CN116041550A - 靶向nkg2d的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向NKG2D的嵌合抗原受体，属于生物医药技术领域。本发明要解决的技术问题是：如何实现胃癌患者CAR‑T治疗的稳定性和有效性。为解决上述技术问题，本发明提供一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号识别结构域，所述信号识别结构域为氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；所述嵌合抗原受体还包括信号传导结构域；所述信号传导结构域为氨基酸序列是SEQ ID No.2的多肽。本发明的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞抗肿瘤实验表明，该嵌合抗原受体具有设计合理，使用疗效显著的优点，在胃癌免疫细胞治疗领域具有巨大的应用前景。

Description

靶向NKG2D的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向NKG2D的嵌合抗原受体及其应用
背景技术
最近，利用宿主免疫系统的疗法改变了肿瘤的治疗格局。PD-1以及PD-L1的封闭治疗彻底改变了许多实体瘤的治疗，CAR-T已成为许多癌症潜在的突破性疗法。免疫治疗在晚期胃癌治疗已经取得突破性进展，免疫检查点抑制剂PD-1单抗获批晚期胃癌三线治疗，免疫治疗单药疗效欠佳，PD-1单抗联合化疗已成为晚期转移性胃癌一线治疗新标准。
NKG2D，是一种在人类天然杀伤细胞，CD56+和CD8+T细胞表面表达的激活性受体，在天然免疫中发挥着重要的作用，参与病毒感染细胞的识别及NK对肿瘤细胞的杀伤。NKG2D拥有多种配体，包括人类MHC-I类链相关分子(MICA和MICB)和人类UL16结合蛋白(ULBPs，也称为人类RAET1)。NKG2D配体大都为多片段组成的跨膜蛋白，但也有部分RAET1蛋白缺乏跨膜结构，他们通过糖基磷脂酰肌醇锚固在细胞膜上。在感染、肿瘤以及器官移植受体组织细胞中都有MIC的表达。已有研究证实许多上皮来源的肿瘤，比如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、神经胶质瘤以及黑色素瘤中都有MIC的产生，MIC被认为是一种肿瘤相关性抗原。与MIC相比，ULBP表达更为广泛，在多种正常组织及肿瘤均有表达。ULBP在病毒感染及人类巨细胞病毒逃脱免疫监视过程中起重要作用。NKG2D/NKG2DL可以介导免疫细胞的肿瘤杀伤作用。这种杀伤作用是由多种免疫细胞及免疫因子共同参与实现的。
NKG2D受体是一种凝集素样跨膜糖蛋白，主要表达于自然杀伤细胞(NK细胞)、CD8+T细胞和自身免疫抑制的CD4+T细胞，它是一个重要的激活受体。NKG2D受体在正常组织或细胞中呈低表达或不表达，但当NKG2D配体受到病原体感染、基因毒性药物或细胞恶性转化时表达量会迅速增加。因此，NKG2D可以作为CAR-T治疗的理想靶点。此外研究人员发现，NKG2D不仅可以作为CAR-T杀伤的抗原靶点，同时它还可以通过激活宿主自身免疫系统来进行抗肿瘤作用。目前NKG2D修饰的CAR-T杀伤试验已经在多发性骨髓瘤、恶性胶质瘤及肝细胞肝癌中取得了显著疗效，包括胃癌在内的靶向NKG2D的CAR-T杀伤临床试验即将于2021年完成。
与血液癌症相比实体瘤一个重要的不同点是实体瘤周围形成的肿瘤微环境(TME)。肿瘤微环境中包含着调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞等多种具有免疫抑制能力的细胞，以及过度表达具有免疫抑制能力的细胞因子。而这一环境则容易导致CAR-T细胞迁移和持久性不佳、细胞功能受损以及细胞衰竭，从而导致治疗效力不佳。
为了克服肿瘤微环境的影响，提供强大免疫反应所必需的两个要素：1)浸润肿瘤的CAR-T细胞；2)PD-1/PD-L1阻断，可确保维持T细胞的持久性和功能。
因此，降低胃癌免疫抑制，提高CAR-T细胞免疫治疗的特异性、可控性、安全性、以及效力，是目前亟待解决的技术难题。
总而言之，胃癌患者的诊疗方案仍存在着未被满足的临床需求，领域内诸多空白有待未来研究进一步填补。既往报道的诸多生标志物及治疗靶点已经为胃癌诊疗带来了革命性的进展，尤其是免疫治疗的成功应用。但无论是免疫治疗向前线的尝试，还是后线耐药之后的选择，都是学界亟待解决的问题。新兴的细胞疗法，嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)-T细胞近年来走进了人们的视野，为胃癌治疗带来了新的曙光。这类“活的”药物既往已经在血液肿瘤界大展拳脚，并正在向实体瘤领域积极拓展中。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：如何实现胃癌患者CAR-T治疗的稳定性和有效性。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号识别结构域，所述信号识别结构域为下述任一种：
