CN108872612A - 建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素（Anti‑Mullerian Hormone，AMH）试剂盒。本发明试剂盒是利用稀土元素荧光寿命长特征，延时测定，即时间分辨荧光法（（Time‑resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)，结合侧向免疫层析技术（Lateral flow immunoassay,LFIA），经过对各步骤的优化，实现AMH时间分辨荧光定量测定。本发明试剂盒是由检测AMH试纸卡和时间分辨免疫荧光（TRFIA）分析仪组成。制备方法包括：昆虫细胞表达AMH，纯化出AMH作为校准品；AMH抗体偶联稀土元素荧光微球；AMH抗体‑荧光微球喷涂到结合垫上，AMH抗体喷涂到硝酸纤维素膜上，组装成试纸条，加外壳形成试纸卡；把AMH校准品加到AMH试纸卡后，用TRFIA分析仪进行检测，建立TRFIA分析仪自动显示AMH浓度检测系统，用于临床检测血液中AMH浓度。

Description

建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒

技术领域

本发明涉及基因重组蛋白制备领域，表达和纯化出自然结构Flag-AMH蛋白，及建立TRFIA测定LFIA试纸条上荧光强度过程。

技术背景

抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子β超家族的成员之一，人类AMH编码基因位于19号染色体短臂，大小2.4～2.8kb，含有5个外显子。AMH是由两个相同的70KDa亚基，通过二硫键连接组成的二聚糖蛋白，分子质量为140KDa。

AMH在性腺器官发育过程中起着重要作用，是男女性腺功能的重要标记物之一。在男性AMH主要由睾丸间质细胞产生，始于胚胎形成并贯穿生命始终；在男性胎儿的发育过程中，AMH导致缪勒氏管退化，形成正常发育的男性生殖管道。在女性AMH主要由卵巢窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞产生并分泌到血液中。

AMH功能是调节卵泡生长发育，AMH通过旁分泌抑制卵泡从始基卵泡池进入生长卵泡池，从而调控始基卵泡募集过程。AMH通过与AMH受体作用，影响始基卵泡向生长卵泡转换期和早窦卵泡期发育过程，高浓度AMH对卵泡生长和发育有抑制作用，防止卵泡过早过快消耗，保存卵巢储备功能。

研究表明，卵巢内小窦卵泡数量越多，血液中AMH浓度就越高；但由于年龄及各种因素影响，卵泡数量逐渐消耗，血液中AMH浓度会随之降低，当接近绝经期时，AMH浓度接近于零，由此可见，血液中AMH可作为预测卵巢卵泡储备的标志物。

女性一生排出约400个卵细胞，通常随着年龄的增长，卵泡数量和质量会随之下降。但很多情况下，实际年龄与卵巢年龄(卵巢储备功能)是不一致的，有些育龄期女性呈现卵巢功能早衰(POF)，血液中AMH浓度降低，孕育能力变差；也有实际年纪大但卵巢年龄年轻女性，血液中AMH浓度较高，其卵巢储备功能仍然良好，应保持其生育能力。血液中AMH值越高，代表卵泡存量越丰沛，适合受孕的黄金期较长，AMH值越低，则卵巢功能越差，35岁过后，AMH值会开始急剧下降，当AMH值低于0.7ng/ml时，表示卵泡库存量已严重不足，几乎难以受孕。

目前，临床上常用的卵巢储备功能评价的方法包括年龄、性激素检测、卵巢刺激试验和卵巢超声检查等。然而，这些指标不仅在检测时间和操作要求上有诸多限制，更因其只能在原发性卵巢功能不足出现生理表现期时测出，无法提前提示生育能力下降，导致诊断的延误，错过最佳治疗时段。在评价卵巢储备功能方面，AMH检测弥补了传统激素检测的不足，血液中AMH不受月经周期、怀孕、服用药物等影响而变动，任何时间的浓度都一样稳定，使得检测血清中AMH用于评估卵巢储备功能。在临床上得到广泛的应用。

临床上，常用ELISA测定病人血清中AMH，灵敏度高，特异性强，但检测时间长，不能自动化；化学发光法检测血清中AMH，能自动化检测，但需要昂贵化学发光检测系统。本发明建立时间分辨荧光免疫层析法检测AMH试剂盒，可用手持型TRFIA仪，测定血清中AMH浓度，此法特异性强，灵敏度高，操作快速简便，短时间获得结果。

