EP0614531A1 - NACHWEISVERFAHREN FÜR p53-SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER - Google Patents

NACHWEISVERFAHREN FÜR p53-SPEZIFISCHE ANTIKÖRPER

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Publication number
EP0614531A1
EP0614531A1 EP93920841A EP93920841A EP0614531A1 EP 0614531 A1 EP0614531 A1 EP 0614531A1 EP 93920841 A EP93920841 A EP 93920841A EP 93920841 A EP93920841 A EP 93920841A EP 0614531 A1 EP0614531 A1 EP 0614531A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
antibodies
fragments
bound
fragment
specific
Prior art date
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Ceased
Application number
EP93920841A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hanswalter Zentgraf
Peter Schranz
Martin Volkmann
Claudia Tessmer
Ralf Klein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP0614531A1 publication Critical patent/EP0614531A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5748—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of p53-specific antibodies in body fluids. It also relates to a kit that can be used for this purpose. Furthermore, the invention relates to p53 fragments and the DNA sequences encoding them, the fragments having binding regions for p53-specific antibodies, and methods for their preparation.
  • p53 protein express the designated protein (p53). This protein is known in its primary structure and has 393 amino acids (cf. Lamb, P. and Crawford, L.V., Mol. Cell. Biol., Volume 6 (1986), 1379-1386). There is an increased expression of p53 in many tumor diseases. This can be associated with the presence of specific antibodies directed against p53. To detect such antibodies
  • p53-containing cell extracts are radiolabelled in vivo and immunoprecipitated with patient sera (see de Fromentel, C.C. et al., Int. J. Cancer 39 (1987), 185-189).
  • Carrier materials are also coated with antibodies directed against p53, p53 is then adsorbed from cell extracts and patient sera are added. Bound anti- ⁇ 53 antibodies are detected with iodine-coupled protein A (cf.
  • Radioactive substances are used in these detection methods. This means an increased security risk and thus limited usability, especially in the clinic.
  • the in vivo labeling of cells is also financially and technically complex and therefore only of limited suitability for larger test series. Furthermore, the use of cell extracts often leads to non-specific antibody binding.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for the detection of p53-specific antibodies which does not have the disadvantages mentioned.
  • this is achieved in a method in which carrier material-bound p53 and / or carrier material-bound, binding regions for p53-specific antibodies having fragments thereof are incubated with body fluids and the specific antibodies bound to the p53 and / or the fragments (a)
  • Antibodies (c) can react, the label being non-radioactive in each case.
  • p53 encompasses a wild type sequence p53 protein.
  • Such a cell can be isolated from cells such as HepG2 (see Knowles, B. et al., Science 209 (1990),
  • P53 can also be one of the wild type sequence
  • p53 can be part of a fusion protein.
  • Such as any other p53 can be isolated from cells that express it after genetic engineering.
  • Such cells include prokaryotic and eukaryotic cells. Examples of the former are E. coli strains such as BL21 (see Studier, F.W. et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), while the latter
  • a p53 cDNA from HepG2 cells (see above) is reverse transcribed in the usual way and amplified in a conventional PCR method.
  • the sequence of the cDNA is compared with published data (e.g. EMBL library) and inserted into the known vector pet 3d, whereby the recombinant vector pet 92/2 is obtained.
  • This is transformed into the bacterial strain BL21 (see above) for the expression of p53.
  • P53 induction is achieved by adding IPTG.
  • the bacteria are sedimented and subjected to lysozyme and DNasel treatment after freezing and thawing.
  • lysates are incubated with urea solutions of various concentrations and, after centrifugation, released p53 is provided in pure form by polyacrylamide gel electrophoresis and subsequent electroelution.
  • urea solutions of various concentrations and, after centrifugation, released p53 is provided in pure form by polyacrylamide gel electrophoresis and subsequent electroelution.
  • p53 fragments which contain binding regions for p53-specific antibodies. These fragments are referred to below as p53-AKBR fragments.
  • the p53-AKBR fragments preferably comprise the amino acids 1-241, 40-349, 40-393, 66-241, 66-393,
  • Procedures are used.
  • a method has proven to be favorable in which the entire length of p53 distributed fragments constructed, wherein at least two fragments each have an overlapping area, which allows fragments to react with a p53-specific antibody and identifies the overlapping area bound by the antibody and provides it as a p53-AKBR fragment and, if appropriate, as the basis for one single or multiple repetition of the above cycle used.
  • the starting point for this method is a p53 cDNA obtained from HepG2 cells (see above).
  • DNA fragments distributed over the entire length of the cDNA are amplified in a conventional PCR method, at least two fragments each having an overlapping area.
  • the amplified DNA fragments are inserted into pet 3d and, after transformation and IPTG induction, are expressed in the bacterial strain BL21.
  • the p53 fragments obtained are isolated as described above for p53 and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. This is followed by a Western blot analysis, in which labeled, commonly available p53-specific
  • Antibodies e.g. Pab 240
  • the binding region of the antibody is assigned to the overlapping region. This area is provided as a fragment designated p53-AKBR.
  • p53-AKBR a fragment designated p53-AKBR.
  • the above cycle can be repeated one or more times with the p53-AKBR fragment in order to further narrow the binding region of the p53-specific antibody.
  • This binding region can be limited to a few amino acids. The under certain circumstances necessary short p53 fragments can be produced synthetically. Those skilled in the art are the above
  • DNA sequences coding for p53-AKBR fragments are also provided. These DNA sequences preferably comprise those for amino acids 1-241,
  • p53 and / or p53-AKBR fragments are bound to a carrier material.
  • a carrier material for example, a single ⁇ 53-AKBR fragment or this can also be bound together with p53.
  • Microtiter plates, tubes, microspheres and slides can be used. With very small p53-AKBR fragments, especially peptides, it is advisable to bind to the
  • Carrier material via a common carrier e.g. BSA.
  • a common carrier e.g. BSA.
  • microtiter plates are used as the carrier material.
  • p53 and / or p53-AKBR fragments are taken up in carbonate buffer, diluted differently and placed in the holes of a microtiter plate. After incubation overnight at 4 ° C, several washing steps follow in physiological
  • Buffer The binding of p53 and / or the p53-AKBR fragments is stable.
  • bound p53 and / or bound p53-AKBR fragments are incubated with body fluids.
  • body fluids preferably include serum, lymph, saliva and urine. They also include liquids that spill out solid tissues such as lungs, brain and bone marrow, as well as from tumors such as colorectal carcinoma and hepatocell carcinoma.
  • the incubation is carried out according to customary procedures. In the present case, sera from patients are diluted differently and added bound p53 and / or bound p53-AKBR fragments in the microtiter plate. After 1 hour incubation at 37 ° C, several washing steps in physiological buffer follow. The binding of specific anti-p53 antibodies is stable.
  • antibody (a) (hereinafter referred to as antibody (a))
  • Antibodies (c) implemented.
  • the marking is non-radioactive in each case. Rather, other common markers are used. Fluorescent dyes such as e.g. Fluorescein isothiocyanate, and enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase. A biotin / streptavidin complex can be used as an amplifier system.
  • the markers are generally available.
  • the conjugation with the antibodies (b) or (c) takes place according to the manufacturer's instructions. Labeled antibodies (b) and (c) are also generally available.
  • suitable antibodies (b) whether labeled or unlabelled, depends on the animal or animal species from which the body fluid used originates. If, for example, it is a liquid from a human, then antibodies (b) which are directed against human immunoglobulin are used. In corresponding If antibodies (c) are additionally used, these are selected in relation to the animal or the animal species from which the antibodies (b) originate.
  • suitable antibodies is known to the person skilled in the art and can be carried out without further ado.
  • the reaction of bound antibodies (a) with labeled antibodies (b) or with unlabeled antibodies (b) and then with labeled antibodies (c) can be carried out in the usual way.
  • the reaction with the antibodies (b) in both alternatives takes place within 1 h at 37 ° C.
  • a substrate solution corresponding to the marker is added to develop the detection reaction. This is done according to the manufacturer's instructions.
  • the antibodies (c) are added after the washing processes. Their implementation and the development of the detection reaction take place in a corresponding manner.
  • the method according to the invention has a high sensitivity. This is particularly high if the antibodies (c) are also used.