A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2)、A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的多肽；
A3)、在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽。
进一步地，上述的嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体还包括信号传导结构域；
所述信号传导结构域为下述任一种：
A4)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的多肽；
A5)、A4)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A4)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的多肽；
A6)、在A4)或A5)的N端和/或C端连接标签得到的融合的多肽。
进一步地，上述的嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体选自下述任一种：
A7)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A8)、A7)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A7)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的蛋白质；
A9)、在A8)或A9)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
其中，SEQ ID No.1由135个氨基酸残基组成。
SEQ ID No.2由225个氨基酸残基组成。
SEQ ID No.4由456个氨基酸残基组成。其中SEQ ID No.4第1-81位为信号肽；第82-216位为信号识别结构域；第217-231位为连接肽；第232-456位为信号传导结构域。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag蛋白标签、His蛋白标签、MBP蛋白标签、HA蛋白标签、myc蛋白标签、GST蛋白标签和/或SUMO蛋白标签等。
第二个方面，本发明提供与上述的嵌合抗原受体相关的生物材料，所述生物材料为下述任一项：
B1)、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的重组细胞、或含有B2)所述表达盒的重组细胞、或含有B3)所述重组载体的重组细胞。
进一步地，上述的生物材料中，B1)所述的核酸分子选自下述任一项：
g1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
g2)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
g3)、与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。
本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本发明中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
进一步地，上述的生物材料中，B3)所述重组载体为慢病毒重组载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体为NKG2D-CAR-pLVX质粒，所述NKG2D-CAR-pLVX质粒为将SEQ ID No.3所示的DNA分子替换pLVX-IRES质粒(Taksra公司，货号：631238)中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段，保持pLVX-IRES质粒其它核苷酸序列不变得到的NKG2D-CAR-pLVX质粒。
进一步地，上述的生物材料中，B4)所述重组微生物为重组慢病毒。
进一步地，上述的生物材料中，B5)所述重组细胞为T细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞或干细胞。
进一步地，上述的生物材料中，B5)所述重组细胞可为T细胞。
进一步地，上述的生物材料，所述重组细胞还包括用于敲除PD-1基因的gRNA和cas9蛋白质。
所述敲除PD-1基因的gRNA和cas9蛋白质嵌合组成RNP复合物。
所述gRNA的靶标序列选自SEQ ID No.7第1-21位，SEQ ID No.9第1-21位，SEQIDNo.11第1-20位和/或SEQ ID No.13第1-20位。
进一步地，所述gRNA的核苷酸序列选自SEQ ID No.8，SEQ ID No.10，SEQ IDNo.12和/或SEQ ID No.14。
