CN117624356A - NfL特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用 - Google Patents
NfL特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了NfL特异性抗体及其在阿尔茨海默症辅助诊断试剂盒的应用，属于体外诊断技术领域，本申请提供的抗NfL蛋白的抗体对NfL蛋白具有较强的结合特异性，因此具有开发用于检测NfL蛋白的试剂盒的价值。本申请提供的检测试剂盒可以用于与NfL相关的疾病，例如阿尔茨海默症的辅助诊断。
Description
技术领域
本申请属于体外诊断技术领域，涉及一种NfL特异性抗体、检测NfL的试剂盒及其在阿尔茨海默症辅助诊断的应用。
背景技术
神经丝（Neurofilament，NF）是广泛存在于中枢神经系统与外周神经系统的成熟神经原中主要的中间丝，丰富分布于锥体束大口径的神经元轴突中，是神经元主要的细胞骨架成分。神经丝蛋白由三种分子量大小的蛋白构成，①神经丝轻链蛋白(neurofilamentlight chain，NfL)分子量68KD；②神经丝中链蛋白(neurofilament middle chain，NfM)，分子量160KD；③神经丝重链蛋白(neurofilament heavy，NfH)，分子量 200KD。这些蛋白质是从轴突运输的研究中发现的，通常被称为“神经丝三联体”，研究表明，有且只有NfL能够单独组装成中间丝结构，因此NfL是三联体蛋白正确组装成中间丝必不可少的部分。
神经丝轻链蛋白(Neuroflament light chain protein，NfL)是神经丝的一个亚单位，它是位于神经元细胞质中的圆柱形蛋白质，可以维持神经元结构的稳定性。NfL共543aa，含2个糖基化位点，2-543aa为主链。其中2-92aa为链的头部，是抗体结合区；93-396aa是链体，其特别的质量和高电荷密度有别于其他神经丝蛋白但与其他神经丝的同源性非常高；397-543aa是链的尾部，影响链的空间结构。在正常情况下，轴突会释放低水平的NfL，随着年龄的增高，NfL的释放逐渐增多。病理条件下，由于炎症性、神经退行性、创伤性或血管损伤而导致的中枢神经系统轴突损伤会使NfL的释放急剧增加。释放的NfL经脑脊液通过血脑屏障流入到外周血中，NfL与多种神经系统疾病密切相关。因此NfL的检测对神经系统相关的疾病如阿尔茨海默症、帕金森等的诊断、治疗和预后判断具有重要的指导意义。
发明内容
本申请的目的是提供一种特异性好、亲和力高的抗NfL抗体及其在化学发光免疫检测试剂盒中的应用，为与NfL相关的疾病的辅助诊断提供工具，更进一步地提供该抗体或试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症中的应用。
一方面，本申请提供一种特异性结合NfL的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下述的CDR：(a)包含如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；(c)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3；(d)包含如与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L1；(e)包含如与GAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(f)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列：(a)包含如与SEQ ID NO：1氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ IDNO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；和(c)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(b)包含如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；和(c)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VL CDR序列：(a)包含如与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L1；(b)包含如与GAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L3。在又一个实施方案中，该抗体包含(a)包含如与SEQ ID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L1；(b)包含如与GAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L2；和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链链可变域CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)包含至少一种、至少两种或所有三种选自下述的VH CDR序列的VH域：(i)包含如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H1；(ii)包含如与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H2；(iii)包含如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列的具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域CDR-H3；和(b)包含至少一种、至少两种、或所有三种选自下述的VL CDR序列的VL域：(i)包含如与SEQID NO：4的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L1；(ii)包含如与GAS的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L2；和(c)包含如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域CDR-L3。