DE69433110T2 - Allogenes vakzin und synthesemethode für selbiges - Google Patents

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Description

  • ALLOGENES VAKZIN UND SYNTHESEMETHODE FÜR SELBIGES
  • Stand der Technik
  • Die herkömmlichen Verfahren zur Behandlung des metastatischen Melanoms sind unzureichend. Deutliche Beachtung fanden die therapeutischen Ansätze zur Stärkung der eigenen Immunantwort des Patienten, da es in Tiermodellen Hinweise auf schützende Immunantworten gegen eine Provokation mit Tumorzellen nach einer geeigneten Immunisierung gibt (Borberg et al., 1972; Smith et al., 1977; Fernandez-Crus et al., 1979; Cheever et al., 1980; Shu et al., 1985).
  • Obwohl Impfprotokolle bei Krebspatienten noch keinen deutlichen Erfolg auf die Überlebenszeit der Patienten zeigten, legen die Ergebnisse mehrerer Studien nahe, dass Patienten, die Immunantworten hervorbringen, im Vergleich zu Non-Respondern eine signifikante Verlängerung der erkrankungsfreien Überlebenszeit sowie der gesamten Überlebenszeit zeigen (Livingston, 1991; Livingston et al., 1985a; Livingston et al., 1985b; Livingston et al., 1987; Livingston et al., 1979; Livingston et al., 1983; Livingston und Watanabe, 1982; Livingston et al., 1985c). Ein Hauptzweck der Impfstudien bestand darin, serologische und cytotoxische T-Zell-(CTL)-Antworten zu induzieren. Obwohl Blut und Tumorinfiltrate aus Patienten mit Melanom und Nierenkrebs zirkulierende cytotoxische Vorläuferzellen mit einer eingeschränkten Reaktivität auf das autologe Melanom (Darrow et al., 1989; Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992) und auf den Nierenkrebs enthalten (Belldegrun et al., 1990; Radrizzani et al., 1989; Belldegrun et al., 1989; Ikemoto et al., 1992; Belldegrun et al., 1988; Koo et al., 1991; Alexander et al., 1990), war es schwierig zu zeigen, dass eine Impfung serologische oder CTL-Antworten induziert oder verstärkt. Es gibt verschiedene Hypothesen, z. B. dass Tumorzellen schwache antigenpräsentierende Zellen sind, dass sie wenige oder gar keine auf der Zelloberfläche exprimierte MHC-Moleküle aufweisen, dass sie Suppressorfaktoren absondern oder dass die Beteiligung des T-Zell-Rezeptors (TCR) über die Tumorantigene ohne ein ko-stimulierendes Signal eine Anergie induziert. IL-2 kann zwei dieser Mechanismen umkehren. Erstens kann IL-2 die Suppression von CTL-Antworten aufheben, die durch den Tumor- Wachstumsfaktor-β (TGF-β) induziert wird (Inge et al., 1992). Zweitens kann der Kontakt des TCR ohne ein proliferatives Signal eine Anergie induzieren, wobei jedoch das Vorliegen von IL-2 verhindern kann, dass sich diese Anergie entwickelt (Harding et al., 1992; Liu et al., 1992).
  • Untersuchungen haben gezeigt, dass die Einführung von Cytokin-Genen in murine Tumorzellen eine gesteigerte Immunogenität und eine verminderte Tumorbildung induzierten (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1990; Ley et al., 1991; Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990b; Gansbacher et al., 1992; Tepper et al., 1989; Hock et al., 1991; Porgador et al., 1992). Die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ durch ein murines Fibrosarkom führte zu einer T-Zell-vermittelten Antwort, die eine Abstoßung des Tumors zur Folge hatte (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). Das menschliche Melanom (Crowley et al., 1990) ist ein besonders vielversprechender Kandidat für diese Strategie der aktiven Immunisierung. In den Patienten können cytotoxische T-Zellclone, die für das autologe Melanom spezifisch sind, erzeugt werden, indem mononukleäre Zellen im peripheren Blut in Gegenwart von IL-2 mit Tumorzellen stimuliert werden. Außerdem wurden gemeinsame Melanomantigene identifiziert, die durch die CTL im Zusammenhang mit spezifischen MHC-Halotypen (z. B. HLA-A1 und HLA-A2) erkannt werden (Darrow et al., 1989; Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992). Kürzlich wurde ein Gen, das ein Melanomantigen codiert, welches durch autologe CTL erkannt wird, aus einer Cosmidbank cloniert, die aus der cDNA von Melanomzellen hergestellt worden war (Van Der Bruggen et al., 1991). Diese und andere Untersuchungen machen deutlich, dass es gemeinsame Melanomepitope gibt, die durch T-Zellen erkannt werden, und dies legt nahe, dass allogene Melanomzellen für die Verwendung in Impfstrategien geeignet sein könnten (Crowley et al., 1990; Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1989).
  • Aufgrund der Beweise, dass es beim Melanom gemeinsame Tumorantigene gibt (Crowley et al., 1990; Kawakami et al., 1992; Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1989), dass die Cytokin-Sekretion durch Tumorzellen die Immunogenität erhöht (Inge et al., 1992; Harding et al., 1992; Liu et al., 1992; Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1990; Ley et al., 1991; Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990b; Gansbacher et al., 1992; Tepper et al., 1989; Hock et al., 1991), dass die Häufigkeit von CTL-Vorläufern in Melanompatienten so hoch sein kann wie 1 : 900 (Coulie et al., 1992) und dass die in vivo-Sekretion von IL-2 durch Tumorzellen die Häufigkeit von zirkulierenden cytotoxischen Vorläufern und von CTLs, die für den immunisierenden Tumor spezifisch waren, in einem murinen Modell erhöhte (Ley et al., 1991), entschied sich der Anmelden dafür, die Technologie des Gentransfers einzusetzen, um in Melanomzellen die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ zu induzieren.
  • Diese Zellen könnten dann möglicherweise an entsprechend HLA-übereinstimmende Patienten verabreicht werden und zur Amplifikation von vorliegenden cytotoxischen T-Zell-Vorläufern führen.
  • Ein entscheidendes Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass anstelle der früher beschriebenen Strategie mit syngenen Vakzinen hier eine allogene Vakzine eingesetzt wird, die mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, kostimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A und 1B : Struktur von retroviralen Vektoren, die die menschlichen IL-2- oder IFN-γ-cDNAs enthalten (weitere Einzelheiten finden sich in Material und Methoden in der ersten Serie von Experimenten).
  • 2: Southern-Blot-Analyse von transduzierten SK-MEL-29. Die genomische DNA wurde mit Bgl II gespalten, einer Elektrophorese unterworfen, geblottet und mit der NeoR-cDNA als Sonde getestet. Als Größenkontrolle wurde das mit Spe I gespaltene Plasmid DC/AD/R/IL2 der SK-MEL-29-DNA beigemischt. Bgl II spaltet einmal im Polylinker im 3'-LTR.
  • 3: Northern-Blot-Analyse von Poly(A)-mRNA aus transduzierten SK-MEL-256-Zellen. Die Poly(A)-RNA, die auf einem 1% Formaldehyd/Agarose-Gel fraktioniert und auf Nylon-Filter geblottet worden war, wurde mit einer Mo-MuLV U3-spezifischen Sonde hybridisiert. „V" und „N" sind LTR-initiierte Transkripte, die ungespleißte Virion-RNA (V) und die gespleißte Neo-mRNA (N). „P" bedeutet ein inneres Promotor-initiiertes RNA-Transkript.
  • 4: IL-2-Sekretion durch bestrahlte SK-MEL-256- und SK-MEL-245-Zellen. Eine Million SK-MEL-256- oder SK-MEL-245-Zellen wurden in einer 60-mm-Schale plattiert, mit 5 000 oder 10 000 Rad bestrahlt und der Überstand alle drei Tage abgenommen. IL-2 wurde im Testüberstand bestimmt, indem ein Biotest und ein ELISA eingesetzt wurden, wie in Material und Methoden beschrieben.
  • 5A bis 5D: MHC-Klasse-1-Expression von parentalen und Cytokinsekretierenden SK-MEL-131-, SK-MEL-19-, SK-MEL-245- und SK-MEL-256-Zellen. Lebende Zellen wurden mit dem monoclonalen Antikörper W6/32 markiert, der gegen eine monomorphe Determinante auf dem MHC-Molekül der Klasse 1 gerichtet ist, hierauf folgte ein Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertes affinitätsgereinigtes Anti-Maus-IgG der Ziege (GaM-FITC), und anschließend wurden die Zellen mit einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer EPICS V (Coulter Electronics, Inc.) analysiert.
  • 6: NIH3T3-Amplifikationstest. RT wurde an Überständen durchgeführt, die aus den Zellen gewonnen wurden, die 28 Tage vorher transduziert worden waren. SK-MEL-29, SK-RC-28 und SK-RC-39: Überstände, abgenommen von Melanom- und Nierenkrebs-Zelllinien, die mit DC/AD/R/IL2 transduziert worden waren. SAX-2: SN aus NIH3T3-Zellen, die mit SAX-2 transduziert worden waren und von denen bekannt war, dass sie ein Helfervirus aufwiesen. Die Verpackungszelllinie, die zum Erzeugen von SAX-2 verwendet wurde, war PA 317. SN 3T3: SN, genommen aus nicht-transduzierten NIH3T3-Zellen. AM12/DC/AD/R/IL2 SN 3T3: SN, genommen aus 3T3-Zellen, die mit DC/AD/R/IL2 transduziert worden waren. AM12/ETAR29: SN, genommen aus der Erzeugerzelllinie AM12/ETAR29.
  • 7: Struktur von retroviralen Vektoren, die die menschliche cDNA für IL-2 oder für IFN-γ enthält (Einzelheiten finden sich in Material und Methoden in der dritten Serie von Experimenten).
  • 8: Nachweis eines replikationskompetenten murinen Retrovirus unter Verwendung des NIH3T3-Amplifikationstests. Keine Aktivität einer reversen Transkriptase konnte in Zellkulturüberständen nachgewiesen werden, die von NIH3T3-Zellen gewonnen wurden, die mit Überständen der transduzierten RC-Zelllinien SK-RC-9, SK-RC-28, SK-RC-29 und SK-RC-39 sowie der Erzeugerzelllinie AM12, enthaltend das Vektorkonstrukt DC/AD/R/IL2, in Kontakt gebracht worden waren. Kulturen der Erzeugerzelllinie AM12/ETAR29 und der Helfer-Virusproduzierenden Zelllinien SAX-2 und SAX-3 wurden als positive Kontrollen eingesetzt. Als negative Kontrollen dienten die gebrauchten Medien von nichtmodifizierten NIH/3T3-Zellen (Kontrollen 1 und 2) oder das Dulbecco modifizierte Eagle-Medium alleine.
  • 9A bis 9C: Das Überleben von SK-RC-29-Zellen nach einer in vitro durchgeführten y Bestrahlung mit 5 000 oder 10 000 Rad: 0,25 × 106 Tumorzellen wurden in doppelter Ausführung plattiert, mit 5 000 oder 10 000 Rad bestrahlt (Tag 0) und an den Tagen 1, 12 und 22 nach der Bestrahlung mit Trypsin behandelt. Der prozentuale Anteil der lebenden Zellen wurde durch eine Färbung mit Trypanblau anhand eines Hämocytometers ermittelt. Der gefüllte Kreis steht für parentale Zellen; das gefüllte Dreieck bezeichnet DC/TKIL2; das gefüllte Quadrat bedeutet N2/CMVIFNγ.
  • 10: Wirkung einer y Bestrahlung (R) auf die Freisetzung von IFN-γ aus SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt N2/CMVIFNγ tragen. Die Überstände einer 72-Stunden-Kultur wurden vor (Tag 0: leerer Balken) und 3, 12 und 22 Tage nach der Bestrahlung entnommen. Die IFN-γ-Konzentration in den Überständen wurde durch einen Biotest oder einen Radioimmuntest bestimmt. Die Ergebnisse stellen Mittelwerte von doppelten Proben dar, die durch den Radioimmuntest erhalten wurden.
  • 11A und 11B : Wirkung einer y Bestrahlung auf die Expression von HLA-DR. Die Expression des HLA-DR-Antigens durch (A) parentale und (B) SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt N2/CMVIFNγ tragen, wurde an den Tagen 1, 7 und 14 nach der y Bestrahlung durch eine indirekte Immunfluoreszenz bestimmt. Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität, die durch FACS bestimmt wurde, ist in Form von willkürlichen Einheiten einer logarithmischen Skala angegeben (Testprobe – negative Kontrolle). In der negativen Kontrolle wurde der primäre Antikörper durch PBS ersetzt.
  • 12A bis 12C: Tumorbildung durch parentale und Lymphokinfreisetzende SK-RC-29-Zellen in vivo. Die Tumorbildung in BALB/c-Nacktmäusen wurde fünf Wochen nach der s. c.-Inokulation von Tumorzellen festgestellt. * Für jedes Experiment wurden drei Mäuse verwendet. ** Bei der höchsten Dosierung. SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt DC/TKIL2 trugen, bildeten nur kleine s. c.-Aggregate von Zellen an der Injektionsstelle (durchschnittliches Gewicht ± SD: 0,02 ± 0 g); Tiere, die Injektionen mit parentalen Zellen oder mit IFN-γ sekretierenden SK-RC-29-Zellen erhielten, die das Konstrukt N2/CMVIFNγ trugen, entwickelten große s. c.-Tumoren (durchschnittliches Gewicht ± SD: 3,63 ± 0,8 g).
  • 13A bis 13F: Immunhistochemische Analysen von Tumor-Xenotransplantaten, gewachsen in BALB/c-nu/nu-Mäusen. a: Parentale menschliche SK-RC-29-Zellen. (b, d und f) SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt DC/TKIL2 tragen, oder (c und e) SK-RC-29-Zellen, die N2/CMVIFNγ Konstrukte enthalten; a und b: PBS substituiert für den mAB, und H2O2-Schritt weggelassen (Färbung auf endogene Peroxidase); c und d: biotinylierter Ratten-mAB gegen Maus-Gewebe makrophagen; oder e und f: biotinylierter Maus-mAB gegen HLA-DR. Zu beachten ist die eindrucksvolle Zahl von (b) Peroxidase-positiven mononukleären Wirtszellen, (d) die überwiegenden Makrophagen im Stroma, die die SK-RC-29-Zellen umgeben, die das Konstrukt DC/TKIL2 enthalten, nicht jedoch die (a) parentalen oder (c) IFN-γ produzierenden SK-RC-29-Zellen. Die positive heterogene Immunfärbung für HLA-DR von (e) IFN-γ produzierenden SK-RC-29-Zellen, nicht jedoch von (f) SK-RC-29-Zellen, die IL-2 freisetzen; Balken = 100 um.
  • 14: Konstrukte, die zwei Cytokine zeigen, können in einen retroviralen Vektor eingeführt werden.
  • 15: Tumorwachstum von Cytokin-sekretierenden CMS-5-Zellen in BALB/c-Mäusen.
  • 16-1 bis 16-3: Strukturen von retroviralen Vektoren, die die menschliche IL-2-, Maus-IFN-γ oder Maus-GM-CSF-cDNA enthalten, und von einem Kontrollvektor, der das menschliche ADA-Minigen enthält (weitere Einzelheiten finden sich in Material und Methoden der sechsten Serie von Experimenten).
  • 17: Proliferation von parentalen und Vektor-transduzierten CMS-5-Zellen in vitro.
  • 18: Durchflusscytometrische Analyse der MHC-Expression auf parentalen und Cytokin-sekretierenden CMS-5-Zellen. Die Zellen wurden mit monoclonalen Antikörpern gegen MHC der Klasse 1 oder der Klasse II markiert, hierauf folgte eine Inkubation mit einem FITC-konjugierten Anti-Ratte-IgG der Ziege und danach eine Analyse durch FACS. Die Expression von MHC der Klasse 1 von IFN-γ und IL2/IFN-γ sekretierenden CMS-5-Zellen war unreguliert, während keine Hinaufregulierung der Expression von MHC der Klasse II auf den transduzierten Zellen nachgewiesen wurde (Ergebnisse nicht dargestellt).
  • 19: Wachstum von parentalen und Cytokin-sekretierenden CMS-5-Clonen in BALB/c-Mäusen. Gruppen zu jeweils drei Mäusen erhielten in jeder Kategorie Injektionen mit 2,5 × 105 parentalen oder 1 × 106 transduzierten Tumorzellen, wie angegeben. Die Ergebnisse sind als der durchschnittliche Durchmesser (in mm) der Tumoren angegeben. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar. Das Tumorwachstum wurde überwacht, wie in Material und Methoden beschrieben.
  • 20: Wachstum eines Gemisches aus IL-2- und IFN-γ sekretierenden CMS-5-Clonen in BALB/c-Mäusen. Eine Gruppe der BALB/c-Mäuse erhielt Injektionen mit einem Gemisch aus 5 × 105 DC/TKIL2/CMS5-Zellen und 5 × 105 DC/AD/RIFNγ/CMS5-Zellen, eine andere Gruppe erhielt Injektionen mit 1 × 106 DC/TKIL2/CMS5-Zellen und 1 × 106 DC/AD/RIFNγ/CMS5-Zellen, wie angegeben. Die Ergebnisse sind als der durchschnittliche Durchmesser (in mm) der Tumoren ausgedrückt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar.
  • 21: Wachstum der gesamten transduzierten CMS-5-Zellen, die große, mittlere oder kleine Mengen von GM-CSF sekretieren. BALB/c-Mäuse erhielten Injektionen mit 2,5 × 105 GM-CSF-transduzierten CMS-5-Tumorzellen oder parentalen CMS-5-Zellen, anschließend wurde das Tumorwachstum überwacht. Die Ergebnisse sind als der durchschnittliche Durchmesser (in mm) der Tumoren angegeben. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar.
  • 22: Wachstum von IL-2/IFN-γ-sekretierenden CMS-5-Zellen in nichtverarmten und in an den Effektorzellen verarmten BALB/c-Mäusen. In jeder Kategorie wurden Gruppen zu jeweils drei Mäusen an den angegebenen Effektorzell-Subpopulationen verarmt, indem sie i.p.-Injektionen mit dem entsprechenden Antikörper erhielten, außerdem erhielten sie Injektionen mit 1 × 106 N/CIL2/TIFNγ/CMS5-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem anderen Experiment erhalten. (Weitere Einzelheiten finden sich in Material und Methoden.)
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen retroviralen Vektor bereit, der die folgenden Bestandteile umfasst: (a) ein 3'-LTR; und (b) eine Insertion, umfassend (i) einen Promotor, (ii) eine Sequenz, die ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und (iii) ein Poly-A-Signal, wobei der Promotor, die ein Immunmolekül codierende Sequenz und das Poly-A-Signal in einer 5'- nach 3'-Orientierung angeordnet sind, wobei die Insertion innerhalb des 3'-LTR in einer Orientierung angeordnet ist, die entgegen der Orientierung des 3'-LTR ist.
  • In der vorliegenden Erfindung bedeutet „Immunmolekül" Moleküle, die das Immunsystem beeinflussen können. Ein Beispiel eines solchen Moleküls ist ein Cytokin. Ein anderes Beispiel eines solchen Moleküls stellt die tumorassoziierten oder tumorspezifischen Antigene dar.
  • Cytokine sind biologische Moleküle, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele von Cytokinen sind Interleukine, die durch Lymphocyten abgesondert werden. Andere Cytokine umfassen Interferone, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Beispiele der Interferone sind Interferon-alpha, Interferon-beta und Interferongamma.
  • Adhäsionsmoleküle sind dem Fachmann auch bekannt. Endotheliale Adhäsionsmoleküle wurden als Strukturen identifiziert, die die Lokalisation und Anlagerung von Leukocyten an die Wände von Blutgefäßen unterstützen. Normalerweise zirkulieren Neutrophile, Monocyten und Lymphocyten frei im ganzen Körper. Wenn jedoch eine Gewebeverletzung oder Injektion auftritt, brauchen die Leukocyten einen Mechanismus, um sich in der Nähe der Entzündungsstelle anheften zu können. Hierfür werden die Adhäsionsmoleküle auf den Oberflächen der Endothelzellen in der Umgebung einer Gewebeentzündung exprimiert.
  • Eine Reihe von unterschiedlichen Adhäsionsmolekülstrukturen wurde identifiziert und charakterisiert. Die Liste umfasst das endotheliale Leukocyten-Adhäsionsmolekül (ELAM), das intrazelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM), das endotheliale Thrombocyten-Zelladhäsionsmolekül (PECAM) und das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül (VCAM).
  • Ko-stimulierende Faktoren sind dem Fachmann bekannt. Die Bedeutung der Ko-Stimulation ist bekannt (Übersicht von Schwartz, 1992). Ein Beispiel eines kostimulierenden Faktors ist B7 (Chen, L., et al., 1992).
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine allogene Vakzine bereit, die eine genetisch manipulierte Zelle umfasst, die mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, wobei das Immunmolekül ein ko-stimulierender Faktor ist. In einer weiteren Ausführungsform ist der ko-stimulierende Faktor B7/BB1 (CD80) oder B70/B7-2 (Clark, E. A., et al., (Feb. 1994), Nature 367: 425–428).
  • Sowohl tumorassoziierte als auch tumorspezifische Antigene sind dem Fachmann bekannt. Tumorassoziierte Antigene liegen nicht nur in einer bestimmten Art von Tumor vor. Ein Beispiel eines tumorassoziierten Antigens ist das Melanomassoziierte Antigen E-1 (MAGE-1). MAGE-1 ist nicht nur auf einem Melanom zu finden, sondern auch auf Brustkrebs. Dagegen werden tumorspezifische Antigene nur auf den Tumorzellen gefunden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin den vorstehend beschriebenen retroviralen Vektor bereit, in dem der Promotor aus der Gruppe stammt, die aus dem ADA-Gen, dem TK-Gen und dem CMV-Gen besteht. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht nur auf diejenigen Promotoren beschränkt, die von den ADA-, TK- und CMV-Genen stammen. Dem Fachmann sind verschiedene Promotorsequenzen bekannt, die in der beanspruchten Erfindung eingesetzt werden können.
  • In einer Ausführungsform ist der Promotor vom ADA-Gen hergeleitet. In einer anderen Ausführungsform ist das Immunmolekül ein Cytokin. In einer weiteren Ausführungsform ist das Cytokin Interleukin. In einer anderen Ausführungsform ist das Cytokin Interleukin-2.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen retroviralen Vektor bereit, der die folgenden Bestandteile umfasst: (a) ein 3'-LTR; und (b) eine Insertion, umfassend (i) einen Promotor, (ii) eine Sequenz, die ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, kostimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und (iii) ein Poly-A-Signal, wobei der Promotor, die ein Immunmolekül codierende Sequenz und das Poly-A-Signal in einer 5'- nach 3'-Orientierung angeordnet sind, wobei die Insertion innerhalb des 3'-LTR in einer Orientierung angeordnet ist, die entgegen der Orientierung des 3'-LTR ist, wobei die Promotorsequenz von dem ADA-Gen hergeleitet ist und wobei die Sequenz, die ein Immunmolekül codiert, das Interleukin-2 codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Retrovirus mit DC/AD/R/IL2 bezeichnet, und das IL2-Gen ist in dem DC/AD/R/IL2 enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine retrovirale Säuger-Erzeugerzelle bereit, die eine retrovirale Verpackungszelle und einen retroviralen Vektor umfasst, umfassend (a) ein 3'-LTR; und (b) eine Insertion, enthaltend (i) einen Promotor, (ii) eine Sequenz, die ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und (iii) ein Poly-A-Signal, wobei der Promotor, die ein Immunmolekül codierende Sequenz und das Poly-A-Signal in einer 5'- nach 3'-Orientierung angeordnet sind, wobei die Insertion innerhalb des 3'-LTR in einer Orientierung angeordnet ist, die entgegen der Orientierung des 3'-LTR ist.
  • In einer Ausführungsform umfasst die vorstehend beschriebene retrovirale Säuger-Erzeugerzelle den retroviralen Vektor DC/AD/R/IL2.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die retrovirale Verpackungszelle AM12. In einer anderen Ausführungsform ist die vorstehend beschriebene retrovirale Säuger-Erzeugerzelle mit AD/IL2/AM12 # 12 (DC/AD/R/IL2/AM12 # 12, ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11210) bezeichnet, die den retroviralen Vektor DC/AD/R/IL2 und die Verpackungszelle AM12 umfasst.
  • Diese Zelllinie, AD/IL2/AM12 # 12 (DC/AD/R/IL2/AM12 # 12), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 1. Dezember 1992 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie AD/IL2/AM12 # 12 (DC/AD/R/IL2/AM12 # 12) erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11210.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Tumorzelle bereit, die mit dem Retrovirus infiziert ist, der durch die vorstehend beschriebene retrovirale Säuger-Erzeugerzelle produziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Tumorzelle bereit, die mit dem Retrovirus infiziert ist, der durch die retrovirale Säuger-Erzeugerzelle produziert wird, die mit AD/IL2/AM12 # 12 bezeichnet ist.
  • Andere Tumorzellen könnten durch Viren infiziert werden, die durch die vorstehend beschriebene retrovirale Säuger-Erzeugerzelle erzeugt werden. In einer Ausführungsform ist eine Tumorzelle aus der Gruppe ausgewählt, die aus Melanomzellen, Nierenkrebszellen, Brusttumorzellen und Gehirntumorzellen besteht.
  • In einer anderen Ausführungsform stammt die infizierte Tumorzelle von einem Melanom. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Tumorzelle mit SK-MEL-29/AD/IL2 bezeichnet (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11208).
  • Diese Zelllinie, SK-MEL-29/AD/IL2 (SK-MEL-29/IL2), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 1. Dezember 1992 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie SK-MEL-29/AD/IL2 erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11208.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine infizierte Tumorzelle bereit, wobei die Tumorzelle von einem Nierenkrebs stammt. In einer Ausführungsform ist die Tumorzelle mit SK-RC-28/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11209).
  • Diese Zelllinie, SK-RC-28/AD/IL2 (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 1. Dezember 1992 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie SK-RC-28/AD/IL2 erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11209.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Tumorzelle mit SK-RC-39/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11210).
  • Diese Zelllinie, SK-RC-39/AD/IL2 (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 1. Dezember 1992 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie SK-RC-39/AD/IL2 erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11210.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine genetisch manipulierte Tumorzelle bereit, die eingesetzt werden kann, um einen bösartigen Tumor bei einem Patienten zu behandeln oder zu verhindern, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, kostimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf den Patienten allogen ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytokine, Adhäsionsmoleküle, ko-stimulierende Faktoren, tumorassoziierte Antigene und tumorspezifische Antigene umfasst, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird.
  • In der vorliegenden Erfindung ist eine „genetische Manipulation" als eine Modifikation der bestehenden genetischen Ausstattung, die in der Zelle vorliegt, durch Einfügen eines exogenen genetischen Materials definiert. Die Verfahren, mit denen eine solche Modifikation erreicht werden kann, sind dem Fachmann bekannt. Z. B. kann exogenes DNA-Material durch die Technologie der Calciumphosphat- Fällung in die Zelle eingeführt werden. Auch andere Technologien können eingesetzt werden, z. B. die Technologie unter Verwendung eines retroviralen Vektors, die Elektroporation, Lipofektion, andere virale Vektorsysteme, z. B. ein Adenoassoziiertes Virussystem, oder die Mikroinjektion. Das Ergebnis einer solchen genetischen Manipulation besteht darin, dass die genetisch manipulierte Zelle nun in der Lage ist, ein bestimmtes Genprodukt zu exprimieren, das vorher nicht exprimiert wurde.
  • Der Begriff „allogen" bedeutet aus der gleichen Art. Allogene Zellen sind Zellen, die aus der gleichen Art stammen, die jedoch antigen verschieden sind. In einer Ausführungsform stimmen die Zellen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgewählt sind, in einigen oder allen Menschlichen Lymphocyten-Antigenen (Human Lymphocytic Antigen, HLA) mit den geimpften Patienten überein. Dabei können unterschiedliche Grade an Übereinstimmung verwendet werden. Da es z. B. die Klassen I und II der HLA-Moleküle gibt und da innerhalb der Klasse I die Unterklassen A, B und C vorliegen, kann die Übereinstimmung beliebige, eine oder alle Unterklassen betreffen, und da es innerhalb der Klasse II DR, DP und DQ gibt, kann die Übereinstimmung beliebige, eine oder alle diese Unterklassen betreffen. Ein Fachmann wird in der Lage sein, Experimente so zu gestalten, dass getestet werden kann, welche Übereinstimmung zu optimalen Effekten führen wird. Ein solches Experiment besteht darin, verschieden Gruppen von Tieren/Patienten mit unterschiedlichen Graden von Übereinstimmung zu inokulieren und danach mit dem Tumor zu provozieren, um die Wirkung zu untersuchen. Andererseits kann der Test auch an Tumorpatienten durchgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem die genetisch manipulierte Zelle eine nicht-professionelle antigenpräsentierende Zelle ist.
  • In der vorliegenden Erfindung sind die nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen als Zellen definiert, die normalerweise nicht verwendet werden, um ein Antigen zu präsentieren, so dass eine Immunantwort gegen dieses Antigen erzeugt wird. Beispiele von nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen sind Tumorzellen und Fibroblasten. Die nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen sind dem Fachmann bekannt.
  • Die nicht-professionellen antigenpräsentierenden Zellen können andere Tumorzellen umfassen, z. B. Zellen, die aus einem Prostatakrebs, Lymphom, Kolonkrebs und Blasenkrebs stammen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem die genetisch manipulierte Zelle eine nicht-professionelle antigen präsentierende Zelle ist, die eine Tumorzelle ist. In einer Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Melanom. In einer anderen Ausführungsform ist die Melanomzelle SK-MEL-29.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum umfasst, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf den Patienten allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei das Immunmolekül ein Cytokin darstellt, das Interleukin-2 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die genetisch manipulierte Zelle mit SK-MEL-29/AD/IL2 bezeichnet (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11208).
  • In einer anderen Ausführungsform kann die genetisch manipulierte Zelle von SK-MEL-131 hergeleitet sein.
  • In einer Ausführungsform stellt das Immunmolekül ein Cytokin dar, das Interferon-gamma ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die genetisch manipulierte Zelle mit DC/TKHIFNγ/MEL131 bezeichnet (SK-MEL-131/DC/TK/IFNγ, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11255).
  • Diese Zelllinie, DC/TKHIFNγ/MEL131 (SK-MEL-131/DC/TKIFNγ) wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 2. Februar 1993 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie DC/TKHIFNγ/MEL-131 erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11255.
  • In einer anderen Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Nierenkrebs. In einer weiteren Ausführungsform ist die Nierenkrebszelle SK-RC-28. Die vorliegende Erfindung stellt das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem das Immunmolekül ein Cytokin darstellt, das Interleukin-2 ist.
  • In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist die genetisch manipulierte Zelle mit SK-RC-28/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11209).
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Nierenkrebszelle SK-RC-39. In einer weiteren Ausführungsform stellt das Immunmolekül ein Cytokin dar, das Interleukin-2 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist die genetisch manipulierte Zelle mit SK-RC-39/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11210).
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren kann mit einer Tumorzelle durchgeführt werden, die von einem Brusttumor, einem Blasentumor und einem Gehirntumor stammt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem das Immunmolekül Interleukin-2 ist und das Interleukin-2 ein Interleukin-2 ist, das in DC/AD/R/IL2 enthalten ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem das Cytokin ein Interferon ist. In einer Ausführungsform ist das Interferon Interferon-gamma. In einer anderen Ausführungsform ist das Cytokin GM-CSF. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin als auch Interferon. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin-2 als auch Interterongamma. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle entweder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen oder beide und mindestens ein Cytokin.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem das Immunmolekül einen ko-stimulierenden Faktor darstellt, der B7/BB1 (CD80) oder B70/B7-2 ist (Clark, E. A., et al., (Feb. 1994), Nature 367: 425-428). In einer anderen Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das tumorassoziierte Antigen das melanomassoziierte Antigen E-1.
  • In einer Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Melanom. In einer weiteren Ausführungsform ist die Tumorzelle von einem Nierenkrebs hergeleitet. In einer weiteren Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Brustkrebs. In einer weiteren Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Gehirnkrebs.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das verwendete Cytokin GM-CSF.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, das (a) die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum umfasst, die mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsproteinen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und (b) die in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist.
  • In der vorliegenden Erfindung sind mit der professionellen antigenpräsentierenden Zelle diejenigen Zellen gemeint, die normalerweise ein Antigen präsentieren, um eine Immunantwort zu erzeugen. Ein Beispiel von solchen Zellen stellen die dendritischen Zellen wie die Langerhans-Zellen oder Makrophagen dar (Vidard et al., 1992).
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist, z. B. eine normale B-Zelle, ein peritonealer Makrophage oder andere antigenpräsentierende Zellen der Milz.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist und das Cytokin ein Interleukin darstellt. Ein Beispiel eines solchen Interleukins ist Interleukin-2.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist und das Cytokin ein Interferon darstellt. Ein Beispiel eines solchen Interferons ist Interferon-gamma.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Behandlung eines bösartigen Tumors bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Proliferation des bösartigen Tumors gehemmt wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist und sowohl Interleukin als auch Interferon exprimiert. In einer Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin-2 als auch Interferon-gamma. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle entweder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen oder beide und mindestens ein Cytokin.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können unterschiedliche wirksame Mengen der genetisch manipulierten Zellen eingesetzt werden. Ein Fachmann kann einfache Titrationsexperimente durchführen, um die wirksame Menge zu bestimmen, die für eine wirksame Immunisierung erforderlich ist. Ein Beispiel eines solchen Titrationsexperiments besteht darin, unterschiedliche Mengen der allogenen Vakzine dem Patienten zu injizieren und danach die Immunantwort zu testen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens werden etwa zehn bis 50 Millionen genetisch manipulierte Zellen an das Individuum verabreicht.