正常女性血清中AMH浓度在2-7ng/ml之间，而卵巢功能低下女性血清中AMH浓度低于0.7-2.0ng/ml,对于AMH试剂盒的灵敏度要求较高，对传统LFIA，需要进一步的提升检测的灵敏度，以适应检测AMH要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测方法的不足，利用测向免疫层析法简单快速性，结合TRFIA高灵敏度、建立TRFIA免疫层析法检测AMH试剂盒，用于临床测定血液中AMH浓度。

本发明包括试纸卡和时间分辨荧光分析仪；所述试纸卡在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有AMH抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成2-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡；所述TRFIA分析仪是一种光学检测系统，可在激发光波长350-430nm作用后，延时100-400uS，发射光波长600-650nm，测定荧光强度；对AMH检测范围为0.1-50ng/mL。

本发明制备AMH校准品：提取HGL5细胞RNA，合成HGL5cDNA基因库，用PCR扩增出AMHDNA(核酸序列1-1683)，构建pFastBac-Flag-AMH载体，转导到HD10Bac细菌中，产生重组Flag-AMH AcNPV(昆虫病毒)质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞(SF9细胞)，产生重组Flag-AMHAcNPV；此病毒感染SF9细胞后，表达出Flag-AMH蛋白；用Anti-Flag抗体亲和层析法纯化出自然结构Flag-AMH蛋白，此纯化Flag-AMH蛋白作为校准品。

本发明制备AMH抗体-荧光微球：选用稀土元素荧光标记羧基修饰微球，稀土元素可以是铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等中的任意一种或几种；碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理羧基修饰荧光微球后，AMH抗体偶联到荧光微球上，AMH抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将AMH抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。

本发明所述稀土元素荧光微球激发光波长是420nm，发射光波长是615nm；荧光微球直径范围是100-500nmn。

本发明喷涂检测线和质控线：将AMH抗体和抗IgG抗体浓度调整到0.2-2mg/ml,膜液量0.5-2ul/cm,将抗体分别喷洒在硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，两线间隔为4-6mm,干燥后，密封备用。

本发明预处理样品垫和结合垫：本发明选用玻璃纤维样品垫，侵泡在20mmolTris缓冲液(pH7.5)含0.02％Tween-20，0.02％NaN3，室温下，1小时，再37℃，烘干5小时，干燥封闭，备用；选用玻璃纤维结合垫，侵泡在,10mmolTris缓冲液(pH8.0)，含0.2％PVP，0.2％PEG,10％Sucrose,0.02％Tween-20，0.01％NaN3)，室温下，1小时，再37℃，烘干5小时，干燥封闭，备用。

本发明Flag-AMH为校准品，用TRFIA分析仪测定不同浓度AMH校准品试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备AMH浓度标准曲线，建立AMH浓度标准卡，输入到TRFIA分析仪，建立TRFIA分析仪自动显示样品中AMH浓度检测系统。

本发明采用昆虫细胞系统表达AMH，昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，能大量生产，纯化出AMH具有蛋白自然结构和抗原性，相似血清中AMH，能作为TRFIA层析法检测AMH浓度试剂盒的校准品。

