CN112394055A - 白色念珠菌化学发光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供白色念珠菌化学发光检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、样本稀释液、清洗液、激发液1和激发液2。本发明公开的试剂盒操作简便灵敏度高、线性范围宽,能实现白色念珠菌的定量检测。采用抗白色念珠菌抗体,能识别出样本中的白色念珠菌,特异性好,有效避免了其他微生物的干扰。通过在样本稀释液中添加合适的表面活性剂,减少了样本中白色念珠菌的团聚,增加了其分散性,提升了试剂盒测值的CV。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,尤其涉及白色念珠菌化学发光检测试剂盒。
背景技术
白色念珠菌(Candida albicans)又称白假丝酵母菌,是一类腐败物寄生菌,单细胞真菌,是阴道内的正常菌群且生存于健康人的皮肤、黏膜,正常情况下白色念珠菌与机体处于共生状态,不致炎症。但当某种因素破坏其平衡状态,则局部白色念珠菌由酵母菌相转为菌丝相,在局部大量生长繁殖,引起皮肤、黏膜甚至全身念珠菌病,故又称之为条件性致病菌。
念珠菌性外阴阴道炎(VVC)是最常见的妇女外阴阴道炎之一,且易复发,其中,白色念珠菌阴道炎占80~90%,常见于青春期至绝经期前。75%妇女一生中至少患一次VVC。由于念珠菌性阴道炎具有难以根治、易反复的特点,对孕妇的危害更大,可增加胎膜早破、羊水污染、早产以及产时、产后感染等并发症,引发早产、胎儿感染、畸形,威胁母婴健康,因此及时准确地诊断和鉴别念珠菌性阴道炎,采取有效的治疗措施,对于提高国民的健康水平,特别是女性生殖健康水平,具有重要的现实和深远意义。
白色念珠菌在VVC患者中的阳性率约为80~90%,正常人参考值:105cfu/mL。
目前常用的检测手段是生理盐水湿片镜检和胶体金法。镜检直接检查清洁度及有无真菌菌丝。该方法操作简单方便,成本低但主观性强。该方法对于样本中的细胞以及微生物均没有染色效果,根据各成分的形态来辨别,但是整个涂片背景较复杂,有时候较难观察识别一些微小的微生物,如真菌类感染。而胶体金法仅可以实现定性检测,无法定量。
化学发光免疫分析是近年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽,是免疫学检测重要的发展方向。目前还没有化学发光用于检测白色念珠菌的试剂盒。白色念珠菌菌体容易团聚,分散性较差,易导致化学发光检测测值CV波动大,影响试剂盒相关性能。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种实现对白色念珠菌定量检测且灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强的白色念珠菌化学发光检测试剂盒。
为了实现上述目的,本发明提供了一种白色念珠菌化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、样本稀释液、清洗液、激发液1和激发液2,所述试剂R1包括包被了亲和素的磁微粒,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,蛋白稳定剂,曲拉通X-405,Proclin300,所述试剂R2包括标记了生物素的抗白色念珠菌抗体,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,Proclin 300,所述试剂R3包括标记了吖啶酯的抗白色念珠菌抗体,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,Proclin 300,所述样本稀释液包括磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20或曲拉通100,Proclin 300,所述清洗液包括磷酸缓冲液,吐温20,Proclin 300,所述激发液1包括双氧水,硝酸,消泡剂所述激发液2包括氢氧化钠,吐温80。
作为一个优选方案,所述试剂盒各组分含量为,
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
样本稀释液:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.01-0.1M
吐温20 0.1-0.5%
Proclin 300 0.01-0.1%
激发液1:
双氧水 0.1-0.5%
硝酸 0.05-0.2M
消泡剂 0.01-0.1%
激发液2:
氢氧化钠 0.1-1.0M
吐温80 0.5-1%。
作为一个优选方案,所述试剂盒各组分含量为,
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
样本稀释液:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.05%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%。
