JP2016194437A - 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前記測定方法は、試料に、fPSAに反応するが、PSA−ACTとは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントを添加する工程、fPSAと、PSA−ACTとの両方に反応する抗体を添加する工程を含む。前記測定キットは、fPSAと、PSA−ACTとの両方に反応する抗体と、fPSAに反応するが、PSA−ACTとは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントとを含む。
【選択図】なし
Description
上記問題を解決するために、特許文献1では、反応混合液にfPSA上のACTと結合する領域に対する抗体を加えることで、PSA−ACTでは隠れているfPSA上のエピトープをマスクし、ポリクローナル抗体を用いたPSA免疫検定法で見られるバイアスを是正できることが開示されている。
本発明はこれらの問題に鑑みてなされたものであり、高感度かつ広い測定範囲を有し、fPSAとPSA−ACTの反応性を等しく測定することが可能な総PSAの測定方法およびその測定キットを提供するものである。
[1]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントとを含む、
PSA測定キット。
[2]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、[1]のPSA測定キット。
[3]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、[1]又は[2]のPSA測定キット。
[4]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントとを含む、
PSA測定キット。
[5]前記Fab又はFab’フラグメントが、検体処理液に含まれている、[1]〜[4]のいずれかのPSA測定キット。
[6]各抗体及びFab又はFab’フラグメントがモノクローナル抗体である、[1]〜[5]のいずれかのPSA測定キット。
[7]試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体を添加する工程
を含む、PSA測定方法。
[8]さらに、B/F分離工程を含む、[7]のPSA測定方法。
[9]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、[7]又は[8]のPSA測定方法。
[10]遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、[7]〜[9]のいずれかのPSA測定方法。
[11]試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体を添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体を添加する工程、
B/F分離工程
を含む、PSA測定方法。
[12]前記FabまたはFab’フラグメントを添加する工程が、遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体を添加する工程より先に行われる、[7]〜[11]のいずれかのPSA測定方法。
[13]使用される抗体がすべてモノクローナル抗体である、[7]〜[12]のいずれかのPSA測定方法。
へテロジニアス法としては、例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法等が挙げられる。放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法はそれぞれ放射性物質、酵素、蛍光物質を、標的物質に特異的に反応する抗体に結合した標識化抗体を用いる方法で、一般的には、抗体や抗原を不溶性担体に結合した固相化抗体または固相化抗原と組み合わせた固相法で使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識化抗体」複合物を作らせ測定する非競合法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識化抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法がある。高感度かつ広い測定範囲を有するものであれば制限はないが、増感を行いやすいため酵素反応を利用したものが好ましく、なかでも化学発光酵素免疫測定法が好ましい。また、非特異反応によるシグナルを低下させることができることから、非競合法が好ましい。
有機化学的方法では、例えば、架橋試薬を用いて共有結合させることにより結合体を製造することができる。主な架橋試薬としてはカルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、グルタルアルデヒド、過ヨウ素酸、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル化合物、マレイミド化合物、ピリジル・ジスルフィド化合物等があげられる。
生物学的親和性を利用した結合体の製造方法の例としては、アビジンとビオチンの結合を利用した方法がある。例えば同一抗体の抗体(断片)とアルブミンなどの他の高分子物質の両方にビオチン分子を導入しアビジンにより架橋する方法や、あるいは両者の一方にアビジンを導入し、もう一方にビオチンを導入して架橋する方法がある。ビオチン分子の導入にはビオチニル−ε−アミノカプロン酸−N−ヒドロキシスクシミニドエステルなどが試薬として使われる。
抗体(断片)と標識物質及び/又は固相担体との結合体は、本発明に係る抗原抗体反応の前に製造してもよいし、事前に一方の結合体を製造していなくても、液相中で抗原抗体反応を行った後に、標識物質または固相担体と結合させてもよい。例えば、アビジンとビオチンの結合を利用した結合体の製造方法を例にすると、ビオチンまたはアビジン等を導入した抗体(断片)を用いて抗原抗体反応を液相中で行った後に、アビジンまたはビオチン等を導入した標識物質または固相担体と反応させることにより、抗原抗体反応の後に該抗体(断片)を標識化または固定化することもできる。
標識化抗体および固相化抗体の使用濃度は測定性能を考慮して決めればよい。
本実施例では、異なるPSA濃度を有する試料において、抗fPSA抗体のFab’フラグメントを添加することが等モル反応性に与える影響を確認した。
測定対象試料のPSA濃度が、低濃度のものから高濃度のものまで存在することを想定し、1ng/mLまたは100ng/mLのfPSAおよびPSA−ACTを調製した。市販のfPSAおよびPSA−ACTを、WHO国際基準品(WHO Internation Standard Prostate Specific Antigen (90:10) NIBSC code:96/670)を基準として、それぞれの濃度に調製した。