  • the present method can be carried out quickly in any laboratory. There are no special safety precautions to be taken.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for carrying out larger series examinations.
  • kit is also provided which is suitable for carrying out the above methods.
  • This kit contains
  • the marking is non-radioactive in each case.
  • the statements made above for the method according to the invention apply to them as well as the other components of the kit.
  • Pages 20-25 show the DNA sequences of the p53-AKBR fragments listed on pages 17-19.
  • a p53 cDNA was reverse transcribed with a "hexamer random primer” and amplified using the oligoprimers "Fo” and “R 11 " in a conventional PCR method (sequence “Fo”: GCA TGG ATC CGA ATT CTG CCT TCC GGG TCA CTG C; "R 11 ": GGT ACC.CGG GGA TCC TGG GTG CTT CTG ACG).
  • the amplified sequence was compared with published data (EMBL library) and over Restriction enzyme sites cloned at the start codon of p53 (NcoI) and in primer R 11 (BamHI) while maintaining the entire coding region in the vector ⁇ et3d in the bacterial strain HMS 174.
  • the vector pet 92/2 obtained was transformed into the bacterial strain BL21 (see above). After culturing the bacteria at 37 ° C to an optical density of 0.6 (600 nm) in LB medium containing 100 / ⁇ g / ml ampicillin and 30 / ⁇ g / ml chloramphenicol, p53 was induced for 3 hours at 30 ° C performed with 2mM IPTG.
  • a p53 cDNA was reverse transcribed from the cell line HepG2 (see above) and amplified by means of the oligoprimers "Fp53-B” and "His-Rp53” by PCR.
  • the amplified sequence was cloned via BamHI cleavage sites in both PCR primers in the known expression vector pQE-8 opened with BamHI.
  • Solution A 6M guanidinium hydrochloride, 0.1M NaH-PCK,
  • Solution C 8M urea, 0.1M NaH 2 PO 4 , 0.01M TrisHCl,
  • Solution D 8M urea, 0.1M NaH 2 PO 4 , 0.01M TrisHCl,
  • Solution E 8M urea, 0.1M NaH 2 PO 4 , 0.01M TrisHCl,
  • Solution F 6M guanidinium hydrochloride, 0.2M acetic acid
  • Rp 53-70 amplified in a common PCR method.
  • the amplified sequences were compared with published data (EMBL library) and cloned into the vector pet 3 d via the restriction enzyme site BamHI (see above).
  • the sequences were expressed after transformation and IPTG induction in the bacterial strain BL21 (cf. above).
  • the expressed sequences (p53 fragments) were isolated as described in Example 2 (A) for P53 and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. This was followed by a conventional Western blot analysis using a commonly available p53-specific antibody to bind to the p53 fragments. This antibody showed binding to both overlapping p53 fragments.
  • overlapping area i.e. amino acids 30-55, was considered the binding region of the antibody.
  • This binding region was further narrowed down using two synthetic overlapping p53 peptides. This allowed the binding region of the p53-specific antibody to be limited to the p53-AKBR fragment of amino acids 37-52.
  • Carbonate buffer with 0.2 ng, 0.15 ng, 0.1 ng, 0.05 ng, 0.01 ng and 0.005 ng p53 and a 1% BSA solution as an empty control are pipetted in once. After overnight incubation at 4 ° C, ten short washes with PBS were performed.
  • a serum of a patient with hepatocellular carcinoma to be tested was diluted 1: 100, 1: 250, 1: 500 and 1: 1000 (dilution in 500 mg BGG / 1, 100 mg BSA / 1, 0.05% Tween -20) added to each of the various p53 concentrations and the BSA control and incubated for 1 hour at 37 ° C ("checkerboard titration"). This was followed by five washing steps
  • PBS containing 0.05% Tween-20 PBS containing 0.05% Tween-20.
  • a commonly available peroxidase-coupled goat anti-human antibody was diluted according to the manufacturer's instructions (100 mg / 1 BGG, 500 mg / 1 BSA, 0.05% Tween-20). Three washing steps with PBS followed. The peroxidase detection reaction was carried out with OPD developing solution. For this, a 0.1 M
  • O-phenylenediamine dihydrochloride O-phenylenediamine dihydrochloride
  • Color intensity determined photometrically at 492 nm. Absorbance values of more than twice the BSA control were rated as a positive response.
  • the table shows the data of a correspondingly performed ELISA in comparison to the determination of specific antibodies by immunoblot. The almost complete
  • Serum code 5 9 10 11 13 14 15 18 28 29 38
  • amino acids are specified in the usual "one-letter code" known from the literature:
  • Fragment 1 amino acid sequences 1-241
  • Fragment 2 amino acid sequences 40-349
  • Fragment 4 amino acid sequences 66-241
  • Fragment 5 amino acid sequences 66-393
  • Fragment 7 amino acid sequences 237-393
  • Fragment 8 amino acid sequences 9-33
  • Fragment 9 amino acid sequences 37-52 S Q A M D D L M L S P D D I E Q
  • Fragment 10 amino acid sequences 368-386

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Description

Nachweisverfahren für p53-spezifische Antikörper
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von p53-spezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Ferner betrifft sie einen hierfür verwendbaren Kit. Desweiteren betrifft die Erfindung p53-Fragmente und die sie codierenden DNA-Sequenzen, wobei die Fragmente Bindungsregionen für p53-spezifische Antikörper aufweisen, und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es ist bekannt, daß eukaryotische Zellen ein mit p53
bezeichnetes Protein (p53) exprimieren. Dieses Protein ist in seiner Primärstruktur bekannt und weist 393 Aminosäuren auf (vgl. Lamb, P. und Crawford, L.V., Mol. Cell. Biol., Band 6 (1986), 1379-1386). Bei vielen Tumorerkrankungen findet man eine erhöhte Expression von p53. Dies kann mit dem Vorliegen spezifischer gegen p53 gerichteter Antikörper einhergehen. Zum Nachweis solcher Antikörper werden
verschiedene Verfahren beschrieben. Beispielsweise werden p53-enthaltende Zellextrakte in vivo radioaktiv markiert und mit Patientenseren immunpräzipitiert (vgl. de Fromentel, C.C. et al., Int. J. Cancer 39 (1987), 185-189). Auch werden Trägermaterialien mit gegen p53-gerichteten Antikörpern beschichtet, hieran p53 aus Zellextrakten adsorbiert und Patientenseren hinzugegeben. Gebundene Anti-ρ53-Antikörper werden mit Jod-gekoppeltem Protein A nachgewiesen (vgl.
Crawford, L.V. et al., Mol. Biol. Med. 2 (1984), 261-272).
In diesen Nachweisverfahren werden radioaktive Substanzen verwendet. Dies bedeutet ein erhöhtes Sicherheitsrisiko und damit eine eingeschränkte Verwendbarkeit, insbesondere in der Klinik. Auch ist die in vivo-Markierung von Zellen finanziell und arbeitstechnisch aufwendig und somit für größere Testreihen nur bedingt geeignet. Desweiteren führt die Verwendung von Zellextrakten vielfach zu unspezifischer Antikörperbindung. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von p53-spezifischen Antikörpern bereitzustellen, das nicht die angesprochenen Nachteile aufweist.
Erfindungsgemäß wird dies in einem Verfahren erreicht, bei dem man Trägermaterial-gebundenes p53 und/oder Trägermaterial-gebundene, Bindungsregionen für p53-spezifische Antikörper aufweisende Fragmente davon mit Körperflüssigkeiten inkubiert und die spezifischen an das p53 und/oder die Fragmente gebundenen Antikörper (a)
mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten
Antikörpern (b),
oder
mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit
markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten
Antikörpern (c) reagieren läßt, wobei die Markierung jeweils nicht-radioaktiv ist.