作为一个优选方案,所述试剂盒各组分含量为,
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
样本稀释液:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.5%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%。
本发明提供的检测白色念珠菌的试剂盒检测白色念珠菌的方法,包括如下步骤:
a.稀释样本:用添加了表面活性剂的样本稀释液稀释临床样本;
b.反应:将样本和包被了亲和素的磁微粒、标记了生物素的抗白色念珠菌抗体、标记了吖啶酯的抗白色念珠菌抗体混合反应;
c.检测:加入免疫分析仪激发液,检测其化学发光光子强度。
本发明提供的检测白色念珠菌的试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1.样本稀释液的制备,具体过程如下:取0.1%-1.0%的吐温20,加入0.05-0.1M磷酸缓冲液,混合均匀,得到添加量表面活性剂的样本稀释液;
2.试剂R1制备,具体过程如下:将所述磁珠用0.01-0.1M的、pH5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤两次,重悬后的磁珠浓度为5-30mg/mL,加入新鲜配制的10-30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺和10-30mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与磁珠的质量比为1:10-1:2,在25-40℃下混匀30-60分钟;磁分离去上清,用0.01-0.1M的、pH5-6的2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤一次;磁分离去上清,用0.01-0.1M的、pH7-9的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤一次;磁分离去上清,用0.01-0.1M的、pH7-9的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液重悬磁珠,重悬后的磁珠浓度为5-30mg/mL,然后加入所述的亲和素(链霉亲和素或是中性亲和素),其中所述的磁微粒与所述的亲和素的质量比为0.1:10-1:10,在25-40℃下混匀1-6小时;继续加入50ul的1-5M甘氨酸溶液与100ul的1-5M乙醇胺溶液,在2-8℃下混匀8-16小时;磁分离去上清,用0.01-0.1M的磷酸缓冲液(含0.05%的吐温20)洗涤3次;用含1-5%的牛血清白蛋白、0.05-0.2M氯化钠、0.05-0.1%吐温20、1-5%蛋白稳定剂、0.01-0.05%曲拉通X-405、0.01-0.1%Proclin 300、0.01-0.1mol/L pH7-8的磷酸缓冲液重悬偶联了亲和素的磁微粒至浓度为0.1-1mg/ml,即所述试剂R1。
3.试剂R2制备,具体过程如下:取适量白色念珠菌抗体,用0.01-0.1mol/L、pH7-9的碳酸氢钠缓冲液,在2-8℃下透析过夜,加入所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯,其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯和白色念珠菌抗体的摩尔比例为10:1-100:1,在25-40℃下混匀1-6小时;加入所述的1M的氯化铵水溶液,其中所述氯化铵和N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔比例为10:1-50:1,在25-40℃下混匀5-30分钟;然后用pH7-8的磷酸缓冲液透析过夜;用1-5%的牛血清白蛋白、0.05-0.2M氯化钠、0.05-0.1%吐温20、0.01-0.1%Proclin300、0.01-0.1mol/L pH7-8的磷酸缓冲液稀释标记了生物素的白色念珠菌抗体至浓度0.1-20μg/mL,即所述试剂R2。
4.试剂R3制备,具体过程如下:取适量白色念珠菌抗体,用0.01-0.1mol/L、pH9-10的碳酸氢钠缓冲液,在2-8℃下透析过夜,加入所述吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺,其中所述的吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺和白色念珠菌抗体的摩尔比例为10:1-20:1,在25-40℃下混匀1-2小时;加入所述的1M的赖氨酸水溶液,其中所述赖氨酸和吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为50:1-200:1,在25-40℃下混匀5-30分钟;然后用0.01-0.1mol/L、pH7-8的磷酸缓冲液透析过夜;用1-5%的牛血清白蛋白、0.05-0.2M氯化钠、0.05-0.1%吐温20、0.01-0.1%Proclin 300、0.01-0.1mol/L pH7-8的磷酸缓冲液稀释标记了吖啶酯的白色念珠菌抗体至浓度0.1-20μg/mL,即所述试剂R3。