附图说明

图1是扩增AMH DNA PCR产物；

图2是BamHI切割fastbac-flag-amh质粒DNA；

图3是Flag-AMH AcNPV质粒DNA；

图4是银染法测定Flag-AMH纯度；

图5是非变性凝胶测定Flag-AMH双聚体；

图6是测定Westernblot结果；

图7是BSA浓度标准曲线图；

图8是侧向免疫层析法试纸条侧面图；其中：1是底板，2是样品垫，3是结合垫，4是硝酸纤维素膜，5是检测线，6是质控线，7是吸水垫；

图9是包装外壳后侧向免疫层析法试纸条卡示意图；其中：5是检测线，6是质控线，8是试验液窗口，9是样品窗口，10是加测窗口；

图10是AHM浓度标准曲线图；

图11是AHM浓度敏感度曲线图。

具体实施方式

一.制备AMH校准品

本发明TRFIA层析法检测AMH试剂盒需要纯化AMH蛋白做为校准品。

提取HGL5细胞RNA,用于合成才cDNA，用PCR扩增出AMH DNA(核酸序列1-1683)。选用昆虫细胞表达载体pFastBac-Flag,含Polyhedrin启动子，在昆虫细胞中表达外源性蛋白；此载体插入8个氨基酸残基(DYKDDDDK)短肽(Flag)DNA序列,用于表达Flag融合蛋白；此载体带有部分AcNPV DNA序列，用于在HD10Bac细菌中产生基因重组昆虫病毒(AcNPV)质粒。用内切酶NdeI/SalI切割AMH DNA，NdeI/XhoI切割pFastBac-Flag，将AMH DNA连接到pFastBac-Flag NdeI/XhoI部位，构建成pFast-Flag-AMH载体；此载体DNA转导入HD10Bac细菌中，产生重组Flag-AMH AcNPV质粒；此质粒DNA转导进SF9细胞，产生重组Flag-AMH AcNPV；用此AcNPV感染SF9细胞，表达出Flag-AMH蛋白，AMH蛋白有560氨基酸残基。本发明表达全长AMH(1-560氨基酸残基)，N-端带有Flag标记短肽，可用Anti-Flag M2affinity agarose纯化出Flag-AMH。

纯化Flag-AMH进行SDS-PAGE电泳，再做银染法，测定Flag-AMH纯度达到98％以上；用非变性凝胶法测定70％Flag-AMH形成二聚体；Western blot法进一步证实，抗AMH抗体结合Flag-AMH蛋白。用纯化Flag-AMH作为校准品，建立TRFIA免疫层析系统测定样品中AMH浓度。

二.建立TRFIA免疫层析检测AMH试纸卡

本发明所述的TRFIA免疫层析法检测AMH试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡和TRFIA分析仪构成。

所述试纸卡，是在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有AMH抗体-荧光微球的结合垫、喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成3-5mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳中形成试纸卡。

所述结合垫上吸附的稀土元素荧光微球，直径范围100-500nm，进一步优选，所选用荧光微球直径是300nm。

所述稀土元素荧光微球标记有稀土元素，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)中的任意一种或几种。进一步优选，所选用稀土元素荧光物为铕螯合物(Europium Chelate)，在基态下稳定，在420nm激发光作用下，能够发射出波长615nm荧光。

所述与荧光微球偶联抗体为两个AMH单克隆抗体混合，识别不同AMH抗原表位；所述检测线的抗体为兔抗AMH多克隆抗体。

所述TRFIA分析仪是一种光学检测系统，可在激发光(350-430nm)作用后，延时100-400uS，再测定发射光(600-650nm)强度。对AMH检测范围为0.1-50ng/mL。

1.制备AMH单克隆抗体-荧光微球

(1)将AMH单克隆抗体加到抗体净化和浓缩离心柱中(Innova Biosciences),按说明书步骤，净化和浓缩CPP抗体，用磷酸盐缓冲液调节AMH单克隆抗体浓度到1.0mg/ml。

(2)用50mmol MES缓冲液(pH6.0)洗涤铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，加入10mmol碳二亚胺(EDC)和20mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，室温下,反应20分钟。

(3)用50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤荧光微球后，复溶荧光微球后，加入净化后AMH抗体，使AMH抗体与荧光微球的质量比为1:30，室温下，反应2小时。

(4)用200mM Tris(pH7.5)终止反应，0.2％BSA，0.01％Tween-20，50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤微球，再复溶AMH抗体-荧光微球。

2.制备吸附AMH单克隆抗体-荧光微球的结合垫

用10mM Tris缓冲液(pH8.0)含0.2％BSA，10％Sucrose,0.2％PEG,0.2％PVP，0.02％Tween20,0.01％NaN3复溶AMH抗体-荧光微球至需要浓度。本发明选用玻璃纤维结合垫，侵泡在,10mmolTris缓冲液(pH8.0)，含0.2％PVP，0.2％PEG,10％Sucrose,0.02％Tween-20，0.01％NaN3)，室温下，1小时，再37℃，烘干5小时。将上述玻璃纤维膜放在Bio-DotXYZ3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，5ul-15ul/cm速度，将AMH单克隆抗体-荧光微球喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

3.制备包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜

用10mM Tris缓冲液(pH8.0)含0.2％BSA，10％Sucrose,0.01％Tween20,0.01％NaN3溶解AMH多克隆抗体和抗鼠IgG抗体至需要浓度，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060三维喷点平台上，用非接触式微定量喷头，0.8-1.5ul/cm速度，将AMH抗体和抗鼠IgG抗体喷到硝酸纤维素膜上，两线间隔4-6mm,37℃烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