PSA−ACTとは反応しない抗fPSAマウスモノクローナル抗体を使用した。公知の方法により、チオール基安定化Fab’フラグメントを調製し、防腐剤を含む0.1MのHEPES緩衝液(pH8.0)に、それぞれ終濃度が、0μg/mL、0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mLになるように添加した。
磁性粒子(JSR社)に抗tPSAマウスモノクローナル抗体を感作し、防腐剤を含む0.01MのMES緩衝液(pH6.0)に分散させた。なお、使用した抗体はfPSAとPSA−ACTに共通のエピトープを認識する。
抗tPSAマウスモノクローナル抗体をアルカリホスファターゼ(ALP)標識し、0.01MのMES緩衝液(pH6.0)に分散させた。なお、使用した抗体は、fPSAとPSA−ACTに共通するエピトープであるが、固相化抗体で使用した抗体が認識するエピトープとは異なるエピトープを認識する。
2−クロロ−5−(4−メトキシスピロ{1,2−ジオキセタン−3,2´−(5´−クロロ)−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン}−4−イル)−1−フェニルホスフェート・二ナトリウム(CDP−Star(登録商標):アプライドバイオシステム社)を使用した。
測定には、全自動臨床検査システムSTACIA(LSIメディエンス社製)を使用した。25μLの試料に150μLの抗fPSA抗体Fab’フラグメント溶液を加え、37℃で4分間加温した。その後、60μLの固相化抗体溶液を加え、37℃で6分間加温した後、B/F分離を行い、100μLの標識化抗体溶液を加え、37℃で4分間加温し、再度B/F分離を行った後、100μLの発光基質溶液を加え、37℃で約3分反応後にシグナル強度(counts)を測定した。
比較例として、抗fPSA抗体溶液として、抗fPSA抗体のFab’フラグメントに代えて、抗fPSA抗体の完全抗体IgGを用意した。その結果を表1に示す。
さらに試料に添加する抗fPSA抗体の形状が等モル反応性に与える影響を確認した。抗fPSA抗体溶液として、Fab’フラグメントに変えて、完全抗体IgGまたはF(ab’)2フラグメントを添加したものを用意した。抗fPSA抗体は実施例1と同じものを用い、1ng/mLのfPSAおよびPSA−ACTを測定した。それ以外は実施例1と同様に測定した。その結果を表2に示す。
次に、Fab’フラグメントの濃度を2μg/mLから段階希釈した抗fPSA抗体溶液を用意した。1ng/mLまたは100ng/mLのfPSAおよびPSA−ACTを測定し、その添加量毎の効果を確認した。測定条件は実施例1と同様である。その結果を表3に示す。
fPSAとPSA−ACTの混合比率を変えた測定対象試料を用いて、抗fPSA抗体Fab’フラグメントの添加効果を確認した。
総PSAが一定量(fPSA濃度換算で1ng/mL)となるようにfPSAとPSA−ACTの混合比率を変えた試料を調製した。抗fPSA抗体溶液として0.25μg/mLのFab’フラグメントを用いた以外は、実施例1と同様に測定した。0、1、10、50、及び100ng/mLのWHO国際基準品を基に作製した検量線を用いて、試料中の総PSA濃度を求めた。その結果を表4に示す。一般的に、測定値の誤差が±10%以内であれば、等モル反応が達成されていると言えることから、PSA−ACTとfPSAの混合比率に依らず等モル反応性が達成できることが示された。
PSA−ACTと、WHOのtPSA基準品(患者実検体に近い割合でPSA−ACTとfPSAが含まれる)の混合比率を変えた測定対象試料を用いて、抗fPSA抗体Fab’フラグメントの添加効果を確認した。
総PSA濃度が1ng/mLになるようにWHOのtPSA基準品とPSA−ACTの混合比率を変えた試料を調製し、実施例4と同様に測定した。結果を表5に示す。その結果、PSA−ACTの混合比率に依らず等モル反応性が達成できることが示された。
1ng/mLのfPSAおよびPSA−ACT、及びPSA濃度レベルが異なる4種類の血清サンプルを用意し、実施例4と同様に測定した。結果を表6に示す。その結果、Fab’フラグメントを添加することで、より正確な総PSA濃度の測定が可能となることが示された。
Claims (13)
- 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントとを含む、
PSA測定キット。 - 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、請求項1に記載のPSA測定キット。
- 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、請求項1又は2に記載のPSA測定キット。
- 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体と、
遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントとを含む、
PSA測定キット。 - 前記Fab又はFab’フラグメントが、検体処理液に含まれている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のPSA測定キット。
- 各抗体及びFab又はFab’フラグメントがモノクローナル抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のPSA測定キット。
- 試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する抗体を添加する工程
を含む、PSA測定方法。 - さらに、B/F分離工程を含む、請求項7に記載のPSA測定方法。
- 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体が、固相化または標識化されている、請求項7又は8に記載のPSA測定方法。
- 遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体として、エピトープの異なる二種類の抗体を含む、請求項7〜9に記載のPSA測定方法。
- 試料に、遊離型の前立腺特異抗原に反応するが、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体とは反応しない抗体のFab又はFab’フラグメントを添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する固相化第一抗体を添加する工程、
遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応し、且つ、前記第一抗体とは異なるエピトープを認識する標識化第二抗体を添加する工程、
B/F分離工程
を含む、PSA測定方法。 - 前記FabまたはFab’フラグメントを添加する工程が、遊離型の前立腺特異抗原と、前立腺特異抗原/α1−アンチキモトリプシン複合体との両方に反応する前記抗体を添加する工程より先に行われる、請求項7〜11のいずれか一項に記載のPSA測定方法。
- 使用される抗体がすべてモノクローナル抗体である、請求項7〜12のいずれか一項に記載のPSA測定方法。
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