  • Dem Fachmann ist bekannt, dass andere Nebenwirkungen in Betracht gezogen werden müssen, wenn die wirksame Menge der Reagenzien bestimmt wird.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet „pharmazeutisch verträglicher Träger" einen beliebigen herkömmlichen pharmazeutischen Träger. Beispiele eines geeigneten Trägers sind dem Fachmann bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf beliebige der herkömmlichen pharmazeutischen Vehikel, z. B. Lösungen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, eine Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, enthaltend Polysorb 80, Wasser, Emulsionen, z. B. eine Öl/Wasser-Emulsion, und verschiedene Typen von Fechthaltemitteln.
  • Die genetisch manipulierten Zellen der vorliegenden Erfindung können intradermal, subkutan und intramuskulär verabreicht werden. Außerdem können noch andere Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Tumorbildung verhindert wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bei einem Individuum bereit, in dem die genetisch manipulierte Zelle eine nicht-professionelle antigenpräsentierende Zelle ist. In einer Ausführungsform ist die nicht-professionelle antigenpräsentierende Zelle eine Tumorzelle. In einer anderen Ausführungsform stammt die Tumorzelle von einem Melanom. In einer weiteren Ausführungsform ist die Melanomzelle SK-MEL-29.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem das Cytokin Interleukin-2 ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem die genetisch manipulierte Zelle mit SK-MEL-29/AD/IL2 bezeichnet ist (SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11208).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem die Melanomzelle SK-MEL-131 ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem das Interferon Interferon-gamma ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens zur Verhinderung einer Tumorbildung ist die genetisch manipulierte Zelle mit DC/TKHIFNγ bezeichnet (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11255).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem die Tumorzelle von einem Nierenkrebs stammt. In einer Ausführungsform ist die Nierenkrebszelle SK-RC-28.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens zur Verhinderung einer Tumorbildung ist die genetisch manipulierte Zelle mit SK-RC-28/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-28/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11209).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem die Nierenkrebszelle SK-RC-39 ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bereit, in dem das Cytokin Interleukin-2 ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens zur Verhinderung einer Tumorbildung ist die genetisch manipulierte Zelle mit SK-RC-39/AD/IL2 bezeichnet (SK-RC-39/DC/AD/R/IL2, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11210).
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahrens zur Verhinderung einer Tumorbildung stammt die Tumorzelle von einem Brustkrebs oder von einem Gehirnkrebs.
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahrens zur Verhinderung einer Tumorbildung ist das Interleukin-2 das in DC/AD/R/IL2 enthaltene Interleukin-2.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden beanspruchten Erfindung zur Verhinderung einer Tumorbildung ist das Cytokin ein Interferon. In einer weiteren Ausführungsform ist das Interferon Interferon-gamma. In einer anderen Ausführungsform ist das Cytokin GM-CSF. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden beanspruchten Erfindung zur Verhinderung einer Tumorbildung exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin als auch Interferon. In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin-2 als auch Interferon-gamma.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden beanspruchten Erfindung zur Verhinderung einer Tumorbildung exprimiert die genetisch manipulierte Zelle entweder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen oder beide und mindestens ein Cytokin.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden beanspruchten Erfindung zur Verhinderung einer Tumorbildung stellt das Immunmolekül einen kostimulierenden Faktor dar, der B7/BB1 (CD80) oder B70/B7-2 ist (Clark, E. A., et al., (Feb. 1994), Nature 367: 425-428).
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Immunmolekül ein tumorassoziiertes Antigen. In einer weiteren Ausführungsform ist das tumorassoziierte Antigen das melanomassoziierte Antigen E-1.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verhinderung einer Tumorbildung bei einem Individuum bereit, umfassend die Verabreichung einer Vielzahl von einer genetisch manipulierten Zelle an das Individuum, die (a) mindestens ein Immunmolekül exprimiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cytokinen, Adhäsionsmolekülen, ko-stimulierenden Faktoren, tumorassoziierten Antigenen und tumorspezifischen Antigenen besteht, und die (b) in Bezug auf das Individuum allogen ist, so dass die Tumorbildung verhindert wird, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist.
  • In einer Ausführungsform ist die professionelle antigenpräsentierende Zelle eine dendritische Zelle. In einer anderen Ausführungsform ist das Cytokin, das in der professionellen antigenpräsentierenden Zelle exprimiert wird, entweder ein Interleukin oder ein Interferon. In einer weiteren Ausführungsform ist das Interleukin Interleukin-2. In einer weiteren Ausführungsform ist das Interferon Interferon-gamma.
  • In einer weiteren Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl ein Interleukin als auch ein Interferon.
  • In einer Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle sowohl Interleukin-2 als auch Interferon-gamma. In einer anderen Ausführungsform exprimiert die genetisch manipulierte Zelle entweder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen oder beide und mindestens ein Cytokin. In einer weiteren Ausführungsform werden etwa zehn bis 50 Millionen genetisch manipulierte Zellen an das Individuum verabreicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung der genetisch manipulierten Zellen bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren.
  • Ein Fachmann wird in der Lage sein, ein geeignetes Präparat von genetisch manipulierten Zellen auszuwählen, die synthetisiert werden, indem mindestens ein Gen, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen eingeführt wird und die erhaltenen Zellen auf die Expression des eingeführten Gens getestet werden. Ein Kriterium für eine solche Selektion kann die Anzahl der Zellen sein, die das eingeführte Gen exprimieren. Ein weiteres Kriterium kann das Ausmaß der Expression des eingeführten Gens in den Zellen sein. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl von Zellen, die das eingeführte Gen enthalten, sind dem Fachmann bekannt. Außerdem sind Verfahren bekannt, mit denen die Expression des Gens in der Zelle quantitativ bestimmt werden kann.
  • Der Begriff „exprimieren" bedeutet in der vorliegenden Erfindung nicht nur eine stabile Expression, sondern auch eine transiente Expression. Diese Erfindung ist nicht auf Zellen beschränkt, die mindestens ein Gen stabil exprimieren können, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, sondern sie betrifft auch Zellen, die das eingeführte Gen oder die eingeführten Gene transient exprimieren.
  • Die vorliegenden Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, die zur Behandlung von bösartigen Tumoren oder zur Verhinderung einer Tumorbildung eingesetzt werden kann, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in eine Zelle; b) Testen der erhaltenen Zelle auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, und wobei es weiterhin das Isolieren der Zelle umfasst, die das eingeführte Gen stabil enthält. Verfahren zum Isolieren solcher Zellen sind dem Fachmann bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, in dem Schritt a) weiterhin folgendes umfasst: i) Clonieren mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in einen retroviralen Vektor, ii) Transfizieren des Vektors in eine Verpackungszelle, wodurch eine Erzeugerzelllinie hergestellt wird, die ein Virus produziert, das das Cytokin- oder Adhäsionsmolekül-Gen oder ein kostimulierendes Gen enthält, und iii) Transduzieren einer Zelle mit dem in ii) produzierten Virus.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, in dem der Vektor aus der Gruppe ausgewählt ist, die im Wesentlichen aus AD, DC und N2 besteht. Genauso können auch andere retrovirale Vektoren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle unter Verwendung der Verpackungszelle AM12 bereit. Außerdem können auch andere Verpackungszellen eingesetzt werden, die sind dem Fachmann sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der verwendete Vektor AD, und das Cytokin ist IL2. Die hergestellte Erzeugerlinie ist mit AD/IL2/AM12 # 12 (DC/AD/R/IL2/AM12 # 12) bezeichnet.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle ist der verwendete Vektor DC, und das Cytokin ist Interferon-gamma. Die hergestellte Erzeugerlinie ist mit DC/TKHIFNγ/AM12 # 6 (DC/TKIFNγ/AM12 # 6) bezeichnet. Diese Zelllinie, DC/TKHIFNγ/AM12 # 6 (DC/TKIFNγ/AM12 # 6), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 2. Februar 1992 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie DC/TKHIFNγ/AM12 # 6 (DC/TKIFNγ/AM12 # 6) erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11256.
  • In einer anderen Ausführungsform für dieses Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle ist der verwendete Vektor N2, und das Cytokin ist Interferon-gamma. Die hergestellte Erzeugerlinie ist mit N2/CMVHIFNγ/AM12 # 5 (N2/CMVIFNVγ/AM12 # 5) bezeichnet. Diese Zelllinie, N2/CMVHIFNγ/AM12 # 5 (N2/CMVIFNVγ/AM12 # 5), wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 2. Februar 1993 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie N2/CMVHIFNγ/AM12 # 5 (N2/CMVIFNVγ/AM12 # 5) erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11257.
  • In einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle ist der verwendete Vektor N2, und das Cytokin ist Granulocyten-Makrophagen koloniestimulierender Faktor (GM-CSF). Die hergestellte Erzeugerlinie ist mit N2/CMVHGM-CSF/AM12 # 8 bezeichnet. Diese Zelllinie N2/CMVHGM-CSF/AM12 # 8 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 2. Februar 1993 nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Die Zelllinie N2/CMVHGM-CSF/AM12 # 8 erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11258.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in eine Zelle; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren. Die Verfahren zum Einführen eines Gens in eine Zelle sind nach dem Stand der Technik schon bekannt und sollten nicht auf das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung eines retroviralen Vektors beschränkt sein. Andere Verfahren wie Transfektion durch eine Calciumphosphat-Fällung, Lipofektion, Mikroinjektion und andere vitale Vektorsysteme sind in der vorliegenden Erfindung enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gen durch Elektroporation in die Zelle eingeführt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; und b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei die Zelle entweder eine nichtprofessionelle antigenpräsentierende Zelle oder eine professionelle antigenpräsentierende Zelle ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, wobei die nicht-professionelle antigenpräsentierende Zelle eine Tumorzelle ist. Tumorzellen sind dem Fachmann bekannt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist die Tumorzelle aus einer Gruppe ausgewählt, die im Wesentlichen aus SK-MEL-29, SK-MEL-131, SK-RC-28 und SK-RC-39 besteht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; und b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei das Cytokin aus einer Gruppe ausgewählt ist, die im Wesentlichen aus IL2, Interferon-gamma und GM-CSF besteht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zell-Vakzine bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei die Zellen entweder professionelle antigenpräsentierende Zellen oder nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen sind und sowohl ein Interleukin-Gen als auch ein Interferon-Gen in die Zellen eingeführt werden. Ein solches Interleukin-Gen ist das Interleukin-2-Gen, und ein solches Interferon-Gen ist das Interferon-gamma-Gen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei die Zellen entweder professionelle antigenpräsentierende Zellen oder nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen sind und wobei entweder ein tumorassoziiertes Antigen- oder ein tumorspezifisches Antigen- oder beide und ein Cytokin-Gen in die Zellen eingeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei die Zellen entweder professionelle antigenpräsentierende Zellen oder nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen sind und wobei das eingeführte Gen B7/BB1 (CD80) oder B70/B7-2 codiert (Clark, E. A., et al., (Feb. 1994), Nature 367: 425-428).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch manipulierten Zelle bereit, das die folgenden Schritte umfasst: a) Einführen mindestens eines Gens, das ein Immunmolekül codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Cytokin, Adhäsionsmolekül, ko-stimulierenden Faktor, tumorassoziierten Antigen und tumorspezifischen Antigen besteht, in Zellen; b) Testen der Zellen auf die Expression des eingeführten Gens; und c) Selektieren der Zellen, die das eingeführte Gen exprimieren, wobei die Zellen entweder professionelle antigenpräsentierende Zellen oder nicht-professionelle antigenpräsentierende Zellen sind und wobei das eingeführte Gen das melanomassoziierte Antigen E-1 codiert.
  • In der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Vakzine" in diesem Zusammenhang als die Antigenquelle für die Aktivierung von Immunantworten gegen etablierte Tumoren und für eine prophylaktische Immunisierung verwendet. Somit können die genetisch manipulierten Zellen, die in dieser Erfindung beansprucht werden, als Vakzine bezeichnet werden.
  • Die vorliegende Erfindung lässt sich anhand der nachstehenden Experimentellen Einzelheiten noch besser verstehen. Für den Fachmann wird es jedoch klar sein, dass die angegebenen spezifischen Verfahren und Ergebnisse lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen sollen, die in den beiliegenden Patentansprüchen noch vollständiger beschrieben ist.
  • Experimentelle Einzelheiten
  • Erste Serie von Experimenten
  • Der retrovirale Gentransfer induzierte eine konstitutive Expression von IL-2 oder
  • IFN-γ in bestrahlten menschlichen Melanomzellen
  • Die Ergebnisse dieser Serie von Experimenten zeigen, dass Melanomzellen diese Cytokine nach dem retroviral vermittelten Gentransfer stabil sekretieren. Außerdem blieb die Lymphokin-Sekretion nach der Bestrahlung der Zellen bestehen, wobei es sich um eine wichtige Vorsichtsmaßnahme handelt, wenn diese Zellen in klinischen Studien in vivo injiziert werden. Schließlich zeigen diese Cytokine in Nacktmäusen in vitro und in vivo eine biologische Wirkung. Diese Ergebnisse stellen eine logische Grundlage für die Entwicklung von Vorgehensweisen zur aktiven Immuntherapie bei Menschen bereit.
  • Material und Methoden
  • Zelllinien und Gewebekultur
  • Für diese Studie wurden fünf menschliche Melanomzelllinien ausgewählt. Die Zelllinien SK-MEL-19, -29, -131, -245, -256 wurden aus primären Tumorproben oder metastatischen Läsionen angelegt, wobei sie aus einer Zellbank stammten (Houghton et al., 1982; Houghton et al., 1984; Houghton et al., 1987). Die Zelllinien wurden gezüchtet in minimalem essentiellem Eagle-Medium (MEM), 2 mM Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, angereichert mit 10% fetalem Rinderserum (FBS). Die Kulturen wurden regelmäßig auf Mycoplasma getestet.
  • Design retroviraler Vektoren und Infektion von Tumorzellen
  • Die retroviralen Vektoren N2/IL2, DC/TK/IL2, N2/CMVIL2 und DCA, die in diesem Projekt eingesetzt wurden, sind identisch mit den Vektoren, die in dem früheren murinen Fibrosarkom-Tumormodell verwendet wurden (Gansbacher et al., 1990b). DC/AD/R/IL2 wurde hergestellt, indem ein Minigen, enthaltend den menschlichen ADA-Promotor, die menschliche IL-2-cDNA und die Poly-A-Sequenzen in das 3'-LTR in umgekehrter Orientierung cloniert wurden. Der ADA-Promotor ist ein 832-bp-Fragment, das aus dem menschlichen ADA-Gen durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Sspl und Ncol hergeleitet wurde, und wurde in umgekehrter Orientierung in die Klenow-behandelte Mlu-I-Stelle cloniert. Das Poly-A-Signal, enthaltend ein 275 by langes SmaI-Alul-Fragment, stammte aus dem Plasmid PBS/CMV/IL2 und wurde in die Klenow-behandelte Apal-Stelle des 3'-LTR-Polylinkers cloniert (Cullen et al., 1988). Die menschliche IL-2-cDNA, die für dieses Konstrukt verwendet wurde, wurde durch PCR aus peripheren Lymphocyten eines gesunden Freiwilligen cloniert. Die Sequenzierung der IL-2-cDNA deckte eine polymorphe Stelle in der Position 456 (G für A) auf, die zu keiner Änderung in der Aminosäuresequenz führt. Retrovirale Vektorkonstrukte wurden in das entsprechende Virus umgewandelt, wobei eingeführte Verfahren verwendet wurden. Kurz gesagt wurde die Vektor-DNA (N2/IL2, DC/TKIL2, DC/TKIFNγ, N2/CMVIL2, N2/CMVIFNγ, DCA und DC/AD/R/IL2) in eine Helfer-freie, amphotrope Verpackungszelllinie transfiziert (Markowitz et al., 1988; Markowitz et al., 1988). Die Kolonien wurden durch eine G418-Selektion isoliert, sodann zu Zelllinien expandiert, und der zellfreie Überstand wurde auf das Vorliegen des Virus getestet. Diejenigen Zelllinien, die hohe Titer des Virus absonderten (105 bis 106 Neokolonien bildende Einheiten pro ml), wurden zum Infizieren von Melanomzelllinien verwendet. Die gesamten („bulk") und die clonalen Derivate von Melanomzellen wurden durch eine G418-Selektion isoliert, sodann zu Zelllinien expandiert, und die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ in den Zellüberstand wurde gemessen. Die Abwesenheit eines replikationskompetenten Virus in den Cytokin-produzierenden Melanomzellen wurde durch die Unfähigkeit, die G418-Resistenz auf NIH3T3-Zellen zu übertragen, und durch einen negativen Test auf die reverse Transkriptase in den HeLa- und NIH3T3-Amplifikationstests gezeigt.
  • Southern- und Northern-Blotting
  • Die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus den Tumorzellen durch herkömmliche Verfahren hergestellt, umfassend Natriumdodecylsulfat (SDS), Spaltung mit Proteinkinase, Phenolextraktion und Ethanolfällung. Jede Analyse wurde mit 10 μg DNA durchgeführt. Die Proben wurden einer Elektrophorese untennrorfen und auf ein Nylon-Filter überführt (Biotrans, ICN). Die Filter wurden unter Verwendung der NeoR-Sonde hybridisiert, die durch ein Random-Primer-Verfahren markiert worden war (Feinberg et al., 1983). Nach der Hybridisierung wurden die Filter gewaschen und mit Kodak-XAR-Röntgenfilmen in Kontakt gebracht.
  • Die Poly-A-RNA wurde aus der gesamten zellulären RNA anhand von Oligo(dT)-Cellulose-Säulen hergestellt. Die RNA wurde auf einem 1% Agarose-Gel, das Formaldehyd enthielt, nach der Größe fraktioniert, danach auf ein Nylon-Filter (Biotrans, ICN) überführt und mit dem Filter durch UV vernetzt. Die Hybridisierung wurde 24 Stunden durchgeführt, wie früher beschrieben (Gansbacher et al., 1989), indem eine cDNA-Sonde für U3 verwendet wurde, die durch das Random-Primer-Verfahren markiert worden war (Feinberg et al., 1983). Das Filter wurde unter stringenten Bedingungen gewaschen, trocken getupft, in Saran-Wrap eingewickelt und bei –70°C mit einem Kodak-XAR-Röntgenfilm unter Verwendung eines Verstärkungsschirms in Kontakt gebracht.
  • Test auf IL-2
  • Die Überstände von 2 × 106 semikonfluenten nicht-modifizierten oder IL-2-sekretierenden Zellen wurden nach 24 bis 48 Stunden gewonnen und auf menschliches IL-2 getestet. Präparate von IL-2 wurden auf die biologische Aktivität getestet, indem in einem Proliferationstest ihre Fähigkeit ermittelt wurde, den Einbau von 3H-Thymidin (TdR) in die DNA von IL-2-abhängigen gezüchteten T-Zellen (CTC) zu induzieren, wie früher beschrieben (Zier, 1982). Die Einheiten sind in Cetus-Units angegeben. Die Ergebnisse wurden durch einen Immuntest unter Verwendung eines ELISA-Kits (Genzyme) bestätigt. Kurz gesagt wurden 50 000 CTC mit seriellen Verdünnungen der Testproben gemischt und bei 37°C in 5% CO2 gezüchtet. Nach etwa 60 Stunden wurden die Kulturen die letzten 12 Stunden der Züchtung mit 1 μCi 3H-TdR(New England Nuclear, spezifische Aktivität 6,7 Ci/μM) gepulst.
  • Test auf menschliches IFN-γ
  • Die Überstände wurden in einem Biotest auf IFN-γ analysiert, dieser Test beruhte auf der antiviralen Aktivität im Überstand der Zellkultur, die durch die Reduktion der cytopathischen Effekte des vesikulären Stomatitis-Virus auf WISH-Zellen bestimmt wurde (Rubinstein et al., 1987). Die Ergebnisse wurden anhand eines im Handel verfügbaren Radioimmuntests (RIA) auf menschliches IFN-γ (Centocor, Malvern, PA) bestätigt. Die biologische Aktivität des menschlichen IFN-γ im Überstand wurde durch einen neutralisierenden murinen monoclonalen Antikörper blockiert, der für menschliches IFN-γ spezifisch war (Olympus Corp., Lake Success, NY).
  • Durchflusscytometrie
  • 200 000 Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 2% FBS, 0,02% Natiumazid, resuspendiert und auf Mikrotiter-Vertiefungen verteilt. Die Zellen wurden zentrifugiert und der Überstand abgegossen. Danach wurden 100 μl pro 106 Zellen des verdünnten monoclonalen Antikörpers W6/32 zugegeben, der gegen eine monomorphe Determinante auf dem MHC-Molekül der Klasse I gerichtet war, und die Zellen 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 100 μl kalter PBS, wie vorstehend beschrieben, gewaschen, und nach vorsichtigem Aufbrechen des Zellpellets wurde zu jeder Probe 100 μl/106 Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-) konjugiertes Anti-Maus-IgG der Ziege zugegeben. Die Zellen wurden auf Eis im Dunkeln weitere 30 Minuten inkubiert und, wie vorstehend beschrieben, gewaschen. Danach wurden sie sofort auf die prozentuale Fluoreszenz analysiert, indem ein Epics C-Cytometer, ausgestattet mit logarithmischen Verstärkern, für die Fluoreszenzmessungen eingesetzt wurde. Die Fluoreszenz, die von abgestorbenen Zellen stammte, wurde durch Ausschluss eines Schwellenwerts von Vorwärts- und 90°-Streulicht-Signalen eliminiert (Gansbacher et al., 1986).
  • Bestrahlung
  • Parentale und Lymphokin-sekretierende Melanomzellen wurden bei Raumtemperatur mit dem Linearbeschleuniger 6 MV Varian CL6-100 bei einer Dosisrate von 100 Rad/Min. bestrahlt und danach in mehreren 60-mm-Platten bei identischen Konzentrationen plattiert. Die bestrahlten Zellen wurden bei 37°C in einer 5% CO2-Atmosphäre gezüchtet. Die Zellen wurden alle drei bis vier Tage mit 3 ml pro Platte eines frischen RPMI-Mediums, das 10% FCS enthielt, neu gefüttert und die Überstände zu den angegebenen Zeitpunkten gewonnen. Das verbrauchte Medium wurde bei –20°C eingefroren, bis es verwendet wurde. Nachdem die Überstände abgenommen worden waren, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und gezählt.
  • Test zum Nachweis von replikationskompetenten murinen Retroviren Ein ml der zu testenden Probe wurde mit 3 ml DMEM, 10% FCS, 5 mM Glutamin und Polybrene, 8 μg/ml, gemischt, und anschließend das Ganze zu einer 60-mm-Platte zugegeben, die 105 NIH3T3-Zellen enthielt, die vorher über 12 Stunden einer Passage unterzogen worden waren. Die infizierten NIH3T3-Zellen wurden 21 Tage gezüchtet, wobei die Zellen alle drei Tage mit einer Verdünnung von 1 : 5 Passagen unterzogen wurden. Die eine Hälfte dieser Zellpopulation wurde auf eine G418-Resistenz getestet, und aus der anderen Probe wurde der Überstand gewonnen, mit dem die Aktivität der reversen Transkriptase bestimmt wurde. Die Aktivität der reversen Transkriptase wurde bestimmt, indem 10 μl des Probenmediums mit 40 μl 50 mM Tris, pH 8,0, 20 mM DTT, 0,6 mM MnCl2, 60 mM NaCl, 0,05% NP, 5 μg/ml Oligo-dT, 10 μg/ml Poly-A, 62 μM dTTP, 10 μM 32P-dTTP (3000 Ci/mMol) eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Das Medium alleine wurde als negative Kontrolle verwendet, um die Hintergrund-Aktivität zu bestimmen. Anschließend wurden 10 μl des Reaktionsgemisches auf eine DEAE DE 81 Filterscheibe getüpfelt, zweimal 15 Minuten bei 25°C mit 2X SSC gewaschen, sodann mit 95% Ethanol gespült und an der Luft getrocknet. Die Radioaktivität des Filters wurde gemessen, indem es drei bis fünf Stunden mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht wurde, anschließend erfolgte die quantitative Bestimmung durch Szintillationszählung.
  • Ergebnisse
  • Herstellung von Tumorzelllinien, die IL-2 oder IFN-γ exprimieren
  • 1 zeigt die retroviralen Vektorkonstrukte, die eingesetzt wurden, um die menschlichen IL-2- oder IFN-γ Gene in Tumorzellen einzuführen und zu exprimieren. Alle waren von dem murinen Moloney-Leukämievirus (MLV) hergeleitet und beruhten auf dem retroviralen Vektor N2 hohen Titers, der auch das selektierbare Gen für die bakterielle Neomycin-Resistenz (Neo) enthält. In Tabelle 1 sind die fünf menschlichen Melanomzelllinien angegeben, die mit IL-2- oder IFN-γ Vektorkonstrukten transduziert wurden. Diese Zelllinien umfassen sowohl pigmentierte als auch nicht-pigmentierte Stämme, und sie stellen sowohl frühe als auch späte Stadien der Melanocyten-Differenzierung dar (Houghton et al., 1982; Houghton et al., 1984; Houghton et al., 1987). Nach der Züchtung in einem G418-enthaltenden Medium wurde die Southern-Blot-Analyse eingesetzt, um zu zeigen, dass ein intaktes Provirus vorlag. Eine Southern-Blot-Analyse von SK-MEL-29-Zellen, die mit DC/AD/R/IL2 transduziert waren, ist in 2 dargestellt, wobei gezeigt wird, dass die Provirus-DNA in einer nicht-umpelagerten Form eingebaut war und dass die Übertragung der Minieinheit vom 3'- zum 5'-LTR stattgefunden hat. Ein Northern-Blot von transduzierten SK-MEL-256, die für diejenigen repräsentativ sind, die mit drei der eingesetzten Vektoren erhalten wurden, ist in 3 dargestellt, wobei gezeigt wird, dass die transduzierten Zellen vektorspezifische RNA-Transkripte der richtigen Größe exprimierten. Diese umfassen ein ungespleißtes Transkript „V", das aus der Virion-RNA besteht, und ein gespleißtes Transkript „N", das aus der Neo-mRNA besteht, wobei beide von dem LTR hergeleitet sind, und außerdem ein kleineres Transkript „P", das von dem inneren Promotor stammt. Die nicht-infizierten Zellen exprimierten keine dieser Informationen.
  • Sekretion von IL-2 und IFN-γ durch Tumorzellen
  • Die Sekretion von IL-2 und IFN-γ durch Melanomzellen, die mit den retroviralen Vektoren transduziert worden waren, wurde bestimmt, indem für IL-2 ein Biotest und ein ELISA sowie für IFN-γ ein Biotest und ein RIA durchgeführt wurden (Tabelle 1). Tabelle 1 Sekretion von IL-2 oder IFN-γ aus Vektor-transduzierten Melanomzellen1
    Figure 00280001
    die Werte dar (die Mittelwerte von doppelten Proben), die aus dem IL-2-Biotest und dem IFN-γ-RIA erhalten wurden.
  • Die in Tabelle 1 angegebenen Daten stehen für transduzierte gesamte („bulk") infizierte Zellpopulationen. Außerdem wurden clonale Populationen isoliert und analysiert. Das durch einzelne clonale Populationen erzeugte IL-2 variierte in dem großen Bereich von 691 U/ml/106 Zellen bis 0 U/ml/106 Zellen (Tabelle 2).
  • Tabelle 2 Produktion von IL-2 durch transduzierte clonierte Melanomzellen1
    Figure 00290001
  • Wie aus früheren Ergebnissen zu erwarten war, unterschieden sich die Zelllinien in ihrer Expression und Sekretion der Cytokine, und zwar abhängig von dem bestimmten retroviralen Vektor, der verwendet wurde. In allen Fällen konnte die menschliche IL-2- oder IFN-γ Aktivität durch einen geeigneten monoclonalen Antikörper neutralisiert werden (Ergebnisse nicht gezeigt).
  • Die Melanomzellen, die mit dem Kontrollvektor DCA transduziert worden waren, sonderten keine nachweisbaren Mengen von IL-2 oder IFN-γ ab (Ergebnisse nicht dargestellt). Die Sekretion des menschlichen IL-2 oder IFN-γ hatte im Vergleich zu parentalen Zellen oder zu Zellen, die mit DCA transduziert worden waren, keine erkennbare Wirkung auf die Morphologie der Zelle, auf die Pigmentierung oder auf die Wachstumsrate in der Kultur (Ergebnisse nicht dargestellt). Einige dieser transduzierten Zelllinien wurden länger als sechs Monate in Kultur gehalten, wobei sie ständig stabile Mengen von IL-2 oder IFN-γ freisetzten.
  • Bestrahlte Melanomzellen sekretieren weiterhin IL-2
  • Im Zusammenhang mit einer Immuntherapie könnten transduzierte Zellen, die intradermal injiziert werden, sowohl als Quelle für eine kontinuierliche, örtlich begrenzte Cytokin-Produktion als auch für ein Tumorantigen dienen. Obwohl Cytokin-sekretierende Tumorzellen eine verminderte Tumorbildung zeigen und in vivo mit größter Wahrscheinlichkeit nicht wachsen würden, wurden Experimente konzipiert, mit denen getestet werden konnte, ob eine Bestrahlung dieser Zellen die Cytokin-Sekretion beeinträchtigen würde, wobei die Bestrahlung als eine weitere Vorsichtsmaßnahme dienen sollte. Die Ergebnisse zeigten, dass die Cytokin-Produktion auch nach einer Bestrahlung mit bis zu 10 000 Rad noch drei bis vier Wochen anhielt (Tabelle 3 und 4).
  • Tabelle 3 IL-2-Produktion von SK-MEL-29/DC/AD/R/IL2 nach der Bestrahlung mit 10 000 Rad1
    Figure 00300001
  • Nach der Bestrahlung nahm die Sekretion von IL-2 zu, dies ist möglicherweise auf ein verstärktes Auslaufen aus den strahlungsgeschädigten Zellen zurückzuführen (Tabelle 3). Die Dauer der IL-2-Sekretion wurde durch das Ausmaß der Bestrahlung beeinflusst, der die Zellen ausgesetzt wurden, und wurde auf diese Weise durch die Radiosensitivität jeder Zelllinie definiert. Die bestrahlten Zelllinien waren nicht fähig, in Kultur zu wachsen, dies wurde durch die Zellzahl gezeigt, die mit der Zeit abnahm (Tabelle 3). Außerdem waren die bestrahlten IL-2-sekretierenden Tumorzellen nicht in der Lage, in Nacktmäusen Tumoren zu bilden. Dies war ein Ergebnis, das in verschiedenen Tumortypen übereinstimmte. Die Sekretion von IFN-γ nach der Bestrahlung wurde nicht getestet, wobei jedoch in einem Modell eines menschlichen Nierenkrebses, das verwendet wurde, um die Wirkung der Transduktion des IFN-γ Gens zu untersuchen, die Sekretion von IFN-γ noch mehrere Wochen nach der Bestrahlung anhielt (Gastl et al., 1992). Diese Ergebnisse machen deutlich, dass es möglich ist, die Zellen letal zu bestrahlen, bevor sie in die Patienten injiziert werden, und dass sie dann noch mehrere Wochen weiterhin das Cytokin freisetzen.
  • Hinaufregulation von MHC der Klasse I durch IFN-γ
  • IFN-γ ist in der Lage, die Oberflächenexpression von MHC-Antigenen auf einer Vielzahl von Zelltypen nach oben zu regulieren (Wallach et al., 1982; Collins et al., 1984; Rosa et al., 1983). Da ein Antigen durch T-Zellen nur dann erkannt wird, wenn es im Zusammenhang mit MHC-Molekülen der Klasse I oder II präsentiert wird, kann man davon ausgehen, dass ein wichtiger Mechanismus, durch den IFN-γ seine Antitumor-Wirkung ausübt, darin besteht, die Antigenpräsentation durch eine Steigerung der MHC-Expression nach oben zu regulieren. Um zu testen, ob es eine biologische Wirkung des IFN-γ auf die MHC-Expression durch Melanomzellen gibt, wurde die Expression von MHC-Antigenen der Klasse I nach der IFN-γ Transduktion untersucht. Auf den IFN-γ sekretierenden Melanomlinien wurde eine variable Hinaufregulation des MHC der Klasse I festgestellt. In Analogie zu den für IL-2 beschriebenen Beobachtungen wurde in der Expression von IFN-γ eine große Schwankungsbreite festgestellt. Andere Forscher stellten unter Verwendung eines der in diesem Bericht beschriebenen IFN-γ Vektoren in einem experimentellen murinen System ein ähnliches Ergebnis fest (Restifo et al., 1992). MHC der Klasse 1 wurden auf parentalen SK-MEL-131-Tumorzellen vor der Infektion exprimiert, und nach der Transduktion des IFN-γ Gens waren die Spiegel nach oben reguliert worden (5). Auch SK-MEL-245 und SK-MEL-256 exprimierten auf der Zelloberfläche HLA-Moleküle der Klasse I. Die IFN-γ Sekretion induzierte eine mäßige Hinaufregulation auf den SK-MEL-245-, nicht jedoch auf den SK-MEL-256-Zellen. SK-MEL-19-Zellen exprimierten keine HLA-Moleküle der Klasse 1, und die IFN-γ Sekretion hatte keine Wirkung (5). Somit war die Hinaufregulation von Molekülen der Klasse I nach der IFN-γ Transduktion variabel, so dass die Induktion von MHC auf einer individuellen Grundlage getestet werden muss.