4.组装TRFIA免疫层析法检测AMH试纸卡

在底板上依次粘贴预理样品垫、吸附有AMH抗体-荧光微球结合垫、包被有检测线和质控线硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸板，按照要求切割成4mm宽试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡，干燥剂封存备用。

5.建立AMH试纸卡检测AMH浓度方法，步骤如下：

将AMH校准品放室温平衡，取出AMH试纸卡，平放；取50ul校准品，加到样品孔中，加150ul实验液到实验液窗口，反应15-20分钟，用TRFIA分析仪，测定试纸卡中检测线和质控线荧光强度，建立AMH校准品浓度与荧光强度关系曲线，进一步设置TRFIA分析仪浓度与荧光强度相关参数后，获得自动显示AMH浓度检测系统，再测定血清/浆(50ul)或全血(100μ1)中AMH浓度。

具体实施方案所描述是优选实施例，仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明，结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步实验过程：

一.制备Flag-AMH蛋白

(一)提取HGL5细胞RNA

1、用Prigrow IV培养液，加2％胎牛血清(FBS),2％Ultrosr G,1％ITS Plus，1％Penicilin/Streptomycin，在5％CO₂,37℃条件下，培养HGL5细胞

2、收集2X10⁶细胞，离心，5000g，5分钟，去除上清液，获得HGL5细胞

3、用RNeasy Mini kit(QIAGEN)，按说明书步骤，提取HGL5细胞RNA

4、用Nanodrop Spectrophotometer测定RNA浓度

(二)合成cDNA和PCR扩增AMH DNA

1、合成cDNA用随机引物法试剂盒(cDNA synthesis kit,Life Technologies,Inc.)，按说明书步骤，合成cDNA

2、合成AMH引物，引物-1，tttttcatatgcgggacctgcctctcaccag；

引物-2，tttttgtcgactcaccggcagccacactcggtg

3、进行PCR

5x Reaction buffer 10ul

5x High GC enhancer 10ul

10mM dNTP 1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

cDNA 2ul

Q5HF-DNA Polymerase 0.5ul

H2O 25ul

4、PCR条件如下：

重复B-D步骤30次

E.95℃ 1分钟30秒

F.56℃ 1分钟30秒

G.72℃ 6分钟

冷却到25℃，完成PCR

5、吸取6ul PCR产物，进行1％Agarose/TBE凝胶电泳分析，

6、用EB进行DNA染色，紫外线下观察1.6KbDNA条带(孔1和孔2)

7、纯化其余PCR产物，用于构建载体。

(三)构建FastBac-Flag-AMH质粒

1、用NdeI/SalI内切酶(New England Biolabs)切割FastBac-Flag载体DNA和PCR DNA，37℃反应2小时，

2、放在1％Agarose/TBE胶电泳孔中，进行电泳

3、EB进行DNA染色，紫外线下观察1.6kb(PCR产物)和4.6kb(载体)DNA条带，分别切割下DNA条带,分别放到1.5ml微量离心管中

4、用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN),按说明书步骤，提取Agarose条带中DNA

5、用Nanodrop Spectrophotometer测定DNA浓度

6、用T4DNA ligase(New England Biolabs.)，连接PCR DNA片段pFastBac-Flag载体中，在1.5ml微量离心管中加入以下物质

混均，25℃反应4小时，

7、按标准方法把DNA转入感受态细菌(XL10 Gold细菌株)

8、挑选单个菌落，接种到3ml100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃，摇动，过夜

9、用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits(Life Technologies Inc.)按说明书步骤，提取细菌质粒DNA

10、用Nanodrop Spectrophotometer测定DNA浓度

11、内切酶(New England Biolabs)，切割pFastBac-Flag-AMH DNA，37℃,反应2小时，

12、进行1％Agarose/TBE胶电泳，分析结果

13、EB进行DNA染色，紫外线下观察形成DNA条带

14、选出970bp,249bp DNA条带质粒(1-6和8)为FastBac-Flag-AMH阳性质粒

15、用AMH DNA测序引物(tttttcatatgcgggacctgcctctcaccag；

tttttgtcgactcaccggcagccacactcggtg)进行DNA序列测定

16、选择出正确AMH DNA序列的pFastBac-Flag-AMH质粒DNA。

AMP DNA序列(1-1683bp)