第三个方面，本发明提供应用，所述应用为上述嵌合抗原受体或上述的生物材料在下述任一项中的应用：
C1)、在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；
C2)、在制备用于预防或治疗表达NKG2D抗原的肿瘤的药物中的应用；
C3)、在制备调节肿瘤微环境的免疫抑制作用或制备调节肿瘤微环境的免疫抑制作用的产品中的应用；
C4)、在预防或治疗肿瘤中的应用；
C5)、在预防或治疗表达NKG2D抗原的肿瘤中的应用。
进一步地，上述应用中，所述肿瘤可为胃部肿瘤，例如胃癌。
本发明取得的有益技术效果如下：
PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞解除了免疫抑制信号PD-1/PD-L1信号通路对CAR-T细胞的抑制效应的同时，提高靶向NKG2D的CAR-T细胞免疫治疗的疗效。本发明提供的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞抗肿瘤实验表明，该嵌合抗原受体具有设计合理，使用疗效显著的优点，在胃癌免疫细胞治疗领域具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为流式细胞术检测PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞阳性率。
图2为流式细胞术检测PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞激活标志性分子CD28的表达情况。
图3为流式细胞术检测PD-1基因敲除NKG2D CAR-T记忆型细胞标志性分子CD45RO/CD62L的表达情况。
图4为PD-1基因敲除的NKG2D CAR-T细胞的杀伤能力检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
293T细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号1101HUM-PUMC000091。
人胃癌细胞系MKN-45购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，资源编号1101HUM-PUMC000229。
实施例1、负载NKG2D嵌合抗原受体(NKG2D-CAR)的慢病毒制备
NKG2D嵌合抗原受体(NKG2D-CAR)由信号识别结构域和信号传导结构域串联而成。信号识别结构域为NKG2D受体的胞外区。所述信号传导结构域依次由CD8α铰链区、CD137跨膜区和胞内区以及CD3ζ胞内区串联而成。其中信号识别结构域的氨基酸序列是SEQ IDNo.1，信号传导结构域的氨基酸序列是SEQ ID No.2。
本发明中，所述NKG2D嵌合抗原受体的编码序列是SEQ ID No.3。其中SEQ IDNo.3第1-243位为信号肽的编码基因，SEQ ID No.3第244-648位为信号识别结构域的编码基因，SEQ ID No.3第649-693为连接肽的编码基因，第694-1371位为信号传导结构域的编码基因。
本发明中，SEQ ID No.3所示的编码序列编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的融合蛋白，其中SEQ ID No.4第1-81位为信号肽；第82-216位为信号识别结构域；第217-231位为连接肽；第232-456位为信号传导结构域。
Figure BDA0004065861590000061
Figure BDA0004065861590000071
二、NKG2D-CAR-pLVX质粒的构建
具体构建方法如下：
1、委托金斯瑞生物科技有限公司依据申请人提供的基因序列SEQ ID No.3合成含酶切位点HindⅢ(-AAGCTT-)、BglⅡ(-AGATCT-)的基因序列片段，并将其克隆到pUC57质粒(金斯瑞生物科技有限公司，货号：SD1176)中，得到的重组质粒即为NKG2D-CAR-pUC57质粒。
NKG2D-CAR-pUC57质粒的结构为：用核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子替换pUC57质粒的HindⅢ、BglⅡ酶切识别位点之间的小片段，保持pUC57质粒的其它核苷酸序列不变得到的重组质粒。
2、将pLVX-IRES质粒(Takara公司，货号：631238)与NKG2D-CAR-pUC57质粒分别用HindⅢ(Takara公司，货号：1060A)和BglⅡ(Takara公司，货号：1021A)进行双酶切，酶切产物进行凝胶电泳并回收pLVX-IRES酶切后的大片段和NKG2D-CARpUC57酶切后的小片段。
3、回收产物用T4DNA连接酶(Takara公司，货号：2011A)连接即获得NKG2D-CARpLVX质粒。