  • Wachstum in Nacktmäusen
  • Um Zellen zu testen, die einen bestimmten Bereich der IL-2-Sekretion abdecken, wurden für die Injektion in Nacktmäuse die Zellen SK-MEL-29 und SK-MEL-245 ausgewählt, die 40 bzw. 2 U IL-2/ml/106 Zellen absondern. Gruppen von jeweils drei BLAB/c-nu/nu-Mäusen erhielten subkutane Injektionen mit 2,5 × 105, 5 × 105 und 1 × 106 Zellen von parentalen oder von den entsprechenden gesamten IL-2-sekretierenden selektierten Melanomzellpopulationen. Alle Mäuse, denen parentale Zellen injiziert worden waren, entwickelten innerhalb von vier Wochen tastbare Tumoren, während alle Mäuse, denen IL-2-sekretierende Tumorzellen injiziert worden waren, während des Beobachtungszeitraums von drei Monaten tumorfrei blieben (Ergebnisse nicht dargestellt). Keine der IL-2-sekretierenden Melanomzelllinien erzeugte in den Nacktmäusen Tumoren, dies zeigt, dass das freigesetzte IL-2 biologisch aktiv war, und es legt nahe, dass Effektorzellen, möglicherweise NK-Zellen, in vivo aktiviert werden. IL-2- oder IFN-γ sekretierende Tumorzellen, die mit 10 000 Rad bestrahlt und unmittelbar danach in Nacktmäuse injiziert wurden, bildeten auch keine Tumoren. Nicht-bestrahlte IFN-γ sekretierende Tumorzellen bildeten, wie erwartet, Tumoren aus, da die Wirkung von IFN-γ artspezifisch ist (Langer et al., 1988).
  • Replikationskompetente Retroviren werden nicht erzeugt
  • Während der Testverfahren können replikationskompetente murine Retroviren durch eine Rekombination mit endogenen Retrovirus-ähnlichen Sequenzen entstehen. Das Vorliegen eines replikationskompetenten murinen Retrovirus wurde in einer Gruppe von transduzierten Tumorzelllinien getestet. Melanom- und Nierenkrebszelllinien waren 21 bis 28 Tage vorher mit DC/AD/R/IL2 transduziert worden, anschließend wurden ihre Überstände für die Infektion von NIH3T3-Zellen verwendet. Nachdem die NIH3T3-Zellen 21 Tage gezüchtet worden waren, wurden bei ihnen die G418-Resistenz und die Aktivität der reversen Transkriptase bestimmt. Keine G418-Resistenz wurde nachgewiesen. Unter Verwendung des HeLa- und NIH3T3-Amplifikationstests war keine Aktivität der reversen Transkriptase feststellbar (6).
  • Diskussion
  • In dieser Beschreibung wurde gezeigt, dass es möglich ist, menschliche Melanomzellen unter Verwendung von retroviralen Vektoren mit dem IL-2- oder dem IFN-γ-Gen zu transduzieren und bei ihnen die konstitutive Sekretion von Cytokinen zu induzieren. In Tiermodellen wurde gezeigt, dass die Expression einer Vielzahl von Cytokin-Genen, umfassend IL-2 (Gansbacher et al., 1990b; Fearon et al., 1990; Ley et al., 1991), IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN-γ (Gansbacher et al., 1990a; Watanabe et al., 1988), IL-6 (Porgador et al., 1992) und IL-7 (Hock et al., 1991), Antitumor-Effekte aufweisen. Mehrere dieser Untersuchungen haben gezeigt, dass die cytotoxischen T-Lymphocyten in der Tumorabstoßung eine Rolle spielen (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1990; Ley et al., 1991; Gansbacher et al., 1990b; Hock et al., 1991; Porgador et al., 1992). Eine Cytokin-Gentherapie beim Melanom wurde getestet, wobei das Ziel darin bestand, transduzierte Zellen in einem Protokoll der aktiven Immuntherapie einzusetzen. Das Melanom zählt zu den am besten untersuchten menschlichen Krebsarten, bei denen gezeigt wurde, dass sie Tumorantigene exprimieren (Van Der Bruggen et al., 1991), wobei diese Antigene Epitope aufweisen, die durch CTLs erkannt werden (Coulie et al., 1992). Sowohl gemeinsame als auch einmalige (die z. B. nur durch autologe Tumorzellen exprimiert werden) Determinanten können durch CTL in einer MHC-eingeschränkten Art und Weise auf Melanomzellen entweder zusammen mit HLA-A1 oder zusammen mit HLA-A2 erkannt werden (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Kawakami et al., 1992; Crowley et al., 1992). Am wichtigsten von der therapeutischen Perspektive aus ist der Punkt, dass eines der Gene, die aus einer menschlichen Melanomzelle cloniert wurden, auf einer Vielzahl von Tumorzellen, einschließlich Nicht-Melanom-Zellen, exprimiert wurde, dass es jedoch bisher noch nicht auf normalen Zellen nachgewiesen wurde (Van Der Bruggen et al., 1991).
  • Für CTLs wurde gezeigt, dass sie eine tumorizide Wirkung auf Melanomzellen ausüben (De Vries et al., 1984; Anichini et al., 1985; Mukherji et al., 1983). Coulie et al. berichteten, dass CTL-Vorläufer im peripheren Blut von Melanompatienten mit einer Häufigkeit im Bereich von 1/900 bis 1/33 000 nachgewiesen werden konnten (Coulie et al., 1992). Die Häufigkeit von cytotoxischen Vorläufern in diesen Melanompatienten liegt in dem Bereich, der nach erfolgreichen Immunantworten gegen bestimmte Viren festzustellen ist, wie Cytomegalie-Virus (CMV), Herpes simplex-Virus (HSV) und Varicella-Zoster (Hickling et al., 1987; Borystewicz et al., 1988). Diese Ergebnisse sind wichtig, da sie Impfprotokolle nahelegen, die das Ziel haben, die Häufigkeit der CTLs zu erhöhen, anstatt sie de novo zu induzieren. Der Beweis, dass eine solche Expansion auftreten kann, wurde in dem P815-Tumormodell gezeigt, in dem die in vivo-Sekretion von IL-2 durch die Tumorzellen die Häufigkeit der zirkulierenden tumorspezifischen CTLs um das Zwei- bis Vierfache steigerte (Ley et al., 1991).
  • Vier IL-2-Konstrukte und zwei IFN-γ Konstrukte wurden in diesen Untersuchungen eingesetzt (1). IL-2 und IFN-γ wurden ausgewählt, da früher ihre Wirksamkeit gezeigt wurde, die Tumorbildung von diejenigen Zellen, die sie absondern, abzuschwächen, und da sie sowohl auf Effektor- als auch auf Tumorzellen wirken, und zwar möglicherweise in einer synergistischen Art und Weise (Gansbacher et al., 1990a; Fearon et al., 1992; Ley et al., 1991; Gansbacher et al., 1990b; Watanabe et al., 1988). Wie erwartet, schwankte bei den Zellen, die mit den rekombinanten Vektoren infiziert waren, die Menge des freigesetzten Cytokins (Tabelle 1). Bei den gesamten infizierten Zellen wurden Clone gefunden, die 0 U/ml bis 691 U/ml/106 Zellen absonderten. Wenn die transduzierten Tumorzellen ein bekanntes Tumorantigen exprimieren, z. B. MAGE-1, kann man den Versuch machen, die clonale Expansion der MAGE-1-spezifischen CTL-Population in vivo zu maximieren, indem man für die Impfung den Clon mit der höchsten IL-2- und MAGE-1-Expression auswählt. Wenn das Tumorantigen nicht bekannt ist, ist es vernünftig, die gesamten selektierten Cytokin-sekretierenden Tumorzellen als Vakzine einzusetzen, um die antigene Heterogenität aufrechtzuerhalten.
  • Nach der Bestrahlung mit 10 000 Rad produzieren die Zellen weiterhin drei bis vier Wochen signifikante Mengen von IL-2 (4 und Tabelle 3). Die Gamma-Bestrahlung löste sogar für einen kurzen Zeitraum eine verstärkte Cytokin-Freisetzung aus, dies beruht möglicherweise darauf, dass die Cytokine aus den absterbenden Zellen auslaufen. Diese Beobachtungen können bei der klinischen Anwendung wichtig sein, wenn vermieden werden soll, dass lebenden Tumorzellen in Patienten injiziert werden.
  • Die Sekretion von IFN-γ durch Tumorzellen erhöhte die Expression von MHC der Klasse I in einigen Linien, nicht jedoch in anderen Linien, wobei die Grundlage für dieses Phänomen noch nicht geklärt ist (5). Da die Tumorantigene den T-Zellen im Zusammenhang mit den HLA der Klasse I präsentiert werden (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991), wird es für Impfprotokolle wichtig sein, Tumorzellen zu selektieren, die auf IFN-γ ansprechen.
  • Die Ergebnisse dieser Serie von Experimenten zeigten eine biologische Wirkung in vivo, denn die IL-2-sekretierenden Zellen wurden in BALB/c-nu/nu-Mäusen abgestoßen, während die normalen Gegenstücke Tumoren ausbildeten. Da den Nacktmäusen die T-Zellen fehlen, sie jedoch NK-Zellen aufweisen, wurde angenommen, dass eine Aktivierung der NK-Zellen an der Tumorabstoßung beteiligt war. Diese Ergebnisse erhärten lediglich die Idee, dass das sekretierte IL-2 biologisch aktiv ist, sie sagen jedoch nicht die Wirkung auf eine CTL-Population voraus. Als Kontrolle wurden menschliches IFN-γ-sekretierende Tumorzellen verwendet, um die Möglichkeit auszuschließen, dass andere durch eine retrovirale Infektion induzierte Faktoren für die Tumorabstoßung verantwortlich sein könnten. Die Wirkung von IFN-γ ist artspezifisch (Langer et al., 1988), wobei Melanomzellen, die menschliches IFN-γ abgaben, Tumoren ausbildeten, die mit den parentalen Melanomzellen identisch waren.
  • Diese experimentellen Ergebnisse zeigen, dass IL-2- oder IFN-γ sekretierende Melanomzellen für die Anwendung in der Klinik verfügbar sind. Für Impfprotokolle können autologe Zellen gegenüber allogenen Zellen zu bevorzugen sein, dies muss jedoch nicht der Fall sein, wobei aber nur bei 20 bis 30% der Melanompatienten Tumorzelllinien etabliert werden können. Da die gemeinsamen Tumorantigene MHC-Klasse-1-eingeschränkt sind (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991), sollte es möglich sein, für eine Impfung etablierte allogene Zelllinien zu verwenden, die mit Cytokin-Genen transduziert sind. Für mindestens zwei MHC-Moleküle der Klasse 1, HLA-A1 und HLA-A2, wurde beschrieben, dass sie gemeinsame Melanomantigene präsentieren (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991; Van Der Bruggen et al., 1991). Da 40% der kaukasischen Population die HLA-A2-Moleküle exprimieren, besteht eine attraktive Strategie darin, allogene Melanomzellen einzusetzen, die HLA-A2 und gemeinsame Melanomantigene exprimieren. In dieser Studie exprimieren SK-MEL-29, SK-MEL-245 und SK-MEL-256 (Tabelle 1) das Molekül HLA-A2. Kandidaten für ein solches Impfprotokoll wären HLA-A2-übereinstimmende Melanompatienten, da die meisten HLA-A2-positiven Melanome ein gemeinsames Melanomantigen exprimieren (Kawakami et al., 1992). HLA-A-übereinstimmende allogene bestrahlte Tumorzellen, die IL-2 absondern, haben das Potential, cytotoxische Effektorzellen zu aktivieren und zu amplifizieren, welche die Peptide erkennen, die durch autologe Tumorzellen im Zusammenhang mit übereinstimmendem HLA präsentiert werden. Kürzlich veröffentliche Ergebnisse zeigen eine 80-mal stärkere Expansion des antigenspezifischen Clons, wenn die antigenpräsentierenden Zellen das Antigen zusammen mit einem ko-stimulierenden Signal exprimieren (Liu et al., 1992).
  • Eine der in dieser Beschreibung angeführten Zelllinien, SK-MEL-29, wurde bereits als eine allogene Vakzine bei 17 Melanompatienten eingesetzt (Livingston et al., 1985). SK-MEL-29 exprimiert gut charakterisierte Melanocyten-Differenzierungsantigene. Keiner der geimpften Patienten entwickelte eine Antikörperantwort gegen diese Diffferenzierungsantigene, dies zeigt, dass bestrahlte Tumorzellen alleine als Stimulatoren einer humoralen Antitumor-Antwort unzureichend sind. Für die Induktion von IgG-Antworten mit hoher Affinität ist die Hilfe von CD4+-T-Zellen erforderlich. Somit wäre eine Produktion von IgG mit hoher Affinität gegen die Melanocyten-Difterenzierungsantigene auch ein Hinweis darauf, dass eine solche Impfung die T-Zellen des Wirts aktivieren könnte.
  • Trotz der ermutigenden experimentellen Ergebnisse kann es sein, dass eine Impfstrategie unter Verwendung von IL-2-sekretierenden Tumorzellen scheitert. Z. B. kann die Bestrahlung die Immunogenität der Tumorzellen vermindern, das Design des Vektors kann nicht optimal sein, und die Mengen des abgesonderten IL-2 könnten nicht ausreichend groß sein, oder Tumorzellen könnten Suppressorfaktoren freisetzen, durch die eine erfolgreiche Expansion der CTL verhindert wird. Systematische Vorgehensweisen sind für jedes der möglichen Probleme erforderlich. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass retrovirale Vektoren eingesetzt werden können, um Cytokin-Gene in menschliche Tumorzellen einzuführen. Die transduzieren Tumorzelllinien können in Kultur mehrere Monate aufrechterhalten werden, wobei sie während dieser Zeit kontinuierlich stabil Cytokine freisetzen. Die Abstoßung von IL-2-sekretierenden Tumoren durch Nacktmäuse und die Hinaufregulation von MHC-Klasse-I-Genen auf einigen der Tumorzellen zeigen, dass die abgesonderten Cytokine biologisch aktiv sind.
  • Diese Ergebnisse bieten eine wissenschaftliche und praktische Unterstützung für aktive Impfprotokolle, bei denen ein retroviraler Cytokin-Gentransfer eingesetzt wird, wobei versucht wird, die Häufigkeit von schon vorliegenden cytotoxischen Vorläufern im Kreislauf von Patienten, die einen Tumor haben, zu erhöhen.
  • Cytokine sind wichtige Modulatoren der Antitumor-Antworten des Wirts. Zwei dieser Cytokine, Interleukin-2 (IL-2) und Interferon-gamma (IFN-γ), werden nach einer durch Antigen (Ag) induzierten Aktivierung von Helfer-Lymphocyten produziert. Die Cytokine werden in die unmittelbare Umgebung freigesetzt, wo sie entweder mit den geeigneten Rezeptoren auf Effektorzellpopulationen interagieren oder schnell gespalten werden. Um diese physiologische Freisetzung von Cytokinen an der Effektor-Ziel-Stelle nachzuahmen, wurden retrovirale Vektoren für die Transduktion von Melanomzellen mit der IL-2- oder IFN-γ cDNA eingesetzt. Fünf Melanomzelllinien wurden mit IL-2- oder IFN-γ enthaltenden Vektoren transduziert und gaben dann IL-2 mit 1 bis 40 U/ml/106 Zellen pro 48 Stunden bzw. IFN-γ mit 1 bis 8 U/ml/106 Zellen in 48 Stunden ab. Nach einer Gamma-Bestrahlung sekretierten diese Zellen die Cytokine weiterhin noch etwa drei bis vier Wochen. Die Sekretion von IFN-γ induzierte in einer Untergruppe von Melanomzelllinien eine Hinaufregulation der Moleküle des Haupthistokompatibiltätskompexes (MHC) der Klasse I. Die Produktion von IL-2 durch menschliche Melanom-Xenotransplantate induzierte in BALB/c-nu/nu-Mäusen eine Tumorabstoßung, dies zeigt die in vivo-Wirkung dieses Cytokins. Diese Untersuchung macht deutlich, dass a) menschliche Melanomzellen mit Cytokin-enthaltenden retroviralen Vektoren stabil transduziert werden können, dass b) Cytokine durch die transduzierten Tumorzellen konstitutiv sekretiert werden und die erwarteten biologischen Effekte in vitro und in vivo zeigen, und dass c) die Cytokine nach einer Gamma-Bestrahlung weiterhin noch mehrere Wochen sekretiert werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass bestrahlte Cytokinsekretierende allogene oder autologe Tumorzellen in Impfprotokollen für Krebspatienten eingesetzt werden können.
  • Zweite Serie von Experimenten
  • Pilotstudie einer Immunisierung mit HLA-A2-übereinstimmenden allogenen
  • Melanomzellen die Interleukin-2 absondern, bei Patienten mit metastatischem
  • Melanom
  • Die Aufgabe dieser Serie von Experimenten besteht darin, HLA-A2-positive Melanompatienten mit HLA-A2-übereinstimmenden allogenen Melanomzellen zu immunisieren, die so verändert wurden, dass sie Interleukin-2 absondern.
  • Stand der Technik
  • Das maligne Melanom
  • Jährlich werden in den Vereinigten Staaten mehr als 32 000 Fälle mit einem Melanom diagnostiziert, die zu mehr als 8 000 Todesfällen führen (American Cancer Society, 1989). Die herkömmliche systemische Therapie für das metastatische Melanom ist unzureichend. Dacarbazin (DTIC) ist das wirksamste einzeln verabreichte chemotherapeutische Mittel und wird verbreitet zur Behandlung von Patienten mit der metastatischen Erkrankung eingesetzt, wobei die Responderrate im Bereich von 14 bis 20% liegt (Comis, 1976; Carbone et al., 1976; Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979). Normalerweise kommt es zu keiner klinisch bedeutenden Regression von viszeralen Metastasen. Auch der Einsatz der Nitrosoharnstoffe führte zu genauso enttäuschenden Ergebnissen (Comis, 1976; Carbone et al., 1976; Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979). Auch eine Kombinations-Chemotherapie konnte die bei der Therapie mit einem verabreichten einzelnen Mittel festgestellte Responderrate nicht deutlich erhöhen und weist darüber hinaus noch eine größere Toxizität auf (Luikart et al., 1984; Costanza et al., 1977; Bellet et al., 1979).
  • Das Versagen der herkömmlichen chemotherapeutischen Mittel bei der Behandlung des metastatischen Melanoms hatte zur Folge, dass in klinischen Studien Mittel eingesetzt wurden, mit denen die biologische Antwort modifiziert werden kann. In verschiedenen Untersuchungen wurden Interleukin-2 (IL-2) mit oder ohne LAK-Zellen (Rosenberg, 1988; Parkinson et al., 1990), Interferon (Creagan et al., 1984) und monoclonale Antikörper getestet (Vadhan-Raj et al., 1988), wobei die Responderrate im Bereich von 19 bis 23% lag. Diese Responderraten sind bei den herkömmlichen verwendeten Therapieschemata mäßig, weisen jedoch manchmal eine deutliche Toxizität auf.
  • Impfstudien
  • In jedem Jahrzehnt nach der Jahrhundertwende wurden Fortschritte in der Entwicklung von Impfstoffen gegen Krebs gemacht, wobei diese in Form von autologen oder allogenen frischen Tumorgeweben, gezüchteten Tumorzellen oder Tumorzellen vorlagen, die durch Chemikalien, Enzyme oder eine Virusinfektion modifiziert worden waren. In diesen Studien war das maligne Melanom bei weitem die führende Krebsart. Im Allgemeinen lieferten diese Testreihen keinen überzeugenden Beweis für die therapeutische Wirksamkeit, wenn sie auf geeignete Weise kontrolliert wurden (Oettgen et al., 1991).
  • Beim Testen von menschlichen Vakzinen gegen Krebs gibt es Unsicherheit n, die vom geeigneten Typ, der geeigneten Dosis, Route und Häufigkeit der Vakzine bis zur Auswahl geeigneter Patienten und dem Test der klinischen Antwort reich n. Aufgrund der großen Anzahl von Variablen wäre eine anschließende Analyse der Wirksamkeit extrem zeitaufwändig, wenn nur die Wirksamkeit auf die klinische Tumorantwort getestet würde. Vielmehr braucht man für die Entwicklung einer immunogenen Krebsvakzine Verfahren, mit denen die Wirksamkeit festgestellt werden kann, wobei die Verfahren sowohl schnell als auch objektiv sein müssen und außerdem dazu dienen müssen, den schrittweisen Prozess bei der Konstruktion und beim Testen einer Vakzine entsprechend zu steuern. Bei Vakzinen gegen Infektionskrankheiten stellen die serologischen Antworten gegen bakterielle und virale Antigene einen entscheidenden Schritt in ihrer Entwicklung dar. Das Fehlen von vergleichbaren Tests der humoralen und zellulären Immunität, mit denen die Immunigenität von Krebsvakzinen bei Menschen überwacht werden könnte, war bisher ein wichtiger Hinderungsgrund, so dass diese Vorgehensweise nicht auf die Krebstherapie angewendet werden konnte.
  • Mit Beginn der 1970er Jahre wurden durch zahlreiche Gruppen Versuche unternommen, bei Patienten, die Krebsvakzine erhalten hatten, eine spezifische Immunantwort auf eine Impfung zu zeigen. Die meisten dieser Studien wurden an Patienten mit Melanom durchgeführt und umfassten Tests auf eine verzögerte Hypersensitivität der Haut, Lymphocyten-Cytotoxizität, Hemmung der Lymphocytenmigration und eine Vielzahl von serologischen Tests. Aufgrund der Schwierigkeiten, auf die man bei der Analyse der Spezifität von allogenen Reaktionen stoßen kann (in den meisten Fällen stammten die getesteten Seren oder Lymphocyten und die für die Konstruktion der Vakzine oder für das Zielzellenpräparat verwendeten Melanomzellen nicht von demselben Patienten), ergaben diese Untersuchungen keinen eindeutigen Beweis für eine tumorspezifische Immunantwort auf die Vakzine (Oettgen et al., 1991).
  • Ein deutlicheres Bild ergab sich, wenn man die Analyse auf autologe serologische Reaktionen beschränkte. Obwohl diese Vorgehensweise davon abhängig war, dass von jedem Patienten, der untersucht werden sollte, Tumorzelllinien etabliert wurden, konnten durch das Testen der autologen Kombinationen aus Tumorzellen und Seren die verwirrenden Reaktionen auf die normalen allogenen Zelloberflächen-Antigene eliminiert werden. Durch die autologe Typisierung wurden auf Melanomzellen drei Klassen von Oberflächen-Antigenen definiert. Die Antigene der Klasse I sind auf den autologen Tumor beschränkt. Die Antigene der Klasse II sind gemeinsame Tumorantigene, die auf autologen und auch auf allogenen Tumorzellen zu finden sind; einige der Antigene der Klasse II liegen auf einem eingeschränkten Satz von normalen Zelltypen vor und können somit als autoantigene Differenzierungsantigene angesehen werden. Antigene der Klasse III sind sowohl auf bösartigen als auch auf normalen Zellen weit verbreitet (Old, 1981). Durch die Entwicklung von autologen Typisierungssystemen zum Definieren von Zelloberflächen-Antigenen von Melanomen wurden serologische Tests mit der erforderlichen Empfindlichkeit und Spezifität verfügbar, die eingesetzt werden konnten, um die Immunogenität von Melanomvakzinen zu beurteilen. Eine Reihe von Versuchen mit einer Vakzine gegen die Melanomantigene der Klasse I oder II zeigte jedoch, dass eine Antikörperantwort auf die relevanten Melanomantigene der Klasse I oder II durch eine Impfung nur in außergewöhnlichen Fällen induziert wurde, obwohl die humorale Immunantwort auf andere Komponenten der Vakzine nicht fehlte (Livingston et al., 1985). Die Spekulationen, welche Gründe für die Schwierigkeiten verantwortlich sein könnten, die bei diesen Versuchen zum Induzieren einer Antikörperantwort gegen die Melanomantigene der Klasse I oder der Klasse II auftreten, zogen mehrere Möglichkeiten in Betracht, umfassend eine unzureichende Empfindlichkeit der serologischen Tests, eine ungünstige Antigenpräsentation in den Vakzinen, eine genetische Einschränkung der Reaktivität mit Melanomantigenen und eine Suppression der Antikörperproduktion durch Suppressorzellen oder anti-idiotypische Antikörper.
  • Mit dem Aufkommen der Hybridomtechnik wurden verschiedene Proteine, Glykoproteine und Glykopeptide als Bestandteile der Zelloberfläche von menschlichen Melanomen und als Kandidaten für die Konstruktion einer Vakzine identifiziert. Unter ihnen sind die Ganglioside GM2, GD2 und GD3 besonders wichtig. Mit Vakzinen, die gereinigtes GM2 enthalten, wurde gezeigt, dass sie bei Patienten mit Melanom die Produktion von GM2-Antikörpern induzieren (Livingston et al., 1987; Tai et al., 1985), wenn sie zusammen mit BCG als Adjuvans nach einer Vorbehandlung mit niedrigen Dosen Cyclophosphamid zum Hemmen der Suppressoraktivität verabreicht werden.
  • Die zelluläre Immunität gegen Krebsantigene fand, im Gegensatz zu der humoralen Immunität, großes Interesse, seit in den frühen 1960er Jahren gezeigt wurde, dass bei der Maus eine spezifische Immunität gegen eine Provokation durch chemisch induzierte Sarkomen zwar mit den Lymphocyten aus immunisierten Spendern, nicht jedoch mit ihrem Serum, übertragen werden kann. Das Definieren der Spezifität von zellulären Immunreaktionen gegen Krebs gestaltete sich viel schwieriger als das Definieren der Spezifität von humoralen Immunreaktionen gegen Krebsantigene. In dieser Hinsicht war die Entdeckung des T-Zell-Wachstumsfaktors Interleukin-2, wodurch ein Kultivieren und Clonieren von T-Lymphocyten möglich gemacht wird, ein großer Schritt vorwärts und öffnete eine neue Ära in der Erforschung der T-Zell-Immunität. In mehreren Laboratorien wurden aus dem Blut von Patienten cytotoxische T-Lymphocyten-Clone mit einer eingeschränkten Reaktivität für das autologe Melanom isoliert, außerdem wurden ähnliche Ergebnisse in Studien mit Clonen erhalten, die aus tumorinfiltrierten Lymphocyten (TIL) stammten (Hainaut et al., 1990). In einigen Fällen zeigten diese Clone eine außergewöhnlich gute Spezifität für das autologe Melanom (Oettgen et al., 1991). In einigen Fällen konnten die präsentierenden MHC-Moleküle als Moleküle der Klasse 1 identifiziert werden, indem die Lyse mit Antikörpern gehemmt wurde, die gegen die HLA-Determinanten gerichtet waren. Im Fall der Melanomzelllinie SK-MEL-29 (Patient AV von Livingston et al., 1979), die in diesem Institut etabliert wurde, werden mindestens diese Antigene durch autologe und cytotoxische T-Zell-Clone in Assoziation mit HLA-A2 erkannt (Wolfel et al., 1989).
  • Sowohl HLA-A2 als auch HLA-A1 wurden in anderen Melanomen und auch in Sarkomen als Elemente der Restriktion identifiziert (Knuth et al., 1991). Es wurde gezeigt, dass das auf menschlichen Melanomzellen exprimierte HLA-A2 gemeinsame Melanomantigene präsentiert, die durch T-Zellen erkannt werden, die aus peripherem Blut, regionalen Lymphknoten und Tumorinfiltraten stammen. Somit ist HLA-A2 in der Lage, Antigene zu präsentieren, die bei den Melanomzellen gemeinsam vorliegen, die jedoch von verschiedenen anderen Zelltypen nicht offensichtlich exprimiert werden. Eine außerordentliche Herausforderung, die sich auf dem Fachgebiet der zellulären Immunität bietet, ist die strukturelle Definition der Ziele, die durch die cytotoxischen Zellen auf den menschlichen Tumorzellen erkannt werden. Ein großer Fortschritt auf diesem Gebiet war die Clonierung des Gens, das ein Tumorantigen der Maus codiert, das durch cytotoxische T-Zellen erkannt wird, sowie die Identifizierung seiner Mutation (Deplaen et al., 1988). Die gleiche Vorgehensweise wurde nun auf das menschliche Melanom angewendet, wobei ein Gen identifiziert wurde, das ein Antigen codiert, welches durch cytolytische T-Zellen auf dem menschlichen Melanom erkannt wird. In diesem Fall zeigt sich, dass das Antigen anscheinend durch HLA-A1 präsentiert wird (T. Boon, persönliche Mitteilung N. Oettgen), (Van Der Bruggen, 1991).
  • Biologische Effekte von Interleukin-2 in vitro
  • Interleukin-2 ist ein Lymphokin, das durch T-Helferzellen produziert wird und das T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) stimuliert. In vitro-Studien haben gezeigt, dass IL-2 die Proliferation von antigenspezifischen T-Zellen induziert. Helfer-, cytotoxische und Suppressor-T-Zellen aus Melanompatienten wurden in vitro gezüchtet, indem sie in Gegenwart von IL-2 und antigenpräsentierenden Zellen kultiviert wurden (Glasebrook et al., 1982). Auch die B-Zell-Antworten in vitro wurden durch IL-2 gesteigert (Roehm et al., 1983). Das Züchten von T-Zellen in IL-2 kann auch zur Sekretion anderer Lymphokine durch die T-Zellen führen, umfassend Interferon-γ, IL-1, IL-4, IL-6, GM-CSF und TNF-α.
  • Interleukin-2 in Studien an Menschen
  • Verschiedene Forscher haben die systemische Verabreichung von IL-2 an Patienten mit fortgeschrittenen Krebserkrankungen untersucht (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989). Systemisches IL-2 zeigte bei Patienten mit fortgeschrittenem Melanom und anderen Tumoren eine mäßige Aktivität, wobei über eine Responderrate von 15 bis 20% berichtet wurde (Rosenberg et al., 1987). Dabei zeigt sich, dass die Hauptwirkung von IL-2 anscheinend in der Expansion von Effektorzellpopulationen besteht, welche die Fähigkeit besitzen, Tumoren in vitro abzutöten. Jedoch wurden aufgrund der kurzen Serumhalbwertszeit von IL-2 hohe Dosierungen eingesetzt, die sehr toxisch sind. Eine Hypotonie und ein Syndrom mit erhöhter Durchlässigkeit der Kapillaren („capillary leak syndrome") mit einem verminderten systemischen Gefäßwiderstand führten zu einem interstitiellen Lungenödem, einer prärenalen Azotämie, Herzrhythmusstörungen und zu einem Myokardinfarkt (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989).
  • Gentransfer in Tiermodellen
  • Mehrere Laboratorien haben gezeigt, dass die Einführung von Cytokin-Genen, wie IL-2, IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN-γ (Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990), TNF-α (Asher et al., 1991) und G-CSF (Colombo et al., 1991), in Tumorzellen in spezifischen Modellsystemen bei Tieren zu deren Abstoßung durch einen immunologisch kompetenten Wirt führt. Die Sekretion von G-CSF oder IL-4 durch Tumorzellen führte zu örtlich begrenzten Entzündungsreaktionen an der Stelle des Tumors, ohne dass offensichtlich ein immunologisches Gedächtnis induziert wurde (Tepper et al., 1989; Colombo et al., 1991). Einleitende Studien von Tepper et al., (Tepper et al., 1989) zeigten, dass eine örtlich begrenzte IL-4-Sekretion an der Stelle des Tumors durch die Akkumulation von eosinophilen Zellen und Makrophagen gekennzeichnet war. Andererseits induzierten IL-2, Interferon-γ und TNF-α lang anhaltende zelluläre Immunantworten, die bei Provokationen zu späteren Zeitpunkten zur Abstoßung von möglicherweise letalen Tumoren führten (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b; Tepper et al., 1989; Watanabe et al., 1989). Fearon et al. (Fearon et al., 1989) führten das IL-2-Gen in einen schwach immunogenen murinen Kolonkrebs ein. Die IL-2-sekretierenden Tumoren wurden abgestoßen und induzierten anschließend eine wirksame cytolytische T-Zell-Antwort. Durch die Entfernung von CD8-positiven Zellen in vivo wurde die zelluläre Antitumor-Antwort außer Kraft gesetzt, dies legt nahe, dass die MHC Klasse Ieingeschränkten CD8-positiven Zellen eine zentrale Rolle spielen.
  • Um dem physiologischen Modus einer im Verlauf einer Immunantwort erzeugten Cytokin-Sekretion noch näher zu kommen, wurde das IL-2-Gen direkt in eine murine Fibrosarkom-Zelllinie (CMS-5) eingeführt. Auf diese Weise wurde eine örtlich begrenzte Sekretion von niedrigen Spiegeln des Cytokins erreicht, die zur Regression der injizierten Tumorzellen führte (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). Wenn die Kontrollmäuse durch Tumor provoziert wurden, verendeten sie innerhalb von 45 Tagen. Mäuse, die mit IL-2-sekretierenden Tumorzellen provoziert wurden, stießen die implantierten Tumorzellen ab und wurden geheilt. Diese Mäuse entwickelten ein spezifisches immunologisches Gedächtnis. Die erneute Provokation, mehrere Monate später, mit möglicherweise letalen Dosen der parentalen Tumorzellen CMS-5 führte zur Abstoßung des Tumors, während ein nicht-verwandter Tumor wuchs und die immunen Mäuse abtötete, dies macht deutlich, dass die Antwort spezifisch ist. Lymphocyten, die aus Milzen von immunen Tieren entnommen wurden, waren in der Lage, den Tumor in vitro abzutöten, dies bezog sich auf die gesamte Lebenszeit der Mäuse. Es ist zu beachten, dass gegen die Tumorzellen CMS-5 nach einer Provokation mit parentalen Tumorzellen nur schwache cytolytische Antworten erzeugt wurden; diese Antworten waren vorübergehend und verschwanden innerhalb von drei Wochen nach der Implantation des Tumors wieder. Jedoch brachten Mäuse, denen die IL-2-sekretierenden Tumorzellen injiziert worden waren, eine tumorspezifische cytolytische Aktivität hervor, die mehr als 75 Tage lang anhielt.