(四)制备重组Flag-AMH AcNPV质粒DNA

1、pFastBac-Flag-AMH DNA转入感受态细菌(HD10Bac细菌株)后

2、加LB培养液，37℃，摇动4小时培养细菌

3、取细菌液，涂种在50ug/ml Kanamycin,7ug/ml Gentamicin,10ug/mlTetracycline,100ug/ml X-gal,40ug/ml IPTGLB-琼脂板上，37℃，培养过夜

4、挑选单个白色菌落，接种到3ml 50ug/ml Kanamycin,7ug/ml Gentamicin,10ug/mlTetracyclineLB培养液中，37℃，摇动，培养过夜

5、提取细菌质粒DNA

6、用AMH引物-1,引物-2进行PCR

5x Reaction buffer 10ul

5x High GC enhancer 10ul

10mM dNTP 1ul

25pm/ul引物-11ul

25pm/ul引物-21ul

重组Flag-AMHAcNPV质粒DNA1ul

Q5HF-DNA Polymerase 0.5ul

H2O 25ul

7、PCR条件如下：

8、重复B-D步骤30次

E.95℃ 1分钟30秒

F.56℃ 1分钟30秒

G.72℃ 6分钟

冷却到25℃，完成PCR

9、吸取10ul PCR产物，加3ul 5X DNA loading buffer

10.放在1％Agarose/TBE凝胶电泳孔中，进行电泳

11.用EB进行DNA染色，紫外线下观察1.6kbDNA条带,1,2,3，4，5,6质粒为阳性重组Flag-AMH AcNPV质粒

(五)制备Flag-AMHAcNPV

1、溶液A：6ul重组Flag-AMH AcNPV DNA+100ul TNM-FH液(No FBS，No antibiotics)

2、溶液B：6ul Cellfectin(Invitrogen)+100ul TNM-FH液(No FBS，No antibiotics)

3、混合溶液A和溶液B，用微量移液器轻轻吹吸3次，室温下，放置30分钟后，加800ulTNM-FH液,混匀,成为质粒DNA细胞转染液

4、吸出6孔培养皿中SF9细胞TNM-FH培养液，加2ml TNM-FH液，洗涤SF9细胞一次

5、加质粒DNA细胞转染液到SF9细胞培养皿中，放在摇床上缓慢摇动，室温下，5小时

6、从SF9细胞培养皿吸出DNA细胞转染液，加2.5ml含有10％FBS TNM-FH培养液,28℃，培养3天

7、吸取细胞培养液到离心管中，3000rpm,离心10分钟，收集上清液，做为Flag-AMHAcNPV液。

(六)制备Flag-AMH蛋白

1、培养SF9细胞，感染Flag-AMH AcNPV表达Flag-AMH后,收集细胞

2、加细胞溶解液(20mM Hepes.pH7.5,100mM NaCl,0.5％NP-40,1mM EDTA,1mM DTT,1mM PMSF,10ug/ml leupetine,10ug/ml Aprotinin)裂解SF9细胞

3、在4℃条件下，离心，13000rpm,15分钟，收集上清液

4、Anti-Flag M2affinity agarose(Sigma-Aldrich)与上清液反应1小时，3000rpm离心2分钟，收集Anti-Flag M2affinity agarose，

5、洗涤液(40mM Tris,pH8.0,300mM NaCl,5％Glycerol,0.01％NP-40,1mM EDTA,1mMDTT,1mM PMSF,10ug/ml Leupetine,10ug/ml Aprotinin)洗涤Anti-Flag M2 affinityagarose

6、用洗脱液(0.1M Glycine-HCl,pH3.0)从Anti-Flag M2 affinity agarose洗脱出Flag-AMH

7、将洗脱液转入到透析袋(Spectra/Pro)中，放在透析液(20mM Tris,pH7.5,150mMNaCl,5％Glycerol,1mM DTT,1mM EDTA)中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜

8、收集透析袋中蛋白液，分装后，4℃短期保存，-20℃或-80℃，长期保存。

(七)测定纯化Flag-AMH

A.银染法测定Flag-AMH纯度

1、取10ulFlag-AMH蛋白液，加3ul 4X蛋白加样液(50mMTris，pH 6.8，2％SDS,10％Glycerol,1％β-mercaptoethanol,12.5mM EDTA,0.02％Bromophenol blue),100℃，3分钟