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合片段包含(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1；(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2；(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3；(d)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(e)包含GAS的氨基酸序列的CDR-L2；和(f)包含选自SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的重链可变域(VH)。在一些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗NfL抗体保留结合NfL的能力。在一些实施方案中，该VH包含一种、两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的轻链可变域(VL)。在一些实施方案中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的抗NfL抗体保留结合NfL的能力。在一些实施方案中，该VL包含一种、两种或三种选自下述的CDR：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR-L1；(b)GAS的氨基酸序列的CDR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。
一方面，本申请提供一种多核苷酸，其编码上述的抗体或抗原结合片段。
一方面，本申请提供一种载体，其包含本申请的多核苷酸。
在一些实施方案中，提供一种编码本文所描述的抗NfL抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，提供一或多种包含此类核酸的载体(例如表达载体)，所述载体包括病毒载体、表达载体、重组表达载体。在一些实施方案中，表达载体是pcDNA3.1。
一方面，本申请提供一种宿主细胞，其包含本申请的多核苷酸或载体。
在一些实施方案中，宿主细胞包含：(1)包含编码包含抗体VL和抗体VH的核酸的载体；或(2)包含编码包含抗体VL的核酸的第一载体和包含编码包含抗体VH的核酸的第二载体。在一些实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞，例如E.coli、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、链霉菌(Streptomyces sp.)、假单孢菌(Pseudomonas sp.)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)或葡萄球菌(Staphylococcus sp.)。在一些实施方案中，宿主细胞可以是真菌细胞，例如曲霉菌(Aspergillussp.)，酵母细胞如甲醇酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycessp.)和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)，低级真核细胞和诸如昆虫细胞之类的高级真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞可以来自植物和/或哺乳动物。如PER.C6细胞、猴肾细胞7(COS7，特别是simian COS细胞)、NSO细胞、SP2/0、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、W138、幼仓鼠肾(BHK)细胞、Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞、骨髓瘤细胞系、HuT78细胞、293T细胞、293F细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是HEK293细胞。
一方面，本申请提供一种检测NfL的试剂盒。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本申请的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述试剂盒以非诊断目的免疫检测NfL。在一些实施方案中，所述试剂盒为化学发光法、电化学发光法、ELISA。在一些实施方案中，所述试剂盒是双抗夹心原理的化学发光免疫检测试剂盒，其包括：靶向NfL的第一抗体包被的磁珠、经化学发光剂标记的靶向NfL的第二抗体。在一些实施方案中，所述化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶(HRP)中的至少一种。
在一些实施方案中，所述靶向NfL的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体选自如上所述的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述靶向NfL的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为KAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。在一些实施方案中，所述靶向NfL的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：19所示的轻链可变区VL。