  • Rosenberg et al. (unveröffentlichte Daten) haben diese Ergebnisse mit dem schwach immunogenen Tumor MCA-102 reproduziert. Trotz zahlreicher Versuche waren sie unter Verwendung von nicht-modifizierten Tumorzellen niemals in der Lage, eine zelluläre Antitumor-Antwort zu erzeugen. Durch die Einführung des IL-2-Gens in diese Zellen wurde ihre Immunogenität auf ein Niveau erhöht, so dass eine Tumorabstoßung und ein Gedächtnis erzeugt wurden. Außerdem brachte die gemeinsame Injektion von IL-2-produzierenden Tumorzellen und nicht-modifizierten parentalen Tumorzellen eine Immunantwort hervor, die stark genug war, um nicht nur die Lymphokin-sekretierenden Tumorzellen, sondern auch die nicht-modifizierten Tumorzellen abzustoßen.
  • Dieses Ergebnis wurde am MSKCC auch in unterschiedlichen Tumortypen der Maus reproduziert, umfassend das Melanom B16, das B-Zell-Lymphom 38C13 und den Blasenkrebs MBT2. Eine mit IL-2 zusammenhängende Toxizität wurde in jedem der Tiere festgestellt, die mit IL-2-sekretierenden Tumorzellen provoziert worden waren. Weitere Experimente unter Verwendung von bestrahlten, IL-2-sekretierenden CMS-5-Zellen zeigten, dass im Vergleich zu nicht-bestrahlten IL-2-sekretierenden Tumorzellen kein Unterschied in ihrer Fähigkeit bestand, das immunologische Gedächtnis in vivo zu induzieren.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Einführung und die konstitutive Expression von IL-2 durch die Tumorzellen selbst die Immunogenität von einer Vielzahl von histologisch unterschiedlichen Krebsarten steigerte. Aus diesen Studien ist ersichtlich, dass die örtlich begrenzte persistierende Expression und Sekretion von niedrigen Spiegeln von IL-2 möglicherweise eine Wirkung auf die Antitumor-Antwort des Wirts hat, und zwar ohne dass eine nachweisbare Toxizität auftritt.
  • Gentransfer bei Menschen
  • Kürzlich verwendeten Rosenberg et al. genetisch veränderte autologe tumorinfitrierende Lymphocyten und injizierten sie in Patienten mit refraktären metastatischen Tumoren (Rosenberg et al., 1990). Ein retroviraler Vektor, der ein Neomycin-Resistenzgen enthielt, wurde in autologe Lymphocyten eingeführt, um die Zellen überwachen zu können, die wieder in die Patienten infundiert wurden. Von den fünf beschriebenen Patienten konnten die Zellen aus vier Patienten erfolgreich in Gewebekulturen zusammen mit G418, einem Neomycin-Analogon, gezüchtet werden. Diese Zellen, die eine Neomycin-Resistenz aufwiesen, wurden den Patienten zusammen mit systemischem IL-2 intravenös verabreicht. In regelmäßigen Abständen wurde peripheres Blut abgenommen und zirkulierende mononukleäre Zellen mit einer Neomycin-Resistenz nachgewiesen. Als Folge der genetischen Veränderung traten keine zusätzlichen Toxizitäten auf. Aus keinem Patienten konnte ein intaktes Virus gewonnen werden. Rosenberg folgerte hieraus, dass dieses Verfahren sowohl durchführbar als auch sicher ist (Rosenberg et al., 1990).
  • Frühere Sicherheitsstudien haben gezeigt, dass der Kontakt von Primaten mit einer umfangreichen Infusion eines infektiösen murinen amphotrophen Virus keine akuten pathologischen Effekte erzeugte (Cornetta et al., 1990). 21 Primaten, denen ein retroviral genmodifiziertes Knochenmark transplantiert worden war, zeigten fünf Jahre nach der Infusion keine Anzeichen einer Toxizität, die mit dem Gentransfer zusammenhängen könnte (Kantoff et al., 1987). Der erste Adenosindesaminasedefiziente Patient mit einer Schweren Kombinierten Immundefizienz (SCID) wurde etwa vor einem Jahr am NCI erfolgreich mit einem retroviral vermittelten Adenosindesaminase-Gentransfer behandelt (Kantoff et al., 1987). Bisher stellten die Forscher nach der Infusion eine teilweise Wiederherstellung der zellulären Immunfunktion fest, ohne dass beim Patienten ungünstige Wirkungen nachgewiesen werden konnten.
  • Nun sollte untersucht werden, ob die Ergebnisse aus dem murinen System ausgeweitet werden konnten, hierzu wurden menschliche Tumorzelllinien unter Verwendung von retroviralen Vektoren mit Cytokin-Genen infiziert. Bisher wurden am MSKCC das menschliche IL-2-Gen, das menschliche IFN-γ Gen und das menschliche Gen des epidermalen Wachstumsfaktors alle erfolgreich in eine Vielzahl von menschlichen Zelllinien transduziert. In Zusammenarbeit mit Dr. Ray Taetle (Universität von Arizona) wurde das Gen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in die Burkitt-Lymphom-Zelllinie Namalwa eingeführt; es wurde gezeigt, dass der Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert wurde und vollständig funktionell war (Oval et al., 1991). Die Stimulation dieser transduzierten Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor hatte die geeignete Bindung eines Liganden und die Signalübertragung zur Folge (Oval et al., 1991). Außerdem wurde das IL-2- oder das IFN-γ-Gen in primäre und etablierte menschliche Melanomzelllinien eingeführt und darin exprimiert. Diese genetisch modifizierten menschlichen Melanomzellen sonderten konstitutiv bis zu 20 U/ml rekombinantes IL-2 in den Überstand ab. Die konstitutive Expression von IFN-γ hatte eine Hinaufregulation von MHC-Antigenen der Klasse I und der Klasse II auf der Zelloberfläche von Melanomzellen zur Folge. Die Injektion der IL-2-sekretierenden Tumorzellen in Nacktmäuse führte zur Tumorabstoßung, während nicht-modifizierte parentale Zellen nicht abgestoßen wurden. Die Bestrahlung der genetisch veränderten Melanomzellen hat nicht zur Folge, dass die Sekretion von IL-2 unmittelbar eingestellt wird (vgl. Anhang F). Vielmehr wurde das IL-2 nach der letalen Bestrahlung noch zwei bis drei Wochen kontinuierlich in den Mengen freigesetzt, die mit denen von nicht-bestrahlten transduzierten Zellen vergleichbar waren.
  • Begründung
  • Eine Studie wird vorgeschlagen, mit der bestimmt werden kann, ob eine Immunisierung mit allogenen Melanomzellen, die ein rekombinantes menschliches IL-2-Gen exprimieren, ohne eine offensichtliche Toxizität gut toleriert wird. Am MSKCC und an anderen Instituten hat man viel Erfahrung, so dass die allgemeine Sicherheit bei einer Immunisierung unter Verwendung von bestrahlten allogenen Tumorzellen gewährleistet ist. Die Auswahl von allogenen HLA-A2-positiven Tumorzellen beruht auf den zwei folgenden Überlegungen. Erstens kann durch die Verwendung einer einzigen etablierten immunisierenden Zelllinie die Notwendigkeit umgangen werden, für jeden Patienten autologe Tumorzellen zu infizieren. Das Züchten von autologen Tumorzellen in Gewebekultur kann eine schwierige und zeitaufwändige Prozedur sein. Da etwa 40% der Nordamerikaner HLA-A2-positiv sind, könnte eine Tumorvakzine, die aus HLA-A2-übereinstimmenden Melanomzelllinien hergestellt wird, bei einer wesentlichen Subpopulation von Melanompatienten eingesetzt werden. Präklinische Studien wurden mit einer einzelnen Zelllinie, SK-MEL-29, durchgeführt. Diese Zelllinie exprimiert eine Reihe von eingeschränkten Melanocyten-Differenzierungsantigenen, wie durch die Typisierung mit monoclonalen Antikörpern bestimmt wurde, sowie MHC-Antigene der Klasse II. Außerdem stammte SK-MEL-29 von einem Patienten (AV) mit einem ausgedehnten Melanom im Stadium III, bei dem im peripheren Blut cytotoxische CD8-positive T-Zellen nachgewiesen wurden, die autologen Tumor in HLA-A2-eingeschränkter Art lysierten (Roehm et al., 1983; Basham et al., 1983) (vgl. Vaccination Studies und Clinical Protocol). Trotz des ausgedehnten und rezidivierenden Melanoms ist der Patient AV mehr als 15 Jahre nach seiner ersten Behandlung noch am Leben und erkrankungsfrei. Zweitens gibt es wesentliche Hinweise, dass die Melanomzellen den autologen T-Zellen eingeschränkte gemeinsame Antigene präsentieren können (d. h. Antigene, die durch autologe und allogene Melanomtumoren exprimiert werden, nicht jedoch durch bestimmte Nicht-Melanom-Zelltypen). Das Protokoll wird auf Patienten beschränkt, die HLA-A2-positiv sind.
  • Melanomzelllinie
  • Eine gut charakterisierte und etablierte Melanomzelllinie, SK-MEL-29, wurde für die Expression von IL-2 verwendet. SK-MEL-29 ist eine gut charakterisierte Melanomzelllinie, von der bekannt ist, dass sie eine Reihe von Melanocyten-Differenzierungsantigenen und Gangliosidantigenen exprimiert (Wolfel et al., 1989; Houghton et al., 1982). SK-MEL-29 wurde im Jahr 1975 aus einem Patienten, AV, aus regionalen Lymphknoten-Metastasen etabliert (vgl. Livingston et al., 1979). Beim Patienten AV wurde 1974 im Alter von 18 Jahren ursprünglich ein Melanom der vorderen Thoraxwand im Clark-Stadium IV diagnostiziert. Im März 1975 trat das Melanom in mehreren Lymphknoten der linken Achsel mit einer tiefen Invasion in die Weichteile erneut auf. Die erkrankten Bereiche wurden reseziert, und der Patient erhielt eine experimentelle adjuvante Immuntherapie mit Corynebacterium parvum. Im August 1975 rezidivierte die Krankheit im linken supraclavicularen und infraclavicularen Bereich. Der Patient musste sich einer operativen Resektion unterziehen und begann eine Behandlung mit einer Vakzine aus bestrahlten autologen Melanomzellen und BCG-Adjuvans. Im Dezember 1975 erlitt der Patient zum dritten Mal ein Rezidiv mit Tumoren in der linken Seite des Halses mit einer Invasion von Achselvene und Brachialplexus. Er wurde mit einer operativen Resektion behandelt, hierauf folgte eine Strahlentherapie, danach erhielt er eine adjuvante Chemotherapie mit Dacarbazin in den Jahren 1976 bis 1977. Im Jahr 1977 erhielt er erneut eine Impfung mit autologen Tumorzellen und BCG. Im Februar 1978 bildete sich ein rezidivierendes Melanom in der linken Seite des Halses, das operativ entfernt wurde. Die Impfung wurde bis zum Jahr 1980 fortgesetzt. Bis 1991 war bei ihm kein weiteres Rezidiv des Melanoms aufgetreten. Nach der Impfung wurden aus dem peripheren Blut CD8-positive T-Zellen hergeleitet, die wirksam autologe SK-MEL-29-Tumorzellen in einer HLA-A2-eingeschränkten Weise lysierten und die von Knuth und Kollegen ausführlich beschrieben wurden (Wolfel et al., 1989; Knuth et al., 1984).
  • Die Melanomzelllinie SK-MEL-29 wurde mit dem retroviralen Vektor NAP-AD/IL-2 (DC/AD/R/IL2) infiziert. Diese Tumorzellen sondern IL-2 konstitutiv und stabil ab. Die Zellen werden vor der Injektion mit 10 000 Rad bestrahlt, um sicherzustellen, dass sie sich nicht vermehren können. Zwei Dosierungen von Melanomzellen werden für die Vakzine eingesetzt.
  • Klinisches Protokoll
  • Dies ist eine Pilotstudie der Immunisierung mit den allogenen Melanomzellen SK-MEL-29, die so verändert wurden, dass sie IL-2 sekretieren und die als Vakzine an Patienten verabreicht werden, die an einem metastatischen Melanom im Stadium IV leiden, wobei die Sicherheit dieses Verfahrens getestet werden soll. Die Patienten werden HLA-Gewebe-typisiert. Die Patienten, die HLA-A2-positiv sind, erhalten Impfungen mit den allogenen SK-MEL-29-Zellen, die IL-2 freisetzen. In diese Studie sollen 12 Patienten aufgenommen werden. Man geht davon aus, dass der Versuch sechs bis zwölf Monate dauert.
  • Die Gewebekultur von SK-MEL-29-Zellen (DC/AD/R/IL2) wird in den Laboratorien der Drs. Bernd Gansbacher und Alan Houghton gezüchtet. Die Melanomzellen wurden mit dem retroviralen Vektor NAP-AD/IL2 infiziert. Die Zellen, die IL-2 absondern, werden bestrahlt (10 000 Rad) und als eine Serie von vier Impfungen verabreicht. Wenn ein Patient eine Antwort zeigt, wie in dem Abschnitt Kriterien für eine therapeutische Antwort definiert, wird eine zusätzliche Boosterung bis zu ein Jahr lang oder bis zur Progression der Erkrankung gegeben. Sechs Patienten erhalten eine Vakzine in der geringen Dosis, und die sechs anderen Patienten erhalten die höhere Dosis.
  • Kriterien für die Teilnahmeberechtigung der Patienten
  • Die Patienten müssen die folgenden Kriterien erfüllen, um an der Studie teilnehmen zu können.
    • 1. Patienten mit einem metastatischen malignen Melanom, das am MSKCC histologisch bestätigt wurde.
    • 2. Erkrankung im Stadium IV, die durch eine operative Resektion nicht heilbar ist.
    • 3. Die Patienten müssen eine messbare oder bestimmbare Erkrankung aufweisen.
    • 4. Der Leistungszustand nach Karnofsky ist größer oder gleich 70%, und die Lebenserwartung beträgt mehr als vier Monate.
    • 5. Eine adäquate hämatologische Funktion, mit WBC ≥ 3 000/mm3, absolute Lymphocyten-Zahl > 1000/mm3, Hämoglobin ≥ 9 und Thrombocyten ≥ 100 000/mm3.
    • 6. Eine adäquate Nieren- und Leberfunktion (Serum-Kreatinin ≤ 2,5 mg/dl und Bilirubin ≤ 1,7 mg/dl).
    • 7. Mindestens vier Wochen sind vergangen seit einer vorherigen Strahlentherapie, Immuntherapie oder Chemotherapie (sechs Wochen für Nitrosoharnstoffe), und der Patient hat sich von einer solchen Behandlung vollständig erholt.
    • 8. Die Fähigkeit, eine schriftliche informierte Zustimmung zu geben.
    • 9. Alter ≥ 18 Jahre.
    • 10. Keine Vorgeschichte mit anderen gleichzeitigen malignen Erkrankungen, außer Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Haut oder Carcinoma in situ der Zervix.
    • 11. Keine systemischen Steroide mindestens eine Woche vor der Behandlung.
    • 12. Keine intrakranialen oder mehrfachen hepatischen Metastasen.
    • 13. Die Patienten müssen HLA-A2-positiv sein.
  • Ausschlusskriterien
  • Die folgenden Bedingungen/Situationen führen dazu, dass die Patienten nicht in die Studie aufgenommen werden können.
    • 1. Ernsthafte, zwischenzeitlich auftretende Erkrankungen, umfassend eine signifikante Herzkrankheit (New York Heart Association, Klasse III oder IV), Angina pectoris oder Myokardinfarkt innerhalb der vorausgehenden sechs Monate.
    • 2. Das Vorliegen einer aktiven Infektion, einschließlich einer Infektion des Harntrakts.
    • 3. Das Vorliegen von aktiven intrakranialen oder mehrfachen hepatischen Metastasen.
    • 4. Schwangere oder stillende Frauen.
    • 5. Patienten, die mehr als zwei Schemata einer systemischen Chemotherapie erhalten hatten. Die Verwendung von niedrigdosiertem Cyclophosphamid als Teil eines früheren Tumor-Impfprogramms soll nicht als früheres systemisches Chemotherapieschema angerechnet werden.
    • 6. Patienten, die eine ständige Therapie mit Corticosteroiden benötigen, können nicht aufgenommen werden.
  • Gleichzeitige Therapie
  • Die folgenden Therapien sind in der Zeit verboten, in der die Patienten nach diesem Protokoll behandelt werden: Strahlentherapie, Chemotherapie, Corticosteroide (außer, wenn sie aufgrund von lebensbedrohenden Umständen verabreicht werden) oder eine andere Immuntherapie.
  • Auswertung der Vorbehandlung
    • 1. Anamnese und körperliche Untersuchung, einschließlich Dokumentation aller messbaren Erkrankungszeichen;
    • 2. Größe, Gewicht und Leistungszustand;
    • 3. Screeningprofil, BUN und Kreatinin;
    • 4. Großes Blutbild („CBC", complete blood count), Differenzialblutbild und Thrombocytenzahl;
    • 5. Röntgen des Brustkorbs;
    • 6. EKG;
    • 7. CT-Aufnahme des Kopfes.
    • 8. Eine CT-Aufnahme des Abdomens wird durchgeführt, wenn der Patient abnorme Leberfunktionstests und einen erhöhten LDH-Wert aufweist.
    • 9. Peripheres Blut wird für Immuntests entnommen (sechs Röhrchen mit grünem Deckel und zwei Röhrchen mit rotem Deckel). Diese werden in den Laboratorien der Drs. Gansbacher und Houghton gelagert.
    • 10. Weitere Tests, Röntgenbilder und Aufnahmen können durchgeführt werden, wenn der Patient entsprechende Anzeichen und Symptome aufweist und wenn es erforderlich ist, um das Ausmaß der Erkrankung des Patienten definieren zu können.
  • Behandlungsplan
  • Die Patienten erhalten mindestens vier Impfungen. Die ersten sechs Patienten erhalten die niedrig dosierte Impfung (wie nachstehend definiert). Die anderen sechs erhalten die höhere Dosierung der Vakzine. Die Vakzine besteht aus den bestrahlten allogenen SK-MEL-29-Tumorzellen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie IL-2 sekretieren.
    Niedrige Dosis: Etwa 10 Millionen Tumorzellen
    Hohe Dosis: Etwa 50 Millionen Tumorzellen
  • Eine Serie von vier Impfungen wird subkutan entweder in den Oberschenkel oder in den Arm des Patienten verabreicht. Jede Impfung wird an eine andere Stelle verabreicht. Eine Extremität, bei der die Lymphknoten entfernt wurden, wird nicht für die Impfungen verwendet. Alle zwei Wochen, vier Wochen lang, wird eine Impfung verabreicht. Eine Booster-Impfung erfolgt zwei Monate nach der dritten Impfung. Wenn ein Patient eine starke klinische Antwort zeigt (PR oder CR, wie in Kriterien für eine therapeutische Antwort definiert), werden weitere Boosterungen alle drei Monate ein Jahr lang oder bis zur Progression der Erkrankung gegeben. Die Impfung kann bei ansprechenden Patienten nach dem Ermessen der Leitenden Wissenschaftler auch länger als ein Jahr fortgesetzt werden. Patienten mit geringeren Antworten oder einer stabilen Erkrankung erhalten nach dem Ermessen der leitenden Wissenschaftler bis zu ein Jahr lang Boosterungen. Vor jeder Impfung wird eine Blutuntersuchung durchgeführt (vgl. Auswertung während der Studie).
  • Wenn es bei einem Patienten auf die Vakzine hin zu einer ernsten Reaktion, die als Toxizität des Grades 4 definiert ist (vgl. Kriterien für die Toxizität), oder zu einer Verschlechterung seines Leistungszustands kommt, die eine Einweisung in die Klinik erforderlich macht, wird keine weitere Impfung an diesen Patienten verabreicht.
  • Kriterien zum Ausschluss aus der Studie
    • A. Eine progressive Erkrankung, deren Symptome nicht dem Aussehen von kleinen (Durchmesser < 2 cm) oberflächlichen kutanen, subkutanen oder Weichteil-Metastasen entsprechen. Wenn eine kleine oberflächliche Läsion auftritt, kann der Patient nach dem Ermessen des Wissenschaftlers weiterhin geimpft werden.
    • B. Eine schwere, zwischenzeitlich auftretende Erkrankung.
    • C. Eine allgemeine oder spezifische Veränderung im Zustand des Patienten, die eine weitere Behandlung nach der Beurteilung der leitenden Wissenschaftler nicht anraten lässt.
  • Formulierung der Vakzine
  • Für die etablierte HLA-A2-Melanomzelllinie SK-MEL-29, die mit dem Retrovirus NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2) infiziert war, wurde gezeigt, dass sie IL-2 im Überschuss von 20 U/ml absondert. Die Stammkultur der IL-2-infizierten Zelllinie wird in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Laboratorium von Dr. Bernd Gansbacher aufbewahrt. Etwa eine Woche vor dem Impftermin werden die Gläschen, die 10 Millionen Tumorzellen enthalten (ein Gläschen für die niedrige Dosis und fünf Gläschen für die hohe Dosis), aufgetaut, in Gewebekultur expandiert und erneut auf die Produktion von IL-2 analysiert. Außerdem wird nachgewiesen, dass diese Kulturen frei sind von Helfervirus, Mycoplasma, Bakterien und Pilzen.
  • Am Tag der Impfung werden die Zellen mit Trypsin behandelt, gezählt und sodann in 1 ml steriler Phosphat-gepufterter Kochsalzlösung (USP) in einer sterilen Spritze resuspendiert. Die Spritze und ihr Inhalt werden mit 10 000 Rad bestrahlt und danach an die ambulante Abteilung geliefert, wo die subkutane Injektion durch einen Leitenden Wissenschaftler oder einen anderen, hierfür bestimmten beteiligten Wissenschaftler erfolgt.
  • Auswertung während der Studie
    • 1. Körperliche Untersuchung vor jeder Impfung.
    • 2. Großes Blutbild („CBC"), Thrombocytenzahl und Differenzialblutbild werden vor jeder Impfung durchgeführt.
    • 3. Das chemische Profil, umfassend LeberFunktionstests, Bilirubin, Kreatinin und LDH, wird zwei Monate lang alle vier Wochen und danach vor jeder Impfung bestimmt.
    • 4. Peripheres Blut wird für Immuntests abgenommen (vgl. Abschnitt 6.9). Hierbei werden sechs Röhrchen mit grünem Deckel und zwei Röhrchen mit rotem Deckel vor der ersten Impfung und eine bis zwei Wochen nach der vierten Impfung gefüllt.
    • 5. Die Röntgenaufnahme des Brustkorbs wird zwei Monate lang alle vier Wochen und danach vor jeder Impfung wiederholt.
    • 6. Wenn eine mäßige Toxizität (Grad 3) festgestellt wird, werden die relevanten Tests häufiger als in der Tabelle angegeben durchgeführt.
  • Auswertung der Immunantwort
  • Serologische Studien
  • Die direktesten Verfahren zur Messung von Immunantworten auf ein Melanom bestehen darin, Antikörper nachzuweisen. Etwa ein Drittel der Patienten mit einem metastatischen Melanom besitzen Antikörper, die mit den autologen Tumorzellen reagieren (Oettgen et al., 1991). Die meisten dieser Autoantikörper gehören zur IgM-Klasse, jedoch kommen gelegentlich auch Antikörper der IgG-Klasse vor. Mehrere Antigene, die durch diese Autoantikörper erkannt werden, wurden auf molekularer Ebene definiert, umfassend die sauren Glykolipide GM2 und GD2 sowie das melanosomale Glykoprotein gp75. Die immunisierende Zelllinie SK-MEL-29 exprimiert GD2 und gp75. Der Nachweis von IgG-Antikörpern, die durch eine Immunisierung induziert wurden, ist auch möglich, indem eine indirekte Messung der Helfer-T-Zell-Antworten erfolgt, denn für die Induktion von reifen IgG-Antworten mit hoher Affinität ist eine T-Zell-Hilfe durch CD4-positive T-Zellen erforderlich. Bei allen Patienten werden periphere Blutseren entnommen und damit eine serologische Analyse von Antikörpern durchgeführt, die gegen die Zelllinie SK-MEL-29 (wobei die Antikörper gegen GD2 und gp75 eingeschlossen sind) und autologe Tumorzellen gerichtet sind, sofern verfügbar. Außerdem wird eine Kontrolle auf eine positive Immunantwort mit Antikörpern gegen die allogenen MHC-Antigene der Klasse I und II durchgeführt, die durch SK-MEL-29 exprimiert werden. Es ist zu erwarten, dass die meisten Patienten starke IgG-Antworten gegen die Alloantigene der Klasse I und II entwickeln werden, die durch SK-MEL-29 exprimiert werden. Die Entwicklung von IgG-Antikörpern kann dann als ein indirektes Maß für die Induktion einer T-Zell-Helfer-Antwort gegen SK-MEL-29 dienen. Antikörper gegen Zelloberflächen- und intrazelluläres Antigen werden wie folgt nachgewiesen:
    • A. Immunfällung von 1% NP40-Zelllysaten von SK-MEL-29, die mit 35-Methionin metabolisch markiert wurden.
    • B. Gemischte Hämadsorptions-Tests für IgG- und IgM-Antikörper, die gegen Zelloberflächen-Antigene gerichtet sind (23 bis 27). Die Spezifität der Antworten auf MHC-Antigene werden getestet, indem autologe Epstein-Barr-Virus-transformierte AV-B-Lymphocyten oder AV-Fibroblasten eingesetzt werden.
  • Zelluläre Immunantworten
  • Bei ausgewählten Patienten, von denen autologe Tumorzellen verfügbar sind, können MHC-eingeschränkte zelluläre Immunantworten bestimmt werden. Ein Versuch soll gemacht werden, diejenigen Patienten aufzunehmen, von denen Kulturen von autologen Melanomzellen etabliert wurden, wobei diese jedoch bei den meisten Patienten nicht verfügbar sind. Obwohl die zellulären Immunantworten ein kritisches Maß für Immunantworten auf ein Melanom darstellen, gibt es die folgenden Einschränkungen: a) autologe Tumorzellen sind erforderlich, um die Antworten nachzuweisen; b) autologe normale Zellen und MHC-übereinstimmende allogene Zellen sind erforderlich, um die Spezifität der Antworten zu bestimmen; c) der Beweis von cytotoxischen oder Helfer-Antworten lässt sich nicht erbringen, ohne dass eine in vitro-Stimulation durch autologe Tumorzellen erfolgt – diese Voraussetzung macht es schwierig, die T-Zellen, die auf den Tumor angesprochen haben, von den Vorläufer-T-Zellen zu unterscheiden, die in der Lage sind, den Tumor zu erkennen, ohne dass sie in vivo darauf ansprechen. Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut werden durch eine Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation gereinigt. Die Zellen werden zusammen mit den autologen Tumorzellen, Interleukin-2, 20 bis 100 U/ml, und autologen oder allogenen Stimulatorzellen, wie beschrieben, 7 bis 14 Tage gezüchtet (Wolfel et al., 1989). Die folgenden Tests zur Feststellung der zellulären Immunfunktion werden in dem Fall durchgeführt, wenn autologe Tumorzellen verfügbar sind.
  • A. Tests auf Helfer-T-Zellen
  • Periphere Blut-Lymphocyten werden zusammen mit autologen Tumorzellen, autologen normalen Zellen und allogenen Tumorzellen (z. B. SK-MEL-29) 48 Stunden gezüchtet. Die Proliferation wird durch die Aufnahme von 3H-Thymidin in einem vierstündigen Puls am Ende des Tests gemessen. Ein weiteres Maß ist die Sekretion von Cytokinen während der gemeinsamen Kultivierung mit den Zielzellen. Die Produktion von Interleukin-2 wird durch einen „enzymverbundenen Immuntest" (ELISA) und durch Stimulation der Referenz-CTL-Zelllinie gemessen. Die Produktion von Interferon-γ wird durch einen ELISA gemessen. Die Freisetzung weiterer Cytokine kann durch ELISA gemessen werden, umfassend Interleukin-4, Interleukin-6, Tumornekrosefaktor-α und Granulocyten-Monocyten-koloniestimulierender Faktor.
  • B. Test auf cytotoxische T-Zellen
  • Die Cytotoxizität wird entweder in einem vierstündigen oder in einem 18-stündigen 51Chrom-Freisetzungstest gemessen (wie in der Referenz von Wolfel et al., 1989, beschrieben).
  • Kriterien für eine therapeutische Antwort
    • 1. Vollständige Antwort (CR): Verschwinden aller klinischen Hinweise auf einen Tumor bei der körperlichen Untersuchung, beim Röntgen und bei der biochemischen Auswertung mindestens vier Wochen lang.
    • 2. Teilweise Antwort (PR): Mehr als 50% Abnahme bei der körperlichen Untersuchung oder Radiographie (einschließlich CT-Aufnahme und/oder Ultraschall) der summierten Produkte der senkrechten Durchmesser aller gemessenen Läsionen, wobei dies für mindestens vier Wochen bestehen bleibt. Keine gleichzeitige Zunahme der Größe einer Läsion oder Auftreten einer neuen Läsion darf erfolgen.
    • 3. Geringere Antwort (MR): 25 bis 49% Abnahme der summierten Produkte der Durchmesser von gemessenen Läsionen mindestens vier Wochen lang.
    • 4. Stabile Erkrankung (STAB): Weniger als 25% Abnahme oder Zunahme der Tumorgröße mindestens drei Monate lang.
    • 5. Progression (PROG): Mehr als 50% Zunahme der Summe aller gemessenen Läsionen oder Auftreten von neuen Läsionen. Es ist zu beachten, dass der Patient beim Auftreten von oberflächlichen kutanen, subkutanen oder Weichteil-Läsionen mit einem Durchmesser von < 2 cm mit Zustimmung des Wissenschaftlers mit dem Impfprogramm fortfahren kann.
    • 6. Dauer der Antwort: Diese wird vom Beginn der Therapie bis zu einer 50% oder größeren Zunahme aus der kleinsten Summe aller Tumormessungen gemessen, die während der besten Antwort erhalten wurden (CR, PR, MR oder STAB).
  • Kriterien für eine Toxizität
  • Die Toxizität wird gemäß den Herkömmlichen Toxizitätskriterien (Anlage) anhand der folgenden Richtlinie eingeteilt und klassifiziert:
    0 Keine Toxizität.
    1+ Schwache Toxizität, normalerweise vorübergehend, macht keine spezielle Behandlung erforderlich und ist im Allgemeinen bei den üblichen täglichen Aktivitäten nicht störend.
    2+ Mittlere Toxizität, die sich durch einfache Maßnahmen abschwächen lässt.
    3+ Schwere Toxizität, die ein therapeutisches Eingreifen erforderlich macht und die üblichen Aktivitäten unterbricht. Eine Einweisung in die Klinik kann erforderlich sein, dies muss jedoch nicht der Fall sein.
    4+ Lebensbedrohende Toxizität, die eine Einweisung in die Klinik erforderlich macht. Eine Toxizität, die einen mit dem Arzneistoff zusammenhängenden Todesfall verursacht, wird mit 4F bezeichnet.
  • Unerwünschte Wirkungen
  • Bisher wurden bei Impfungen mit allogenen Tumorzellen nur minimale Nebenwirkungen festgestellt (Livingston, 1991). Die Patienten wiesen an der Impfstelle eine Verhärtung und ein Erythem auf. Es gab keine Berichte über eine anaphylaktische Überempfindlichkeit gegenüber allogenen Tumorzellen in vivo. In der einleitenden Studie zur Verabreichung von genetisch veränderten menschlichen Zellen an Patienten wurden keine weiteren Nebenwirkungen festgestellt, die eine Folge des Verfahrens waren, wobei kein lebensfähiges Retrovirus übertragen wurde (Rosenberg et al., 1990).
  • Sollten bei der Behandlung ernsthafte Nebenwirkungen auftreten, werden sie dem IRB des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center und dem Office for Protection from Research Risks des NIH innerhalb von 24 Stunden gemeldet werden, außerdem wird ein schriftlicher Bericht innerhalb von zehn Tagen nachgeschickt. Eine Kopie davon wird auch an das Office of Recombinant DNA Activities des NIH gesendet.
  • Biostatistische Überlegungen
  • Der Endpunkt dieser Pilotstudie wurde als klinische Toxizität definiert. Wie im Behandlungsplan angegeben, sollen mit jeder Dosierung sechs Patienten behandelt werden. Wenn bei drei Patienten eine Toxizität des Grades III oder IV auftritt (wie in den Herkömmlichen Toxizitätskriterien definiert), wird eine maximale tolerierte Dosis definiert und die Studie beendet. Bei allen Patienten wird die Immunantwort ausgewertet, wie in Auswertung der Immunantwort beschrieben, wobei diese Auswertung jedoch keinen messbaren Endpunkt darstellt.