测序结果表明：NKG2D-CAR-pLVX质粒为将SEQ ID No.3所示的DNA分子替换pLVX-IRES质粒中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段，保持pLVX-IRES质粒其它核苷酸序列不变得到的NKG2D-CAR-pLVX质粒。NKG2D-CAR-pLVX质粒可表达氨基酸序列是SEQ ID No.4的融合蛋白。
按照上述方法，将SEQ ID No.5所示的DNA分子替换pLVX-IRES质粒中HindⅢ、BglⅡ酶切位点间的小片段，保持pLVX-IRES质粒其它核苷酸序列不变得到GFP-pLVX质粒。GFP-pLVX质粒可表达氨基酸序列是SEQ ID No.6的GFP蛋白。
二、NKG2D-CAR-pLVX质粒的扩增
1、用CaCl2处理DH5a菌株，使其处于感受态，并将其与NKG2D-CAR-pLVX质粒于37℃共孵育16-24h，挑取单独菌落进行扩大培养。
2、使用质粒大提试剂盒(Sigma公司，PLX50-1KT)，按推荐的实验流程提取质粒，提取的产物用HindⅢ和BglⅡ进行双酶切，得到的小片段与用HindⅢ和BglⅡ双酶切NKG2D-CAR-pUC57质粒时得到的小片段长度相同，证明NKG2D-CAR-pLVX质粒构建成功。
3、使用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测其浓度，结果表明：NKG2D-CAR-pLVX质粒的浓度为0.8-1.2ug/ul。
实施例2、慢病毒载体的包装及慢病毒滴度的检测
一、慢病毒载体的包装
1、复苏293T细胞并进行培养，培养基为含10％胎牛血清(Gibico公司，货号：10099141)的DMEM培养基(Gibico公司，货号：11995065)。调整细胞浓度，使得细胞在10cm培养皿中的培养体积为10mL、汇合度为80％。
2、按照实施例1中的方法对慢病毒包装所需质粒gag(优宝生物，货号:VT1548)、Rev(优宝生物，货号:VT1445)、VSV-G(优宝生物，货号:VT1491)进行扩增及浓度检测。结果表明：上述质粒浓度均为0.8-1.2ug/ul。
3、于1mL DMEM培养基中加入上述gag质粒20ug、Rev质粒30ug、VSV-G质粒15ug和实施例1制备的NKG2D-CAR-pLVX质粒35ug，混匀后室温孵育15min，之后，将混合质粒体系加入293T细胞的培养上清中，混匀后继续培养。
4、添加质粒后，293T细胞培养24h时收集病毒上清，并补加培养基10mL，48h时再次收集病毒上清。
5、收集后的病毒上清使用0.45um滤器进行过滤，向病毒上清中加入1/4体积的无菌PEG8000(北京凯瑞基生物科技有限公司，货号：25322-68-3)，置于摇床上4℃过夜，12000r/mim离心30min，弃去上清，用1mL DMEM培养基重悬底部沉淀即得到浓缩的含有NKG2D-CAR的慢病毒。
保存于-80℃备用。
按照上述方法将GFP-pLVX质粒进行包装，得到含有GFP的慢病毒。
二、慢病毒滴度的检测
1、使用0.25％胰酶消化293T细胞，用含10％FBS的DMEM培养基重悬混匀后计数。取1×10 6个细胞接入6孔板，接入3个复孔，并用含10％FBS的DMEM培养基调整培养体系至2mL，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。
2、细胞贴壁后向培养体系中加入含NKG2D-CAR的慢病毒载体1uL，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养。为计算病毒滴度，设计平行实验，即待细胞贴壁后向培养体系中加入含GFP的慢病毒载体1uL，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱内培养。
3、加入慢病毒后第三天，使用0.25％胰酶消化细胞并计数，使用流式细胞术检测GFP表达量；并根据以下公式计算含有GFP的慢病毒滴度：
慢病毒滴度(TU/mL)＝293T细胞数×三个复孔的平均GFP表达量×103，
本实施例的几个复孔的检测结果显示加入慢病毒后293T细胞GFP表达量为25％，293T细胞数约1.5×10 6个，因此慢病毒滴度＝1.5×10 6×25％×10 3＝3.75×108TU/mL。也即，该病毒滴度为含有NKG2D-CAR的慢病毒的病毒滴度。
实施例3、NKG2D-CAR-T细胞制备
一、T细胞获得与激活
所述T细胞的获得方法如下：
1、分离PBMC
取患者外周血50ml，在15小时内2-8℃条件冷链运送到生产车间后，将外周血转入离心管中，2000rpm离心10分钟，吸取离心上清得到自体血浆；
2、将血细胞分离得到的自体血浆，置于56℃水浴30分钟，然后在2-8℃条件冷却10分钟以上，2000rpm离心10分钟，弃沉淀蛋白，即得到灭活自体血浆；
3、T细胞的制备
取等倍沉淀血细胞体积的PBS，加入到含沉淀血细胞的离心管中，混匀；将混悬液20～30mL加到含15ml人淋巴细胞分离液(ficoll)的离心管上层，2000rpm离心20分钟，离心后每管吸取白膜层细胞转入新的离心管中，吸取PBS至含白膜层细胞的离心管中混匀，1600rpm离心10分钟，弃上清；再次吸取PBSL至离心管中，混悬沉淀细胞，补加PBS混匀1200rpm离心10分钟，得到的沉淀细胞团即为单个核细胞(PBMC)；