本发明标准曲线的建立包含以下步骤:
1.白色念珠菌平板计数法与光密度法关系曲线建立:配制不同浓度梯度的白色念珠菌菌悬液并在600nm波长下分别测定OD值。将不同梯度的菌悬液样品同时做稀释涂平板培养计数。将OD600和对应菌体浓度做直线回归,得出回归方程。
2.参考品制备:将白色念珠菌接种于液体培养基中,摇床震荡培养,离心去上清,加入生理盐水洗涤2~3次,加入少量细胞冻存液重悬菌体,稀释至一定比例,在600nm波长下测量OD值,根据白色念珠菌平板计数法与光密度法关系回归方程,计数出制得的参考品浓度,分装冻存备用。细胞冻存液配方见图6。
3.校准品制备:用样品稀释液将参考品稀释至覆盖线性范围的几个浓度点,分装冻存备用。
4.校准品测试:取不同浓度的校准品滴加到免疫层析试纸条的加样孔,通过荧光免疫分析仪读取检测信号值。
5.校准曲线生成:根据根据校准品的制备浓度和荧光值采用合适的拟合方式生成该批试剂的校准曲线。
本发明的优点在于,本发明通过在样本稀释液中添加合适的表面活性剂,增强菌体的分散性,提升了试剂盒测值的CV,同时首次使用化学发光的方法用于白色念珠菌的检测,该方法采用一对抗白色念珠菌抗体对,分别标记上生物素和吖啶酯,用于结合样本中存在的白色念珠菌,再采用包被了亲和素的磁微粒,用于捕获标记了生物素的抗体-白色念珠菌-标记了吖啶酯的抗体复合物,加入激发液1和激发液2后,通过信号值的高低判断白色念珠菌的浓度,实现了白色念珠菌的定量检测(目前市面上只有白色念珠菌的定性试剂),在白色念珠菌浓度为1.5*10^3-1*10^8CFU/ml间具有良好的线性。本发明检测白色念珠菌的试剂盒灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强。
附图说明
图1为检测原理图,采用双抗体夹心法,标记了生物素的抗体和标记了吖啶酯的抗体识别白色念珠菌表面的抗原,形成生物素标记抗体-白色念珠菌-吖啶酯标记抗体的复合物,通过亲和素磁珠和生物素的结合,捕获复合物。
图2为单纯磷酸缓冲液稀释液镜检结果。
图3-1,3-2,3-3为磷酸缓冲液+吐温20样本稀释液镜检结果。
图4-1,4-2,4-3为磷酸缓冲液+曲拉通100样本稀释液镜检结果。
图5为校准曲线。
图6为细胞冻存液配方。
图7为表面活性剂对试剂盒测值CV的提升。
图8为白色念珠菌平板计数结果。
图9为参考品定标结果。
图10为实施例11校准品的制备浓度和发光值。
图11为最低检测限。
图12为计算考核试剂测定结果与参比试剂测定结果符合或差异程度的统计学指标的评价方法。
图13为比对测试结果。
具体实施方式
以下,结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是,以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明,而非对本发明的限制。
实施例1.白色念珠菌化学发光检测试剂盒1
该试剂盒由样本稀释液,试剂R1,试剂R2,试剂R3,清洗液液,激发液1和激发液2组成,其中:
样本稀释液:
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.5%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%。
白色念珠菌的测试方法,包含下列步骤:
(1)将取样后的拭子在添加了0.5%的吐温20的样本稀释液中旋转10s,取出拭子,将样本稀释液充分混匀;
(2)取50μL混匀好的样本加入反应杯,加入50μL试剂R2和50μL试剂R3,混匀后在37℃孵育15min;
(3)在(2)中反应杯中加入50μL试剂R1,混匀后在37℃孵育15min;
(4)将(3)中反应杯磁分离,吸除上清;
(5)在(4)中反应杯中加入400μL清洗液,混匀后磁分离,吸除上清;
(6)将步骤(5)重复两次后,打入200μL激发液1和200μL激发液2,通过准备好的化学发光仪进行检测。
实施例2.白色念珠菌化学发光检测试剂盒2
该试剂盒由样本稀释液,试剂R1,试剂R2,试剂R3,清洗液液,激发液1和激发液2组成,其中:
样本稀释液:
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.5%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%。
白色念珠菌的测试方法,包含下列步骤:
(1)将取样后的拭子在添加了0.5%的吐温20的样本稀释液中旋转10s,取出拭子,将样本稀释液充分混匀;
(2)取50μL混匀好的样本加入反应杯,加入50μL试剂R1和50μL试剂R2,混匀后在37℃孵育15min;