  • Design und Probengröße
  • Etwa 12 Patienten sollen in diese Pilotstudie über Tumorzell-Impfungen aufgenommen werden. Zwei Dosierungen von Tumorzellen werden eingesetzt.
    Niedrige Dosis: 10 Millionen Tumorzellen
    Hohe Dosis: 50 Millionen Tumorzellen
  • Die maximale tolerierte Dosis wird als die Dosis der Vakzine definiert, bei der drei oder mehr Patienten eine Toxizität des Grades III oder IV aufweisen. Der Test wird mit der Bestimmung der maximalen tolerierten Dosis abgebrochen, oder er wird beendet, wenn die beiden Dosierungen vollständig durchlaufen wurden. Es ist zu erwarten, dass in dieser Studie möglicherweise kein MTD festgelegt wird.
  • Verfahren der Zustimmung
  • Alle Patienten müssen eine Erklärung unterschreiben, dass sie informiert wurden und zustimmen, wobei die Erklärung mit den Richtlinien der IRB übereinstimmen muss. Diese wissenschaftliche Studie wurde durch das IRB des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center und das Recombinant DNA Comittee des NIH geprüft. Der Wissenschaftler wird dem IRB und dem RAC Bericht erstatten über Änderungen im wissenschaftlichen Protokoll und alle unerwarteten Probleme, die Risiken für menschliche Individuen oder andere Personen in sich bergen können, außerdem werden ohne Zustimmung des IRB keine Änderungen in den wissenschaftliche Aktivitäten durchgeführt.
  • Dritte Serie von Experimenten
  • Ein durch einen retroviralen Vektor vermittelter Lymphokin-Gentransfer in menschliche Nierenkrebszellen
  • Einleitung
  • Die Verabreichung von Cytokinen kann in experimentellen Tiermodellen und bei Patienten eine Regression von primären und metastatischen Tumoren induzieren (Malkovska et al., 1989). Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass bestimmte Cytokine möglicherweise eine verstärkte Antitumor-Wirkung zeigen, wenn sie direkt am Ort des Tumors verabreicht werden (Forni et al., 1988), wobei die auf Tumorzellen zielende Cytokin-Gentherapie einen neuen Ansatz darstellt, mit dem dieses Ziel erreicht werden soll (Russe) et al., 1990). Der Transfer von Cytokin-Genen in Tumorzellen, der zu einer deutlich örtlich begrenzten Freisetzung von Cytokinen führt, stellt eine noch bessere Näherung an die physiologische Topologie der Cytokin-Sekretion im Verlauf einer Immunantwort dar. Murine Tumorzellen, die gentechnisch so verändert waren, dass sie IL-2 (Gansbacher et al., 1990; Fearon et al., 1990b; Karasuyame et al., 1988), IL-4 (Tepper et al., 1989), IL-7 (Hock et al., 1991), IFN-γ (Gansbacher et al., 1990a; Myatake et al., 1990), Tumornekrosefaktor-α (Asher et al., 1991) oder Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor (Colombo et al., 1991) produzierten, zeigten in vivo tatsächlich ein verlangsamtes oder gehemmtes Wachstum.
  • Der retroviral vermittelte Gentransfer stellt ein wirksames Verfahren zum Einführen von Genen in Säugerzellen dar, das zu einem stabilen Einbau in das Genom der Wirtszelle und zu einer fortwährenden Expression des codierten Proteins führt (McLachlin et al., 1990). Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde kürzlich gezeigt, dass eine lokale Sekretion des menschlichen IL-2 oder des murinen IFN-γ die Fähigkeit zur Tumorbildung der Cytokin-produzierenden murinen Fibrosarkoms CMS-5 außer Kraft setzte (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b), wobei es sich um einen schwach immunogenen, durch Methylcholanthren induzierten Tumor handelt, der von BALB/c-Mäusen stammte. Außerdem wurde eine lang anhaltende schützende Immunität gegen eine anschließende Tumorprovokation induziert (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b).
  • RCC bleibt ein gegen Chemotherapeutika resistenter Tumor, wobei die beschriebene mittlere Überlebenszeit von Patienten mit einem metastatischen RCC etwa zehn Monate beträgt (Maldazys et al., 1986). Kürzlich haben experimentelle und klinische Ergebnisse gezeigt, dass RCC relativ gut auf verschiedene Formen einer Immuntherapie anspricht (Graham, 1989), einschließlich einer Behandlung mit IL-2 mit oder ohne LAK-Zellen (Rosenberg et al., 1987) und IFN-γ (Aulitzky et al., 1989). Jedoch geht eine systemische Verabreichung von therapeutisch wirksamen Cytokin-Dosen häufig mit einer schweren Toxizität einher (Rosenberg et al., 1987). Eine Möglichkeit, die Immuntherapie von RCC zu verbessern, bestünde darin, die Cytokin-Freisetzung in vitro zielspezifisch direkt auf die Tumorzellen zu bringen. Um dies zu erreichen, wurden menschliche RC-Zelllinien unter Verwendung von retroviralen Vektoren mit den cDNAs für menschliches IL-2 oder IFN-γ transduziert. In diesem Bericht wurde gezeigt, dass eine ertolgreiche Expression von IL-2 und IFN-γ in menschlichen RC-Zellen erfolgte. Unter Verwendung dieser Zellen wurden in vitro der Einfluss des Lymphokin-Gentransfers auf das Antigenprofil der Tumorzellen und die Wirkung einer hochdosierten Gamma-Bestrahlung auf die Lebensfähigkeit der Tumorzellen, den Zellobertlächen-Phänotyp und die Lympokin-Produktion untersucht. Schließlich wurde die Fähigkeit zur Tumorbildung von xenotransplantierten parentalen und Lymphokin-freisetzenden RC-Zellen in einem Nackmaus-Modell ertorscht.
  • Material und Methoden
  • Zelllinien und Gewebekultur
  • Sieben menschliche RC-Zelllinien wurden für diese Studie ausgewählt. Die Zelllinien SK-RC-1, -9, -28, -29, -39, -44 und -49 wurden aus primären Proben einer Nephrektomie oder metastatischen Läsionen, wie früher beschrieben, etabliert (Ebert et al., 1990). Verschiedene Zelloberflächenmarker für diese Zelllinien sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die Zellen wurden in minimalem essentiellem Eagle-Medium gehalten, das mit 2 mM Glutamin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 100 Einheiten/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 10% FBS angereichert war.
  • Design retroviraler Vektoren und Infektion von Tumorzellen
  • DC/AD/R/IL2 wurde erzeugt, indem ein Minigen, enthaltend den menschlichen ADA-Promotor, die IL-2-cDNA und die Poly-A-Sequenzen, in die lange 3'-terminale Wiederholung in umgekehrter Orientierung cloniert wurden. Der ADA-Promotor ist ein 832 Basenpaar großes Fragment, das von dem menschlichen ADA-Gen durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Sspl und Ncol hergeleitet wurde (Wingington et al., 1983). Ein Poly-A-Signal, das ein 275 Basenpaar langes Smal-Alul-Fragment enthält, wurde von dem Plasmid PBC/CMV/IL hergeleitet (Cullen, 1986). Ein 528 Basenpaar langes DNA-Fragment, das die menschliche IL-2-cDNA codiert, wurde aus dem Plasmid PBCII/RSV/ΔT (Cullen, 1988) durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen RamHI und HindIII erhalten. Ein 852 Basenpaar großes DNA-Fragment, das den Promotor der Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus codiert, wurde aus dem Plasmid PHSV106 (McKnight, 1980) durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen RamHI und BgIII erhalten. Ein 794 Basenpaar langes DNA-Fragment, das den Promotor des menschlichen unmittelbaren frühen Haupt- („major immediate early human") Cytomegalievirus-Gens codiert, wurde aus dem Plasmid PRR23 (Wann et al., 1987) durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Ball und SmaI erhalten. N2 ist ein retroviraler Vektor, der aus dem Genom des murinen Moloney-Leukämievirus stammt, enthaltend das bakterielle Gen der Neomycin-Resistenz (neo), die als ein selektierbarer Marken eingesetzt wird (Armentano et al., 1987). Die Fusionsprodukte TKIL2 und TKIFNγ wurden in die MluI-Stelle cloniert, die im Polylinker innerhalb der langen 3'-terminalen Wiederholung eines modifizierten N2-Vektors vorliegt, wie von Hantzopoulos et al. beschrieben (Hantzopoulos et al., 1989), wodurch die Vektorkonstrukte DC/TKIL2 bzw. DC/TKIFNγ erzeugt wurden. Das Fusionsprodukt CMVIFNγ wurde in eine einmalige Xhol-Stelle cloniert, die stromabwärts von den neo-Gen-codierenden Sequenzen vorlag, wodurch das Vektorkonstrukt N2/CMVIFNγ erzeugt wurde (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b). Ein schematisches Diagramm ist in 7 zu sehen, wobei die verschiedenen Vektorkonstrukte dargestellt sind, die in dieser Studie verwendet wurden.
  • Die retroviralen Konstrukte wurden anhand von eingeführten Verfahren in das entsprechende Virus umgewandelt. Kurz gesagt wurde die Vektor-DNA in die helferfreie amphotrope Verpackungszelllinie AM12 transfiziert (Markowitz et al., 1988). Die Kolonien wurden durch eine G418-Selektion isoliert und zu Zelllinien expandiert, anschließend wurden die zellfreien Überstände auf das Vorliegen des Virus getestet. Diejenigen Zelllinien, die einen hohen Titer des Virus ausschieden (105 bis 106 neo koloniebildende Einheiten/ml), wurden durch eine G418-Selektion isoliert und zu Zelllinien expandiert, anschießend wurde die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ in den Zellüberstand durch einen Biotest oder Immuntest gemessen. Das Fehlen eines replikationskompetenten Virus in den Cytokin-produzierenden Tumorzellen wurde durch die Unfähigkeit deutlich gemacht, die G418-Resistenz auf NIH3T3-Zellen zu übertragen.
  • Test zum Nachweis von replikationskompetenten murinen Retroviren
  • Das Vorliegen von replizierenden murinen Retroviren in den Zellkulturüberständen von genmodifizierten RC-Zellen wurde unter Verwendung des NIH3T3-Amplifikationstests nachgewiesen. Dieser Test basiert auf der Entdeckung, dass sich ein replikationskompetentes ektotropes und amphotropes Retrovirus in NIH3T3-Zellen vermehrt. Kurz gesagt wurden NIH3T3-Zellen in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% FBS und 5 mM L-Glutamin gehalten; die Zellen wurden mit 1 × 105 Zellen/Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen 12 Stunden gezüchtet, danach erfolgte die Exposition mit den Proben. Hierfür wurde pro Vertiefung jeweils 1 ml der Überstandsproben zugegeben, die von den genmodifizierten menschlichen RC-Zellen abgenommen worden waren; Polybrene (8 μg/ml) wurde verwendet, um die virale Infektion zu verstärken. Als negative Kontrollen wurden die gebrauchten Medien der NIH/3T3-Zellen und der Verpackungszelllinie AM12 und außerdem das Dulbecco modifizierte Eagle-Medium alleine eingesetzt; als positive Kontrollen wurden die Überstände der Helfervirus-Erzeugerzelllinien SAX-2 und SAX-3 und der Erzeugerzelllinie AM12/ETAR29 verwendet. Nach der Infektion wurden die Medien abgenommen und 5 ml eines frischen Mediums zugegeben. Die Zellen wurden 1 : 5 aufgeteilt, sobald sie konfluent waren, und drei Wochen inkubiert. Wenn die Platten am Ende der dritten Woche konfluent waren, wurde ein frisches Medium zu den Vertiefungen zugegeben und 12 Stunden später wieder abgenommen, um die Aktivität der reversen Transkriptase zu bestimmen.
  • Die Aktivität der reversen Transkriptase wurde bestimmt, indem 10 μl des Probenmediums mit 40 μl 50 mM Tris, pH 8,0, 20 mM Dithiothreit, 0,6 mM MnCl2, 60 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40, 5 μg/ml Oligo-dT, 10 μg/ml Poly-A, 62 μM dTTP und 10 μM [32P]-dTTP (3000 Ci/m; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA) eine Stunde bei 37°C inkubiert wurden. Die negativen Kontrollen mit den zugegebenen Medien alleine dienten dazu, jeweils den Wert des Hintergrunds zu bestimmen. Anschließend wurden 10 μl des Reaktionsgemisches auf eine DEAE DE81-Filterscheibe getüpfelt und diese zweimal mit 1 × Standard-Kochsalzlösung-Citrat (0,15 M Natriumcitrat, pH 7,4) 30 Minuten bei 25°C gewaschen. Nach Spülen mit 95 % Ethanol wurden die Filterscheiben an der Luft getrocknet und danach die Radioaktivität der Filter nachgewiesen, indem sie drei bis fünf Stunden mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht wurden und außerdem die Radioaktivität durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt wurde.
  • Test auf menschliches IL-2
  • Die Überstände von semikonfluenten parentalen oder Lymphokinsekretierenden Tumorzellen in einer 6-cm-Platte wurden nach 48 bis 72 Stunden abgenommen und auf das menschliche IL-2 getestet, indem IL-2-abhängige menschliche primäre Lymphoblasten in einem Proliferationstest eingesetzt wurden, wie früher beschrieben (Gansbacher et al., 1990b). Die aus dem Biotest erhaltenen Ergebnisse wurden durch einen enzymverbundenen Immunadsorptionstest bestätigt (Genzyme, Boston, MA). Die Aktivität von IL-2 wurde im Biotest durch DMS-1 gehemmt, wobei es sich um einen neutralisierenden mAB gegen menschliches IL-2 handelt (Smith et al., 1983).
  • Test auf menschliches IFN-γ
  • Die Überstände, die durch den Test auf menschliches IL-2 getestet worden waren, wurden außerdem auf menschliches IFN-γ analysiert. Der Biotest auf menschliches IFN-γ beruht auf der antiviralen Aktivität im Zellkulturüberstand, die durch die Abschwächung der cytopathischen Effekte des vesikulären Stomatitis-Virus bestimmt wurde, wobei diese Abschwächung der cytopathischen Effekte des vesikulären Stomatitis-Virus auf WISH-Zellen bestimmt wurde (Rubinstein et al., 1987). Die Ergebnisse wurden durch einen im Handel verfügbaren Radioimmuntest auf menschliches IFN-γ bestätigt (Centocor, Malvern, PA). Die Bioaktivität des menschlichen IFN-γ im Überstand wurde durch einen neutralisierenden murinen Antikörper blockiert, der für das menschliche IFN-γ spezifisch ist (Olympus, Lake Success, NY).
  • Analyse der Zelloberflächen-Antigene durch indirekte Immunfluoreszenz und FACS
  • Die Expression von nierenassozierten Antigenen, MHC-Determinanten der Klasse I und der Klasse II, ICAM-1 (CD54) und VLA-β1 auf RC-Zelllinien wurde durch indirekte Immunfluoreszenz bestimmt (Ebert et al., 1990; Finstad et al., 1985). Die folgenden murinen mAB wurden als primäre Antikörper eingesetzt: URO-2, URO-3, URO-4, URO-8 und G250, die alle nierenassoziierte Antigene nachweisen (Finstad et al., 1985; Banden, 1989); W6/32 (Anti-HLA-A, B, C) (Brodsky und Parham, 1982); NAMB-1 (Anti-β2-Mikroglobulin; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); Anti-HLA-DR, -DP und -DQ (Olympus); OKT 27 (Anti-ICAM-1; Ortho Diagnostics, Raritan, NJ); und AJ2 (Anti-VLA-β1) (Cairncross et al., 1982). Die Zellen, die entweder auf Terasaki-Platten mit 60 Vertiefungen plattiert oder in PBS suspendiert waren, wurden zusammen mit dem primären Antikörper 60 Minuten inkubiert, in PBS gewaschen und danach mit einem affinitätsgereinigten Fluoresceinisothiocyanatkonjugierten Anti-Maus-IgG des Kaninchens (Verdünnung von 1 : 50; Dako Corp., Santa Barbara, CA) 45 Minuten inkubiert. Die Zellen, die an die Terasaki-Platten angeheftet waren, wurden anhand eines Fluoreszenzmikroskops ausgewertet, die in Suspension vorliegenden Zellen wurden unter Verwendung eines FACS 440-Systems analysiert (Becton Dickinson FACS Division, Sunnyvale, CA). Als Kontrolle diente PBS, die anstelle des mAB-Reagens eingesetzt wurde.
  • Bestrahlung der gezüchteten Zellen
  • Parentale und Lymphokin-produzierende SK-RC-29-Zellen (0,25 × 106 Zellen/Vertiefung) wurden 24 Stunden vor der Bestrahlung in den Gewebekulturplatten mit zahlreichen Vertiefungen Falcon 3045 (Falcon Labware, Oxnard, CA) plattiert und bei Raumtemperatur mit einem 6-MV Varian CL6-100- Linearbeschleuniger bei einer Dosisleistung von 100 Rad/Min. bestrahlt. Testdosen von 5 000 oder 10 000 Rad wurden eingesetzt. Die bestrahlten Zellen wurden 22 Tage bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO2 gezüchtet. Die Kulturüberstände wurden 3, 12 und 22 Tage nach der Bestrahlung abgenommen und die Zellen jeden dritten Tag mit 1 ml/Vertiefung eines frischen essentiellen Minimalmediums gefüttert, das 10% FBS enthielt. Die gebrauchten Medien wurden bei –20°C eingefroren, bis sie getestet wurden. Parallel dazu wurden die Zellen aus Dreifach-Kulturen 1, 12 und 22 Tage nach der Bestrahlung mit Trypsin behandelt und die Zahl der lebensfähigen Zellen durch Lichtmikroskopie anhand des Trypanblau-Ausschlusses ermittelt. Bestrahlte Zellen, die in getrennten Vertiefungen gezüchtet worden waren, wurden 1, 7 und 14 Tage nach der Bestrahlung für die FACS-Analyse geerntet.
  • Tumorbildung in Nacktmäusen
  • SK-RC-29-Zellen (0,005 × 106, 0,05 × 106 oder 0,5 × 106) wurden s. c. in vier bis sechs Wochen alte männliche, von BALB/c stammende Nacktmäuse injiziert. Über diese RC-Zelllinie wurde berichtet, dass sie in BALB/c-Nacktmäusen nichtmetastasierende s. c.-Tumoren bildet (Ebert et al., 1990). Fünf Wochen nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und das Gewicht des Tumors wurde bestimmt.
  • Immunhistochemische Analyse
  • Fünf Wochen nach der s. c.-Injektion von parentalen oder genmodifizierten SK-RC-29-Zellen in die BALB/c-Nacktmäuse wurden die Tumoren entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, in eine OCT-Zusammensetzung eingebettet (Miles, Inc., Eklhart, IN) und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert. Die mit einem Kryostaten angelegten Gewebeschnitte (6 μm) wurden an der Luft getrocknet, in kaltem Aceton fixiert und mit 0,03% H2O2 behandelt, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu entfernen. Für den Nachweis der endogenen Peroxidase-positiven Zellen wurden die Vorbehandlung mit H2O2 und die Färbung mit einem primären mAB weggelassen, vielmehr wurde Diaminobenzidin unmittelbar zu den Gewebeschnitten zugefügt. Parallel dazu wurden Gewebeschnitte durch das indirekte Immunperoxidase-Verfahren gefärbt, das früher beschrieben wurde (Finstad et al., 1985). Kurz gesagt wurden die Schnitte 90 Minuten mit einem biotinylierten mAB der Maus, der für HLA-DR spezifisch war (Olympus), oder mit einem biotinylierten mAB der Ratte inkubiert, der murine Gewebemakrophagen nachwies (Clon AL-21; Pharmingen, San Diego, CA). Als Kontrolle diente PBS, die anstelle des primären Antikörpers eingesetzt wurde. Nach Waschen der Schnitte mit PBS wurden die biotinylierten Antikörper durch Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Avidin (Verdünnung von 1 : 400; Dako Corp.) in 45 Minuten nachgewiesen. Die Antigen-Antikörper-Komplexe wurden unter Verwendung von Diaminobenzidin in Gegenwart von H2O2 als Chromogen und Harris-Hämatozylin als Gegenfärbung sichtbar gemacht.
  • Experimentelle Ergebnisse
  • Analyse von genmodifizierten RC-Zellen auf das Vorliegen eines replikationskompetenten murinen Retrovirus
  • Ein replikationskompetentes murines Retrovirus könnte möglicherweise während der experimentellen Verfahren in menschlichen Zellen durch eine Rekombination mit endogenen Retrovirus-ähnlichen Partikeln entstehen. Deshalb wurde das Vorliegen eines replikationskompetenten murinen Retrovirus in den gebrauchten Medien der RC-Zelllinien SK-RC-9, -28, -29 und -39 getestet, die 21 bis 28 Tage vorher mit DC/AD/R/IL2 transduziert worden waren. Kein replikationskompetentes murines Retrovirus wurde unter Verwendung des NIH/3T3-Amplifikationstests nachgewiesen (8).
  • Expression und Freisetzung von IL-2 oder IFN-γ aus den genmodifizierten RC-Zellen
  • Zwei retrovirale Vektorkonstrukte, die die menschliche IL-2-cDNA enthielten, und zwei Konstrukte, die die menschliche IFN-γ cDNA trugen, wurden eingesetzt, um diese Lymphokin-Gene in menschliche RC-Zellen zu überführen (7). Für diese Studie wurden sieben menschliche RC-Zelllinien ausgewählt, die verschiede nierenassoziierte Antigene exprimierten (Tabelle 4).
  • Tabelle 4 Zelloberflächenantigen-Phänotyp von menschlichen RC-Zellliniena
    Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Die Ergebnisse der infizierten Zelllinien und die Vektorkonstrukte sind in Tabelle 5 zusammengestellt.
  • Tabelle 5 Lymghokin-Freisetzung durch Vektor-transduzierte menschliche RC-Zellliniena
    Figure 00610002
  • Die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ wurde bestimmt, indem die Lymphokin-Konzentrationen in den Zellkulturüberständen anhand eines geeigneten Biotests gemessen wurden. Die Ergebnisse wurden dann mit einem enzymverbundenen Immunadsorptionstest für IL-2 oder mit einem Radioimmuntest für IFN-γ bestätigt. Dabei wurde gefunden, dass die RC-Zelllinien, die mit den retroviralen Konstrukten infiziert worden waren, welche die IL-2-cDNA enthielten, variable Mengen des biologisch aktiven IL-2 abgaben, dies stimmt mit früheren Ergebnissen überein (Gansbacher et al., 1990b). Die mit dem Konstrukt N2/CMVIFNγ modifizierten SK-RC-29-Zellen setzten mäßige Mengen von IFN-γ frei. Somit stellen in Übereinstimmung mit den früheren Ergebnissen (Gansbacher et al., 1990a; Gansbacher et al., 1990b) sowohl der Typ der Zielzelle als auch das Design des Vektorkonstrukts wichtige Parameter dar, wenn die Wirksamkeit der Expression von transfizierten Lymphokin-Genen bestimmt werden soll.
  • Wirkung der Lymphokin-Sekretion durch Tumorzellen auf ihr Antigenprofil
  • Tumorassoziierte Antigene, MHC und Adhäsionsmoleküle sind kritische Determinanten für die Immunogenität von Tumorzellen. Um die Wirkung der Lymphokin-Sekretion auf solche Marken, die durch menschliche RC-Zellen exprimiert werden, bewerten zu können, wurden das Antigenprofil der parentalen RC-Zelllinien und ihrer Lymphokin-sekretierenden Varianten durch indirekte Immunfluoreszenz und FACS-Analyse untersucht. Als repräsentatives Beispiel dienen die mit der Zelllinie SK-RC-29 erhaltenen Ergebnisse, die im Folgenden ausführlich beschrieben werden (Tabelle 6).
  • Tabelle 6 Zelloberflächenexpression von MHC-Antigenen und Adhäsionsmolekülen auf parentalen und Lymphokin-sekretierenden SK-RC-29-Zellena
    Figure 00620001
  • exprimieren konstitutiv verschiedene nierenassoziierte Antigene, MHC-Antigene der Klasse I und Zelladhäsionsmoleküle, exprimieren jedoch keine MHC-Determinanten der Klasse II (Tabelle 4). Die Expression von nierenassoziierten Antigenen auf SK- RC-29-Zellen wurde durch die Expression eines Lymphokins nicht beeinträchtigt (Ergebnisse nicht dargestellt). Genauso hatten IL-2-freisetzende SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt CD/TKIL2 enthielten, keine nachweisbare Wirkung auf die Expression von MHC-Antigenen und Adhäsionsmolekülen (Tabelle 6). Jedoch war eine effiziente Expression von IFN-γ durch die SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt N2/CMVIFNγ enthielten, mit einer gesteigerten Expression von HLA-ABC, β2-Mikroglobulin und ICAM-1 assoziiert, und außerdem einer neo-Expression von HLA-DR- und DP-Molekülen, eine Expression von HLA-DR war auf IFN-γ produzierenden SK-RC-29-Zellen nachweisbar, die in vitro und in vivo gewachsen waren (vgl. 13e). Das Markerprofil der SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt DC/TKIFNγ enthielten und nur minimale Mengen von IFN-γ freisetzten, war nicht von dem Profil der parentalen Zellen zu unterscheiden (Tabelle 3).
  • Überleben, Lymphokin-Sekretion und Immunogenität von RC-Zellen nach einer hochdosierten Gamma-Bestrahlung
  • Für eine zukünftige Impfung von Patienten mit Lymphokin-sekretierenden allogenen und autologen Tumorzellen sind Verfahren erforderlich, mit denen eine Tumorbildung durch die genmodifizierten Tumorzellen in vivo verhindert werden kann. Solche Schutzverfahren sollten jedoch nicht die Fähigkeit der genmodifizierten Tumorzellen zur Sekretion von Lymphokinen einschränken, und sie sollten nicht ihre Immunogenität aufheben. Die hochdosierte Gamma-Bestrahlung stellt ein Verfahren dar, mit dem dieses Ziel erreicht werden kann. Deshalb wurde die Wirkung der Gamma-Bestrahlung auf das Überleben, die Lymphokin-Produktion und die Expression des HLA-DR-Antigens von Lymphokin-Gen-modifizierten SK-RC-29-Zellen untersucht. Die parentalen und Lympokin-freisetzenden SK-RC-29-Zellen wurden mit einer hohen Zelldichte (0,25 × 106 Zellen/ml) in Platten mit zahlreichen Vertiefungen plattiert und sodann mit 5 000 oder 10 000 Rad bestrahlt. Die Überlebenskurven der bestrahlten parentalen und Lymphokin-produzierenden SK-RC-29-Zellen sind in 9 dargestellt. 22 Tage nach der Bestrahlung waren noch 13% (Mittelwerte im Bereich von 6 bis 20%) der Lymphokin-sekretierenden Tumorzellen lebensfähig, dies wurde durch eine Trypanblau-Färbung festgestellt, wobei diese überlebenden Zellen jedoch wachstumsgehemmt blieben und innerhalb von fünf Wochen nach der Bestrahlung abstarben (Ergebnisse nicht dargestellt).
  • Um die Wirkung der Gamma-Bestrahlung auf die Lymphokin-Freisetzung zu bestimmen, wurde die Konzentration von IFN-γ in den Zellüberständen gemessen, die vor und 3, 12 und 22 Tage nach der Bestrahlung gewonnen worden waren. Wie in 10 dargestellt ist, war die Sekretion von IFN-γ an den Tagen 3 und 12 (nach der Bestrahlung mit 5 000 Rad) sogar noch gesteigert und nahm bis zum Tag 22 ab, dies legt nahe, dass die Biosynthese und Freisetzung dieses Lymphokins in den wachstumsgehemmten Tumorzellen, die die Gamma-Bestrahlung überlebt haben, noch weiterläuft.
  • Um die Wirkung der Bestrahlung auf die Expression von Lymphokininduzierten Zelloberflächen-Antigenen zu beurteilen, wurde die Expression des HLA-DR-Antigens auf parentalen und IFN-γ produzierenden SK-RC-29-Zellen vor und 1, 7 und 14 Tage nach der Gamma-Bestrahlung bestimmt. Gleichzeitig mit einer anhaltenden Freisetzung von IFN-γ aus den bestrahlten SK-RC-29-Zellen, die das Konstrukt N2/CMVIFNγ enthalten, wurde auf diesen Zellen nach der Bestrahlung eine intensivere Färbung auf HLA-DR gefunden (11B ). Die Gamma-Bestrahlung induzierte jedoch keine neo-Expression von HLA-DR auf parentalen (11A) oder IL-2-sekretierenden Zellen (Ergebnisse nicht dargestellt).
  • Wirkung eines retroviral vermittelten Gentransfers auf die Fähigkeit zur Tumorbildung von RC-Zellen in Nacktmäusen
  • Für parentale SK-RC-29-Zellen wurde gezeigt, dass sie in BALB/c-Nacktmäusen Tumoren ausbilden (Ebert et al., 1990). Aus diesem Grund wurde diese Zelllinie ausgewählt, um die Wirkung einer Lymphokin-Produktion durch Tumorzellen auf die Fähigkeit zur Tumorbildung von parentalen und Lymphokinsekretierenden SK-RC-29-Zellen zu untersuchen. Vier bis sechs Wochen alte männliche BALB/c-nu/nu-Mäuse erhielten s. c.-Injektionen mit verschiedenen Mengen von parentalen und Vektor-modifizierten SK-RC-29-Zellen, nach fünf Wochen wurden die Mäuse auf eine Bildung von Tumoren untersucht. Die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten sind in 12 zusammengestellt. Weder die parentalen noch die Lymphokin-produzierenden SK-RC-29-Zellen, die mit der geringsten Dosis verabreicht worden waren (0,005 × 106 Zellen pro Maus), erzeugten Tumoren, wobei diese Mäuse während des Beobachtungszeitraums von 12 Wochen tumorfrei blieben.
  • Jedoch ergab die Injektion von 0,05 × 106 oder von 0,5 × 106 oder von 0,5 × 106 Tumorzellen pro Maus einen deutlichen Unterschied in der Tumorbildung bei den Tieren, die entweder die parentalen oder die Lymphokin-produzierenden SK-RC-29-Zellen erhalten hatten. Während die parentalen und die menschliches IFN-γ sekretierenden SK-RC-29-Zellen große s. c.-Tumoren bildeten, zeigten die Mäuse, die Injektionen mit den IL-2-sekretierenden SK-RC-29-Zellen erhalten hatten, keine makroskopisch sichtbaren Tumoren. Dieses Ergebnis war in zahlreichen anderen Experimenten reproduzierbar, bei denen die Nacktmäuse mit verschiedenen RC- oder Melanomzelllinien infiziert wurden, die mit einem IL-2-Vektor transduziert worden waren (Gansbacher et al., 1992). Bei der mikroskopischen Untersuchung der Injektionsstelle bei den Tieren, denen die höchste Dosis der IL-2-produzierenden Tumorzellen injiziert worden war, waren kleine Aggregate von Tumorzellen zu sehen, die bei der immunhistologischen Untersuchung ein starkes peritumorales Infiltrat von Peroxidase-positiven mononukleären Zellen zeigten (13b). Ein Hauptteil dieser tumorinfiltrierenden Wirtszellen wurde mit einem mAB der Ratte positiv angefärbt, der für murine Gewebemakrophagen spezifisch war (7d). Im Gegensatz dazu waren keine solchen peri- oder intratumoralen Akkumulationen von tumorinfiltrierenden Zellen bei den Tieren zu sehen, bei denen Tumorknoten entstanden, die von parentalen oder von IFN-γ freisetzenden SK-RC-29-Zellen stammten (13a und c). Mäuse, die mit SK-RC-29-Zellen inokuliert worden waren, die das Konstrukt DC/TKIL2 enthielten, blieben im Beobachtungszeitraum von 12 Wochen makroskopisch frei von Tumoren.
  • Diskussion der Experimente
  • Verschiedene Vorgehensweisen können genutzt werden, um in einem Wirt eine Antitumor-Immunität zu induzieren. Eine Möglichkeit besteht in der systemischen Verabreichung von Cytokinen oder der adoptiven Übertragung von LAK-Zellen in den tumorenthaltenden Wirt (Rosenberg et al., 1987). Andererseits können die Tumorzellen selbst und das Immunsystem des Wirts in situ so manipuliert werden, dass eine Antitumor-Antwort des Wirts induziert wird (Forni et al., 1988; Russel et al., 1990). Entsprechend der zweiten Vorgehensweise wurde kürzlich eine Strategie beschrieben, wobei in Versuchstieren eine spezifische zellvermittelte Antitumor-Immunität durch eine auf Tumorzellen zielende Cytokin-Therapie induziert wurde. Eine konstitutive Sekretion von IL-2 (Gansbacher et al., 1990b; Fearson et al., 1990), IL-4 (Tepper et al., 1989), IL-7 (Hock et al., 1991) und IFN-γ (Gansbacher et al., 1990a; Myatake et al., 1990) aus genetisch modifizierten murinen Tumorzellen setzte ihre Fähigkeit zur Tumorbildung in syngenen Tieren außer Kraft und induzierte in vivo eine spezifische und persistierende T-Zellvermittelte Antitumor-Antwort. In klinischen Studien bewiesen Lymphokine, IL-2 und IFN-γ, dass sie bei einer Untergruppe von Patienten mit fortgeschrittenem RCC Remissionen induzieren können (Graham, 1989; Rosenberg et al., 1987; Aulitzky et al., 1989; Topalian et al., 1988). Beim größten Teil der Patienten war eine hochdosierte systemische Lymphokin-Therapie jedoch unwirksam und ging außerdem mit einer schweren Toxizität einher (Graham, 1989; Rosenberg et al., 1987; Topalian et al., 1988).