Der Ausdruck "p53" umfaßt ein p53-Protein mit Wildtyp-Sequenz. Ein solches kann aus Zellen, wie HepG2, isoliert werden (vgl. Knowles, B. et al., Science 209 (1990),
497-499). P53 kann auch eine von der Wildtyp-Sequenz
abweichende Sequenz haben. Eine solche kann Additonen,
Deletionen und/oder Substitutionen von ein oder mehreren Aminosäuren aufweisen. Ferner kann p53 Teil eines Fusionsproteins sein. Ein solches wie auch jedes andere p53 kann aus Zellen isoliert werden, die es nach Genmanipulation exprimieren. Solche Zellen umfassen prokaryotische und eukaryotische Zellen. Beispiele ersterer sind E. Coli- Stämme, wie BL21 (vgl. Studier, F.W. et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), während als letztere
insbesondere Säugetier-, Hefe- und Insektenzellen zu nennen sind. Unter Genmanipulation sind übliche aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zu verstehen, mit denen Nukleinsäuren bestimmter Sequenzen hergestellt, in Zellen eingeführt und exprimiert werden. Der Fachmann kennt hierfür geeignete Materialien, wie Vektoren, und Bedingungen (vgl. z.B. Maniatis, T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).
Vorliegend wird eine p53-cDNA aus HepG2-Zellen (vgl. vorstehend) in üblicher Weise revers transkribiert und in einem gängigen PCR-Verfahren amplifiziert. Die cDNA wird in ihrer Sequenz mit publizierten Daten (z.B. EMBL-Genbank) verglichen und in den bekannten Vektor pet 3d inseriert, wodurch der rekombinante Vektor pet 92/2 erhalten wird. Dieser wird zur Expression von p53 in den Bakterienstamm BL21 (vgl. vorstehend) transformiert. Eine p53-Induktion wird durch Zugabe von IPTG erreicht. Die Bakterien werden sedimentiert und nach Einfrieren und Auftauen einer Lysozym- und DNasel-Behandlung unterzogen. Die Lysate werden mit Harnstofflösungen verschiedener Konzentrationen inkubiert und nach Zentrifugation wird freigesetztes p53 durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese und anschließender Elektroelution in reiner Form bereitgestellt. Der Fachmann kennt vorstehende Verfahren und hierzu notwendige Materialien und Bedingungen.
Erfindungsgemäß werden p53-Fragmente bereitgestellt, die Bindungsregionen für p53-spezifische Antikörper enthalten. Diese Fragmente werden nachstehend mit p53-AKBR-Fragmente bezeichnet. Vorzugsweise umfassen die p53-AKBR-Fragmente die Aminosäuren 1-241, 40-349, 40-393, 66-241, 66-393,
237-349 und 237-393 sowie 9-33, 37-52 und 368-386 von p53 (vgl. Figur 1).
Zur Herstellung von p53-AKBR-Fragmenten können mehrere
Verfahren verwendet werden. Als günstig hat sich ein Verfahren erwiesen, bei dem man über die Gesamtlänge von p53 verteilt Fragmente konstruiert, wobei jeweils mindestens zwei Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem p53-spezifischen Antikörper reagieren läßt und den überlappenden, durch den Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und als p53-AKBR-Fragment bereitstellt sowie dieses ggf. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung obigen Zyklus verwendet.
Ausgangspunkt für dieses Verfahren ist eine aus HepG2-Zellen erhaltene p53-cDNA (vgl. vorstehend). Von dieser werden über die Gesamtlänge der cDNA verteilt DNA-Fragmente in einem gängigen PCR-Verfahren amplifiziert, wobei jeweils mindestens zwei Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden, wie vorstehend beschrieben, in pet 3d inseriert und nach Transformation und IPTG-Induktion im Bakterienstamm BL21 exprimiert. Die erhaltenen p53-Fragmente werden, wie vorstehend für p53 beschrieben, isoliert und einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Dieser folgt eine Westernblot-Analyse, worin markierte, allgemein erhältliche p53-spezifische
Antikörper, z.B. Pab 240, zur Bindung an die p53-Fragmente eingesetzt werden. Durch Bindung eines dieser Antikörper an zwei einen überlappenden Bereich aufweisende p53-Fragmente wird die Bindungsregion des Antikörpers dem überlappenden Bereich zugewiesen. Dieser Bereich wird als mit p53-AKBR bezeichnetes Fragment bereitgestellt. Hierfür wird. z.B. ein gängiges PCR-Verfahren angewandt. Mit dem p53-AKBR-Fragment kann vorstehender Zyklus ein- oder mehrfach wiederholt werden, um die Bindungsregion des p53-spezifischen Antikörpers noch weiter einzugrenzen. Diese Bindungsregion kann bis auf wenige Aminosäuren eingegrenzt werden. Die hierzu u.U. notwendigen kurzen p53-Fragmente können synthetisch hergestellt werden. Dem Fachmann sind die vorstehenden
Verfahren und die zu ihrer Durchführung notwendigen
Materialien und Bedingungen bekannt. Erfindungsgemäß werden auch die für p53-AKBR-Fragmente codierenden DNA-Sequenzen bereitgestellt. Vorzugsweise umfassen diese DNA-Sequenzen die für die Aminosäuren 1-241,
40-349, 40-393, 66-241, 66-393, 237-349 und 237-393 sowie 9-33, 37-52 und 368-386 von p53 codierenden Nukleotide (vgl. Figur 2).
Erfindungsgemäß werden p53 und/oder p53-AKBR-Fragmente an ein Trägermaterial gebunden. Selbstverständlich kann auch ein einzelnes ρ53-AKBR-Fragment oder dieses zusammen mit p53 gebunden werden. Als Trägermaterial kann jegliches zur
Bindung von Proteinen geeignetes Material, insbesondere
Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objektträger, verwendet werden. Bei sehr kleinen p53-AKBR-Fragmenten, insbesondere Peptiden, ist es ratsam die Bindung an das
Trägermaterial über einen üblichen Carrier, z.B. BSA, erfolgen zu lassen. Eine solche Bindung wie auch eine ohne Carrier, kann nach üblichen Verfahren erzielt werden. Vorliegend werden Mikrotiterplatten als Trägermaterial verwendet. Hierzu werden p53 und/oder p53-AKBR-Fragmente in Carbonatpuffer aufgenommen, verschieden verdünnt und in die Löcher einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C folgen mehrere Waschschritte in physiologischem
Puffer. Die Bindung von p53 und/oder der p53-AKBR-Fragmente ist stabil.
Erfindungsgemäß werden gebundenes p53 und/oder gebundene p53-AKBR-Fragmente mit Körperflüssigkeiten inkubiert. Als solche sind sämtliche Flüssigkeiten gemeint, die aus einem tierischen Körper, insbesondere einem Säugetier und ganz besonders einem Menschen erhalten werden könne.n. Die Flüssigkeiten umfassen vorzugsweise Serum, Lymphe, Speichel und Urin. Ferner gehören zu ihnen auch Flüssigkeiten, die aus festen Geweben, wie Lunge, Gehirn und Knochenmark, sowie aus Tumoren, wie Colorektal-Karzinom und Hepatozell-Karzinom isoliert werden können. Die Inkubation erfolgt nach üblichen Verfahren. Vorliegend werden Seren von Patienten verschieden verdünnt und gebundenem p53 und/oder gebundenen p53-AKBR-Fragmenten in der Mikrotiterplatte zugegeben. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte in physiologischem Puffer. Die Bindung von spezifischen Anti-p53-Antikörpern ist stabil.
Erfindungsgemäß werden solche gebundenen Antikörper
(nachstehend mit Antikörper (a) bezeichnet)
- mit markierten, gegen die Antikörper (a)
gerichteten Antikörpern (b),
oder
- mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit
markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten
Antikörpern (c) umgesetzt.
Die Markierung ist jeweils nicht-radioaktiv. Vielmehr werden andere übliche Marker verwendet. Geeignet sind insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, und Enzyme, wie alkalische Phosphatase oder Peroxidase. Als Verstärkersystem kann ein Biotin/Streptavidinkomplex eingesetzt werden. Die Marker sind allgemein erhältlich. Die Konjugierung mit den Antikörpern (b) oder (c) erfolgt nach den Vorschriften des Herstellers. Auch sind bereits markierte Antikörper (b) und (c) allgemein erhältlich.