其中PBS的组成为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.245g，溶于900ml去离子水，并调节pH至7.2，定容至1000ml(也叫0.01M PBS)。
1)培养第0天，激活培养I
用含10％自体血浆的KAL-C溶液，以3×106个细胞/mL重悬PBMC，接种到1个T75细胞培养瓶(Corning)，于37℃，5％CO2、饱和湿度条件培养过夜。
2)培养第1天，激活培养II
在上述T75培养瓶中，补加20-30mL含5％自体血浆的KAL-D溶液，按照培养总体积：KAL-E体积＝50：1添加KAL-E，继续在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
3)培养第3-7天，进行扩增培养I
第3天，将上述T75培养瓶细胞转入1个T225细胞培养瓶(Corning)中，补加含5％自体血浆的KAL-D溶液到80-100mL，使细胞密度维持在1.0±0.2×106个细胞/mL，继续在37℃、5.0％CO2、饱和湿度条件下培养。
第5天，在上述T225培养瓶中，补加含5％自体血浆的KAL-D溶液到200-250mL，使细胞密度维持在1.0±0.2×106个细胞/mL，继续在37℃、5.0％CO2、饱和湿度条件下培养。
4)培养第7-14天，进行扩增培养II
第7天，将上述T225培养瓶细胞转入1.8L细胞培养袋(takara)培养，并补加含2％自体血浆的KAL-D溶液到400-500mL，使细胞密度维持在1.0±0.2×106个细胞/mL，继续在37℃、5.0％CO2、饱和湿度条件下培养，即为制备好的激活的T细胞。
表1：生产试剂配方
Figure BDA0004065861590000111
4、NKG2D CAR-T细胞制备
取激步骤3制备的激活的T细胞，加入实施例2制备慢病毒(MOI＝5)，离心感染，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。24h后离心弃上清换液，重悬于X-VIVO15培养基中，加入5-10％血浆和KAL-D继续扩增，获得NKG2D CAR-T细胞。
实施例4、NKG2D CAR-T细胞PD-1基因敲除
(1)慢病毒感染3天的NKG2D CAR-T细胞，调整细胞密度为1×107cells/mL获得细胞悬液备用；
(2)将纯化得到的Cas9蛋白(购自金斯瑞生物科技股份有限公司，货号：Z03623-GMP-5)与体外合成的得到的靶向PD-1的sgRNA按照一定比例(5：2，其中四种sgRNA的占比相同)混合后于37℃共孵育15min，得到Cas9 RNP(Cas9ribonucleoprotein)；
sgRNA共有4种，分别为sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3和sgRNA4。
4种sgRNA的靶标的核苷酸序列如下(5’-3’)：
sgRNA1：GGCGTGACTTCCACATGAGCGTGG(SEQ ID No.7，下划线为PAM序列)；
sgRNA2：GGCAGTTGTGTGACACGGAAGCGG(SEQ ID No.9，下划线为PAM序列)；
sgRNA3：GACAGCGGCACCTACCTCTGTGG(SEQ ID No.11，下划线为PAM序列)；
sgRNA4：GGGCCCTGACCACGCTCATGTGG(SEQ ID No.13，下划线为PAM序列)；
其中，sgRNA1的核苷酸序列是SEQ ID No.8，sgRNA2的核苷酸序列是SEQ IDNo.10，sgRNA3的核苷酸序列是SEQ ID No.12，sgRNA4的核苷酸序列是SEQ IDNo.14。
Figure BDA0004065861590000121
(3)将步骤(1)制备的细胞悬液与步骤(2)制备的Cas9 RNP混合均匀后，加入到电击杯(2MM)中，通过电转仪(BTX活体基因电转仪ECM830)进行转染；
(4)电转后72小时通过流式细胞术检测NKG2D CAR-T细胞的PD-1基因敲除效率。
(5)细胞扩增
依据细胞的生长状况，适时补充培养基，在37℃、5％CO2培养箱内持续扩增培养14天。收取细胞并离心、洗涤细胞后，重悬于含4％人血白蛋白的0.9％氯化钠注射液中，即为PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞悬液，用于进一步的检测。
实施例5、PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞阳性率、记忆细胞形成及激活能力检测
(1)待检测的CAR-T细胞1500rpm离心5min弃掉上清，加入PBS洗涤后重悬细胞；
(2)CAR-T细胞1500rpm5离心min弃掉上清后加入PBS 100uL重悬细胞，然后加入100uL稀释好的一抗(Anti-NKG2D抗体，购自艾博抗(上海)公司，货号ab35033)，混匀后室温下避光孵育20min；