在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为KAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。在一些实施方案中，所述第二抗体为本申请所述的抗体或抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：19所示的轻链可变区VL。
一方面，本申请提供了如上述的抗体或抗原结合片段在制备用于检测NfL的试剂或试剂盒中的应用。
一方面，本申请提供了如上述抗体或抗原结合片段和如上述的试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症的应用。
一方面，本申请提供了如上述的抗体的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：
(1)使用NfL为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；
(2)筛选特异性B淋巴细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；
(3)将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；
(4)收集培养上清并纯化，即得抗体。
进一步地，步骤1)所述NfL的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
进一步地，步骤2)所述PCR所用的引物序列如SEQ ID NO：9-11所示。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg(SEQ ID NO：10)。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc(SEQ ID NO：9)。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg(SEQ ID NO：11)。
进一步地，步骤4)所述纯化具体为：上清过proteinA亲和层析柱进行纯化。
一方面，本申请提供了一种特异性结合NfL的抗体或抗原结合片段的配对筛选方法，具体采用固定重链可变区如SEQ ID NO：18所示和轻链可变区如SEQ ID NO：19所示的抗体Rabbit anti-NfL mAb，通过夹心ELISA实验配对筛选抗体或抗原结合片段。
本申请的有益效果
本申请提供了一种新的靶向NfL的抗体或抗原结合片段及包含上述抗体或抗原结合片段的试剂盒，利用单B细胞技术生产的抗体或抗原结合片段亲和力高、灵敏度高、生产周期明显缩短，更适合作为核心原料应用于体外诊断试剂领域。
附图说明
图1为抗原特异性单B细胞流式细胞仪分选图；
图2为本申请的NfL抗体用于化学发光检测定值梯度临床样本，检测结果与临床值的相关曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本公开进行详细的说明，但本公开的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本公开的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本公开的保护范围。
除非另外定义，本文所使用的所有术语具有与本公开所属领域技术人员通常理解的相同的含义。整个公开所引用的所有专利、专利申请和出版物其整体通过引用并入本文。如果本文的术语存在多个定义，以本节中的那些定义为准。
下面结合实施例对本公开提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本公开保护范围的限定。
实施例1：抗神经丝轻链蛋白(Neurofilament light chain，NfL)单克隆抗体制备
1.抗原制备
NfL，本实施例选择哺乳动物细胞293F细胞表达系统，C端带His标签。免疫原、分选原相同，均为NfL-His重组蛋白。
NfL，序列为：
MSSFSYEPYYSTSYKRRYVETPRVHISSVRSGYSTARSAYSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGSLMPSLENLDLSQVAAISNDLKSIRTQEKAQLQDLNDRFASFIERVHELEQQNKVLEAELLVLRQKHSEPSRFRALYEQEIRDLRLAAEDATNEKQALQGEREGLEETLRNLQARYEEEVLSREDAEGRLMEARKGADEAALARAELEKRIDSLMDEISFLKKVHEEEIAELQAQIQYAQISVEMDVTKPDLSAALKDIRAQYEKLAAKNMQNAEEWFKSRFTVLTESAAKNTDAVRAAKDEVSESRRLLKAKTLEIEACRGMNEALEKQLQELEDKQNADISAMQDTINKLENELRTTKSEMARYLKEYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRLSFTSVGSITSGYSQSSQVFGRSAYGGLQTSSYLMSTRSFPSYYTSHVQEEQIEVEETIEAAKAEEAKDEPPSEGEAEEEEKDKEEAEEEEAAEEEEAAKEESEEAKEEEEGGEGEEGEETKEAEEEEKKVEGAGEEQAAKKKDGGGGSHHHHHH（SEQ ID NO：8）。