Die Wahl der geeigneten Antikörper (b), ob markiert oder unmarkiert, hängt davon ab, von welchem Tier bzw. welcher Tierart die verwendete Körperflüssigkeit stammt. Handelt es sich beispielsweise um eine Flüssigkeit aus einem Menschen, so werden als Antikörper (b) solche verwendet, die gegen humanes Immunglobulin gerichtet sind. In entsprechender Weise werden, sofern zusätzlich noch Antikörper (c) eingesetzt werden, diese bezüglich des Tiers oder der Tierart ausgewählt, aus der die Antikörper (b) stammen. Die Wahl geeigneter Antikörper ist dem Fachmann bekannt und kann ohne weiteres durchgeführt werden.
Die Umsetzung von gebundenen Antikörpern (a) mit markierten Antikörpern (b) bzw. mit unmarkierten Antikörpern (b) und dann mit markierten Antikörpern (c) kann in üblicher Weise erfolgen. Vorliegend findet die Umsetzung mit den Antikörpern (b) in beiden Alternativen innerhalb von 1 h bei 37°C statt. Nach mehreren Waschvorgängen wird in der ersten Alternative eine dem Marker entsprechende Substratlösung zur Entwicklung der Nachweisreaktion zugegeben. Dies erfolgt gemäß der Anleitung des Herstellers. In der zweiten Alternative werden nach den Waschvorgängen die Antikörper (c) zugegeben. Deren Umsetzung und die Entwicklung der Nachweisreaktion erfolgen in entsprechender Weise.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist eine hohe Sensitivität auf. Diese ist besonders hoch, wenn auch die Antikörper (c) eingesetzt werden. Darüberhinaus ist das vorliegende Verfahren rasch in jedem Labor durchführbar. Besondere Sicherheitsvorkehrungen sind hierfür nicht zu treffen. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher besonders zur Durchführung größerer Reihenuntersuchungen.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit bereitgestellt, der zur Durchführung vorstehender Verfahren geeignet ist. Dieser Kit enthält
- Trägermaterial-gebundenes p53 und/oder Tr.ägermaterial-gebundene p53-AKBR-Fragmente und markierte
Antikörper (b) sowie übliche Waschpuffer und ein der Markierung entsprechendes Substrat
oder
- Trägermaterial-gebundenen p53, und/oder Trägermaterial-gebundene p53-AKBR-Fragmente unmarkierte Antikörper (b) und markierte Antikörper (c) sowie übliche Waschpuffer und ein der Markierung entsprechendes Substrat.
Die Markierung ist jeweils nicht-radioaktiv. Für sie wie auch die anderen Komponenten des Kits gelten die vorstehend für das erfindungsgemäße Verfahren gemachten Ausführungen.
Kurze Erläuterung der Seiten 17-25:
Die Seiten 17-19 zeigen die Aminosäuresequenzen von
bevorzugten p53-AKBR-Fragmenten,
Die Seiten 20-25 zeigen die DNA-Sequenzen der in den Seiten 17-19 aufgeführten p53-AKBR-Fragmenten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert
Beispiel 1: Expression von P53 und His-p53-Fusionsprotein
A) Expression von p53
Aus der Zellinie HepG2 (vgl. vorstehend) wurde eine p53 cDNA mit einem "hexamer random primer" revers transkribiert und mittels der Oligoprimer "Fo" und "R11" in einem gängigen PCR-Verfahren amplifiziert (Sequenz "Fo": GCA TGG ATC CGA ATT CTG CCT TCC GGG TCA CTG C; "R11" : GGT ACC.CGG GGA TCC TGG GTG CTT CTG ACG). Die amplifizierte Sequenz wurde mit publizierten Daten (EMBL-Genbank) verglichen und über Restriktionsenzymstellen am Startcodon von p53 (NcoI) und im Primer R11 (BamHI) unter Erhalt des gesamten codierenden Bereichs in dem Vektor ρet3d im Bakterienstamm HMS 174 kloniert. Zur Expression von p53 wurde der erhaltene Vektor pet 92/2 in den Bakterienstamm BL21 (vgl. vorstehend) transformiert. Nach Kultivierung der Bakterien bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 0,6 (600 nm) in 100/ug/ml Ampicillin und 30/ug/ml Chloramphenicol enthaltendem LB-Medium wurde eine 3-stündige Induktion von p53 bei 30°C mit 2mM IPTG durchgeführt.
(B) Expression von His-p53-Fusionsprotein
Aus der Zellinie HepG2 (vgl. vorstehend) wurde eine p53 cDNA revers transkribiert und mittels der Oligoprimer "Fp53-B" und "His-Rp53" durch PCR amplifiziert. (Sequenz "Fp53": CGC GGA TCC ATG GAG GAG CCG CAG TCA G; "His-Rp53": CGC GGA TCC TCA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GTC TGA GTC AGG CCC TTC TG). Die amplifizierte Sequenz wurde über BamHl-Schnittstellen in beiden PCR-primern in dem bekannten, mit BamHI geöffneten Expressionsvektor pQE-8 kloniert. Die Expression dieses an beiden Enden mit je 6 Histidinen verknüpften p53-Proteins erfolgte im Bakterienstamm E.coli SG13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981) 265-273). Nach
Kultivierung der Bakterien bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von 0,6 in LB-Medium mit 100 .ug/ml Ampicillin und 25 /ug/ml Kanamycin wurde eine 6-stündige Induktion von His-p53-Fusionsprotein bei 37°C mit 1 mM IPTG durchgeführt. Beispiel 2: Isolierung und Reinigung von p53 und His-p53-Fusionsprotein
(A) Isolierung und Reinigung von p53
400 ml Bakterienkultur von Beispiel 1, (A) wurden nach der p53-Induktion durch 10-minütige Zentrifugation bei 500 g sedimentiert, in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach Einfrieren und Auftauen wurde das Sediment in 1,6 ml eines Lyse-Puffers resuspendiert (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 % Saccharose). Nacheinander wurden hierzu Lysozym (Endkonz. 2mg/ml) und 0,5 M EDTA (Endkonz. 50 mM) zugegeben. Nach 20-minütiger Inkubation auf Eis wurden MgCl2 (Endkonz. 80 mM) und DNAse I (250-ug) zugegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur (Endvolumen 6,5 ml). Hierzu wurden 10/ul 0,1M PMSF gegeben und das Gemisch wurde 15 Minuten bei
10000 g, 4°C zentrifugiert. Dieser Zentrifugationsschritt wurde dreimal wiederholt, und zwar jeweils nach Resuspendieren des Sediments und 10-minütiger Inkubation in IM, 3M bzw. 7M Harnstoff mit PMSF (0,1 M, 10/ul). Der Überstand des letzten Zentrifugationsschritts wurde wie folgt weiter aufgereinigt: Nach Gelelektrophorese in einem 10 % Polyacrylamidgel, Ausschneiden der gewünschten Proteinbande und Elektroelution über Nacht bei 4°C in 25 mM Tris-HCl, 0,2M Glycin, 0,5 % SDS, pH 8,8 in einer allgemein erhältlichen Biotrap-Elutionskämmer wurde p53 in reiner Form erhalten. (B) Isolierung und Reinigung von His-p53-Fusionsprotein
250 ml Bakterienkultur von Beispiel 1, (B) wurden nach der Induktion des His-p53-Fusionsproteins sedimentiert und einmal in 40ml PBS gewaschen. Je lg Bakterienpellet wurde in 3 ml Lösung A für 1 min beschallt und anschließend bei RT 8-12h bei mittlerer Geschwindigkeit auf einem Magnetrührer gerührt. Die erhaltene Suspension wurde erneut bei RT für 30 min bei 15000 rpm sedimentiert. 2-6 ml des dabei erhaltenen Überstands wurden auf eine allgemein bekannte Nickel-Chelat-Chromatographiesäule (Ni-NTA-Resin) gegeben. Das Säulenmaterial war zuvor mit 3 Säulenvolumina Lösung A (vgl. nachstehend) gewaschen worden. Die Säule wurde nach Aufladen des Bakterienextrakts nacheinander mit Lösung A bis F gewaschen und zwar mit 2-3 Säulenvolumina der entsprechenden Lösung, solange bis kein Protein mehr eluiert werden konnte. Der Proteingehalt der aufgefangenen Fraktionen wurde durch
Extinktionsmessung bei 280 nm photometrisch bestimmt, wobei 1 O.D. ca. 1 mg Protein/ml entsprach. Das His-p53-Fusionsprotein war in den Fraktionen nach Elution mit Lösung D oder E enthalten, wobei in der Regel nur ein sehr geringer Anteil bakterieller Proteine enthalten war. Um diesen Anteil zu entfernen, wurde ggfs. das eluierte Protein nochmals an die Ni-NTA-Resin Säule gebunden, indem der pH-Wert der vereinigten Fraktionen mit der Hauptmenge des zu reinigenden Proteins auf pH 8,0 eingestellt wurde und diese dann nochmals auf die Säule gegeben wurden. Die anschließende Elution erfolgte mit Lösung A bis F wie vorstehend beschrieben. Die Reinheit und Qualität des eluierten His-p53-Fusionsproteins wurde durch SDS-PAGE geprüft. Zusammensetzung der verwendeten Lösungen:
Lösung A: 6M Guanidinium Hydrochlorid, 0,1M NaH-PCK,
10mM ß-Mercaptoethanol, 0,01M TrisHCl, pH 8,0 Lösung B: 8M Harnstoff, 0,1M NaH2PO4, 0,01M TrisHCl,
pH 8,0
Lösung C: 8M Harnstoff, 0,1M NaH2PO4, 0,01M TrisHCl,
pH 6,3
Lösung D: 8M Harnstoff, 0,1M NaH2PO4, 0,01M TrisHCl,
pH 5,9
Lösung E: 8M Harnstoff, 0,1M NaH2PO4, 0,01M TrisHCl,
pH 4,5
Lösung F: 6M Guanidinium Hydrochlorid, 0,2M Essigsäure
Vorstehendes Verfahren von (B) zeichnet sich durch eine extrem schnelle und effiziente Aufreinigung des exprimierten Proteins aus.