(3)孵育好的样品管中加入1mLPBS，混匀后1500转，5min离心弃掉上清后加入PBS洗涤后重悬细胞，然后加入100uL稀释好的二抗，混匀后室温下避光孵育30min；
(4)孵育好的样品管中加入1mLPBS，混匀后1500rpm离心5min弃掉上清后加入PBS重复洗涤三次，去掉残余液体；
(5)加入500uLPBS重悬细胞后，用流式细胞仪进行检测。以实施例3中制备获得的野生型T细胞作为对照。
实验结果如图1所示，图1中左侧为野生型T淋巴细胞，图1中右侧为PD-1基因敲除的NKG2D CAR-T细胞，图1中两幅图的纵坐标的数值自下至上分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45，图1中两幅图的横坐标的数值自左至右分别为102、103、104、105。结果表明：上述方法成功制备靶向NKG2D联合PD-1基因敲除的CAR-T细胞，CAR-T细胞的CAR阳性率可达60％以上。
CD28是激活的T细胞表面的标志性分子，CD28阳性的细胞所占的比例代表了激活T细胞所占的比例。PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞激活能力检测的结果如图2所示，图2中第一行的三幅图分别为NKG2D CAR-T细胞，图2中第二行的三幅图分别为PD-1基因敲除NKG2DCAR-T细胞。图2中第一列上下两幅图的纵坐标的数值自下至上分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45，图2中第一列上下两幅图的横坐标的数值自左至右分别为50、100、150、200；图2中第2、3列4幅图的纵坐标的数值自下至上分别为101、102、103、104、105，图2中第2、3列4幅图的横坐标的数值自左至右分别为0、103、104、105。如图2所示NKG2D CAR-T细胞、PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞CD28阳性细胞所占比例均在90％以上，NKG2D CAR-T细胞为92.1％，PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞为90.7％，两组相比表达无差异。图2结果表明PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞的激活能力不受基因编辑的影响。
CD45RO、CD62L是效应记忆型T细胞的标志性分子，如图3所示NKG2D CAR-T细胞、PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞中CD45RO、CD62L双阳性细胞所占比例均在85％以上，NKG2DCAR-T细胞为86.7％，PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞为88.6％，两组相比表达无差异。图3中第一列上下两幅图的纵坐标的数值自下至上分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45，图3中第一列上下两幅图的横坐标的数值自左至右分别为50、100、150、200；图3中第2、3列4幅图的纵坐标的数值自下至上分别为101、102、103、104、105，图3中第2、3列4幅图的横坐标的数值自左至右分别为0、103、104、105。结果表明PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞的记忆细胞形成未受影响。
实施例6、PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞的杀伤能力检测
(1)收集靶细胞单细胞悬液1500rpm，5min离心弃掉上清后加入无血清RPMI1640培养液洗涤3次(离心条件：1500rpm，5min)；
(2)加入终浓度为5μM的CFSE室温孵育靶细胞15min后，加入5倍体积的含10％FBS完全培养基，室温静置5min，释放多余的未结合的CFSE来终止其染色；
(3)用含10％FBS完全培养基洗涤细胞3次(离心条件：1500转，5min)；
(4)取1×105个/孔铺于48孔板中，按照效靶比1.25:1，2.5:1，5:1，10:1，20:1的比例，分别加入PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞或NKG2D CAR-T细胞配制共孵育孔；
(5)配置好各细胞孵育孔后，将细胞培养板放于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育过夜；
(6)次日，取出细胞培养板，通过胰酶消化后收集细胞，制备成单细胞悬液；
(7)将各孔细胞用PBS洗涤3次(离心条件：1500rpm，5min)；
(8)在相应细胞组中加入7-AAD(5μL 7-AAD/100μLPBS/孔)进行孵育(2～8℃，避光孵育15min)后1500转，5min离心弃掉上清后加入PBS 500uL重悬细胞；