(3)将(2)中反应杯磁分离,吸除上清,加入50μL试剂R3,混匀后在37℃孵育15min;
(4)同实施例1中步骤(4)(5)(6)。
实施例3.白色念珠菌化学发光检测试剂盒3
该试剂盒由样本稀释液,试剂R1,试剂R2,试剂R3,清洗液液,激发液1和激发液2组成,其中:
样本稀释液:
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.5%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%
白色念珠菌的测试方法,包含下列步骤:
(1)将取样后的拭子在添加了0.5%的吐温20的样本稀释液中旋转10s,取出拭子,将样本稀释液充分混匀;
(2)取50μL混匀好的样本加入反应杯,加入50μL试剂R1和50μL试剂R2,混匀后在37℃孵育15min;
(3)将(2)中反应杯磁分离,吸除上清,加入50μL试剂R3,混匀后在37℃孵育15min;
(4)同实施例1中步骤(4)(5)(6)。
实施例4.白色念珠菌化学发光检测试剂盒4
本发明的一种白色念珠菌试剂盒,该试剂盒由样本稀释液,试剂R1,试剂R2,试剂R3,清洗液液,激发液1和激发液2组成,其中:
样本稀释液:
试剂R1:
试剂R2:
试剂R3:
清洗液:
磷酸缓冲液 0.1M
吐温20 0.5%
Proclin 300 0.05%
激发液1:
双氧水 0.2%
硝酸 0.1M
消泡剂 0.05%
激发液2:
氢氧化钠 0.5M
吐温80 1%
本发明一种白色念珠菌的测试方法,包含下列步骤:
(1)将取样后的拭子在添加了0.5%的曲拉通100的样本稀释液中旋转10s,取出拭子,将样本稀释液充分混匀;
(2)取50μL混匀好的样本加入反应杯,加入50μL试剂R1和50μL试剂R2,混匀后在37℃孵育15min;
(3)将(2)中反应杯磁分离,吸除上清,加入50μL试剂R3,混匀后在37℃孵育15min;
(4)同实施例1中步骤(4)(5)(6)。
实施例5.白色念珠菌化学发光检测试剂盒制备
试剂R1制备,具体过程如下:将所述磁珠用0.05M的、pH5.6的2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤两次,重悬后的磁珠浓度为10mg/mL,加入新鲜配制的10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与磁珠的质量比为1:5,在25-40℃下混匀60分钟;磁分离去上清,用0.05M的、pH5.6的2-吗啉乙磺酸缓冲液洗涤一次;磁分离去上清,用0.05M的、pH8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液洗涤一次;磁分离去上清,用0.05M的、pH8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液重悬磁珠,重悬后的磁珠浓度为10mg/mL,然后加入所述的链霉亲和素,其中所述的磁微粒与所述的亲和素的质量比为0.5:10,在37℃下混匀3小时;继续加入50ul的1M甘氨酸溶液与100ul的1M乙醇胺溶液,在2-8℃下混匀12小时;磁分离去上清,用0.05M的磷酸缓冲液(含0.05%的吐温20)洗涤3次;用含2%的牛血清白蛋白、0.05M氯化钠、0.05%吐温20、2%蛋白稳定剂、0.01%曲拉通X-405、0.05%Proclin 300、0.05mol/LpH7.4的磷酸缓冲液重悬偶联了亲和素的磁微粒至浓度为0.2mg/ml,即所述试剂R1。
试剂R2制备,具体过程如下:取适量白色念珠菌抗体,用0.05mol/L、pH8的碳酸氢钠缓冲液,在2-8℃下透析过夜,加入所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯,其中所述的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯和白色念珠菌抗体的摩尔比例为50:1,在25℃下混匀3小时;加入所述的1M的氯化铵水溶液,其中所述氯化铵和N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯的摩尔比例为50:1,在25℃下混匀10分钟;然后用pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜;用2%的牛血清白蛋白、0.05M氯化钠、0.05%吐温20、0.05%Proclin 300、0.05mol/L pH7.4的磷酸缓冲液稀释标记了生物素的白色念珠菌抗体至浓度2μg/mL,即所述试剂R2。