Beispiel 3: Herstellung von P53-AKBR- und His-p53- AKBR-Fragmenten
(A) Herstellung eines p53-AKBR-Fragments
Von der aus der Zellinie Hep G2 (vgl. vorstehend) erhaltenen cDNA wurden zwei sich überlappende DNA-Sequenzen mittels der Oligoprimer-Paare "Fp 53-B"/"Rp 53-55" und "Fp 53-30"/
"Rp 53-70" in einem gängigen PCR-Verfahren amplifiziert. Die eine DNA-Sequenz codierte für ein p53-Fragment der Aminosäuren 1-55, während die andere für ein p53-Fragment der Aminosäuren 30-70 codierte. Die Sequenzen der verwendeten Oligo primer waren wie folgt: "Fp 53-B"
CGCGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAG, "Rp 53-55"
CGCGGATCCTCAAGTGAACCATTGTTCAATATCGTCCG, "Fp 53-30"
CGCGGATCCAACGTTCTGTCCCCCTTGCCG, "Rp 53-70"
CGCGGATCCTCAAGCAGCCTCTGGCATTCTGGG.
Die amplizierten Sequenzen wurden mit publizierten Daten (EMBL-Genbank) verglichen und über die Restriktionsenzymstelle BamHI in den Vektor pet 3 d (vgl. vorstehend) kloniert. Die Expression der Sequenzen erfolgte nach Transformation und IPTG-Induktion im Bakterienstamm BL21 (vgl. vorstehend). Die exprimierten Sequenzen (p53-Fragmente) wurden, wie in Beispiel 2 (A) für P53 beschrieben, isoliert und einer Polyacrylamid-Gelektrophorese unterzogen. Dieser folgte eine übliche Westernblot-Analyse, worin ein allgemein erhältlicher p53-spezifischer Antikörper zur Bindung an die p53-Fragmente verwendet wurde. Dieser Antikörper zeigte eine Bindung an beide sich überlappende p53-Fragmente. Der
überlappende Bereich, d.h. die Aminosäuren 30-55, wurde als Bindungsregion des Antikörpers angesehen. Diese Bindungsregion wurde in vorstehender Weise weiter eingegegrenzt, indem zwei synthetische sich überlappende p53-Peptide verwendet wurden. Damit konnte die Bindungsregion des p53-spezifischen Antikörpers auf das p53-AKBR-Fragment der Aminosäuren 37-52 eingegrenzt werden.
(B) Herstellung eines His-p53-AKBR-Fragments
Von der aus der Zellinie Hep G2 (vgl. vorstehend) erhaltenen cDNA wurden zwei sich überlappende DNA-Sequenzen mittels der Oligoprimer-Paare "Fp 53-B"/"Rp 53-55-His" und "Fp 53-30"/ "Rp 53-70-His" in einem gängigen PCR-Verfahren amplifiziert. Die eine DNA-Sequenz codierte für ein p53-Fragment der
Aminosäuren 1-55, während die andere für ein p53-Fragment der Aminosäuren 30-70 (vgl. vorstehend (A)) codierte. Die Sequenzen der verwendeten Oligoprimer waren wie folgt: "Fp 53-B" (vgl. vorstehend (A)), "Rp 53-55-His"
CGCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGGTGAGTGAACCATTGTTCAATATCGTCCG, "Fp 53-30" (vgl. vorstehend (A)), "Rp 53-70-His"
CGCGGATCCTCAATGGTGATGGTGATGGTGAGCAGCCTCTGGCATTCTGGG . Die amplizierten Sequenzen wurden mit publizierten Daten (EMBL-Genbank) verglichen und über die Restriktionsenzymstelle BamHI in den Vektor pQE-8 (vgl. vorstehend) kloniert. Die Expression der Sequenzen erfolgte nach Transformation und IPTG-Induktion im Bakterienstamm E.coli SG 13009 (vgl. vorstehend). Die exprimierten Sequenzen (His-p53-Fragmente) wurden, wie in Beispiel 2 (B) für His-p53-Fusionsprotein beschrieben, isoliert und einer Polyacrylamid-Gelektrophorese unterzogen. Dieser folgte eine übliche Westernblot-Analyse, worin ein allgemein erhältlicher p53-spezifischer Antikörper zur Bindung an die His-p53-Fragmente verwendet wurde. Dieser Antikörper zeigte eine Bindung an beide sich überlappende p53-Fragmente. Wie vorstehend in (A) wurde der überlappende Bereich, d.h. die Aminosäuren 30-55, als Bindungsregion des Antikörpers angesehen. Diese wurde wie vorstehend in (A) auf die Aminosäuren 37-52 eingegrenzt.
Beispiel 4: Nachweis von spezifischen p53-Antikörpern im
Serum von Patienten durch p53
Zur Durchführung eines ELISA wurde p53 aus Beispiel 2, (A) in 0,1 M Carbonatpuffer (Natriumcarbonat/Natriumhydrogencarbonat, pH 9,6) aufgenommen. Zur Beschichtung einer 96 Loch-Mikrotiterplatte wurden nebeneinander je 100/ul
Carbonatpuffer mit 0,2 ng, 0,15 ng, 0,1 ng, 0,05 ng, 0,01 ng und 0,005 ng p53 sowie einmal eine 1 % BSA-Lösung als Leerkontrolle einpipettiert. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden zehn kurze Waschschritte mit PBS durchgeführt. Ein zu testendes Serum eines Patienten mit einem Leberzeil-Karzinom wurde in Verdünnungen von 1:100, 1:250, 1:500 und 1:1000 (Verdünnung in 500 mg BGG/1, 100 mg BSA/1, 0,05 % Tween-20) in jede der verschiedenen p53-Konzentrationen und der BSA-Kontrolle gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert ("Schachbrettitration"). Danach folgten fünf Waschschritte mit
0,05 % Tween-20 enthaltendem PBS. Ein allgemein erhältlicher Peroxidase-gekoppelter Ziege Anti-Human Antikörper wurde nach den Angaben des Herstellers verdünnt (100 mg/1 BGG, 500 mg/1 BSA, 0,05 % Tween-20). Es folgten drei Waschschritte mit PBS. Die Peroxidase-Nachweisreaktion wurde mit OPD-Entwicklungslösung durchgeführt. Dazu wurde eine 0,1 M
Na2HPO4-Lösung mit 0,1 M KH2PO4 auf pH 6,0 eingestellt. In 20 ml dieses Puffers wurden 30 mg O-Phenylendiamin Dihydrochlorid (OPD) gelöst und kurz vor Verwendung 35,ul 35 % H2O2 zugegeben. Pro Loch wurden 150/ul
Entwicklerlösung zugegeben. Nach 5-minütiger Inkubation wurde die Reaktion mit 75.ul 4M H2SO4 gestoppt und die
Farbintensität photometrisch bei 492 nm bestimmt. Absorptionswerte des mehr als doppelten der BSA-Kontrolle wurden als positive Reaktion gewertet.