  • Da eine lokale Freisetzung von Lymphokinen durch Tumorzellen einen attraktiven alternativen Ansatz für eine Tumor-Immuntherapie darstellt, wurde RCC als ein Krankheitsmodell gewählt, um zu bestimmen, ob es möglich ist, Lymphokin-Gene in menschliche RC-Zellen einzuführen. In diesem Bericht wird gezeigt, dass ein durch einen retroviralen Vektor vermittelter Transfer von cDNA für IL-2 oder IFN-γ in menschliche RC-Zellen durchführbar ist und zur Herstellung von biologisch aktiven Lymphokinen führt. Die beiden Cytokine IL-2 (Rees und Wiltrout, 1990) und IFN-γ (Trinchieri et al., 1985) werden physiologisch durch aktivierte Helfer-T-Lymphocyten produziert und spielen bei der Induktion von zellvermittelten Immunantworten eine kritische Rolle. IL-2 stimuliert die Proliferation und die lytische Kapazität von NK-Zellen (Trinchieri, 1989) und T-Lymphocyten (Erard, 1985), und es induziert die Differenzierung von NK-Zellen zu LAK-Zellen (Grimm et al., 1982). Belldegrun et al. (Belldegrun et al., 1988) konnten in tumorinfiltrierenden Lymphocyten, die in vitro mit IL-2 aktiviert worden waren, eine starke tumorizide Aktivität gegen autologe RC-Zellen zeigen, wobei jedoch IL-2 keine direkte cytotoxische oder cytostatische Wirkung auf neoplastische Zellen aufwies. IFN-γ ist ein pleiotropes Lymphokin, das die Aktivierung und Differenzierung von cytotoxischen T-Lymphocyten fördert (Chen et al., 1986; Catalon et al., 1981), und es verstärkt die tumorizide Wirkung von NK-Zellen (Catalon et al., 1981) und Makrophagen (Adams und Hamilton, 1987). Außerdem induziert oder verstärkt IFN-γ die Expression von MHC-Antigenen der Klasse I und der Klasse II (Wallach et al., 1982) und von Zelladhäsionsmolekülen (Tomita et al., 1990; Mortarini et al., 1990). Die Hinaufregulation dieser Zelloberflächenmoleküle kann die Fähigkeit von malignen Zellen zur Antigenpräsentation steigern (Ostrand-Rosenbert et al., 1990; Alexander et al., 1989) und ihre Empfänglichkeit für eine Lyse durch cytotoxische T-Lymphocyten erhöhen (Hayashi et al., 1985; Vanky et al., 1988). Außerdem vermittelt IFN-γ auf einigen Typen von Tumorzellen einen direkten antiproliferativen Effekt (Wadler und Schwanz, 1990).
  • In dieser Studie werden zwei wichtige Aspekte der Lymphokin- und Tumorbiologie unter die Lupe genommen: (a) die Regulation der Expression von immunregulatorischen Zelloberflächenmolekülen auf Tumorzellen; und (b) die Lymphokin-induzierte Modulation des Tumorwachstums in vivo. Kürzlich wurde beschrieben, dass die Expression von MHC-Antigenen der Klasse I in IFN-γ sekretierenden murinen CMS-5-Zellen nach oben reguliert ist und möglicherweise für ihre abgeschwächte Fähigkeit zur Tumorbildung in syngenen Mäusen verantwortlich ist, da die Tumorabstoßung mit einer starken tumorspezifischen cytotoxischen T-Zell-Antwort assoziiert war (Gansbacher et al., 1990a). Wie in dieser Studie gezeigt wird, verstärkt das durch die SK-RC-29-Zellen freigesetzte IFN-γ nicht nur die Expression von MHC-Antigenen der Klasse I, sondern es induziert auch die Expression von MHC-Molekülen der Klasse II (HLA-DR und -DP) und reguliert die Expression von ICAM-1 nach oben. Die Modulation von MHC-Antigenen der Klasse II und von ICAM-1-Antigenen auf Tumorzellen scheint besonders wichtig zu sein, da (a) menschliche Tumorzellen, die MHC-Antigene der Klasse II exprimieren, die Fähigkeit annehmen können, den Helfer-T-Lymphocyten lösliche Antigene zu präsentieren (Vanky et al., 1988), und da (b) mit antigenpräsentierenden Zellen, die HLA-DR und ICAM-1 gemeinsam exprimierten, eine wirksamere Antigenpräsentation erhalten wurde (Altmann et al., 1989). Diese Studien legen nahe, dass bei einer Expression von tumorspezifischen neo-Antigenen durch menschliche Tumorzellen die gleichzeitige Expression von MHC-Determinanten der Klasse I und der Klasse II und außerdem von ICAM-1 bewirken könnte, dass diese für MHC-eingeschränkte Helfer- (Ostrand-Rosenberg et al., 1990; Alexander et al., 1989) und cytotoxische T-Lymphocyten zugänglich werden ( Hayashi et al., 1985; Vanky et al., 1988). Hierdurch könnte das Immunsystem des Wirts in die Lage versetzt werden, in vivo eine zellvermittelte Antitumor-Antwort zu erzeugen.
  • Die Wirkung einer lokalen Lymphokin-Freisetzung auf die Tumorbildung durch xenotransplantierte menschliche RC-Zellen wurde in einem Nacktmaus-Modell untersucht. In vitro-Studien zeigten, dass die Wachstumsrate der menschlichen RC-Zellen durch einen retroviralen Transfer und eine Expression des menschlichen IFN-γ oder IL-2-Gens unter keinen Umständen verringert wurde (Ergebnisse nicht dargestellt). Jedoch wurde die Fähigkeit zur Tumorbildung von menschlichen SK-RC-29-Zellen, die s. c. in BALB/c-Nacktmäuse injiziert wurden, durch eine lokale Freisetzung des menschlichen IL-2 außer Kraft gesetzt (12). Es ist auffallend, dass sogar die Sekretion von kleinen Mengen des menschlichen IL-2 aus den s. c. injizierten SK-RC-29-Zellen ausreichte, um Makrophagen lokal anzuziehen und die Tumorbildung zu unterdrücken (13, b und d). In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass für IL-2 früher schon gezeigt wurde, dass es in vitro die cytolytische Aktivität von menschlichen (Malkovsky et al., 1987) und murinen (Verstovsek et al., 1992) Makrophagen stimuliert und dass es in vivo die Proliferation und Differenzierung von murinen Makrophagen-Vorläufern steigert (Baccharini et al., 1989).
  • In Nacktmäusen, denen parentale oder IFN-γ freisetzende SK-RC-29-Zellen inokuliert worden waren, entwickelten sich große Tumoren ohne tumorinfiltrierende Wirtszellen (13, a und c). Dieses Ergebnis lässt sich mit der früheren Beobachtung vereinbaren, dass die parentalen SK-RC-29-Zellen tumorigen sind, wenn sie in Nacktmäuse injiziert werden (Ebert et al., 1990), und dass das menschliche IFN-γ, anders als das IL-2, artspezifisch ist und deshalb nicht in der Lage ist, bei Mäusen tumorregulatorische Funktionen auszuüben (Langer und Pestka, 1988).
  • Für die einführende klinische Studie mit Lymphokin-sekretierenden menschlichen RC-Zellen als eine Lebendzell-Vakzine sind Schutzvorrichtungen erforderlich, um jegliche tumorigene Kapazität außer Kraft zu setzen. Eine hochdosiserte Gamma-Bestrahlung bietet sich als ein durchführbares Verfahren an, mit dem das Wachstumspotential von RC-Zellen außer Kraft gesetzt werden kann, während gleichzeitig ihre metabolische Aktivität und Antigenität über einen begrenzten Zeitraum erhalten bleibt. Eine in vitro durchgeführte Gamma-Bestrahlung mit 5 000 oder 10 000 Rad tötete 100% der SK-RC-29-Zellen innerhalb von fünf Wochen ab. Jedoch überlebte ein signifikanter Anteil der Lymphokin-freisetzenden Tumorzellen noch drei Wochen, wobei sie jedoch wachstumsgehemmt waren ( 9). Wie in einer anderen Veröffentlichung berichtet wird (Gansbacher et al., 1992), blieb das Muster der IL-2- oder IFN-γ Sekretion durch die Lymphokin-Genmodifizierten menschlichen Tumorzellen nach der Gamma-Bestrahlung fast identisch. Die Lymphokin-Freisetzung aus den bestrahlten Tumorzellen hielt etwa drei bis vier Wochen an. Dieser Zeitraum ist möglicherweise ausreichend, um in vivo eine lokale Lymphokin-Freisetzung und Immunstimulation bereitzustellen.
  • Tests wurden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die transduzierten RC-Zelllinien keine replikationskompetenten Helferviren freisetzen. Unter Verwendung des NIH/3T3-Amplifikationstests, mit dem ein einzelnes replikationskompetentes Viruspartikel pro ml Testmedium nachgewiesen werden kann, wurde gefunden, dass kein replikationskompetentes Virus durch die genmodifizierten menschlichen RC-Zelllinien produziert wurde, für die gezeigt worden war, dass sie frei von menschlichem Immundefizienzvirus, Zytomegalie-Virus und Hepatitis-Viren waren.
  • Diese Ergebnisse machen deutlich, dass der durch einen retroviralen Vektor vermittelte Gentransfer eine durchführbare und sichere Vorgehensweise darstellt, um Lymphokin-Gene in menschliche RC-Zellen einzuführen. Während die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der Zelloberfläche der Lymphokin-Gen-modifizierten Tumorzellen erhalten bleiben, bietet die hochdosierte Gamma-Bestrahlung ein einfaches Verfahren, mit dem eine sichere Lebendzell-Vakzine für die in vivo-Immunisierung hergestellt werden kann. Die Wirkung von IL-2 oder IFN-γ, die aus den RC-Zellen örtlich begrenzt freigesetzt werden, auf die Immunzellen des Wirts und die Hinaufregulation der immunregulatorischen Zelloberflächenmoleküle auf den RC-Zellen könnten in vivo sowohl eine lokale als auch eine systemische Antitumor-Immunantwort stimulieren. Unter Berücksichtigung der kürzlichen Ergebnisse, die zeigen, dass unbehandelte Krebspatienten bereits zirkulierende tumorspezifische T-Zellen besitzen (Coulie et al., 1992), ist es durchaus möglich, dass eine aktive Immunisierung mit solchen Lympokin-Gen-modifizierten Tumorzellen die Zahl dieser Efffektorzellen erhöht. Diese Vermutung wird durch die Versuchsergebnisse deutlich erhärtet, die kürzlich mit P815-Mastozytomenthaltenden Mäusen erhalten wurden, wobei die Häufigkeit der zirkulierenden tumorspezifischen Vorläufer- und reifen cytotoxischen T-Lymphocyten durch eine Impfung mit Tumorzellen, die mit der murinen IL-2-cDNA transfiziert waren, signifikant erhöht werden konnte (Ley et al., 1991). Außerdem stand diese zelluläre Immunantwort bei immunisierten Tieren in einem engen Zusammenhang mit einer Tumorabstoßung und einer langfristigen tumorspezifischen Immunität.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ein Fortschritt in der Entwicklung von Tumorvakzinen gemacht wurde. Nun sind Cytokin-sekretierende Tumorzellen für eine klinische Anwendung in Impfprotokollen verfügbar. Somit sind Studien der Phase I gerechtfertigt, mit denen die Durchführbarkeit und die Sicherheit dieser neuen therapeutischen Vorgehensweise bestimmt werden können.
  • Vierte Serie von Experimenten
  • Politstudie zur Immunisierung mit Interleukin-2-sekretierenden allogenen HLA-A2-übereinstimmenden Nierenzellkarzinomzellen an Patienten mit fortgeschrittenem
  • Nierenzellkarzinom
  • HLA-A2-positive Patienten mit Nierenzellkarzinom werden mit HLA-A2-übereinstimmenden allogenen Nierenzellkarzinomzellen immunisiert, die so verändert wurden, dass sie Interleukin-2 absondern. Die Toxizität der Immunisierung, Hinweise auf die Induktion einer humoralen und zellulären Immunität und die Antitumor-Effekte werden untersucht.
  • Stand der Technik
  • Nierenzellkarzinom
  • Das Nierenzellkarzinom („renal cell carcinoma", RCC) ist die viert-häufigste Krebsart des Urogenitaltrakts in den Vereinigten Staaten, mit einer jährlichen Inzidenz von 20 000 Fällen und einer Todesrate von 8 000 bis 10 000. Die Krankengeschichte und die klinischen Manifestationen des RCC können verschieden sein (Javadpour, 1982; Lang et al., 1982; Marshall und Powell, 1982; Robson et al., 1964; Van Der Wef-Messing, 1973). Bei etwa der Hälfte der neuen Fälle ist die Krankheit auf die Niere begrenzt, und 30% der Patienten weisen entfernte Metastasen auf. Eine radikale Nephrektomie ist für das örtlich begrenzte RCC eine kurative Therapie, wobei 66% der Patienten mit den Krankheitsstadien I bis II und 35% der Patienten mit dem Stadium III eine Überlebenszeit von fünf Jahren haben (Robson et al., 1964; Skinner et al., 1972; Boxer et al., 1979). Es gibt ausgewählte Patienten mit dem Krankheitsstadium IV, diejenigen mit Solitärmetastasen, bei denen ein chirurgischer Eingriff die Überlebenszeit verlängern kann.
  • Eine systemische Therapie für das metastatische RCC hat nur eine begrenzte Wirksamkeit. Eine Hormontherapie mit Antiandrogenen, Antiöstrogenen, Androgenen und Progestinen wurde untersucht, wobei jedoch Responderraten von weniger als 2% beschrieben wurden (Bloom, 1973; Hrushesky et al., 1977; Yogada et al., 1982). Eine Chemotherapie ist im allgemeinen unwirksam, wobei mehr als 30 Arzneistoffe alleine oder in Kombination getestet wurden und bei keiner Behandlung eine Responderrate von mehr als 15 bis 20% erreicht werden konnte (Hrushesky, 1977; Yagoda, 1982). Es ist zu beachten, dass spontane Regressionen bei dem hohen Prozentsatz von 7% der Patienten mit einem fortgeschrittenen RCC festzustellen sind (Oliver et al., 1988). Dieses Phänomen hatte zur Folge, dass sich die Forscher der Immuntherapie zuwandten. Am vielversprechendsten waren bisher die immunologischen Vorgehensweisen, insbesondere die Cytokine. Es wurde berichtet, dass die Interferone und Interleukin-2 beim Nierenzellkarzinom Antitumor-Eftekte hervorrufen (Quesada, 1988). Jedoch wurden in den meisten Studien Responderraten von weniger als 20% beschrieben (Krown, 1987).
  • Impfstudien
  • Viele Jahre bestand die Hoffnung, dass eine Impfung gegen Krebs das Immunsystem des Wirts spezifisch sensibilisieren und eine Antitumor-Antwort hervorrufen könnte. Am MSKCC wurden verschiedene Studien mit Tumorvakzinen durchgeführt, deren Ziel darin bestand, eine humorale oder zelluläre Antitumor-Antwort zu induzieren oder zu verstärken. Die meisten dieser Studien befassten sich mit Melanompatienten. Da man mehr Erfahrung in der Behandlung von Melanomen mit Vakzinen hat, bezieht sich diese Studie zum Teil auf Feststellungen, die im Zusammenhang mit Melanomen gemacht wurden.
  • Bei den einleitenden Tests mit autologen und allogenen Melanomzell-Vakzinen testeten Livingston et al. (1979) die Steigerung einer zellvermittelten Cytotoxizität gegen gezüchtete Melanomzellen. Dabei wurde keine Steigerung festgestellt, wobei es sich als schwierig erwies, die Spezifität der vorher vorliegenden zellvermittelten Cytotoxizität zu analysieren. Deshalb konzentrierte man sich auf die serologische Analyse. Bei der Analyse von Reaktionen des Patientenserums mit autologen gezüchteten Melanomzellen wurden drei Klassen von Zelloberflächen-Antigenen definiert (Livingston, 1979). Die Antigene der Klasse I sind einmalige Antigene, die nur auf autologen Zellen nachgewiesen werden. Die Antigene der Klasse II sind eingeschränkte Differenzierungsantigene, die vielen Melanomzelllinien gemeinsam sind. Die Antigene der Klasse III sind unspezifische Antigene, die auf normalen Zellen und anderen Nicht-Melanom-Tumorzellen zu finden sind.
  • Es wurde gefunden, dass cytotoxische T-Zellen, die allogene Tumorzellen abtöten, Klasse-I-eingeschränkt sind. Diese cytotoxischen T-Lymphocyten konnten HLA-übereinstimmende, nicht jedoch Nicht-HLA-übereinstimmende allogene Melanomzellen abtöten (Hoon et al., 1991; Hayashi et al., 1991). Es gibt immer mehr Hinweise auf gemeinsame Tumorantigene. Houghton (unveröffentlichte Ergebnisse) hat festgestellt, dass CD4+-Zellen sowohl autologe als auch allogene Tumorzellen abtöten können und dass diese Zellen gemeinsame Antigene in Einschränkung mit HLA-DR 15 erkennen. Crowley et al. (1990, 1991) zeigten, dass autologe tumorspezifische cytotoxische T-Lymphocyten (CTLs), wenn sie durch eine wiederholte Stimulation mit autologen Melanomzellen erzeugt und in Gegenwart von Interleukin-2 expandiert wurden, Haupt-Histokompatibilitäts-eingeschränkt waren (Crowley et al., 1990; Crowley et al., 1991).
  • Weitere Experimente legten nahe, dass diese CTLs ein tumorassoziiertes Antigen in Gegenwart von HLA-A2 erkannten. Allogene HLA-A2-übereinstimmende Melanomzellen wurden anstelle von autologen Tumorzellen zur Erzeugung von CTLs eingesetzt. Diese Lymphocyten lysierten die autologen Tumorzellen im gleichen Ausmaß wie die CTLs, die durch Stimulation mit autologen Tumorzellen hervorgebracht wurden. Somit könnten tumorspezifische CTLs unter Verwendung von HLA-A2-übereinstimmenden allogenen Melanomzellen erzeugt werden. Da das Züchten von autologen Tumorzellen in Kultur eine zeitaufwändige Prozedur ist, könnten allogene HLA-A2-Zellen eingesetzt werden, um autologe cytotoxische T-Zellen zu erzeugen.
  • Biologische Effekte von Interleukin-2 in vitro
  • Interleukin-2 ist ein Lymphokin, das durch T-Helferzellen erzeugt wird und T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK-Zellen) stimuliert. in vitro wurde gezeigt, dass IL-2 die Proliferation von autigenspezifischen T-Zellen auslöst. Helfer-, cytotoxische und Suppressor-T-Zellen wurden durch eine wiederholte Kultivierung in Gegenwart von IL-2 in vitro unsterblich gemacht (Roehm et al., 1983). Die B-Zell-Antworten werden in vitro auch durch IL-2 gesteigert (Basham et al., 1983). Außerdem kann IL-2 die Sekretion von anderen Lymphokinen, einschließlich Interferon-gamma, durch T-Zellen stimulieren.
  • Interleukin-2 in Studien am Menschen
  • Innerhalb der letzten zehn Jahre führten Rosenberg et al. mehrere Studien mit systemischem IL-2 durch, um die Lymphocyten-Funktion zu steigern (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989). Tatsächlich sprachen Tumoren, wie Nierenzellkarzinom und Melanom, auf intravenöses IL-2 an, und zwar mit einer Responderrate von 20 bis 30% (Rosenberg et al., 1987). Die Hauptwirkung von IL-2 bestand in der Expansion von Effektorzellpopulationen, welche die Fähigkeit besitzen, die Tumorzellen in vitro abzutöten. Jedoch müssen aufgrund der kurzen Serum-Halbwertszeit von IL-2 hohe Dosen eingesetzt werden, die sehr toxisch sind. Eine Hypotonie und ein Syndrom mit erhöhter Durchlässigkeit der Kapillaren („capillary leak syndrome") mit einem verminderten systemischen Gefäßwiderstand können zu einem interstitiellen Lungenödem, einer prärenalen Azotämie, Herzrhythmusstörungen und zu einem Myokardinfarkt führen (Rosenberg, 1985; Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1989).
  • Gentransfer in Tiermodellen
  • Mehrere Laboratorien haben gezeigt, dass die Einführung von Cytokin-Genen, wie IL-2, IL-4 (Tepper et al., 1989), IFN-γ (Watanabe et al., 1989; Gansbacher et al., 1990), TNF (Asher et al., 1991) und G-CSF (Colombo et al., 1991), in Tumorzellen zu deren Abstoßung durch einen immunologisch kompetenten Wirt führt. Die Sekretion von G-CSF oder IL-4 führt zu einer örtlich begrenzten Entzündungsreaktion an der Stelle des Tumors, ohne dass ein immunologisches Gedächtnis induziert wird (Tepper et al., 1989; Colombo et al., 1991). Andererseits induzieren IL-2, Interferon-gamma und der Tumornekrosefaktor eine lang anhaltende zelluläre Immunantwort, die bei Provokationen zu einem späteren Zeitpunkt zur Abstoßung von möglicherweise letalen Tumoren führt (Gansbacher et al., 1990; Watanabe et al., 1989; Asher et al., 1991). Einleitende Studien von Tepper et al. (1989) zeigten die starke Wirkung einer örtlich begrenzten IL-4-Sekretion an der Tumorstelle, die durch eine Akkumulierung von eosinophilen Zellen und Makrophagen gekennzeichnet war. Fearon et al. (1990) führten das IL-2-Gen in einen schwach immunogenen murinen Kolonkrebs ein. Die IL-2-sekretierenden Tumoren wurden abgestoßen und induzierten eine wirksame cytolytische T-Zell-Antwort. Durch die Entfernung von CD8-positiven Zellen in vivo wurde die zelluläre Antitumor-Antwort außer Kraft gesetzt, dies legt nahe, dass die MHC Klasse Ieingeschränkten CD8-positiven Zellen eine zentrale Rolle spielen.
  • Um dem physiologischen Modus einer Cytokin-Sekretion im Verlauf einer Immunantwort noch näher zu kommen, wurde das IL-2-Gen direkt in eine murine Fibrosarkom-Zelllinie (CMS-5) eingeführt. Auf diese Weise wurde eine örtlich begrenzte Sekretion von niedrigen Spiegeln des Cytokins erreicht, die zur Regression des Tumors führte (Gansbacher et al., 1990; Gansbacher et al., 1990). Während die Kontrollmäuse innerhalb von 45 Tagen durch den Tumor abgetötet wurden, stießen die Mäuse, die den IL-2-sekretierenden Tumor enthielten, nicht nur den implantierten Tumor ab und wurden geheilt, sondern sie entwickelten auch ein immunologisches Gedächtnis. Letale Dosen von Tumorzellen, die mehrere Monate später implantiert wurden, wurden abgestoßen, während ein nicht-verwandter Tumor wuchs und diese Mäuse abtötete, dies macht deutlich, dass die Antwort spezifisch ist. Außerdem waren Lymphocyten, die aus den Milzen entnommen worden waren, in der Lage, den Tumor in vitro abzutöten, dies bezog sich auf die gesamte Lebenszeit der immunisierten Maus. Es ist zu beachten, dass durch nichtmodifizierte Tumorzellen nur schwache cytolytische Antworten erzeugt wurden; diese Antworten waren vorübergehend und verschwanden innerhalb von drei Wochen nach der Implantation des Tumors wieder. Jedoch brachten Mäuse, denen die IL-2- sekretierenden Tumorzellen injiziert worden waren, eine tumorspezifische cytolytische Aktivität hervor, die mehr als 75 Tage lang anhielt.
  • Mehrere dieser Ergebnisse wurde am MSKCC in unterschiedlichen Tumortypen reproduziert, umfassend das murine Melanom B16, das murine B-Zell-Lymphom 38C13 und den murinen Blasenkrebs MBT 2. Weitere Experimente unter Verwendung von bestrahlten IL-2-sekretierenden CMS-5-Zellen zeigten, dass im Vergleich zu nicht-bestrahlten IL-2-sekretierenden Tumorzellen kein Unterschied in ihrer Fähigkeit bestand, das immunologische Gedächtnis in vivo zu induzieren. Rosenberg et al. (unveröffentlichte Daten) haben diese Ergebnisse mit dem schwach immunogenen Tumor MCA-102 reproduziert. Trotz zahlreicher Versuche waren sie unter Verwendung von nicht-modifizierten Tumorzellen niemals in der Lage, eine zelluläre Antitumor-Antwort zu erzeugen. Durch die Einführung des IL-2-Gens in diese Zellen wurde ihre Immunogenität auf ein Niveau erhöht, so dass eine Tumorabstoßung und ein Gedächtnis erzeugt wurden. Außerdem brachte die gemeinsame Injektion der IL-2-produzierenden Tumorzellen und der nichtmodifizierten Tumorzellen eine Immunantwort hervor, die stark genug war, um nicht nur die Lymphokin-sekretierenden Tumorzellen, sondern auch die nicht-modifizierten Tumorzellen abzustoßen.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Einführung und die konstitutive Expression von IL-2 durch die Tumorzellen selbst die Immunogenität von einer Vielzahl von histologisch unterschiedlichen Krebszellen steigerte. Aus diesen Studien ist ersichtlich, dass die örtlich begrenzte persistierende Expression und Sekretion von niedrigen Spiegeln von IL-2 möglicherweise eine Wirkung auf die Antitumor-Antwort des Wirts hat, und zwar ohne dass eine nachweisbare Toxizität auftritt.
  • Gentransfer bei Menschen
  • Kürzlich verwendeten Rosenberg et al. genetisch veränderte autologe tumorinfitrierende Lymphocyten und injizierten sie in Patienten mit refraktären metastatischen Tumoren (Rosenberg et al., 1990). Ein retroviraler Vektor, der das Neomycin-Resistenz-Gen enthielt, wurde in autologe Lymphocyten eingeführt, so dass die Zellen überwacht werden konnten, wenn sie wieder in die Patienten infundiert wurden. Von den fünf Patienten konnten die Zellen aus vier Patienten mit G418, einem Neomycin-Analogon, erfolgreich in Gewebekulturen gezüchtet werden. Diejenigen Zellen, die eine Neomycin-Resistenz aufwiesen, wurden den Patienten zusammen mit systemischem IL-2 intravenös verabreicht. In regelmäßigen Abständen wurde peripheres Blut abgenommen, und zirkulierende mononukleäre Zellen mit einer Neomycin-Resistenz wurden gefunden. Als Folge der genetischen Veränderung traten keine zusätzlichen Toxizitäten auf. Aus keinem Patienten konnte ein intaktes Virus gewonnen werden. Rosenberg folgerte hieraus, dass dieses Verfahren sowohl durchführbar als auch sicher ist (Rosenberg et al., 1990).
  • Frühere Sicherheitsstudien haben gezeigt, dass der Kontakt von Primaten mit einer umfangreichen Infusion eines infektiösen murinen amphotrophen Virus keine akuten pathologischen Effekte erzeugte (Cornetta et al., 1990). 21 Primaten, denen ein retroviral genmodifiziertes Knochenmark transplantiert worden war, zeigten bis zu fünf Jahre nach der Infusion keine Anzeichen einer Toxizität, die mit dem Gentransfer zusammenhängen könnte (Kantoff et al., 1987). Der erste Adenosindesaminase-defiziente Patient mit einer Schweren Kombinierten Immundefizienz (SCID) wurde etwa vor einem Jahr am NCI erfolgreich mit einem retroviral vermittelten Adenosindesaminase-Gentransfer behandelt. Bisher stellten die Forscher nach der Infusion eine teilweise Wiederherstellung der zellulären Immunfunktion fest, ohne dass beim Patienten irgendeine negative Wirkung nachgewiesen werden konnte.
  • Nun sollte untersucht werden, ob die Ergebnisse aus dem murinen System erweitert werden konnten, hierzu wurden menschliche Tumorzelllinien mit Cytokinenthaltenden retroviralen Vektoren infiziert. Bisher wurden das menschliche IL-2-Gen, das menschliche IFN-γ Gen und das menschliche Gen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors alle erfolgreich in eine Vielzahl von menschlichen Zelllinien transduziert. In Zusammenarbeit mit Dr. Raymon Taetle (Universität von Arizona) wurde das Gen des epidermalen Wachstumsfaktors in die Burkitt-Lymphom-Zelllinie Namalwa eingeführt; es wurde gezeigt, dass der Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert wurde und vollständig funktionell war. Die Stimulation dieser transduzierten Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor hatte die geeignete Bindung des Liganden und die Signalübertragung zur Folge (Oval et al., 1991). Außerdem wurde das IL-2- oder das IFN-γ Gen in primäre und etablierte Nierenzellkarzinomlinien eingeführt und darin exprimiert. Diese genetisch modifizierten Zellen sonderten konstitutiv bis zu 20 U/ml rekombinantes IL-2 in den Überstand ab. Die konstitutive Expression von IFN-γ hatte eine Hinaufregulation von HLA der Klasse I und der Klasse II auf der Zelloberfläche von Nierenzellkarzinomzellen zur Folge (Gansbacher, unveröffentlichte Ergebnisse). Die Injektion der IL-2-sekretierenden Tumorzellen in Nacktmäuse führte zur Tumorabstoßung, während dies bei nicht-modifizierten Zellen nicht der Fall war. Die Bestrahlung der genetisch veränderten Nierenzellkarzinome führt nicht dazu, dass die Produktion von IL-2 eingestellt wurde. Vielmehr wurde das IL-2 nach der letalen Bestrahlung noch zwei bis drei Wochen kontinuierlich in den Mengen abgegeben, die mit denen von nicht-bestrahlten transduzierten Zellen vergleichbar waren.
  • Begründung
  • Studien wurden vorgeschlagen, mit denen bestimmt werden kann, ob eine Immunisierung mit allogenen Nierenkarzinomzellen, die ein rekombinantes menschliches IL-2-Gen exprimieren, ohne eine offensichtliche Toxizität gut toleriert wird. Am MSKCC und an anderen Instituten hat man viel Erfahrung, so dass die allgemeine Sicherheit bei einer Immunisierung unter Verwendung von bestrahlten allogenen Tumorzellen gewährleistet ist (Livingston et al., 1985; Livingston et al., 1983). Die Auswahl von allogenen HLA-A2-positiven Tumorzellen beruht auf den zwei folgenden Überlegungen. Erstens kann durch die Verwendung einer einzigen etablierten immunisierenden Zelllinie die Notwendigkeit umgangen werden, für jeden Patienten autologe Tumorzellen zu infizieren. Das Züchten von autologen Tumorzellen in Gewebekultur ist eine schwierige und zeitaufwändige Prozedur. Die Erfolgsrate beim Züchten von langfristigen Kulturen mit Nierenkrebszellen liegt bei 10 bis 20% (Ebert et al., 1990). Da etwa 40% der Patienten HLA-A2-positiv sind, könnte eine Tumorvakzine, die aus früher etablierten HLA-übereinstimmenden Nierenzellkarzinom-Zelllinien hergestellt wurde, verbreitet eingesetzt werden. Außerdem gibt es immer mehr Hinweise, dass gemeinsame Tumorantigene existieren (Livingston et al., 1991; Ebert et al., 1990). HLA-Antigene der Klasse I sind das einschränkende Element für eine cytotoxische T-Zell-Antwort. Allogene HLA-A2-übereinstimmende Tumorzellen können cytotoxische T-Zell-Antworten induzieren. Das Protokoll wird auf Patienten beschränkt, die HLA-A2-positiv sind.
  • Nierenkrebs-Zelllinie
  • Zwei Zelllinien, SK-RC-28 und SK-RC-39, werden für die Expression von IL-2 in Kombination eingesetzt. Durch die Kombination werden die Präsentation von mehr nierenassoziierten Antigenen und eine größere allogene Stimulation möglich gemacht. Die Zelllinie SK-RC-28 stammte aus einer primären Nephrektomie-Probe aus dem Jahr 1979 von einer 51 Jahre alten Frau mit einer Humerus-Solitärmetastase. Die parentale Zelllinie ist ein mäßig-gut differenziertes Karzinom, das auf Weichagar wächst, nicht jedoch in Nacktmäusen. Die Zelllinie SK-RC-39 stammte aus der im Jahr 1980 durchgeführten Resektion eines lokalen Rezidivs, das sich bei einer 55 Jahre alten Frau fünf Jahre nach ihrer ersten Nephrektomie gebildet hatte. Die parentale Linie wächst auf Weichagar und in Nacktmäusen; sie hat in vitro eine Verdopplungszeit von 42 Stunden. Nachstehend ist der antigene Phänotyp der beiden Zelllinien angegeben.
  • Figure 00750001
  • Die beiden Zelllinien wurden mit dem retroviralen Vektor NAP-AD/IL-2 (DC/AD/R/IL2) infiziert. Die transfizierten Zelllinien sondern konstitutiv IL-2 ab. SK-RC-28 sekretiert 20 U/ml und SK-RC-39 sekretiert 40 U/ml. Diese Tumorzellen werden vor der Injektion mit 10 000 Rad bestrahlt, um sicherzustellen, dass sie sich nicht mehr vermehren können. Zwei Dosierungen von Tumorzellen werden für die Vakzinen verwendet.