为获得NfL兔单克隆抗体，以自主研发的NfL-His蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔，每只免疫500ug。首次免疫，免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，间隔3周取250ug免疫原与等量的弗式佐剂混合制成乳化剂，皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集PBMC样本，NfL-His蛋白作为分选原包板，ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，250ug免疫原于皮下多点注射加强免疫一次后取兔子脾脏。
2.单B细胞悬液制备
兔脾脏样本淋巴细胞的分离与制备，是通过物理研磨兔脾脏，经多孔滤网过滤制备单细胞悬液。单细胞悬液用于细胞染色和流式分选工作。
3.抗原特异性单B细胞分选
抗原特异性单B细胞分选，是基于流式抗体特异性识别淋巴B细胞表面特征性标志物，应用流式细胞分选术完成淋巴细胞悬液中特异性单个B细胞的获取。
本实施例中，分选原偶联FITC染料。
抗兔IgG二抗，是自研类抗体。偶联PE染料。
细胞标记时，加入DAPI染料，以区分死/活细胞（Dead/Live细胞）。
细胞标记方案，淋巴B细胞分选方案：Dead/Live-/IgG+/Antigen+。
细胞标记操作：兔淋巴细胞悬液，300g离心5min，加入5mL buffer液，上下颠倒混匀，300g离心5min。弃上清，重复1次，取30uL细胞悬液进行细胞计数，取40uL细胞悬液，用于空白对照管和待标记的单染管。剩余细胞液作为样本管，300g离心5min，加少量PBS液重悬。空白管不做处理。单染管，补充PBS液至100uL，分别加入2uL PE、2uL FITC、2uL DAPI染料。样本管按照PE染料1.5uL/106细胞，FITC染料2ug/106细胞，计算实际加入量，避光加入相应的抗体，4℃放置30min。抗体孵育结束后，加入2mL buffer液，轻混匀，300g离心5min，重复洗3次。1mL buffer液重悬，细胞过滤后，等待上机分选。
完成荧光补偿调节后，基于活细胞群，圈定PE和FITC双阳性信号细胞群，抗原特异性B细胞分选入96孔板中，每孔仅有1个细胞，分选后孔板需立即低温保存，本实施例实验中备有干冰盒，可短暂放置。孔中装有细胞裂解液，分选的96孔PCR板直接进行单细胞抗体基因的扩增。
4.兔单B细胞cDNA制备
单B细胞cDNA文库制备，是基于SMART 5’RACE技术，所用试剂皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）N711试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考N711试剂盒说明书。
单B细胞RNA逆转录：完成分选的96孔板，解冻后置于PCR仪中运行程序，程序结束后冰上静置2min。
单B细胞cDNA单链合成：逆转录反应程序结束后，可加入单链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置2min。
单B细胞DNA双链合成：cDNA单链产物的合成反应结束后，可加入双链合成体系。待体系加入后，孔板轻混匀，离心后置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
5.兔单B细胞PCR技术扩增抗体编码基因
单个B细胞cDNA文库，可调取天然配对的抗体重链和轻链编码基因。
编码基因扩增所用试剂，皆为南京诺唯赞生物科技股份有限公司（Vazyme）P515试剂盒，可于市场购得。实施例中实验所涉及的扩增体系，均可参考P515试剂盒说明书。
上游引物包含与启动子CMV基因序列 3’端互搭的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互搭的同源臂。
轻链编码基因调取的下游引物位于恒定区位置，包含与BGH-polyA基因序列互补的同源臂，因此抗体编码基因调取后，可直接用于线性表达框的构建。
抗体重链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体重链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：10）。
抗体轻链编码区基因扩增，正向引物序列为：
caagctggctagcgtttaaacttgccaccagtcgtatgaagctaagagatc（SEQ ID NO：9）。
抗体轻链编码区基因扩增，反向引物序列为：
tagtggatccgagctcggtacctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：11）。
抗体轻链、重链编码基因调取：按照说明书加入PCR扩增体系，孔板轻混匀，置于PCR仪中运行程序，程序结束后孔板样品冰上静置。
本实施例中，抗体轻链、重链编码基因在同一96孔板的扩增产物配对阳性率在80％以上，借助琼脂糖凝胶电泳检测条带清晰，说明单B细胞流式分选和编码基因扩增实验均是有效的。扩增产物，用于重组表达质粒的构建。
6.抗体重链和轻链重组表达质粒的构建与表达
重组表达载体，选择pcDNA3.1（Invitrogen），在ThermoFisher SCIENTIFIC官网购买。重组构建前，选择HindⅢ限制酶单酶切实现表达载体线性化，限制酶在New EnglandBiolabs官网购买。
载体与编码基因的高效重组，选择无缝克隆试剂盒，在Vazyme官网购买C115#试剂盒。
重组表达质粒的构建：抗体重链和轻链的编码扩增产物与pcDNA3.1线性化载体应用无缝克隆技术实现环化连接，后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB固定培养基平板，平板倒置37℃过夜培养。
重组阳性克隆挑选：初筛抗体的重链和轻链，分别挑取8个单菌落，PCR菌检后确定菌落阳性率。