Die Tabelle zeigt die Daten eines entsprechend durchgeführten ELISA im Vergleich zur Bestimmung spezifischer Antikörper mittels Immunoblot. Die nahezu vollständige
Übereinstimmung beider Verfahren weist den Anti-p53 ELISA als geeignetes Verfahren zur Reihentestung klinischen
Materials aus. Ferner zeigt der ELISA eine größere Sensitivität als der Immunoblot, wodurch die Eignung des ELISA als Erstuntersuchungsverfahren unterstrichen wird. Tabelle: Nachweis von spezifischen p53-Antikörpern in Seren von Patienten mit hepatozellulärem Karzinom durch Immunoblot und ELISA mit p53
Serum-Code: 5 9 10 11 13 14 15 18 28 29 38
Immunoblot: - + - - - - + + - + +
ELISA: +- + +- - +- + - + - + +
Legende: Immunoblot:
+: sichtbare Bande auf der Höhe eines Proteins mit 53 kD Molekulargewicht bei einer Serumverdünnung von 1:15, Inkubation mit alkalischer Phosphatase-gekoppeltem human-spezifischen Ziegen-Antikörper (1:5000) und alkalischer Phosphatase-Nachweisreaktion.
-: kein sichtbares Signal
ELISA:
- : Absorptionswert unterhalb des 2-fachen des BSA-Kontrollwerts
+-: Absorptionswert um das 2-fache des BSA-Kontrollwerts
+ : Absorptionswert des wenigstens 2-fachen des BSA- Kontrollwerts in allen Verdünnungen
Aminosäuresequenzen von p53-AKBR:-Fracrmenten
Die Aminosäuren sind in dem üblichen, aus der Literatur bekannten "One-Letter-Code" angegeben:
A Alanin L Leucin
R Arginin K Lysin
N Asparagin M Methionin
D Asparaginsäure F Phenylalanin
C Cystein P Prolin
E Glutaminsäure S Serin
Q Glutamin T Threonin
G Glycin w Tryptophan
H Histidin Y Tyrosin
I Isoleucin V Valin
Fragment 1: Aminosäuresequenzen 1-241
1 MEEPQSDPSV EFPLSQETFS DLWKLLPENN VLSPLPSQAM DDLMLSPDDI
51 EQWFTEDPGP DEAPRMPEAA PPVAPAPAAP TPAAPAPAPS WPLSSSVPSQ
101 KTYQGSYGFR LGTLHSGTAK SVTCTYSPAL NKMFCQLAKT CPVQLWVDST
151 PPPGTRVRAM AIYKQSQHMT EVVRRCPHHE RCSDSDGLAP PQHLIRVEGN
201 LRVEYLDDRN TFRHSVVVPY EPPEVGSDCT TIHYNYMCNS S
Fragment 2: Aminosäuresequenzen 40-349
1 MDDLMLSPDD IEQWTTEDPG PDEAPRMPEA APPVAPAPAA PTPAAPAPAP
51 SWPLSSSVPS QKTYQGSYGF RLGFLHSGTA KSVTCTYSPA LNKMFCQLAX
101 TCPVQLWVDS TPPPGTRVRA MAIYKQSQHM TEVVRRCPHH ERCSDSDGLA
151 PPQHLIRVEG NLRVEYLDDR NTFRHSVVVP YEPPEVGSDC TTIHYNYMCN
201 SSCMGGMNRR PILTIITLED SSGNLLGRNS FEVRVCACPG RDRRTEEENL
251 RKKGEPHHEL PPGSTKRALP NNTSSSPQPK KKPLDGEYTT LQIRGRERTE
301 MFRELNEALE Fragment 3: Aminosäuresequenzen 40-393
1 MDDLMLSPDD IEQWFTEDPG PDEAPRMPEA APPVAPAPAA PTPAAPAPAP
5i SWPLSSSVPS QKTYQGSYGF RLGFLHSGTA KSVTCTYSPA LNKMFCQLAK
101 TCPVQLWVDS TPPPGTRVRA MAIYKQSQHM TEVVRRCPHH ERCSDSDGLA
151 PPQHLIRVEG NLRVEYLDDR NTFRHSVVVP YEPPEVGSDC TTIHYNYMCN
201 SSCMGGMNRR PILTIITLED SSGNLLGRNS FEVRVCACPG RDRRTEEENL
251 RKKGEPHEEL PFGSTKRALP NNTSSSPQPK KKPLDGEYFT LQIRGRERFE
301 MFRELNEALE LKDAQAGKEP GGSRAΞSSHL KSKKGQSTSR HKKLMFKTEG
351 PDSD
Fragment 4: Aminosäuresequenzen 66-241
1 MPEAAPPVAP APAAPTPAAP APAPSWPLSS SVPSQKTYQG SYGFRLGFLH
51 SGTAKSVTCT YSPALNKMFC QLAKTCPVQL WVDSTPPPGT RVRAMAIYKQ
101 SQHMTEVVRR CPHHERCSDS DGLAPPQHLI RVEGNLRVEY LDDRNTFRHS
151 VVVPYEPPEV GSDCTTIHYN YMCNSS
Fragment 5: Aminosäuresequenzen 66-393
1 MPEAAPPVAP APAAPTPAAP APAPSWPLSS SVPSQKTYQG SYGFRLGFLH
51 SGTAKSVTCT YSPALNKMFC QLAKTCPVQL WVDSTPPPGT RVRAMAIYKQ
101 SQHMTEVVRR CPHHERCSDS DGLAPPQHLI RVEGNLRVEY LDDRNTFRHS
151 VVVPYEPPEV GSDCTTIHYN YMCNSSCMGG HNRRPILTII TLEDSSGNLL
201 GRNSFEVRVC ACPGRDRRTE EENLRKKGEP HHELPPGSTK RALPNNTSSS
251 PQPKKKPLDG EYFTLQIRGR ERFEMFRELN EALELKDAQA GKBPGGSRAH
201 SSHLKSKKGQ STSRHKKLMF KTEGPDSD Fragment 6 : Aminosäuresequenzen 237-349
1 MCNSSCMGGM NRRPILTIIT LEDSSGNLLG RNSFEVRVCA CPGRDRRTEE 51 ENLRKKGEPH HELPPGSTKR ALPNNTSSSP QPKKKPLDGE YFTLQIRGRE101 RFEMFRELNE ALE
Fragment 7 : Aminosäuresequenzen 237-393
1 MCNSSCMGGM NRRPILTIIT LEDSSGNLLG RNSFEVRVCA CPGRDRRTEE
51 ENLRKKGEPH HELPPGSTKR ALPNNTSSSP QPKKKPLDGE YFTLQIRGRE 101 RFEMFRELNE ALELKDAQAG KEPGGSRAHS SHLKSKKGQS TSRHKKLMFK 151 TΕGPDSD
Fragment 8 : Aminosäuresequenzen 9-33
S V E P P L S Q E T F S D L W K L L P E N N V L S
Fragment 9 : Aminosäuresequenzen 37-52 S Q A M D D L M L S P D D I E Q
Fragment 10 : Aminosäuresequenzen 368-386
H L K S K K G Q S T S R M K K L M F K DNA-Sequenzen von P53-AKBR-Fragmenten Fragment 1: DNA-Sequenzen 1-723 (=Aminosäuresequenzen 1-241) 1 ATGGAGGAGC CGCAGTCAGA TCCTAGCGTC GAGCCCCCTC TGAGTCAGGA
51 AACATTTTCA GACCTATGGA AACTACTTCC TGAAAACAAC GTTCTGTCCC
101 CCTTGCCGTC CCAAGCAATG GATGATTTGA TGCTGTCCCC GGACGATATT
151 GAACAATGGT TCACTGAAGA CCCAGGTCCA GATGAAGCTC CCAGAATGCC
201 AGAGGCTGCT CCCCCCGTGG CCCCTGCACC AGCAGCTCCT ACACCGGCGG
251 CCCCTGCACC AGCCCCCTCC TGGCCCCTGT CATCTTCTGT CCCTTCCCAG
301 AAAACCTACC AGGGCAGCTA CGGTTTCCGT CTGGGCTTCT TGCATTCTGG
351 GACAGCCAAG TCTGTGACTT GCACGTACTC CCCTGCCCTC AACAAGATGT
401 TTTGCCAACT GGCCAAGACC TGCCCTGTGC AGCTGTGGGT TGATTCCACA
