at de er fremstillet ved lysering af leukoregulin eller ved syntetisering af underenhederne ved fremgangsmåden ifølge krav 7.

9. Biologisk aktivt materiale omfattende en effektiv mængde leukoregulin.

10. Materiale ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det indeholder leukoregulin ifølge krav 1 eller 2.

11. Materiale ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det indeholder leukoregulin indkapslet i phospholipid-blærer.

12. Materiale ifølge krav 11, kendetegnet ved, at 30 phospholipid-blærerne er koblet med monoklonale antistoffer. DK 170781 B1

13. Celle, som producerer human leukoregulin og er valgt blandt transformerede B-celler og hybridomaceller, og som er fremstillet ud fra humane B-celler, der er opnået fra det perifere blod fra en cancerpatient, som er blevet podet med 5 en vaccine omfattende levedygtige celler fra patientens egen tumor eller en kultur deraf.

14. Celle, som producerer human leukoregulin, og som er transformeret med en overføringsvektor indeholdende genet for leukoregulin eller en biologisk aktiv underenhed deraf.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af leukoregulin, ken detegnet ved, at celler ifølge krav 13 eller 14 dyrkes i et serumfrit medium.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at tetradecanoylphorbolacetat sættes til dyrkningsmediet. 15