(9)取500μL细胞悬液，用流式细胞仪检测CFSE+7-AAD+细胞占CFSE+细胞的比例。
实验结果如图4所示，图4中(A)为PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞，图4中(B)为NKG2D CAR-T细胞，图4中横坐标的数值自左至右分别为102、103、104、105。PD-1基因敲除NKG2D CAR-T细胞与肿瘤细胞(人胃癌细胞系MKN-45)孵育后有83％的肿瘤细胞被杀伤(图4中(A))，而未电转过的T细胞与肿瘤细胞孵育后仅有46％的肿瘤细胞被杀伤(图4中(B))。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括信号识别结构域，所述信号识别结构域为下述任一种：
A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2)、A1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的多肽；
A3)、在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括信号传导结构域；
所述信号传导结构域为下述任一种：
A4)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的多肽；
A5)、A4)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A4)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的多肽；
A6)、在A4)或A5)的N端和/或C端连接标签得到的融合的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体选自下述任一种：
A7)、氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A8)、A7)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A7)所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性的蛋白质；
A9)、在A8)或A9)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
4.与权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体相关的生物材料，所述生物材料为下述任一项：
B1)、编码权利要求1-3中任一项所述嵌合抗原受体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的重组细胞、或含有B2)所述表达盒的重组细胞、或含有B3)所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：B1)所述的核酸分子选自下述任一项：
g1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
g2)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；
g3)、与g1)或g2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体的DNA分子。
6.根据权利要求4或5所述的生物材料，其特征在于：B3)所述重组载体为慢病毒重组载体。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的生物材料，其特征在于：B4)所述重组微生物为重组慢病毒。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的生物材料，其特征在于：B5)所述重组细胞为T细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞或干细胞。
9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于：所述重组细胞还包括用于敲除PD-1基因的gRNA和cas9蛋白质。
10.应用，其特征在于：所述应用为权利1-3中任一项所述嵌合抗原受体或权利要求4-9中任一项所述的生物材料在下述任一项中的应用：
C1)、在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；
C2)、在制备用于预防或治疗表达NKG2D抗原的肿瘤的药物中的应用；
C3)、在制备调节肿瘤微环境的免疫抑制作用或制备调节肿瘤微环境的免疫抑制作用的产品中的应用；
C4)、在预防或治疗肿瘤中的应用；
C5)、在预防或治疗表达NKG2D抗原的肿瘤中的应用。
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