451 CCCCCGCCCG GCACCCGCGT CCGCGCCATG GCCATCTACA AGCAGTCACA
501 GCACATGACG GAGGTTGTGA GGCGCTGCCC CCACCATGAG CGCTGCTCAG
551 ATAGCGATGG TCTGGCCCCT CCTCAGCATC TTATCCGAGT GGAAGGAAAT
601 TTGCGTGTGG AGTATTTGGA TGACAGAAAC ACTTTTCGAC ATAGTGTGGT
651 GGTGCCCTAT GAGCCGCCTG AGGTTGGCTC TGACTGTACC ACCATCCACT
701 ACAACTACAT GTGTAACAGT TCC
Fragment 2: DNA-Sequenzen 1-930 (=Aminosäuresequenzen 40-349) 1 ATGGATGATT TGATGCTGTC CCCGGACGAT ATTGAACAAT GGTTCACTGA 51 AGACCCAGGT CCAGATGAAG CTCCCAGAAT GCCAGAGGCT GCTCCCCCCG 101 TGGCCCCTGC ACCAGCAGCT CCTACACCGG CGGCCCCTGC ACCAGCCCCC 151 TCCTGGCCCC TGTCATCTTC TGTCCCTTCC CAGAAAACCT ACCAGGGCAG 201 CTACGGTTTC CGTCTGGGCT TCTTGCATTC TGGGACAGCC AAGTCTGTGA 251 CTTGCACGTA CTCCCCTGCC CTCAACAAGA TGTTTTGCCA ACTGGCCAAG 301 ACCTGCCCTG TGCAGCTGTG GGTTGATTCC ACACCCCCGC CCGGCACCCG 351 CGTCCGCGCC ATGGCCATCT ACAAGCAGTC ACAGCACATG ACGGAGGTTG 401 TGAGGCGCTG CCCCCACCAT GAGCGCTGCT CAGATAGCGA TGGTCTGGCC 451 CCTCCTCAGC ATCTTATCCG AGTGGAAGGA AATTTGCGTG TGGAGTATTT 501 GGATGACAGA AACACTTTTC GACATAGTGT GGTGGTGCCC TATGAGCCGC 551 CTGAGGTTGG CTCTGACTGT ACCACCATCC ACTACAACTA CATGTGTAAC 601 AGTTCCTGCA TGGGCGGCAT GAACCGGAGG CCCATCCTCA CCATCATCAC 651 ACTGGAAGAC TCCAGTGGTA ATCTACTGGG ACGGAACAGC TTTGAGGTGC 701 ATGTTTGTGC CTGTCCTGGG AGAGACCGGC GCACAGAGGA AGAGAATCTC 751 CGCAAGAAAG GGGAGCCTCA CCACGAGCTG CCCCCAGGGA GCACTAAGCG 801 AGCACTGCCC AACAACACCA GCTCCTCTCC CCAGCCAAAG AAGAAACCAC 851 TGGATGGAGA ATATTTCACC CTTCAGATCC GTGGGCGTGA GCGCTTCGAG 901 ATGTTCCGAG AGCTGAATGA GGCCTTGGAA
Fragment 3: DNA-Sequenzen 1-1062 (=Aminosäuresequenzen
40-393)
1 ATGGATGATT TGATGCTGTC CCCGGACGAT ATTGAACAAT GGTTCACTGA
51 AGACCCAGGT CCAGATGAAG CTCCCAGAAT GCCAGAGGCT GCTCCCCCCG
101 TGGCCCCTGC ACCAGCAGCT CCTACACCGG CGGCCCCTGC ACCAGCCCCC
151 TCCTGGCCCC TGTCATCTTC TGTCCCTTCC CAGAAAACCT ACCAGGGCAG
201 CTACGGTTTC CGTCTGGGCT TCTTGCATTC TGGGACAGCC AAGTCTGTGA
251 CTTGCACGTA CTCCCCTGCC CTCAACAAGA TGTTTTGCCA ACTGGCCAAG
301 ACCTGCCCTG TGCAGCTGTG GGTTGATTCC ACACCCCCGC CCGGCACCCG
351 CGTCCGCGCC ATGGCCATCT ACAAGCAGTC ACAGCACATG ACGGAGGTTG
401 TGAGGCGCTG CCCCCACCAT GAGCGCTGCT CAGATAGCGA TGGTCTGGCC
451 CCTCCTCAGC ATCTTATCCG AGTGGAAGGA AATTTGCGTG TGGAGTATTT .
501 GGATGACAGA AACACTTTTC GACATACTGT GGTGGTGCCC TATGAGCCGC
551 CTGAGGTTGG CTCTGACTGT ACCACCATCC ACTACAACTA CATGTGTAAC
601 AGTTCCTGCA TGGGCGGCAT GAACCGGAGG CCCATCCTCA CCATCATCAC
651 ACTGGAAGAC TCCAGTGGTA ATCTACTGGG ACGGAACAGC TTTGAGGTGC
701 ATGTTTGTGC CTGTCCTGGG AGAGACCGGC GCACAGAGGA AGAGAATCTC
751 CGCAAGAAAG GGGAGCCTCA CCACGAGCTG CCCCCAGGGA GCACTAAGCG
801 AGCACTGCCC AACAACACCA GCTCCTCTCC CCAGCCAAAG AAGAAACCAC
851 TGGATGGAGA ATATTTCACC CTTCAGATCC GTGGGCGTGA GCGCTTCGAG
901 ATGTTCCGAG AGCTGAATGA GGCCTTGGAA CTCAAGGATG CCCAGGCTGG
951 GAAGGAGCCA GGGGGGAGCA GGGCTCACTC CAGCCACCTG AAGTCCAAAA
1001 AGGGTCAGTC TACCTCCCGC CATAAAAAAC TCATGTTCAA GACAGAAGGG
1051 CCTGACTCAG AC Fragment 4: DNA-Sequenzen 1-528 (Aminosäuresequenzen 66-241)
1 ATGCCAGAGG CTGCTCCCCC CGTGGCCCCT GCACCAGCAG CTCCTACACC
51 GGCGGCCCCT GCACCAGCCC CCTCCTGGCC CCTGTCATCT TCTGTCCCTT 101 CCCAGAAAAC CTACCAGGGC AGCTACGGTT TCCGTCTGGG CTTCTTGCAT 151 TCTGGGACAG CCAAGTCTGT GACTTGCACG TACTCCCCTG CCCTCAACAA 201 GATGTTTTGC CAACTGGCCA AGACCTGCCC TGTGCAGCTG TGGGTTGATT 251 CCACACCCCC GCCCGGCACC CGCGTCCGCG CCÄTGGCCAT CTACAAGCAG 301 TCACAGCACA TGACGGAGGT TGTGAGGCGC TGCCCCCACC ATGAGCGCTG 351 CTCAGATAGC GATGGTCTGG CCCCTCCTCA GCATCTTATC CGAGTGGAAG 401 GAAATTTGCG TGTGGAGTAT TTGGATGACA GAAACACTTT TCGACATAGT 451 GTGGTGGTGC CCTATGAGCC GCCTGAGGTT GGCTCTGACT GTACCACCAT 501 CCACTACAAC TACATGTGTA ACAGTTCC
Fragment 5: DNA-Sequenzen 1-984 (=Aminosäuresequenzen 66-393)
1 ATGCCAGAGG CTGCTCCCCC CGTGGCCCCT GCACCAGCAG CTCCTACACC
51 GGCGGCCCCT GCACCAGCCC CCTCCTGGCC CCTGTCATCT TCTGTCCCTT 101 CCCAGAAAAC CTACCAGGGC AGCTACGGTT TCCGTCTGGG CTTCTTGCAT 151 TCTGGGACAG CCAAGTCTGT GACTTGCACG TACTCCCCTG CCCTCAACAA 201 GATGTTTTGC CAACTGGCCA AGACCTGCCC TGTGCAGCTG TGGGTTGATT 251 CCACACCCCC GCCCGGCACC CGCGTCCGCG CCÄTGGCCAT CTACAAGCAG 301 TCACAGCACA TGACGGAGGT TGTGAGGCGC TGCCCCCACC ATGAGCGCTG 351 CTCAGATAGC GATGGTCTGG CCCCTCCTCA GCATCTTATC CGAGTGGAAG 401 GAAATTTGCG TGTGGÄGTAT TTGGATGACA GAAACACTTT TCGACATAGT 451 GTGGTGGTGC CCTATGAGCC GCCTGAGGTT GGCTCTGACT GTACCACCAT 501 CCACTACAAC TACATGTGTA ACAGTTCCTG CATGGGCGGC ATGAACCGGA 551 GGCCCATCCT CACCATCATC ACACTGGAAG ACTCCAGTGG TAATCTACTG 50I GGACGGAACA GCTTTGAGGT GCATGTTTGT GCCTGTCCTG GGAGAGACCG 651 GCGCACAGAG GAAGAGAATC TCCGCAAGAA AGGGGAGCCT CACCACGAGC 701 TGCCCCCAGG GAGCACTAAG CGAGCACTGC CCAACAACAC CAGCTCCTCT 751 CCCCAGCCAA AGAAGAAACC ACTGGATGGA GAATATTTCA CCCTTCAGAT 801 CCGTGGGCGT GAGCGCTTCG AGATGTTCCG AGAGCTGAAT GAGGCCTTGG 851 AACTCAAGGA TGCCCAGGCT GGGAAGGAGC CAGGGGGGAG CAGGGCTCAC 901 TCCAGCCACC TGAAGTCCAA AAAGGGTCAG TCTACCTCCC GCCATAAAAA 951 ACTCATGTTC AAGACAGAAG GGCCTGACTC AGAC Fragment 6: DNA-Sequenzen 1-339 (=Aminosäuresequenzen