  • Klinisches Protokoll
  • Dies ist eine Pilotstudie der Immunisierung mit den allogenen Tumorzellen SK-RC-28 und SK-RC-39, die so verändert wurden, dass sie IL-2 sekretieren, und die an Patienten mit einem Nierenzellkarzinom verabreicht werden, wobei die Sicherheit dieses Verfahrens getestet werden soll. Die Patienten werden HLA-Gewebe-typisiert. Die Patienten, die HLA-A2-positiv sind, erhalten Impfungen mit den allogenen, HLA-A2-übereinstimmenden Nierenkrebszellen, die IL-2 freisetzen. In diese Studie sollen 12 Patienten aufgenommen werden. Man geht davon aus, dass der Versuch zwölf Monate dauert.
  • Die Gewebekulturen werden in den Laboratorien von Drs. Bernd Gansbacher und Neil Banden gezüchtet. Die Tumorzellen wurden mit dem retroviralen Vektor NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2) infiziert. Die Zellen, die IL-2 absondern, werden bestrahlt (10 000 Rad) und als eine Serie von vier Impfungen verabreicht. Wenn ein Patient eine klinische Antwort zeigt, wie in dem Abschnitt Kriterien für eine therapeutische Antwort definiert, wird eine zusätzliche Boosterung bis zu einem Jahr lang oder bis zur Progression der Erkrankung gegeben. Sechs Patienten erhalten eine Vakzine in der geringen Dosis, und die sechs anderen Patienten erhalten die hohe Dosis (vgl. Behandlungsplan).
  • Kriterien für die Teilnahmeberechtigung der Patienten
  • Die Patienten müssen die folgenden Kriterien erfüllen, um an der Studie teilnehmen zu können.
    • 1. Patienten mit einem metastatischen Nierenzellkarzinom, das am MSKCC histologisch bestätigtet wurde.
    • 2. Der Leistungszustand nach Karnofsky ist größer oder gleich 70%, und die Lebenserwartung beträgt mehr als vier Monate.
    • 3. Eine adäquate hämatologische Funktion, mit WBG ≥ 3 000/mm3, absolute Lymphocyten-Zahl > 1000/mm3, Hämoglobin ≥ 9 und Thrombocyten ≥ 100 000/mm3.
    • 4. Eine adäquate Nieren- und Leberfunktion (Serum-Kreatinin ≤ 2,5 mg/dl und Bilirubin ≤ 1,7 mg/dl).
    • 5. Mindestens vier Wochen sind vergangen seit einer vorherigen Strahlentherapie, Immuntherapie oder Chemotherapie (sechs Wochen für Nitrosoharnstoffe), und der Patient hat sich von einer solchen Behandlung vollständig erholt.
    • 6. Die Fähigkeit, eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung zu geben.
    • 7. Alter ≥ 18 Jahre.
    • 8. Keine Vorgeschichte mit anderen gleichzeitigen malignen Erkrankungen, außer Basalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom der Haut oder Carcinoma in situ der Zervix.
    • 9. Keine systemischen Steroide mindestens eine Woche vor der Behandlung.
    • 10. Eine Auswahl von Patienten mit einem minimalen Tumorbefall wird bevorzugt. Deshalb sollten große Tumoren vor der Aufnahme entfernt werden, falls dies möglich ist.
    • 11. Die Patienten müssen HLA-A2-positiv sein.
    • 12. Die Patienten müssen eine messbare oder bestimmbare Erkrankung aufweisen.
  • Ausschlusskriterien
  • Die folgenden Bedingungen/Situationen führen dazu, dass die Patienten nicht in die Studie aufgenommen werden können.
    • 1. Ernsthafte, zwischenzeitlich auftretende Erkrankungen, umfassend eine signifikante Herzkrankheit (New York Heart Association, Klasse III oder IV), Angina pectoris oder Myokardinfarkt innerhalb der vorausgehenden sechs Monate.
    • 2. Das Vorliegen einer aktiven Infektion, einschließlich einer Infektion des Harntrakts.
    • 3. Das Vorliegen von aktiven Metastasen im ZNS.
    • 4. Schwangere oder stillende Frauen.
    • 5. Patienten, die mehr als eine Form einer immunsuppressiven Therapie erhalten haben, umfassend Radiotherapie oder Chemotherapie.
    • 6. Patienten, die eine ständige Therapie mit Corticosteroiden benötigen, können nicht aufgenommen werden.
  • Gleichzeitige Therapie
  • Die folgenden Therapien sind in der Zeit verboten, in der die Patienten nach diesem Protokoll behandelt werden: Strahlentherapie, Hormontherapie, Chemotherapie, Corticosteroide (außer, wenn sie aufgrund von lebensbedrohenden Umständen verabreicht werden) oder eine andere Immuntherapie.
  • Auswertung der Vorbehandlung
    • 1. Anamnese und körperliche Untersuchung, einschließlich Dokumentation aller messbaren Erkrankungszeichen;
    • 2. Größe, Gewicht und Leistungszustand;
    • 3. Screeningprofil, BUN und Kreatinin;
    • 4. Großes Blutbild („CBC"), Differenzialblutbild und Thrombocytenzahl;
    • 5. Röntgen des Brustkorbs;
    • 6. EKG;
    • 7. Weitere Tests, Röntgenbilder und Aufnahmen können durchgeführt werden, wenn der Patient entsprechende Anzeichen und Symptome aufweist und wenn es erforderlich ist, um das Ausmaß der Erkrankung des Patienten definieren zu können.
    • 8. Peripheres Blut wird für Immuntests entnommen. Sechs Röhrchen mit grünem Deckel und zwei Röhrchen mit rotem Deckel.
    • 9. Biopsie einer für eine klinische Untersuchung zugänglichen Stelle zur Bestätigung der Diagnose. Es ist zu beachten, dass dies keine absolut erforderliche Voraussetzung für die Aufnahme in dieses Protokoll ist.
  • Behandlungsplan
  • Die Patienten erhalten mindestens vier Impfungen. Die ersten sechs Patienten erhalten die niedrig dosierte Impfung (wie nachstehend definiert). Die anderen sechs erhalten die höhere Dosierung. Die Vakzine besteht aus den bestrahlten allogenen RC-Tumorzellen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie IL-2 sekretieren.
    Niedrige Dosis: Etwa 10 Millionen Tumorzellen
    Hohe Dosis: Etwa 50 Millionen Tumorzellen
  • Eine Serie von vier Impfungen wird subkutan entweder in den Oberschenkel oder in den Arm des Patienten verabreicht. Jede Impfung wird an eine andere Stelle verabreicht. Alle zwei Wochen, vier Wochen lang, wird eine Impfung verabreicht. Eine Booster-Impfung erfolgt zwei Monate nach der dritten Impfung. Wenn ein Patient eine starke klinische Antwort zeigt (CR oder PR, wie in Kriterien für eine therapeutische Antwort definiert), werden weitere Boosterungen alle drei Monate ein Jahr lang oder bis zur Progression der Erkrankung gegeben. Patienten mit geringeren Antworten oder einer stabilen Erkrankung erhalten Boosterungen nach dem Ermessen der leitenden Wissenschaftler. Vor jeder Impfung wird eine Blutuntersuchung durchgeführt (vgl. den Abschnitt Auswertung während der Studie).
    Impfung: Tag 1, 15, 29, 85
  • Wenn es bei einem Patienten auf die Vakzine hin zu einer ernsten Reaktion, die als Toxizität des Grades 4 definiert ist (vgl. Kriterien für die Toxizität), oder zu einer Verschlechterung seines Leistungszustands kommt, die eine Einweisung in die Klinik erforderlich macht, werden keine weiteren Impfungen an diesen Patienten verabreicht.
  • Kriterien zum Ausschluss aus der Studie
    • A. Eine progressive Erkrankung.
    • B. Eine zwischenzeitlich auftretende Erkrankung.
    • C. Eine nicht annehmbare Toxizität des Grades 4+.
    • D. Eine allgemeine oder spezifische Veränderung im Zustand des Patienten, die eine weitere Behandlung nach der Beurteilung der Wissenschaftler nicht anraten lässt.
  • Formulierung der Vakzine
  • Für die etablierten HLA-A2-übereinstimmenden Nierenzellkarzinom-Zelllinien SK-RC-28 und SK-RC-39, die mit dem Retrovirus NAP-AD/IL2 (DC/AD/R/IL2) infiziert waren, wurde gezeigt, dass sie IL-2 im Überschuss von 20 U/ml absondern. Die Stammkulturen der IL-2-infizierten Zelllinien werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Laboratorium von Drs. Bernd Gansbacher und Neil Banden aufbewahrt. Etwa eine Woche vor dem Impftermin werden die Gläschen, die 10 Millionen Tumorzellen enthalten (ein Gläschen für die niedrige Dosis und fünf Gläschen für die hohe Dosis), aufgetaut, in Gewebekultur expandiert und erneut auf die Produktion von IL-2 analysiert. Außerdem wird nachgewiesen, dass diese Kulturen frei sind von Helfervirus, Mycoplasma, Bakterien und Pilzen.
  • Auswertung während der Studie
    • 1. Körperliche Untersuchung während der Therapie vor jeder Impfung.
    • 2. Großes Blutbild („CBC"), Thrombocytenzahl und Differenzialblutbild werden vor jeder Impfung durchgeführt.
    • 3. Das chemische Profil, umfassend Leberfunktionstests, Bilirubin, Kreatinin und LDH, wird zwei Monate lang alle vier Wochen und danach vor jeder Impfung bestimmt.
    • 4. Peripheres Blut wird für Immuntests abgenommen (vgl. Abschnitt 6.8). Hierbei werden zwei Röhrchen mit rotem Deckel und sechs Röhrchen mit grünem Deckel vor Beginn der Impfungen und eine bis zwei Wochen nach der vierten Impfung gefüllt. Diese werden im Laboratorium von Dr. Gansbacher aufbewahrt.
    • 5. Die Röntgenaufnahme des Brustkorbs wird zwei Monate lang alle vier Wochen und danach vor jeder Impfung wiederholt.
    • 6. Wenn eine mäßige bis schwere Toxizität festgestellt wird, werden die relevanten Tests häufiger als in der Tabelle angegeben durchgeführt.
  • Auswertung der Immunantwort
  • Das direkteste Verfahren zur Messung von Immunantworten auf ein Nierenkarzinom besteht darin, Antikörper nachzuweisen. Der Nachweis von IgG-Antikörpern, die durch die Immunisierung induziert wurden, ist auch ein mögliches indirektes Maß für Helfer-T-Zell-Antworten, da für die Induktion von Antworten durch reifes IgG mit hoher Affinität eine T-Zell-Hilfe durch CD4-positive T-Zellen erforderlich ist. Von allen Patienten werden periphere Blutseren für die serologische Analyse von Antikörpern abgenommen, die gerichtet sind gegen die Zelllinien SK-RC-28 und SK-RC-39 (wobei gp160, g120, gp140 und Uro-8 eingeschlossen sind) und autologe Tumorzellen, sofern sie verfügbar sind. Außerdem wird eine Kontrolle für eine positive Immunantwort mit Antikörpern gegen allogene MHC-Antigene der Klasse I und II durchgeführt, die durch SK-RC-28 und SK-RC-39 exprimiert werden. Man kann davon ausgehen, dass die meisten Patienten starke IgG-Antworten gegen Alloantigene der Klasse I und der Klasse II entwickeln werden, die durch die zwei Zelllinien exprimiert werden. Antikörper gegen Zelloberflächen- und intrazelluläres Antigen werden nachgewiesen durch:
    • A. Immunfällung von 1% NP40-Zelllysaten von SK-RC-28 und SK-RC-39, die mit 35-Methionin metabolisch markiert wurden.
    • B. Gemischte Hämadsorptions-Tests für IgG- und IgM-Antikörper, die gegen Zelloberflächen-Antigene gerichtet sind (wie vorstehend angegeben).
  • Bei ausgewählten Patienten, von denen autologe Tumorzellen verfügbar sind, können MHC-eingeschränkte zelluläre Immunantworten bestimmt werden. Obwohl die zellulären Immunantworten ein kritisches Maß für die Immunantwort darstellen, gibt es die folgenden Einschränkungen: a) autologe Tumorzellen sind erforderlich, um die Antworten nachzuweisen; b) autologe normale Zellen und MHCübereinstimmende allogene Zellen sind erforderlich, um die Spezifität der Antworten zu bestimmen; und c) der Beweis von cytotoxischen oder Helfer-Antworten lässt sich nicht erbringen, ohne dass eine in vitro-Stimulation durch autologe Tumorzellen erfolgt. Mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut werden durch eine Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation gereinigt. Die Zellen werden zusammen mit den autologen Tumorzellen, Interleukin-2 (20 bis 100 U/ml) und autologen oder allogenen Stimulatorzellen, wie beschrieben, 7 bis 14 Tage gezüchtet (Wolfel et al., 1989). Die folgenden Tests zur Feststellung der zellulären Immunantwort werden in dem Fall durchgeführt, wenn autologe Tumorzellen verfügbar sind.
  • A. Tests auf Helfer-T-Zellen
  • Lymphocyten aus dem peripheren Blut werden zusammen mit autologen Tumorzellen, autologen normalen Zellen und allogenen Tumorzellen (z. B. SK-MEL-29) 48 Stunden gezüchtet. Die Proliferation wird durch die Aufnahme von 3H- Thymidin in einem vierstündigen Puls am Ende des Tests gemessen. Ein weiteres Maß ist die Sekretion von Cytokinen während der gemeinsamen Kultivierung mit den Zielzellen. Die Produktion von Interleukin-2 wird durch einen enzymverbundenen Immunadsorptionstest (ELISA) und durch Stimulation der Referenz-CTL-Zelllinie gemessen. Die Produktion von Interferon-γ wird durch einen ELISA gemessen. Die Freisetzung weiterer Cytokine kann durch einen ELISA gemessen werden, umfassend Interleukin-4, Interleukin-6, Tumornekrosefaktor-α und Granulocyten-Monocyten-koloniestimulierender Faktor.
  • B. Test auf cytotoxische T-Zellen
  • Die Cytotoxizität wird entweder in einem vierstündigen oder in einem 18-stündigen 51Chrom-Freisetzungstest gemessen (wie in Wolfel et al., 1989, beschrieben).
  • Kriterien für eine therapeutische Antwort
    • 1. Vollständige Antwort (CR): Verschwinden aller klinischer Hinweise auf einen Tumor bei der körperlichen Untersuchung, beim Röntgen und bei der biochemischen Auswertung mindestens vier Wochen lang.
    • 2. Teilweise Antwort (PR): Mehr als 50% Abnahme bei der körperlichen Untersuchung oder Radiographie (einschließlich CT-Aufnahme und/oder Ultraschall) oder der summierten Produkte der senkrechten Durchmesser aller gemessenen Läsionen, wobei dies für mindestens vier Wochen bestehen bleibt. Keine gleichzeitige Zunahme der Größe einer Läsion oder Auftreten einer neuen Läsion darf erfolgen.
    • 3. Geringere Antwort (MR): 25 bis 49% Abnahme der summierten Produkte der Durchmesser von gemessenen Läsionen mindestens vier Wochen lang.
    • 4. Stabile Erkrankung (STAB): Weniger als 25% Abnahme oder Zunahme der Tumorgröße mindestens drei Monate lang.
    • 5. Progression (PROG): Mehr als 25% Zunahme der Summe aller gemessenen Läsionen oder Auftreten von neuen Läsionen.
    • 6. Dauer der Antwort: Diese wird vom Beginn der Therapie bis zu einer 25% oder größeren Zunahme aus der kleinsten Summe aller Tumormessungen gemessen, die während der besten Antwort erhalten wurden (CR, PR, MR oder STAB).
  • Kriterien für eine Toxizität
  • Die Toxizität wird gemäß den Herkömmlichen Toxizitätskriterien anhand der folgenden Richtlinie eingeteilt und klassifiziert:
    0 Keine Toxizität.
    1+ Schwache Toxizität, normalerweise vorübergehend, macht keine spezielle Behandlung erforderlich und ist im Allgemeinen bei den üblichen täglichen Aktivitäten nicht störend.
    2+ Mäßige Toxizität, die sich durch einfache Maßnahmen abschwächen lässt.
    3+ Schwere Toxizität, die ein therapeutisches Eingreifen erforderlich macht und die üblichen Aktivitäten unterbricht. Eine Einweisung in die Klinik kann erforderlich sein, dies muss jedoch nicht der Fall sein.
    4+ Lebensbedrohende Toxizität, die eine Einweisung in die Klinik erforderlich macht. Eine Toxizität, die einen mit dem Arzneistoff zusammenhängenden Todesfall verursacht, wird mit 4F bezeichnet.
  • Unerwünschte Wirkungen
  • Bisher wurden bei Impfungen mit allogenen Tumorzellen nur minimale Nebenwirkungen festgestellt (Livingston, 1991). Die Patienten wiesen an der Impfstelle eine Verhärtung und ein Erythem auf. Es gab keine Berichte über eine anaphylaktische Überempfindlichkeit gegenüber allogenen Tumorzellen in vivo. In der einleitenden Studie zur Verabreichung von genetisch veränderten menschlichen Zellen an Patienten wurden keine weiteren Nebenwirkungen festgestellt, die eine Folge des Verfahrens waren, wobei kein lebensfähiges Retrovirus übertragen wurde (Rosenberg et al., 1990).
  • Sollten ernsthafte Nebenwirkungen der Behandlung auftreten (definiert als Toxizität des Grades III oder IV), werden sie dem IRB des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center und dem Office for the Protection from Research Risks des NIH innerhalb von 24 Stunden gemeldet werden, außerdem wird ein schriftlicher Bericht innerhalb von zehn Tagen an das Office of Recombinant DNA Activities, Gebäude 31, Raum 4B11, Bethesda, MD, gesendet.
  • Biostatistische Überlegungen
  • Der Endpunkt dieser Pilotstudie wurde als klinische Toxizität definiert. Wie im Behandlungsplan angegeben, sollen mit jeder Dosierung sechs Patienten behandelt werden. Wenn bei drei Patienten eine Toxizität des Grades III oder IV auftritt (wie in den Herkömmlichen Toxizitätskriterien definiert), dann wird eine maximale tolerierte Dosis keinen messbaren Endpunkt darstellen.
  • Design und Probengröße
  • Etwa 12 Patienten sollen in diese Pilotstudie über Tumorzell-Impfungen aufgenommen werden. Zwei Dosierungen von Tumorzellen werden eingesetzt.
    Niedrige Dosis: 10 Millionen Tumorzellen
    Hohe Dosis: 50 Millionen Tumorzellen
  • Die maximale tolerierte Dosis wird als die Dosis der Vakzine definiert, bei der drei oder mehr Patienten eine Toxizität des Grades IV aufweisen. Der Test wird mit der Bestimmung der maximalen tolerierten Dosis abgebrochen, oder er wird beendet, wenn die beiden Dosierungen vollständig durchlaufen wurden. Es ist zu erwarten, dass in dieser Studie möglicherweise keine maximale tolerierte Dosis festgelegt wird.
  • Verfahren der Zustimmung
  • Alle Patienten müssen eine Erklärung unterschreiben, dass sie informiert wurden und zustimmen, wobei die Erklärung mit den Richtlinien der IRB übereinstimmen muss. Diese wissenschaftliche Studie wurde durch das IRB des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center und das Recombinant DNA Comittee des NIH geprüft. Der Wissenschaftler wird dem IRB und dem RAC Bericht erstatten über Änderungen im wissenschaftlichen Protokoll und alle unerwarteten Probleme, die Risiken für menschliche Individuen oder andere Personen in sich bergen können, außerdem werden ohne Zustimmung des IRB keine Änderungen in den wissenschaftliche Aktivitäten durchgeführt.
  • Fünfte Serie von Experimenten
  • Erhöhte Wirksamkeit der allogenen Vakzine, wenn mehr als ein Cytokin exprimiert wird
  • 14 zeigt retrovirale Konstrukte von Vektoren, N/CIL2/TIFNγ und N/CIFNγ/TIL2, die sowohl das IL-2- als auch das IFN-γ Gen enthalten. Diese Konstrukte wurden zur Herstellung von Erzeugerzellen, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt. Danach wurde der produzierte retrovirale Vektor für die Transduktion der Zellen verwendet. 15 erläutert die Wirksamkeit von Tumorzellen, die sowohl IL-2 als auch IFN-γ exprimieren. Die gefüllten Quadrate sind eine Kontrolle, die zeigt, dass Tumoren gebildet werden, wenn 250 000 Tumorzellen CMS-5 in BALB/c-Mäuse inokuliert wurden. Die gefüllten Kreise bezeichnen einen kleinen Tumor, der gebildet wurde, wenn die Tumorzellen IL-2 exprimieren, DC/TKIL2/CMS5, und die Inokulation in einer vierfachen Menge erfolgt, d. h. eine Million Zellen. Die gefüllten Rauten geben an, dass der kleinere Tumor auch dann gebildet werden konnte, wenn die Tumorzellen IFN-γ exprimieren, SVIFN-γ/CMS5, und wenn viermal so viel Impfmaterial eingesetzt wurde, d. h. eine Million Zellen. Wenn eine Million Zellen verwendet wurden und die Zellen sowohl IL-2 als auch IFN-γ exprimieren, N/CIL2/TIFNγ/CMS5, konnte sich kein Tumor bilden. Dieses Experiment macht deutlich, dass die Wirksamkeit der allogenen Vakzine durch die Expression von mehr als einem Cytokin gesteigert werden konnte.
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  • Zier, K., Functional and antigenic properties of cultured T-cells in the cell mediated lympholysis (CML) assay. Human Immuno1. 4: 147, 1982.
  • Sechste Serie von Experimenten
  • Mit den Therapiemodellen, bei denen ein Gentransfer in Tumorzellen eingesetzt wurde, wurden drei Ziele verfolgt: (1) die Abstoßung des Tumors zu induzieren, der mit therapeutischen Genen transduziert wurde, (2) eine immunvermittelte Regression der metastatischen Erkrankung zu induzieren, und (3) eine lang anhaltende Immunität zu induzieren, um vor einer Provokation mit Tumorzellen oder einem erneuten klinischen Wachstum einer mikrometastatischen Erkrankung zu schützen. Da mit einer in vivo-Therapie von Krebspatienten unter Verwendung eines Gentransfers in einem ersten Schritt versucht werden sollte, den vorliegenden Tumor zu eliminieren, hat der Anmelden erforscht, ob die Antitumor-Immunität, die durch Tumorzellen induziert wird, welche ein einzelnes Cytokin absondern, durch einen gemeinsamen Transfer eines zweiten Cytokin-Gens gesteigert werden kann. Um diesen Ansatz zu testen, wurde eine murine Fibrosarkom-Zelllinie, CMS-5, mit retroviralen Vektoren transduziert, die die Interleukin-2- (IL-2-), Interferon-γ (IFN-γ ) oder Granulocyten-Makrophagenkoloniestimulierender Faktor- (GM-CSF-) cDNA alleine oder die IL-2-cDNA in Kombination mit der IFN-γ oder der GM-CSF-cDNA enthielten. Clone, die ein einzelnes Cytokin freisetzten, wurden danach ausgewählt, dass bei ihnen die produzierten Cytokin-Mengen mit denen übereinstimmten, die durch die Clone erhalten wurden, die zwei Cytokine freisetzten, so dass ähnliche Mengen von Cytokin sekretiert wurden. IFN-γ- und IL-2/IFN-γ sekretierende CMS-5-Zellen zeigten im Vergleich zu den IL-2- und den GM-CSF-sekretierenden oder den parentalen CMS-5-Zellen erhöhte Spiegel einer MHC-Klasse-I-Expression. IL-2/IFN-γ sekretierende CMS-5-Zellen wurden durch syngene Mäuse immer abgestoßen, während die gleiche Zahl von CMS-5-Zellen, die nur eines dieser Cytokine freisetzten, oder von Gemischen aus CMS-5-Zellen, die einzelne Cytokine absonderten, nicht abgestoßen wurde. Eine in vivo durchgeführte Verarmung an CD4+-, CD8+- oder NK-Effektorzell-Subpopulationen machte deutlich, dass die cytotoxischen CD8+-T-Zellen hauptsächlich für die Abstoßung von IL-2/IFN-γ transduzierten Tumorzellen verantwortlich waren. Die Ergebnisse des Anmelders zeigen die erfolgreiche Verwendung eines einzelnen retoviralen Vektors, um zwei Cytokin-Gene in dieselbe Tumorzelle stabil zu transduzieren, dies führt zu einer verstärkten Wirkung auf die in vivo-Induktion einer Antitumor-Immunität.
  • Einleitung
  • Durch die Tatsache, dass die Verabreichung und die Expression von Transgenen in vivo immer besser zielspezifisch gestaltet werden kann, wurde die Möglichkeit geschaffen, die Gentherapie zur Behandlung menschlicher Krebserkrankungen zu testen (1 bis 6). Unter mehreren möglichen Ansätzen zur Gentherapie bei Krebs hat sich die Einführung von Cytokin-Genen in Tumorzellen als Teil einer Impfstrategie in experimentellen Modellen als wirksam erwiesen (7 bis 24). Die Ergebnisse variieren jedoch abhängig davon, welches Cytokin-Gen und welches Tumorsystem gewählt werden. Es wurde gezeigt, dass die Expression bestimmter Cytokin-Gene durch Tumorzellen die Immunogenität des Tumors steigert und zu einer primären Abstoßung von transfizierten Tumorzellen durch syngene Wirte und außerdem zur Induktion einer systemischen zellulären Antitumor-Immunantwort führt (7 bis 12, 15 bis 17, 21, 23). Cytokine, wie GM-CSF, zeigen in vivo keine Wirkung auf das Tumorwachstum, können jedoch bei einer Provokation mit parentalen Tumorzellen zu einer kräftigen systemischen Immunität führen, wenn die Vakzine als bestrahlte Cytokin-sekretierende Tumorzellen verabreicht wird (24, 25). Tumorzellen, die diese Cytokine exprimieren, könnten sich als ein wichtiger Faktor in einer adjuvanten Tumortherapie erweisen, wobei es jedoch unwahrscheinlich ist, dass sie für Patienten mit einem primären Tumor und einer metastatischen Erkrankung einen Nutzen bringen. Während in einigen Tumorsystemen die Abstoßung einer vorher etablierten Erkrankung gezeigt werden konnte (16, 17, 26 bis 28), war dies in den meisten Tiermodellen nicht möglich. Als einleitende Schritte in Richtung zu einer in vivo-Gentherapie gegen Krebs ist die Entwicklung von Strategien erforderlich, mit denen die Stimulation einer primären Antitumor-Immunität durch die Cytokin-Gen-transduzierten Tumorzellen optimiert werden kann. In der vorliegenden Studie untersuchte der Anmelden die Antitumor-Immunantworten, die durch Tumorzellen induziert werden, die ein einzelnes Cytokin absondern, und außerdem testete er die Wirkung, wenn die Tumorzelle so behandelt wird, dass sie zwei Cytokin-Stimulatorsignale bereitstellt. Der Anmelden und andere haben gezeigt, dass die Transfektion und Expression von IFN-γ cDNA zu einer gesteigerten Expression von Zelloberflächenmolekülen, umfassend MHC-Moleküle und tumorassoziierte Antigene (TAA), führen kann und zur Folge haben kann, dass nicht-immunogene Tumoren für eine Zerstörung durch cytotoxische T-Zellen empfänglich werden (9 bis 14). Die lokale Sekretion von IL-2 aus IL-2-cDNAtransfizierten Tumorzellen kann spezifische cytotoxische Effektorzellen aktivieren und expandieren, die zu einer Tumorabstoßung führen (7, 8, 29). In verschiedenen biologischen Systemen wurde eine synergistische Wechselwirkung von Cytokinen gezeigt. Durch die Transduktion einer Tumorzelle mit den cDNAs für sowohl IL-2 als auch IFN-γ hat der Anmelden versucht, eine gesteigerte Antitumor-Antwort zu induzieren, indem sowohl der afferente als auch der efterente Arm der Immunantwort aktiviert wird: IFN-γ sollte wirken, indem es die Immunogenität der Zielzelle steigert und unspezifische cytotoxische Effektorzellen aktiviert, während IL-2 das ko-stimulierende Signal bereitstellen sollte, das erforderlich ist, um cytotoxische T-Zellen zu aktivieren und expandieren, die vermutlich in der nahen Umgebung der transduzierten Tumorzellen vorliegen (30 bis 34). Da es nach dem Mischen von zwei Tumorzellpopulationen, die jeweils ein bestimmtes Cytokin freisetzen, dazu kommen kann, dass bevorzugt eine der Populationen eliminiert wird (22), wodurch die Effekte des einen Cytokins vorzeitig ausgeschaltet werden, hat der Anmelden sich entschieden, die beiden Cytokine durch dieselbe Tumorzelle zu exprimieren, um auf diese Weise die zelluläre Antitumor-Antwort in vivo zu steigern. Da es für eine in vivo-Anwendung wünschenswert wäre, dass nur ein einzelner Transduktionsschritt erforderlich ist, um Signale für eine optimale primäre Abstoßung bereitzustellen, hat der Anmelden retrovirale Doppel-Cytokin-Vektoren entwickelt, die sowohl das IL-2- als auch das IFN-γ Gen oder sowohl das IL-2- als auch das GM-CSF-Gen enthalten, und als Kontrollen dienten retrovirale Einzel-Cytokin-Vektoren, die das IL-2-, das IFN-γ oder das GM-CSF-Gen enthielten. Diese Vektoren wurden für die Transduktion der murinen Fibrosarkom-Zelllinie CMS-5 eingesetzt. Die Fähigkeit von CMS-5-Clonen, die ein einzelnes Cytokin freisetzen, eine primäre Abstoßung von Tumorzellen zu induzieren, wurde mit den Tumorzellen verglichen, die ähnliche Mengen von zwei Cytokinen sekretieren. Außerdem wurden die immunologischen Mechanismen untersucht, die an der Abstoßung von Cytokinsekretierenden Tumorzellen und an der Fähigkeit beteiligt sind, eine lang anhaltende systemische Antitumor-Immunität zu induzieren.
  • Material und Methoden
  • Design retroviraler Vektoren und Umwandlung der Vektoren zu Viren
  • Der retrovirale Vektor N2 stammt aus dem Genom des murinen Moloney-Leukämievirus (MLV) und enthält das bakterielle Neomycin-Resistenz-Gen (neo) als selektierbaren Marken (35). Die Quellen und die Restriktionsenzyme, die zur Herstellung der DNA-Fragmente verwendet wurden, welche die menschliche IL-2-cDNA, die Maus-IFN-γ-cDNA, den Promotor der Thymidinkinase (TK) des Herpes simplex-Virus, den menschlichen unmittelbaren frühen Hauptpromotor („major immediate early human") von CMV, den Promotor der Adenosin-Desaminase (ADA) und das Poly-A-Signal codieren, wurden schon früher beschrieben (7, 9, 36). Die murine GM-CSF-cDNA war ein Geschenk von Genetics Institute, Inc.. Die CMV-, ADA- und TK-Promotor-codierenden DNA-Fragmente wurden mit dem Fragment der menschlichen IL-2-cDNA, der murinen GM-CSF-cDNA oder der murinen IFN-γ-cDNA fusioniert und in unterschiedliche Stellen des N2-Vektors cloniert. Die Fusionsprodukte TK-IL2 oder TK-IFNγ wurden in die SnaBI-Stelle cloniert, die im Polylinker in der langen 3'-terminalen Wiederholung (LTR) eines modifizierten N2-Vektors lag, wodurch die Vektorkonstrukte DC/TKIL2, N/CIFNγ/TIL2 oder N/CIL2/TIFNγ konstruiert wurden. Die Clonierung der Vektorkonstrukte N/CIL2/TIFNγ und N/CIFNγ/TIL2 wurde vervollständigt, indem die Fusionsprodukte CMV-IL2 bzw. CMV-IFNγ in eine Xhol-Stelle cloniert wurden, die stromabwärts des Neomycin-Resistenz-Gens lag. Zur Herstellung der retroviralen Vektoren DC/AD/R/IFNγ, DC/AD/R/GM-CSF und N/CGM-CSF/RIL2 wurde der ADA-Promotor in umgekehrter Orientierung in die Klenow-behandelte Mlul-Stelle, die murine IFN-γ-, die menschliche IL-2- oder die murine GM-CSF-cDNA in umgekehrter Orientierung in die SnaBI-Stelle und das Poly-A-Signal in die Klenow-behandelte ApaI-Stelle des 3'-LTR-Polylinkers cloniert. Die Clonierung von N/CGM-CSF/RIL2 wurde vervollständigt, indem das Fusionsprodukt CMV-GM-CSF in die Xhol-Stelle stromabwärts der Neomycin-Gen-codierenden Sequenzen von DC/AD/R/IL2 cloniert wurde (36). N2/CMV-GM-CSF wurde hergestellt, indem das Fusionsprodukt CMV-GM-CSF in dieselbe Xhol-Stelle des N2-Vektors cloniert wurde. DCA ist ein früher beschriebener Vektor, in dem das menschliche ADA-Minigen in das 3'-LTR von N2 cloniert wurde (37). Die retroviralen Vektorkonstrukte wurden zu dem entsprechenden Virus umgewandelt, indem die Vektor-DNA mittels Elektroporation in eine helferfreie, ecotrope (GP + E-86: DC/AD/R/IFNγ, DC/AD/R/GM-CSF, N2/CMVGM-CSF, N/CIL2/TIFNγ, N/CIFNγ/TIL2, N/CGM-CSF/RIL2) oder amphotrope Verpackungszelllinie (GP + envAM12: DC/TKIL2, DCA) eingeführt wurde (38, 39). Sodann wurden Kolonien durch G418-Selektion isoliert (0,7 mg/ml Genticin; Gibco® Laboratories, Grand Island, NY), zu Erzeugerzelllinien expandiert, und der zellfreie Überstand wurde auf den Virustiter getestet.