重组质粒的菌检PCR，位于载体的上游引物序列为：caagctggctagcgtttaaactt(SEQ ID NO：12)。
抗体重链菌检PCR下游引物序列为：ctcatttacccggagagcg（SEQ ID NO：13）。
抗体轻链菌检PCR下游引物序列为：acctcaacagtcacccctattg（SEQ ID NO：14）。
重组阳性克隆送测：抗体重链、轻链，分别挑取5个菌检PCR阳性克隆送上海生工生物公司测序。
兔抗体基因序列分析：应用IMGT数据库完成抗体序列V区基因确定，并对抗体重链及轻链CDR1/CDR2/CDR3区等完成抗体序列的分析，导出并确定菌检PCR阳性克隆的正确序列编号。
重组表达质粒的小量表达：正确序列的克隆，菌液中量小提获得抗体轻链、重链质粒。质粒混合后共转染于HEK293哺乳动物细胞。细胞转染10天后，离心收集细胞上清。上清进行抗原特异性评测，等ELISA初筛结果后安排细胞上清纯化。
本实施例中每轮转染100个质粒，即每轮转染可获得100株单克隆抗体。共进行5轮转染实验。
7.重组表达上清抗原特异性评测
抗原包被板制备，筛选原分别为神经丝轻链蛋白(Neurofilament light chain，NfL)、神经丝中链蛋白（neurofilament middle chain，NfM）、神经丝重链蛋白（neurofilament heavy chain，NfH）、α-中间蛋白（α-internexin，AINX），其中NfM、NfH、AINX蛋白均为293F细胞重组表达，C端带His标签。
NfL蛋白单克隆抗体的筛选方案：与NfL-His蛋白反应，且不与NfM-His、NfH-His和AINX-His蛋白反应的抗体，即初步定为NfL特异性单克隆抗体。
筛选原NfM-His，序列为
MSYTLDSLGNPSAYRRVTETRSSFSRVSGSPSSGFRSQSWSRGSPSTVSSSYKRSMLAPRLAYSSAMLSSAESSLDFSQSSSLLNGGSGPGGDYKLSRSNEKEQLQGLNDRFAGYIEKVHYLEQQNKEIEAEIQALRQKQASHAQLGDAYDQEIRELRATLEMVNHEKAQVQLDSDHLEEDIHRLKERFEEEARLRDDTEAAIRALRKDIEEASLVKVELDKKVQSLQDEVAFLRSNHEEEVADLLAQIQASHITVERKDYLKTDISTALKEIRSQLESHSDQNMHQAEEWFKCRYAKLTEAAEQNKEAIRSAKEEIAEYRRQLQSKSIELESVRGTKESLERQLSDIEERHNHDLSSYQDTIQQLENELRGTKWEMARHLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRFSTFAGSITGPLYTHRPPITISSKIQKPKVEAPKLKVQHKFVEEIIEETKVEDEKSEMEEALTAITEELAVSMKEEKKEAAEEKEEEPEAEEEEVAAKKSPVKATAPEVKEEEGEKEEEEGQEEEEEEDEGAKSDQAEEGGSEKEGSSEKEEGEQEEGETEAEAEGEEAEAKEEKKVEEKSEEVATKEELVADAKVEKPEKAKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVPKSPVEEKGKSPVSKSPVEEKAKSPVPKSPVEEAKSKAEVGKGEQKEEEEKEVKEAPKEEKVEKKEEKPKDVPEKKKAESPVKEEAVAEVVTITKSVKVHLEKETKEEGKPLQQEKEKEKAGGEGGSEEEGSDKGAKGSRKEDIAVNGEVEGKEEVEQETKEKGSGREEEKGVVTNGLDLSPADEKKGGDKSEEKVVVTKTVEKITSEGGDGATKYITKSVTVTQKVEEHEETFEEKLVSTKKVEKVTSHAIVKEVTQSDGGGGSHHHHHH（SEQ ID NO：15）。
筛选原NfH-His，序列为
MMSFGGADALLGAPFAPLHGGGSLHYALARKGGAGGTRSAAGSSSGFHSWTRTSVSSVSASPSRFRGAGAASSTDSLDTLSNGPEGCMVAVATSRSEKEQLQALNDRFAGYIDKVRQLEAHNRSLEGEAAALRQQQAGRSAMGELYEREVREMRGAVLRLGAARGQLRLEQEHLLEDIAHVRQRLDDEARQREEAEAAARALARFAQEAEAARVDLQKKAQALQEECGYLRRHHQEEVGELLGQIQGSGAAQAQMQAETRDALKCDVTSALREIRAQLEGHAVQSTLQSEEWFRVRLDRLSEAAKVNTDAMRSAQEEITEYRRQLQARTTELEALKSTKDSLERQRSELEDRHQADIASYQEAIQQLDAELRNTKWEMAAQLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEECRIGFGPIPFSLPEGLPKIPSVSTHIKVKSEEKIKVVEKSEKETVIVEEQTEETQVTEEVTEEEEKEAKEEEGKEEEGGEEEEAEGGEEETKSPPAEEAASPEKEAKSPVKEEAKSPAEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEAKSPPEAKSPEKEEAKSPAEVKSPEKAKSPAKEEAKSPAEAKSPEKAKSPVKEEAKSPAEAKSPVKEEAKSPAEVKSPEKAKSPTKEEAKSPEKAKSPEKAKSPEKEEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEKAKSPVKAEAKSPEKAKSPVKEEAKSPEKAKSPVKEEAKSPEKAKSPVKEEAKTPEKAKSPVKEEAKSPEKAKSPEKAKTLDVKSPEAKTPAKEEARSPADKFPEKAKSPVKEEVKSPEKAKSPLKEDAKAPEKEIPKKEEVKSPVKEEEKPQEVKVKEPPKKAEEEKAPATPKTEEKKDSKKEEAPKKEAPKPKVEEKKEPAVEKPKESKVEAKKEEAEDKKKVPTPEKEAPAKVEVKEDAKPKEKTEVAKKEPDDAKAKEPSKPAEKKEAAPEKKDTKEEKAKKPEEKPKTEAKAKEDDKTLSKEPSKPKAEKAEKSSSTDQKDSKPPEKATEDKAAKGKGGGGSHHHHHH（SEQ ID NO：16）。