2、加10ul蛋白液样本到10％SDS-PAGE凝胶的孔中，进行电泳

3、完成电泳后，获取SDS-PAGE凝胶，进行标准银染色，结果显示，Flag-AMH纯度达98％以上

B.非变性凝胶测定Flag-AMH双聚体

1. 100ul Flag-AMH，转入到透析袋(Spectra/Pro)中，放在透析液(20mM Tris,pH7.5,150mM NaCl,5％Glycerol,4mM DTT,1mM EDTA)中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜

2.收集透析袋中蛋白液体移到微量离心管中

3.取10ulFlag-AMH，加3ul 4XNative PAGE Sample Buffer(Life Technologies Inc)

4.加10ul蛋白液样本3-12％Native PAGE Bis-Tris Gel(Life Technologies Inc)孔中，进行电泳，120V，2小时

5.完成电泳后，获取Native PAGE Bis-Tris Gel

6.进行标准银染色，结果表明，Flag-AMH形成二聚体达70％以上

C.Westernblotting测定纯化Flag-AMH

1.用PBS 1:20稀释Flag-AMH蛋白液

2. 30ul稀释BSA蛋白液(5ug/ml)和30ul稀释Flag-AMH蛋白液，分别加10ul 4X蛋白加样液,100℃，3分钟

3.加5,10ul稀释蛋白液样本加到10％SDS-PAGE凝胶的孔中，进行电泳，100V，2小时

4.完成电泳后，进行Western blot.

5. 1：4000稀释兔抗AMH多克隆抗体(R&D systems)用1％脱脂牛奶粉-PBS，

6.加1：5000稀释抗兔IgG抗体-HRP(Promega)在1％脱脂牛奶粉-PBS

7.用PBS-Tween20洗涤硝基纤维素膜后

8.加ECL Western blotting底物(Pierce)液到硝基纤维素膜上，反应2分钟

9.用ImageReader LAS-4000(FUJIFILM)测定Westernblot结果

D.Bradford法测定Flag-AMH浓度

1.取1ml浓缩染料试剂(Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate)与3mlH₂O混合均匀

2.制备BSA标准液,浓度分别为0,12.5，25，50，100，200ug/ml

3.加80ul PBS到微量滴定板孔中，加5ul不同浓度BSA标准液，5ul纯化Flag-AMH到微量滴定板孔中，每个样本加3个孔

4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，反应5分钟

5.放微量滴定板到Victor3V 1420MultilabelCounter，选用波长495nm,测定OD值

6.根据BSA浓度标准曲线，计算出Flag-AMH浓度为60ug/ml

BSA ug/ml	0	12.5	25	50	100	200	AMH
								OD	0.326	0.416	0.438	0.514	0.658	0.922	0.522
	0.334	0.418	0.445	0.508	0.651	0.926	0.537
									0.328	0.402	0.412	0.506	0.663	0.902	0.528
Average	0.329333	0.412	0.431667	0.509333	0.657333	0.916667	0.529

二、制备TRFIA免疫层析法检测AMH试剂盒

(一)时间分辨荧光免疫层析法测定AMH试纸卡组成

组装试纸条操作在湿度小于30％，稳定25-30℃的房间进行。测定AMH侧向免疫层析试纸条(图8)包括底板以及沿所述底板长度方向顺次粘覆于底板上的吸水纸(30mm)、硝酸纤维素膜(20mm)、结合垫(10mm)和样品垫(28mm)；其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔的由兔抗AMH抗体涂层形成的检测线和由羊抗鼠IgG抗体涂层形成的质控线，检测线位于结合垫一侧，质控线靠近吸水纸一侧；结合垫喷涂有AMH抗体-铕螯合物荧光微球；吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫以及样品垫之间，依次与相邻部位接触且部分重叠。

本发明实施例中，检测线与质控线平行设置，检测线与质控线之间的距离为5mm。吸水垫位于硝酸纤维素膜靠近质控线一端，且吸水垫一端与硝酸纤维素膜有部分重叠，其重叠部分长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。

结合垫位于硝酸纤维素膜靠近检测线一端；且结合垫一端与硝酸纤维素膜部分重叠，其重叠部分长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。