试剂R3制备,具体过程如下:取适量白色念珠菌抗体,用0.05mol/L、pH9的碳酸氢钠缓冲液,在2-8℃下透析过夜,加入所述吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺,其中所述的吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺和白色念珠菌抗体的摩尔比例为20:1,在25℃下混匀2小时;加入所述的1M的赖氨酸水溶液,其中所述赖氨酸和吖啶酯酸-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比例为150:1,在25-40℃下混匀10分钟;然后用pH7.4的磷酸缓冲液透析过夜;用2%的牛血清白蛋白、0.05M氯化钠、0.05%吐温20、0.05%Proclin 300、0.05mol/L pH7.4的磷酸缓冲液稀释标记了吖啶酯的白色念珠菌抗体至浓度2μg/mL,即所述试剂R3。
实施例6.表面活性剂对白色念珠菌分散性的影响
为了验证在样本稀释液中添加一定含量的吐温20可以很好的提升白色念珠菌的分散性,分别用0.1mol/L磷酸缓冲液以及添加不同含量的吐温20、曲拉通100稀释白色念珠菌至107cfu/mL,用江苏美克医学技术有限公司生产的双重荧光染色液染色,置于生物(荧光)显微镜下,选择波长为450nm-500nm的蓝光作为激发光,进行镜检,观察白色念珠菌的分散性。单纯磷酸缓冲液稀释液镜检结果见附图2,磷酸缓冲液+吐温20稀释液镜检结果见附图3-1、3-2、3-3。磷酸缓冲液+曲拉通100稀释液镜检结果见附图4-1、4-2、4-3,镜检结果表明,添加了吐温20和曲拉通100的稀释液均能够使白色念珠菌在溶液中分散更均匀,而白色念珠菌在单纯的PBS稀释液中则会出现明显的团聚现象。
实施例7.表面活性剂对试剂盒测值CV的提升
白色念珠菌分散性的提升带来了试剂盒测值CV的提升,为验证其提升效果,分别用0.1mol/L磷酸缓冲液以及添加不同含量的吐温20、曲拉通100稀释白色念珠菌至105cfu/mL,用本发明的白色念珠菌试剂盒进行测试,对所得的数据进行整理,具体见图7。
从图7中可知在样本稀释液中添加0.5%吐温20提升测试的CV的效果最好,所以后续样本稀释液配方中即采用0.5%吐温20的添加量,可以显著提升白色念珠菌在溶液中分散性,使试剂盒的测值CV变小,从而提升试剂盒性能。
实施例8.定标曲线建立
1.不同光密度值的菌悬液制备:用接种针挑取在SDA固体培养基上活化好的白色念珠菌于无菌生理盐水中混匀,制成菌悬液。并在600nm波长下测定OD值。制备OD值在0.8左右的菌悬液作为原菌液样品,并将原菌液样品做稀释梯度,制备OD值在0.2-0.8之间的5-7个菌悬液样品。
2.稀释涂平板:将制备好的不同梯度的菌悬液样品做稀释涂平板,在PDA培养基上,37℃培养24h计数。
3.定标曲线生成:依据稀释倍数和涂布量,算出菌体浓度,结果见下表。将OD600和对应菌体浓度做直线回归,得出回归方程y=ax+b(如图5),白色念珠菌平板计数结果见图8。
实施例9.参考品制备
1.接种:将在SDA固体培养基上活化好的白色念珠菌接种于SDA液体培养基中,37℃摇床震荡培养24h。
2.清洗:将培养好的白色念珠菌离心去上清,并加入生理盐水,离心洗涤2~3次,加入少量细胞冻存液重悬菌体。
3.参考品定标:用0.01mol/LPBS稀释至一定比例,在600nm波长下测量OD值(OD值需在0.2-0.8之间),根据白色念珠菌平板计数法与光密度法关系回归方程y=ax+b,计数出制得的参考品浓度,参考品定标结果件图9。分装冻存备用。
实施例10.校准曲线和线性范围的确定
将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释,其中稀释的最低浓度样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本至少重复测定2次,计算其平均值,根据校准品的制备浓度和发光值(图10)采用四参数拟合方式生成该批试剂的校准曲线,见附图5。
本实施例采用所述试剂盒各组分配方与实施例3相同。
得出该试剂盒的线性范围为1.5*10^3-1*10^8CFU/ml,样本浓度在该线性范围内能实现定量检测,有助于辅助临床医生指导其用药,而目前市面上的产品仅能实现定性检测(判定阴阳性)。
实施例11.最低检测限
灵敏度:检测“0”浓度样本,重复检测20次,计算相对发光强度(RLU)的平均值(M)和标准差(SD),并计算M+2SD值,根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程,将M+2SD值带入上述方程中,求出对应的浓度值,即为最低检测限(图11)。
本实施例采用所述试剂盒各组分配方与实施例3相同。
得出该试剂盒的最低检测限位1.5*10^3CFU/ml,远远低于白色念珠菌阴阳性判定值。目前市面上的产品仅能实现1*10^5CFU/ml的定性检测。
实施例12.计算考核试剂测定结果与参比试剂测定结果符合或差异程度的统计学指标
收集经金标准确定的病例组与对照组样本,用考核试剂(本试剂盒)与参比试剂(北京泰格科信试剂盒)同步测定,计算考核试剂测定结果与参比试剂测定结果符合或差异程度的统计学指标,评价方法如图12。
阳性符合率:考核试剂检出阳性的样本占参比试剂检出阳性样本总数的比例,即阳性符合率。
阴性符合率:考核试剂检出阴性的样本占参比试剂检出阴性样本总数的比例,即阴性符合率。
总符合率:考核试剂与参比试剂检出结果一致的样本占总样本的比例,即总符合率。