筛选原AINX-His，序列为
MSFGSEHYLCSSSSYRKVFGDGSRLSARLSGAGGAGGFRSQSLSRSNVASSAACSSASSLGLGLAYRRPPASDGLDLSQAAARTNEYKIIRTNEKEQLQGLNDRFAVFIEKVHQLETQNRALEAELAALRQRHAEPSRVGELFQRELRDLRAQLEEASSARSQALLERDGLAEEVQRLRARCEEESRGREGAERALKAQQRDVDGATLARLDLEKKVESLLDELAFVRQVHDEEVAELLATLQASSQAAAEVDVTVAKPDLTSALREIRAQYESLAAKNLQSAEEWYKSKFANLNEQAARSTEAIRASREEIHEYRRQLQARTIEIEGLRGANESLERQILELEERHSAEVAGYQDSIGQLENDLRNTKSEMARHLREYQDLLNVKMALDIEIAAYRKLLEGEETRFSTSGLSISGLNPLPNPSYLLPPRILSATTSKVSSTGLSLKKEEEEEEASKVASKKTSQIGESFEEILEETVISTKKTEKSNIEETTISSQKIGGGGSHHHHHH（SEQ ID NO：17）。
间接ELISA检测细胞上清，应用自产兔二抗Anti-Rabbit IgG mAb包被，羊抗兔多抗标记HRP检测，反应性OD>1，说明重组质粒在293细胞上正常表达。
间接ELISA检测细胞上清，分别对4种抗原包被板进行反应性评测，得到孔板上清的初筛检测结果（表1例示性的展示了50株细胞上清的检测数据）。
表1：部分抗体的抗原-抗体的亲和力数据表
间接ELISA检测结果：NfL-His抗体初筛共转染重组获得500株单克隆抗体，与NfL-His蛋白反应，且不与NfM-His、NfH-His和AINX-His蛋白反应的抗体，初步筛选出100株单克隆抗体。
初步筛选确定的细胞上清，经proteinA纯化后获得小量单克隆抗体，每株平均1-3mg。
8.重组抗体ELISA配对筛选
神经丝轻链蛋白(Neurofilament light chain，NfL) 配对抗体筛选，早期已完成NfL高亲和力特异性抗体的开发，因此本实施例选择固定Rabbit anti-NfL mAb，夹心ELISA实验配对检测初步筛选的100株单克隆抗体，筛选出可以与Rabbit anti-NfL mAb配对检测的较优单克隆抗体。
Rabbit anti-NfL mAb重链可变区序列为：
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGIDLSNYAMNWVHQAPGKGLEWIAIIYASGSTYYTTWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARALSMTNVYTFNIWGPGTLVTVSS（SEQ ID NO：18）；
（CDRH1：GIDLSNYA（SEQ ID NO：20）；CDRH2：IYASGST（SEQ ID NO：21）；CDRH3：ARALSMTNVYTFNI（SEQ ID NO：22））
轻链可变区序列为：
DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQNIYNNLAWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGSSYVAFGGGTEVVVK（SEQ ID NO：19）；
（CDRL1：QNIYNN（SEQ ID NO：23）；CDRL2：KAS；CDRL3：QCTYGSSYVA（SEQ ID NO：24））
临床阳性样本ELISA平台同步检测数据显示，ELISA配对实验可以选择NfL-His作为检测原。
初步筛选的100株单克隆抗体，经夹心ELISA实验检测NfL-His，最终筛选出检测原高值和低值的配对检测信号值排序的前10株，上化学发光平台验证抗体的临床样本检出情况（表2例示性的展示了20对配对抗体的检测结果）。
表2：NfL-His配对抗体的检测数据（部分）
9.重组抗体化学发光平台筛选
将步骤8中筛选出的抗体在化学发光平台上进行反应性与特异性检测，具体操作如下：
磁珠包被：固定Rabbit anti-NfL mAb为包被抗体（抗体可变区序列信息已在步骤8中展示），取2mg磁珠，活化buffer清洗2次，后加入一定量的EDC振荡混匀，磁吸弃上清。沉淀加入1000uL偶联buffer，加入抗体40ug，振荡混匀2h，后加入100uL封闭液，振荡混匀封闭3h。最后加入1000uL TBST清洗磁珠，再加入1000uL保存液。
吖啶酯标记：将步骤8中筛选出的抗体作为标记抗体，取100-(100/CAb)uL偶联Buffer至0 .5mL的棕色EP管中，加入(100/CAb)uL Ab至0 .5mL的棕色EP管中，使抗体标记终浓度在1mg/mL，加入5mM的吖啶酯到0 .5mL的棕色EP管中，漩涡振荡器混合均匀，之后室温(20-25℃)条件下垂直混匀仪反应2h，纯化去除游离的吖啶酯。
筛选原选择NfL、NfH、NfM、AINX，筛选原具体序列信息已在步骤7中展示，各筛选原的使用浓度均为10000pg/mL，同时检测样本稀释液作为对照。
按上述方法分别完成包被抗体、标记抗体及筛选原的制备，使用全自动化学发光仪，按设定程序对各筛选原进行检测。检测结果与NfL有反应，且不与NfH、NfM、AINX有反应的抗体即为优选抗体。