  • Tumorzelllinien und Infektion von Tumorzellen
  • CMS-5 und CMS-13 sind Methylcholanthren-induzierte nicht-metastatische Fibrosarkom-Zelllinien, die aus BALB/c-Mäusen stammen (40, 41). Beide Zelllinien bildeten nach einer intradermalen (i. d.) Injektion reproduzierbar Tumoren in syngenen und auch in Immundefizienten Nacktmäusen. Die minimale letale Dosis in BALB/c-Mäusen beträgt 2 × 105 Zellen (7). Die Tumorzellen wurden in DMEM-Medium gezüchtet, das angereichert war mit 10% fetalem Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Für die Infektion von CMS-5-Zellen wurden Virus-Erzeugerzelllinien verwendet, die einen hohen Virustiter absonderten. Sodann wurden clonale Derivate von CMS-5-Zellen durch G418-Selektion isoliert, zu Zelllinien expandiert und für die weitere Analyse verwendet. Die Wachstumsrate in vitro von parentalen und von transfizierten CMS-5-Zellen wurde bestimmt, indem sie an jedem Tag in dreifacher Ausführung mit 0,25 × 105 Zellen pro ml plattiert und die lebensfähigen Zellen 2, 3, 4 und 5 Tage nach dem Aussäen gezählt wurden.
  • Cytokin-Tests
  • Die Sekretion von IL-2, GM-CSF und IFN-γ in die Überstände durch retroviral infizierte Tumorzellen wurde anhand von geeigneten Biotests bestimmt und durch einen ELISA bestätigt (Genzyme, Boston, MA; Endogen, Cambridge, MA). Nach 24 Stunden wurde der Überstand von semikonfluenten parentalen oder Cytokinsekretierenden CMS-5-Zellen gewonnen und auf das menschliche IL-2, den murinen GM-CSF oder das murine IFN-γ getestet. Die biologische Aktivität des IL-2 wurde gemessen, indem die Fähigkeit von IL-2-enthaltenden Präparaten getestet wurde, den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA von IL-2-abhängigen menschlichen primären Lymphoblasten zu induzieren (42). Die Konzentration des murinen GM-CSF wurde genauso in einem Biotest bestimmt, wobei die GM-CSF-abhängigen murinen Zellen 32DC13 verwendet wurden. Nach einer Inkubation über Nacht ohne GM-CSF wurden 104 Zellen mit seriellen Verdünnungen von Testproben inkubiert und sechs Stunden bei 37°C und 6% CO2 gezüchtet. Nachdem die Kulturen mit 1 μCi 3H-Thymidin gepulst worden waren, wurde die Inkubation noch weitere 15 Stunden bei 37°C fortgesetzt, anschließend wurden die Zellen anhand einer Flüssigszintillation gezählt. Die Aktivität des GM-CSF wurde als CpM angegeben und in ng/24 Std./106 Zellen berechnet, indem ein Vergleich mit einer Standardkurve eines rekombinanten murinen GM-CSF durchgeführt wurde. Der Biotest des Maus-IFN-γ beruhte auf der antiviralen Aktivität der Überstände, wobei diese Aktivität durch die Abschwächung der cytopathischen Effekte des vesikulären Stomatitis-Virus auf L-Zellen bestimmt wurde.
  • Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse
  • Eine Durchflusscytometrie wurde für die quantitative Analyse der Oberflächenexpression des MHC der Klasse I und II durchgeführt. Eine Million Zellen wurden aus den Gewebekulturplatten durch Behandlung mit 5 mM EDTA geerntet, mit FACS-Puffer (PBS mit 2% FCS und 0,02% Natriumazid) gewaschen und 30 Minuten bei 4°C mit den Kulturüberständen der Ratten-Hybridomzelllinien M1/42.3.9.8. HLK (ATCC TIB 126) und B21-2 (ATCC TIB 229) inkubiert. Diese Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten wurden, erzeugen monoclonale Antikörper, die mit einer monomeren Determinante auf dem MHC-Molekül der Klasse I bzw. mit einer polymorphen Determinante auf den MHC-Molekülen der Klasse II der Haplotypen I-Ab,d reagieren. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen mit einer Verdünnung von 1 : 50 eines Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Anti-Ratten-IgG der Ziege (Cappel Laboratories, Durham, NC) 30 Minuten bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und danach analysiert. Die Fluoreszenz, die von toten Zellen stammte, wurde anhand einer Färbung mit Propidiumiodid und durch Gating von Vorwärts- und 90°-Streulicht-Signalen von einem Schwellenwert eliminiert. Die Ergebnisse wurden anhand der Fluoreszenzmikroskopie bestätigt.
  • Tumorwachstum in vivo
  • Die BALB/c-Mäuse stammten aus einer Zucht des Sloan Kettering Institut. Die Tumorzellinjektionen wurden mit frisch zubereiteten Tumorzellen durchgeführt, die aus den Kulturplatten durch Trypsin-Behandlung entfernt und zweimal in PBS gewaschen worden waren. Die Zellen wurden den sieben bis zehn Wochen alten weiblichen Tieren i. d. in den Rücken injiziert. Das Tumorwachstum wurde mit einem Greifzirkel in mm gemessen und als mittlerer Durchmesser aufgezeichnet (die längste Länge an der Oberfläche plus die Breite, geteilt durch zwei).
  • In vivo-Verarmung an Subpopulationen von Effektorzellen
  • Der Anti-Maus-mAb der Ratte GK1.5 (IgG2b) und der Anti-Maus-mAb der Ratte 2.43 (IgG2b) in Aszitesflüssigkeit wurden eingesetzt, um die CD4+-Helferzellen bzw. die CD8+ cytotoxischen Zellen zu verringern (43, 44). Die Menge, die für eine Verarmung an T-Zellen erforderlich war, wurde durch wöchentliche i. p. Injektionen von unterschiedlichen Verdünnungen von Aszitesflüssigkeit in die BALB/c-Mäuse bestimmt. Die Splenocyten wurden eine Woche nach der Injektion anhand von Durchflusscytometrie analysiert. Für die in vivo-Studien wurden wöchentliche i. p. Injektionen von 0,5 ml einer 1 : 50 (2.43) oder einer 1 : 30 (GK 1.5) verdünnten Aszitesflüssigkeit verabreicht, wobei eine Woche vor der Injektion der Tumorzellen damit begonnen wurde. Für die Verarmung an NK-Zellen wurden 30 μl eines Anti-Asialo-GM1-Serums des Kaninchens (Wako Chemicals USA, Richmond, VG) alle fünf Tage i. p. injiziert, wobei fünf Tage vor der Injektion der Tumorzellen damit begonnen wurde. Die Verarmung an NK-Zellen wurde durch eine in vitro-Analyse der Cytotoxizität von Milzzellen gegen die NK-Zielzelllinie YAC-1 bestätigt.
  • Ergebnisse der Experimente
  • Infektion von Tumorzellen und Sekretion von Cytokinen
  • Die Strukturen der retroviralen Vektoren, die zur Transduktion der murinen Fibrosarkomzellen CMS-5 verwendet wurden, sind in 16 dargestellt. Der Virustiter wurde bestimmt, indem die Virus-enthaltenden zellfreien Überstände von infizierten Verpackungszellclonen zum Infizieren von NIH3T3-Fibroblasten verwendet wurden. Die Virustiter von unterschiedlichen Konstrukten variierten und standen in einem umgekehrten Zusammenhang mit der Komplexität des verwendeten retroviralen Konstrukts (Tabelle 7). Die Virustiter von Doppel-Cytokin-Konstrukten lagen im Bereich von 103 bis 105 Neo CFU/ml, diejenigen von Einzel-Cytokin-Konstrukten lagen im Bereich von 105 bis 106 Neo CFU/mI. Für die Infektion der Fibrosarkomzellen CMS-5 wurden die Clone mit den hohen Titern ausgewählt. Die G418-resistenten CMS-5-Clone wurden auf die Expression von transfizierten Cytokin-Genen durchgemustert, indem die Freisetzung von IL-2, GM-CSF und IFN-γ in den Kulturüberstand durch einen Biotest gemessen wurde. Danach wurden die Ergebnisse durch einen ELISA bestätigt. Die parentalen CMS-5-Zellen setzten keines der in dieser Studie getesteten Cytokine frei. Die clonalen Isolate der mit dem Cytokin-Gen transduzierten CMS-5-Zellen zeigten abhängig von dem verwendeten retroviralen Vektor eine unterschiedlich stark ausgeprägte Fähigkeit, die Cytokine zu exprimieren und freizusetzen. Die Mengen der durch die verschiedenen Clone produzierten Cytokine lagen im Bereich von 0 bis 170 ng/24 Stunden/106 Zellen für IL-2, 0 bis 1600 pg/24 Stunden/106 Zellen für IFN-γ und 0 bis 400 ng/24 Stunden/106 Zellen für GM-CSF. Clone, die einzelne Cytokine absonderten, wurden ausgewählt; nach einer Inokulation von einer Million Zellen zeigten sie ein verzögertes Tumorwachstum, jedoch keine Tumorabstoßung. Die IL-2- oder IFN-γ transduzierten CMS-5-Clone DC/TKIL2/CMS5 # 6 und DC/AD/R/IFNγ/CMS5 # 13 setzten IL-2 mit 53 ng/24 Std./106 Zellen (160 U/24 Std./106 Zellen) bzw. IFN-γ mit 268 pg/24 Std./106 Zellen (2 U/24 Std./106 Zellen) frei. Für die Analyse, ob die Sekretion eines zweiten Cytokins durch dieselbe Zelle eine Tumorabstoßung induzieren würde, wählte der Anmelden den Tumorclon N/CIL2/TIFNγ/CMS5 # 3 aus, der 58 ng/24 Std./106 Zellen (174 U/24 Std./106 Zellen) von IL-2 und 159 pg/24 Std./106 Zellen (0,72 U/24 Std./106 Zellen) von IFN-γ produzierte (Tabelle 8). Für die Analyse der in vivo-Effekte von GM-CSF auf eine primäre Tumorabstoßung wurden die gesamten transduzierten CMS-5-Zellen, die große (130 ng/24 Std./106 Zellen), mittlere (80 ng/24 Std./106 Zellen) und kleine (8 ng/24 Std./106 Zellen) Mengen von GM-CSF freisetzten, und der Clon N2/CMV-GM-CSF/CMS5 # 6.1 selektiert, der 65 ng/24 Std./106 Zellen absonderte. Der Tumorzellclon N/CGM-CSF/RIL2 # 14.14, der 130 ng/24 Std./106 Zellen von GM-CSF und 3,3 ng/24 Std./106 Zellen (10 U/24 Std./106 Zellen) von IL-2 freisetzte, wurde als Kontrolle verwendet (Tabelle 2). Die Sekretion von IL-2, IFN-γ oder GM-CSF hatten keinen feststellbaren Effekt auf die Morphologie der Zellen. Keine Änderung der Wachstumsrate in vitro wurde bei den GM-CSF- oder IL-2/GM-CSF-sekretierenden Zellen im Vergleich zu den parentalen CMS-5-Zellen festgestellt. Die Wachstumsrate in Kultur wurde durch die Sekretion von IFN-γ geringfügig reduziert (17). Tabelle 7 Virustiter für die in den Experimenten verwendeten Konstrukte
    Konstrukt Titer (Neo KBE/ml)
    DC/TKIL2 1 × 106
    DC/AD/R/IFNγ 1 × 105
    DC/AD/R/GM-CSF 5 × 105
    N2/CMVGM-CSF 1 × 106
    DCA 1 × 106
    N/CIL2/TIFNγ 5 × 103
    N/CIFNγ/TIL2 1 × 104
    N/CGM-CSF/RIL2 1 × 105
  • Tabelle 8 Cytokin-Sekretion aus den in den Experimenten verwendeten Vektor-transduzierten CMS-5-Clonen
    Figure 01140001
  • MHC-Expression von IFN-γ transduzierten Tumorzellen
  • Eine Hinaufregulation von MHC-Molekülen und anderen Molekülen, die an der Prozessierung und Präsentation von Antigenen beteiligt sind, wurde für IFN-γ gezeigt, wobei man davon ausgehen kann, dass diese Wirkung zu den festgestellten Antitumor-Effekten von IFN-γ beiträgt (12, 13, 45 bis 49). Um zu bestimmen, ob die konstitutive Expression von IFN-γ zu Effekten auf die MHC-Expression der Klasse I und II führen würde, wurden die IL-2-, IFN-γ-, GM-CSF- und IL-2/IFN-γ-transduzierten CMS-5-Zellen durch eine indirekte Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse getestet (18). Die parentalen CMS-5-Zellen exprimierten MHC-Moleküle der Klasse 1, jedoch waren keine MHC-Moleküle der Klasse II nachweisbar. Der Spiegel der MHC-I-Expression war im Vergleich zu den nicht-transduzierten Fibrosarkomzellen in den Zellen, die das IFN-γ alleine sekretierten, wesentlich erhöht und in den Zellen, die IFN-γ plus IL-2 freisetzten, mäßig erhöht. Keine de novo-Expression von MHC-Molekülen der Klasse II war bei IFN-γ transfizierten Zellen zu sehen. Wie erwartet wurden keine Effekte der IL-2- oder der GM-CSF-Sekretion auf die MHC-Expression festgestellt (Ergebnisse nicht dargestellt, 9).
  • Steigerung einer spezifischen Antitumor-Antwort durch IL-2 und IFN-γ
  • Um die in vivo-Effekte einer Sekretion von IL-2, IFN-γ und GM-CSF auf die primäre Tumorabstoßung zu testen, wurden Cytokin-sekretierende oder parentale CMS-5-Zellen i. d. in den Rücken von BALB/c-Mäusen injiziert, und das Tumorwachstum wurde gemessen. Der Anmelden hat früher gezeigt, dass eine Injektion von 2 × 105 nicht-modifizierten CMS-5-Zellen in BALB/c-Mäuse bei 100% der Mäuse zu einem Tumorwachstum führt (7). Deshalb verwendete der Anmelden in den CMS-5-Kontrollgruppen 2,5 × 105 parentale CMS-5-Zellen. Eine frühere Untersuchung zeigte, dass die Sekretion von IL-2 oder IFN-γ alleine durch CMS-5-Zellen zu einer primären Tumorabstoßung führt (7, 9). Der Anmeldet hat nun CMS-5-Clone, die ein einzelnes Cytokin freisetzen, ausgewählt, die nicht zur Abstoßung führten, wenn eine Million Zellen injiziert wurden. Dagegen wurden eine Million CMS-5-Zellen, die vergleichbare Mengen von sowohl IL-2 plus IFN-γ freisetzten, immer innerhalb von drei bis vier Wochen abgestoßen. Ein repräsentatives Experiment ist in 19 dargestellt. Die gemeinsame Injektion von 106 oder 5 × 105 IL-2-sekretierenden CMS-5-Zellen mit der gleichen Zahl von IFN-γ sekretierenden CMS-5-Zellen führte auch zu keiner Tumorabstoßung (20). Somit scheint die gemeinsame Sekretion von IL-2 und IFN-γ aus derselben Tumorzelle im Vergleich zur Sekretion der einzelnen Cytokine die primären Antitumor-Antworten des Wirts zu steigern.
  • Da sich der GM-CSF als eine wirksame Substanz zur Induktion der Immunität gegen eine Provokation mit parentalen Tumorzellen erwiesen hat, untersuchte der Anmeldet die direkten in vivo-Effekte von GM-CSF-sekretierenden Fibrosarkomzellen. Die gesamten transduzierten CMS-5-Zellen, die große, mittlere oder kleine Mengen von GM-CSF freisetzten, führten bei einer Dosis von 2,5 × 105 Zellen zu keiner Regression (21). Außerdem legen die Ergebnisse nahe, dass die GM-CSF-Sekretion von CMS-5-Fibrosarkomzellen das Tumorwachstum sogar gefördert haben könnte. Um die fortgesetzte Cytokin-Sekretion in vivo zu zeigen, wurden die GM-CSF-sekretierenden Tumoren nach drei bis vier Wochen entnommen, wieder in Kultur etabliert und die Produktion des Cytokins vor und nach einer zehntägigen Kultur mit G418 gemessen. Die GM-CSF-Sekretion vor der Injektion entsprach in allen Fällen der Menge, die nach der Resektion des Tumors und nach der G418-Selektion freigesetzt wurde (Ergebnisse nicht dargestellt). Diese Daten legen nahe, dass die Produktion von GM-CSF für die in vivo-festgestellten Effekte verantwortlich war. Weitere in vivo-Experimente unter Verwendung von CMS-5-Zellen, die mit Vektoren transduziert worden waren, welche die IL-2-cDNA alleine oder die GM-CSF- plus die IL-2-cDNA enthielten, zeigen, dass die Sekretion von GM-CSF zusätzlich zu IL-2 im Vergleich zu IL-2 alleine keine weitere Wirkung auf die Hemmung des Tumorwachstums hat (Ergebnisse nicht dargestellt).
  • Um zu untersuchen, ob die in Mäusen induzierte Antitumor-Aktivität, denen N/CIL2/TIFN-γCMS5 injiziert worden war, eine systemische, lang anhaltende tumorspezifische Antwort war, wurden die Mäuse, die vorher die Cytokinsekretierenden CMS-5-Zellen abgestoßen hatten, mit einer letalen Dosis der parentalen Tumorzellen oder mit nicht-kreuzreagierenden Methylcholanthreninduzierten Tumoren des gleichen genetischen Hintergrunds (CMS-13) provoziert. Danach wuchsen Tumoren in den Mäusen, die mit CMS-13 provoziert worden waren, nicht jedoch in den Mäusen, die mit den CMS-5-Zellen provoziert worden waren, dies bestätigt die früheren Ergebnisse (Ergebnisse nicht dargestellt, 7, 9). Die CMS-5-Zellen, die IL-2 und IFN-γ sekretierten, induzierten somit sowohl unmittelbare Antitumor-Antworten als auch eine lang anhaltende schützende Immunität gegen den parentalen Tumor.
  • Einfluss einer in vivo-Verarmung an Subpopulationen von Effektorzellen auf das Tumorwachstum
  • Um die Beteiligung der verschiedenen Subpopulationen von Eftektorzellen an der Abstoßung von IL-2/IFN-γ-sekretierenden Tumorzellen zu bestimmen, wurde das Tumorwachstum in Mäusen überwacht, die selektiv an CD4+-, CD8+- oder NK-Zellen verarmt worden waren. Ein repräsentatives Experiment ist in 7 dargestellt. Die Mäuse erhielten Injektionen mit mAbs gegen die CD4+-, CD8+- oder NK-Zellen, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Abwesenheit von CD8+-Zellen verhinderte die Abstoßung von IL-2/IFN-γ-sekretierenden CMS-5-Zellen. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Verarmung an CD4+-Zellen nicht die Fähigkeit von Mäusen, die transduzierten Tumorzellen abzustoßen. Die Verarmung an NK-Zellen verzögerte die Abstoßung von IL-2/IFN-γ-sekretierenden Tumoren im Vergleich zu den Mäusen, bei denen diese NK-Zellen nicht verringert worden waren. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die cytotoxischen CD8+-T-Zellen hauptsächlich für die primäre Abstoßung von IL-2/IFN-γ-sekretierenden Tumorzellen verantwortlich waren, dass jedoch auch die NK-Zellen, die zwar für die Entfernung des Tumors nicht erforderlich waren, induziert wurden und dass sie möglicherweise auch einen Einfluss auf die Tumorabstoßung ausübten (29). Die CD4+-Zellen schienen dagegen in der durch die IL-2/IFN-γ-sekretierenden CMS-5-Zellen vermittelten Antitumor-Aktivität keine Rolle zu spielen.
  • Diskussion der Experimente
  • In dieser Arbeit untersucht der Anmelden die Mechanismen der primären Abstoßung von Tumorzellen, die mit Cytokin-Genen transduziert wurden, welche in Einzel- oder Doppel-cDNA-enthaltenden retroviralen Konstrukten vorlagen. Obwohl es zurzeit nicht möglich ist, therapeutische Gene in situ zielgerichtet auf Tumorzellen zu lenken, kann man davon ausgehen, dass diese Vorgehensweise durch den Fortschritt in der Entwicklung von Systemen zur gewebespezifischen Verabreichung und Expression zu einem realistischen Ansatz für die Zukunft wird (1 bis 6). Da man bei einer in vivo-Behandlung von Patienten mit Krebs unter Verwendung eines Gentransfers versuchen sollte, eine maximale Induktion der Antitumor-Immunität durch einen einzelnen Transduktionsschritt zu erreichen, hat der Anmelden getestet, ob die gemeinsame Transduktion von zwei Cytokinen in eine einzige Tumorzelle durch einen einzigen retroviralen Vektor zu einer gesteigerten Antitumor-Antwort des Wirts führt.
  • Der Anmelden wählte in dieser Studie IFN-γ und IL-2, da für diese Cytokine früher gezeigt wurde, dass sie eine primäre Tumorabstoßung wirksam induzieren (7 bis 12), und da die beiden Cytokine auf verschiedenen Ebenen der Immunantwort wirken: IFN-γ ist ein Cytokin, von dem bekannt ist, dass es Moleküle nach oben reguliert, die an der Prozessierung und Präsentation von Antigenen beteiligt sind, und dass es somit auf der Ebene der Zielzellen wirkt (45, 47 bis 52). Außerdem reguliert IFN-γ die Induktion von cytotoxischen T-Zellen und die Aktivierung von Makrophagen, NK-Zellen und LAK-Zellen und kann verschiedene andere immunregulatorische Faktoren induzieren (29 bis 33, 53, 54). IL-2 löst andererseits die Proliferation von cytotoxischen T-Zellen, NK- und LAK-Zellen aus und wirkt somit hauptsächlich auf der Ebene der Effektorzellen (55 bis 57). Außerdem kann man von einer Synergie von IL-2 und IFN-γ ausgehen, da kürzlich erhaltene Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von T-Zellen gesteigert werden kann, wenn ein Antigenunspezifisches ko-stimulierendes Signal, wie B7 oder IL-2, durch die APC freigesetzt wird (26, 27, 58 bis 60). Die Impfung mit GM-CSF-sekretierenden bestrahlten Tumorzellen kann eine starke, lang anhaltende Immunität gegen eine Provokation mit parentalen Tumorzellen stimulieren (24). Der Anmelden untersuchte die Effekte von lebenden GM-CSF- und GM-CSF/IL-2-sekretierenden Tumorzellen auf die Induktion einer primären Tumorabstoßung.
  • Hierfür konstruierte der Anmelden retrovirale Einzel-Cytokin-Vektoren, die die murine IFN-γ , die murine GM-CSF- oder die menschliche IL-2-cDNA enthielten, und retrovirale Doppel-Cytokin-Vektoren, die sowohl die IL-2- als auch die IFN-γ cDNA oder sowohl die IL-2- als auch die GM-CSF-cDNA enthielten, und infizierten hiermit CMS-5, ein schwach immunogenes Fibrosarkom. Unsere Ergebnisse zeigen, dass retrovirale Vektoren, die zwei Cytokin-Gene enthalten, für eine stabile Transfektion von Tumorzellen eingesetzt werden können, wodurch es zu einer Sekretion von biologisch aktiven Proteinen über längere Zeitspannen kommt. Die Sekretion von kleinen Mengen von IFN-γ durch Fibrosarkomzellen hatte eine Hinaufregulation der MHC-Moleküle der Klasse I auf der Zelloberfläche zur Folge. Die Immunogenität konnte somit erhöht werden, da die tumorassoziierten Antigene den cytotoxischen T-Zellen im Zusammenhang mit MHC-Molekülen der Klasse I präsentiert werden (61, 62). Die Sekretion von IL-2 und IFN-γ aus derselben Tumorzelle führte zur Erzeugung von cytotoxischen Zellen, die in der Lage waren, mindestens eine Million CMS-5-Zellen abzustoßen, eine Dosis, die viermal höher war als die für BALB/c-Mäuse letale Dosis von CMS-5. Die Sekretion von ähnlichen Mengen von IFN-γ oder IL-2 alleine induzierte keine Immunantwort, die stark genug gewesen wäre, um die Abstoßung von einer Million Tumorzellen zu bewirken. Auch das Mischen der gleichen Anzahl von IL-2- und von IFN-γ sekretierenden CMS-5-Zellen hatte keine Tumorabstoßung zu Folge. Dieses Phänomen hängt möglicherweise mit dem Umstand zusammen, dass die beiden Cytokine durch den Doppel-Cytokin-Vektor mit einer konstanten Konzentration pro Zelle freigesetzt werden, bis alle Tumorzellen zerstört sind, dass dagegen in dem Zellgemisch vorzugsweise eine Cytokinsekretierende Population vor der anderen zerstört wird. Diese Ergebnisse sprechen für das Konzept, dass IL-2 und IFN-γ gemeinsam cytotoxische Funktionen des Immunsystems aktivieren können (46, 63 bis 65), und sie legen nahe, dass es ein Vorteil ist, wenn die beiden Cytokine durch dieselbe Zelle freigesetzt werden. Es ist möglich, dass die in vivo durch IFN-γ induzierte Hinaufregulation von Molekülen, die an der Prozessierung und Präsentation von Antigenen beteiligt sind, in der autokrinen Situation wirksamer ist, und dass in der parakrinen Situation mehr IFN-γ erforderlich wäre. Jedoch muss beachtet werden, dass, bezogen auf eine Zelle, in einem Gemisch von Clonen nur halb so viel Cytokin produziert wird. Die Frage, ob die gemeinsame Sekretion der beiden Cytokine durch eine einzige Tumorzelle ein Vorteil ist, ist mit den hier durchgeführten Experimenten noch nicht definitiv beantwortet. Trotzdem sollte die Sekretion der beiden Cytokine durch eine einzelne Zelle dazu führen, dass alle Effektorzellen gleichzeitig den beiden Cytokinen ausgesetzt werden. Im Gegensatz dazu kann man davon ausgehen, dass es bei einer Sekretion der beiden Cytokine durch unterschiedliche Tumorzellen dazu kommt, dass die Effektorzellen variablen Konzentrationen der Cytokine ausgesetzt werden. Weiterhin würde die Verwendung eines einzelnen Vektors, der die beiden Cytokin-Gene enthält, den Gentranfer für die Behandlung von Tumoren in vivo vereinfachen, da hiertür nur ein einziger Transduktionsschritt erforderlich ist.
  • Die gesamten transduzierten, GM-CSF-sekretierenden CMS-5-Zellen, die nicht bestrahlt waren, und clonal selektierte GM-CSF- und GM-CSF/IL-2-sekretierende CMS-5-Zellen wurden nicht abgestoßen, auch nicht bei niedrigeren Zellzahlen. Vielmehr wuchs der Tumor umso schneller, je mehr GM-CSF freigesetzt wurde, dies legt einen wachstumsfördernden Effekt von GM-CSF auf die CMS-5-Zellen nahe. Die Entnahme von Tumor und die erneute Selektion mit G418 in vitro zeigte, dass das Auswachsen von CMS-5-Zellen, die keinen oder wenig GM-CSF sekretierten, nicht der Grund für das in vivo festgestellte Tumorwachstum sein konnte. In weiteren Experimenten wurde der GM-CSF-enthaltende Vektor verwendet, um MBT-2, einen Blasenkrebs, TS/A, ein Adenokarzinom, und B16, ein Melanom, zu transduzieren. In keinem Fall induzierte die Sekretion von GM-CSF die Abstoßung der transduzierten Tumorzellen. Die Ergebnisse des Anmelders stimmen mit den veröffentlichten Ergebnissen überein, die zeigen, dass der GM-CSF seine kräftigen immunstimulierenden Effekte am besten dann ausübt, wenn er durch bestrahlte Tumorzellen freigesetzt wird, die sich nicht mehr vermehren können. Dranoff et al. beschrieben ein systemisches Syndrom mit einer zum Tode führenden Toxizität, die sich durch eine Leukozytose, Hepatosplenomegalie und pulmonale Blutung bei den Mäusen äußerte, denen lebende GM-CSF-sekretierende B16-Zellen injiziert worden waren (24). Dieses Phänomen wurde der in vivo immer mehr zunehmenden Zahl an GM-CSF-exprimierenden Tumorzellen zugeschrieben. Menschliche Tumoren, die von Natur aus GM-CSF sekretieren, scheinen auch nicht abgestoßen zu werden (66). Diese und unsere Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, das Cytokin für jeden Tumor und für jede gewählte Gentherapie sorgfältig zu selektieren.
  • In Abwesenheit von cytotoxischen CD8+-T-Zellen wurden die IL-2/IFN-γ sekretierenden CMS-5-Tumoren nicht abgestoßen, dies bestätigt, dass die CD8+-CTLs für die Eliminierung des Tumors erforderlich sind. Dieses Ergebnis legt nahe, dass trotz einer leichten Wachstumshemmung von IFN-γ sekretierenden Zellen in vitro die direkten Hemmeffekte von IFN-γ auf das Tumorwachstum nicht für die Tumorregression verantwortlich waren. Obwohl die IL-2/IFN-γ Sekretion durch die Tumorzellen NK-Zellen aktivierte, wie durch die verzögerte Abstoßung von Tumoren in den an NK-Zellen verarmten Tieren gezeigt wird, war ihr Vorliegen für die Eliminierung der Tumoren nicht erforderlich. Die CD4+-Helfer-T-Zellen schienen nicht zur Abstoßung von IL-2/IFN-γ sekretierenden CMS-5-Zellen beizutragen, da die Tumorabstoßung in den an CD4 verarmten Mäusen nicht abgeschwächt war, möglicherweise weil die konstitutive Sekretion von IL-2 und IFN-γ durch die Zielzellen die Notwendigkeit von Helfer-T-Zellen umgeht (8). Aus den hier dargestellten Experimenten kann der Anmeldet nicht ausschließen, dass andere unspezifische Effektorzellen des Immunsystems an der Abstoßung von neoplastischen Zellen beteiligt sind. IFN-γ ist ein wirksamer Makrophagen-Aktivator, weshalb in diesem System die Antitumor-Aktivität teilweise den cytostatischen oder cytotoxischen Effekten von aktivierten Makrophagen zuzuschreiben sein könnte. Außerdem führt die Sekretion von IL-2 und IFN-γ nicht nur zur Abstoßung von transduzierten Tumorzellen, sondern sie stimuliert auch eine spezifische, lang anhaltende Antitumor-Immunität. Dies könnte klinisch wichtig sein, wenn nach einer primären Therapie nicht alle Tumorzellen entfernt wurden. Dann könnte die Immunität verhindern, dass wieder Mikrometastasen wachsen. Die Frage, ob die Immunantwort, die durch Doppel-Cytokin-transduzierte Tumorzellen induziert wird, ausreichend sein könnte, um auch eine schon vorher etablierte Krankheit zu eliminieren, oder, falls dies nicht der Fall ist, wie dies erreicht werden kann, bedarf noch weiterer Untersuchungen.
  • Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass retrovirale Vektoren, die ein doppeltes Cytokin-Gen enthalten, eingesetzt werden können, um Tumorzellen stabil zu transfizieren, wodurch in vivo die Antitumor-Aktivität gesteigert werden kann. Außerdem ist die Expression der beiden Cytokine aus einem einzigen Vektorkonstrukt möglicherweise für die zukünftigen klinischen Anwendungen von Vorteil, da die beiden Gene zur gleichen Zeit in eine einzige Tumorzelle eingebracht werden können.
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Claims (15)

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  2. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, die ein anderes Immunmolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Cytokin, einem Adhäsionsmolekül, einem kostimulierenden Faktor, einem tumorassoziiertem Antigen und einem tumorspezifischen Antigen, exprimiert.
  3. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine nichtprofessionelle antigenpräsentierende Zelle ist.
  4. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ein tumorassoziiertes Antigen und ein tumorspezifisches Antigen exprimiert.
  5. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle entweder ein tumorassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen exprimiert.
  6. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einer Melanomzelle, einer Nierenkrebszelle, einer Brusttumorzelle und einer Gehirntumorzelle.
  7. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle einen retroviralen Vektor umfasst, der die folgenden Bestandteile umfasst: (a) ein langes 3'-terminales Repeat (LTR); und (b) ein Insert, umfassend: (i) einen Promotor, (ii) DNA, die Interleukin-2 und Interferon-Gamma codiert, und (iii) ein Poly-A-Signal, wobei der Promotor, die Interleukin-2 und Interferon-Gamma codierende DNA und das Poly-A-Signal im Leserahmen in einer 5'- nach 3'-Orientierung angeordnet sind, und wobei das Insert innerhalb des 3'-LTR in einer Orientierung gelegen ist, die entgegen der Orientierung des 3'-LTRs ist.
  8. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 7, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Promotor des Herpex simplex-Virus-Thymidin-Kinase-Gens, einem Promotor des menschlichen unmittelbaren frühen Haupt ("major immediate early human")-CMV-Gens und einem Promotor des Adenosin-Desaminase-Gens.
  9. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 7, wobei der Vektor N2 ist.
  10. Genetisch manipulierte Zelle nach Anspruch 1, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, die im Wesentlichen aus SK-MEL-29, SK-MEL-131, SK-RC-28 und SK-RC-39 besteht.
  11. Zusammensetzung, umfassend eine Vielzahl von genetisch manipulierten Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
  12. Verwendung der genetisch manipulierten Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des Tumorwachstums in einem Säugerindividuum.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Zelle weiterhin das tumorassoziierte Antigen melanomassozüertes Antigen E-1 exprimiert.
  14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die genetisch manipulierte Zelle eine dendritische Zelle ist.
  15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei dem Säugerindividuum etwa zehn bis etwa fünfzig Millionen genetisch manipulierter Zellen verabreicht werden sollen.
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