一致率:计算Kappa系数,若Kappa系数≥0.75,表明一致率良好。
用下列公式表示:
阳性符合率=A/(A+C)×100%
阴性符合率=D/(B+D)×100%
总符合率=(A+D)/(A+B+C+D)×100%
Kappa系数=2×(A×D-B×C)/[(A+B)×(B+D)+(A+C)×(C+D)]
结果如图13所示。
阳性符合率=99/(1+99)×100%=99%;
阴性符合率=99/(1+99)×100%=99%;
总符合率=(99+99)/(100+100)=99%;
Kappa系数=2×(99×99-1×1)/[(99+1)×(1+99)+(99+1)×(1+99)]=0.98。
从比对结果可以看出,本试剂与参比试剂具有较高的一致性。其中有两例比对不一致的样本,与镜检结果比对,本试剂的检测结果与镜检结果一致,可见,本试剂性能优于参比试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.白色念珠菌化学发光检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、样本稀释液、清洗液、激发液1和激发液2,所述试剂R1包括包被了亲和素的磁微粒,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,蛋白稳定剂,曲拉通X-405,Proclin 300,所述试剂R2包括标记了生物素的抗白色念珠菌抗体,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,Proclin 300,所述试剂R3包括标记了吖啶酯的抗白色念珠菌抗体,磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20,牛血清白蛋白,Proclin 300,所述样本稀释液包括磷酸缓冲液,氯化钠,吐温20或曲拉通100,Proclin 300,所述清洗液包括磷酸缓冲液,吐温20,Proclin 300,所述激发液1包括双氧水,硝酸,消泡剂所述激发液2包括氢氧化钠,吐温80。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101609090A (zh) * | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种采用吖啶酯标记抗原或抗体分析方法 |
CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
WO2017078170A1 (ja) * | 2015-11-05 | 2017-05-11 | 武 永安 | Ck19に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法 |
CN108333344A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-07-27 | 南京迪格诺斯生物技术有限公司 | 高灵敏度的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 |
CN109425732A (zh) * | 2017-08-25 | 2019-03-05 | 苏州长光华医生物医学工程有限公司 | 一种检测抗原的化学发光检测试剂盒和免疫分析方法 |
-
2019
- 2019-08-15 CN CN201910753250.5A patent/CN112394055A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101609090A (zh) * | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 北京华科泰生物技术有限公司 | 一种采用吖啶酯标记抗原或抗体分析方法 |
CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
WO2017078170A1 (ja) * | 2015-11-05 | 2017-05-11 | 武 永安 | Ck19に特異的なモノクローナル抗体およびこれを産生するハイブリドーマ、癌の検出キット、癌の検出方法および癌の転移の判定方法 |
CN109425732A (zh) * | 2017-08-25 | 2019-03-05 | 苏州长光华医生物医学工程有限公司 | 一种检测抗原的化学发光检测试剂盒和免疫分析方法 |
CN108333344A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-07-27 | 南京迪格诺斯生物技术有限公司 | 高灵敏度的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法和应用 |
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