237-349)
1 ATGTGTAACA GTTCCTGCAT GGGCGGCATG AACCGGAGGC CCASCCTCAC
51 CATCATCACA CTGGAAGACT CCAGTGGTAA TCTACTGGGA CGGAACAGCT
101 TTGAGGTGCA TGTTTGTGCC TGTCCTGGGA GAGACCGGCG CACAGAGGAA
151 GAGAATCTCC GCAAGAAAGG GGAGCCTCAC CACGAGCTGC CCCCAGGGAG
201 CACTAAGCGA GCACTGCCCA ACAACACCAG CTCCTCTCCC CAGCCAAAGA
251 AGAAACCACT GGATGGAGAA TATTTCACCC TTCAGATCCG TGGGCGTGAG
301 CGCTTCGAGA TGTTCCGAGA GCTGAATGAG GCCTTGGAA
Fragment 7: DNA-Sequenzen 1-471 (=Aminosäuresequenzen
237-393)
1 ATGTGTAACA GTTCCTGCAT GGGCGGCATG AACCGGAGGC CCATCCTCAC
51 CATCATCACA CTGGAAGACT CCAGTGGTAA TCTACTGGGA CGGAACAGCT
101 TTGAGGTGCA TGTTTGTGCC TGTCCTGGGA GAGACCGGCG CACAGAGGAA
151 GAGAATCTCC GCAAGAAAGG GGAGCCTCAC CACGAGCTGC CCCCAGGGAG
201 CACTAAGCGA GCACTGCCCA ACAACACCAG CTCCTCTCCC CAGCCAAAGA
251 AGAAACCACT GGATGGAGAA TATTTCACCC TTCAGATCCG TGGGCGTGAG
301 CGCTTCGAGA TGTTCCGAGA GCTGAATGAG GCCTTGGAAC TCAAGGATGC
351 CCAGGCTGGG AAGGACCCAG GGGGGAGCAG GGCTCACTCC AGCCACCTGA
401 AGTCCAAAAA GGGTCAGTCT ACCTCCCGCC ATAAAAAACT CATGTTCAAG
451 ACAGAAGGGC CTGACTCAGA C
Fragment 8: DNA-Sequenzen 1-75 (=Aminosäuresequenzen 9-33)
1 TCCCAAGCAA TGGATGATTT GATGCTGTCC CCGGACGATA TTGAACAA
Fragment 9: DNA-Sequenzen 1-48 (=Aminosäuresequenzen 37-52 1 AGCGTCGAGC CCCCTCTGAG TCAGGAAACA TTTTCAGACC TATGGAAACT
51 ACTTCCTGAA AACAACGTTC TGTCC
Fragment 10: DNA-Sequenzen 1-57 (=Aminosäuresequenzen
368-386)
1 CACCTGAAGT CCAAAAAGGG TCAGTCTACC TCCCGCCATA AAAAACTCAT
51 GTTCAAG

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von p53-spezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man Trägermaterial-gebundenes p53 und/oder Trägermaterial- gebundene, Bindungsregionen für p53-spezifische Antikörper aufweisende Fragmente davon mit Körperflüssigkeiten inkubiert und die spezifischen, an das p53 und/oder die Fragmente gebundenen Antikörper (a)
- mit markierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörpern (b),
oder
- mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit
markierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten
Antikörpern (c) reagieren läßt, wobei die Markierung jeweils nicht-radioaktiv ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperflüssigkeiten Serum, Lymphe, Speichel und Urin sowie aus festen Geweben und Tumoren erhaltene
Flüssigkeiten umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das p53 durch Expression einer cDNA-Sequenz erhalten ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die p53-Fragmente die Aminosäuren 1-241, 40-349, 40-393, 66-241, 66-393, 237-349 und 237-393 sowie 9-33, 37-52 und 368-386 von p53 umfassen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägermaterial Mikrotiterplatten, Röhrchen, Mikrokugeln und Objektträgeτ umfaßt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der zweiten
Alternative mit einem Enzym markiert sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Antikörper (b) in der ersten Alternative und die Antikörper (c) in der zweiten
Alternative mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sind.
8. Kit, enthaltend
- Trägermaterial-gebundenes p53 und/oder Trägermaterial-gebundene, Bindungsregionen für
p53-spezifische Antikörper aufweisende Fragmente davon und markierte Antikörper (b) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und ggfs. ein der Markierung entsprechendes Substrat
oder
- Trägermaterial-gebundene p53 und/oder Trägermaterial-gebundene, Bindungsregionen für
p53-spezifische Antikörper aufweisende Fragmente davon und unmarkierte Antikörper (b) und markierte Antikörper (c) nach Anspruch 1 sowie übliche Waschpuffer und ggf. ein der Markierung entsprechendes Substrat.
9. p53-Fragment mit Bindungsregion für p53-spezifischen
Antikörper.
10. p53-Fragment nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 1-241, 40-349, 40-393, 66-241, 66-393, 237-349 oder 237-393 von p53 umfaßt.
11. p53-Fragment nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 9-33, 37-52 oder 368-386 von p53 umfaßt.
12. DNA-Sequenz eines p53-Fragments nach Anspruch 9.
13. DNA-Sequenz einen p53-Fragments nach Anspruch 10.
14. DNA-Sequenz eines p53-Fragments nach Anspruch 11.
15. Verfahren zur Herstellung eines p53-Fragments mit
Bindungsregion für p53-spezifischen Antikörper, bei dem man über die Gesamtlänge von p53 verteilt Fragmente in üblicher Weise konstruiert, wobei jeweils mindestens 2 Fragmente einen überlappenden Bereich aufweisen, die Fragmente mit einem p53-spezifischen Antikörper
reagieren läßt und den überlappenden, durch den
Antikörper gebundenen Bereich identifiziert und als eingangs definiertes Fragment in üblicher Weise
bereitstellt sowie dieses ggf. als Basis für eine ein- oder mehrfache Wiederholung des Zyklus verwendet.
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