经夹心ELISA实验筛选出的10株单克隆抗体，经化学发光平台检测，优选出1株NfL特异性抗体。表3例示性的展示了4对配对抗体的检测结果。
表3：NfL特异性抗体化学发光平台配对检测数据（部分）
将筛到的特异性抗体命名为Anti-NfL-rRmab-1，重链可变区序列为：
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSIHDMSWVRQAPGKGLEWIGLISSNNNTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGGFSTDLWGPGTPVTVSS（SEQ ID NO：6）。
轻链可变区序列为：
DVVMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSIYTYLSWYQQKPGQPPKLLIYGASNLASGVSSRFKGSGSGTDYTLTISGVQCDDAATYYCQCTYFSSSYVGGFGGGTEVVVK（SEQ ID NO：7）。
表4：抗NfL抗体的氨基酸序列
实施例2：单克隆抗体在化学发光平台的应用
将优选出的NfL特异性抗体Anti-NfL-rRmab-1应用于化学发光检测实验，搭配能够与之配对的抗体，对定值梯度临床样本进行检测，比较检测结果与临床定值间的相关性。
梯度临床样本采用simoa单分子免疫法对样本中的NfL浓度进行定值，具体浓度如表5：
表5：临床样本NfL浓度表
将优选出的NfL特异性抗体Anti-NfL-rRmab-1和上述与之配对的抗体Rabbitanti-NfL mAb组成抗体对，使用全自动化学发光仪对样本P1-P4，以及样本稀释液中NfL的浓度进行检测（步骤同实施例1（9）），结果如表6：
表6：临床样本化学发光检测结果表
以simoa单分子免疫法检测的NfL浓度为横轴，化学发光法检测的NfL浓度为纵轴，绘制各样本NfL浓度的散点图，并计算两种检测方法间NfL浓度值的相关系数。
如图2所示，两种检测方法的相关系数R=0.9998，即使用优选出的NfL特异性抗体Anti- NfL-rRmab-1，搭配能够与之配对的抗体，应用于化学发光检测实验时，检测结果与simoa单分子免疫法具有较强的相关性，该优选抗体可用于下游试剂盒制备。
尽管已经示出和描述了本申请的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本申请的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (11)
1.一种特异性结合NfL的抗体或其抗原结合片段，其重链CDRH1-CDRH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为GAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：如SEQ ID NO：6所示的重链可变区VH，和如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区VL。
3.一种检测NfL试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括靶向NfL的第一抗体包被的磁珠，和经化学发光剂标记的靶向NfL的第二抗体，其中，靶向NfL的第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的一个抗体为权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：22所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为KAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述第一抗体和第二抗体组成的抗体对中的另一个抗体包含：如SEQ ID NO：18所示的重链可变区VH和如SEQ ID NO：19所示的轻链可变区VL。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体的重链CDRH1-CDRH3氨基酸序列如SEQ ID NO：20-SEQ IDNO：22所示，轻链CDRL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，轻链CDRL2的氨基酸序列为KAS，轻链CDRL3的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，所述第二抗体为权利要求1～2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述第一抗体包含如SEQ ID NO：18所示的重链可变区VH和如SEQ IDNO：19所示的轻链可变区VL。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，化学发光剂选自吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶中的至少一种。
9.根据权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求3-8任一项所述的试剂盒在辅助诊断阿尔茨海默症中的应用。
10.一种多核苷酸，其编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，具体采用单B细胞抗体克隆技术制备，包括以下步骤：
1）使用NfL为免疫原免疫兔，免疫结束后收集脾脏并分离脾细胞；
2）分选特异性淋巴B细胞，并提取其总RNA，合成cDNA，再利用PCR获得抗体可变区及恒定区序列；
3）将扩增的抗体基因插入重组表达载体中，转染293细胞；
4）收集培养上清并纯化，即得抗体。
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