样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，其重叠部分长度为4mm；样品垫重叠在结合垫上方。将上述组装成试纸板切割成宽度为4mm试纸条。

将上述结构试纸条装入塑料外壳中构成试纸卡(图9)，外壳包括底座和卡盖，卡盖上设置有实验液窗口(8)，加样窗口(9)，检测窗口(10)，露出试纸条局部区域；实验液窗口和加样窗口开口在样品垫(2)上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开口于硝酸纤维素膜(4)上部，以露出全部检测线(5)和质控线(6)。

本发明选用玻璃纤维Fusion5样品垫(GE Healthcare)，侵泡在20mmolTris缓冲液(pH7.5)含0.02％Tween-20，0.02％NaN3，室温下，1小时，再37℃，烘干5小时，干燥封闭，备用。本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫(EMD Millipore)，侵泡在,10mmolTris缓冲液(pH8.0)，含0.2％PVP，0.2％PEG,10％Sucrose,0.02％Tween-20，0.01％NaN3)，室温下，1小时，再37℃，烘干5小时，干燥封闭，备用。

(二)AMH单克隆抗体化学偶联到铕螯合物荧光微球上

本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒(Carboxylated Fluorescent Microspheres)，购于Ocean NanoTech,可选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒直径为100-500nm。

本发明实施例中，选用AMH单克隆抗体(Invitrogen),用InnovaBiosciences公司抗体浓缩和净化离心柱(AbSelect^TMAntibody Concentration and Clean-Up Kit)预处理AMH抗体,步骤如下：

1、加500ul AMH抗体到抗体浓缩和净化离心柱中，

2、离心，15000g 1-4分钟,减少AMH抗体到100ul

3、去除收集管中液体,加400ul20mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到抗体浓缩和净化离心柱中

4、离心，15000g 1-4分钟,减少离心柱中液体积到100ul

5、重复3-4步骤，6次以上

6、吸出抗体浓缩和净化离心柱中约100ulAMH抗体

7、测定AMH抗体浓度，50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)稀释AMH抗体到需要浓度

本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把AMH抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球(直径300nm)上,步骤如下：

1、取0.4mlCarboxylated Fluorescent Microspheres(10mg/ml),直径300nmm，加入1.5ml离心管中，离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

2、再加入1.0ml 50mmolMES缓冲液(pH6.0)到离心管中，悬浮微球

3、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液

4、重复2-3步骤2次

5、再加0.5ml50mmol MES缓冲液(pH6.0)含10mmol碳二亚胺(EDC)和20mmol N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)到离心管中,混均，25℃，反应20分钟

6、离心，10000rpm，6分钟，去除反应液

7、加入1.0ml 50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中

8、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复8-9步骤1次

9、加入0.4ml预处理过AMH抗体(0.3mg/ml)加入到上述离心管中，25℃，反应2小时

10、加入100ul of 0.2M Tris(pH7.5)到离心管中，25℃，反应30分钟

11、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，

12、加入1.0ml 0.2％BSA，0.01％Tween-20 50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.5)到离心管中

13、离心，10000rpm，6分钟，去除上清液，重复13-14步骤2次

14、用10mM Tris缓冲液(pH8.0)含0.2％BSA，10％Sucrose,0.2％PEG,0.2％PVP，0.02％Tween20,0.01％NaN3复溶AMH抗体-荧光微球至需要浓度，4℃储存，备用。

(三).喷涂AMH抗体到结合垫和硝酸纤维素膜上

1.将上述制备AMH抗体-铕螯合物荧光微球液(0.2mg/ml)，用Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，10ul/cm速度，将AMH单克隆抗体-荧光微球喷到玻璃纤维膜上，37℃烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

2.用10mM Tris缓冲液(pH8.0)含0.2％BSA，10％Sucrose,0.01％Tween20,0.01％NaN3溶解AMH多克隆抗体(1.5mg/ml)和抗鼠IgG抗体(0.5mg/ml)，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，1.2ul/cm速度，将AMH抗体和抗鼠IgG抗体喷到硝酸纤维素膜上，两线间隔5mm,37℃,烘干2小时，加入干燥剂封存备用。

(四).TRFIA试纸卡检测AMH浓度操作过程

使用TRFIA试纸卡进行定量检测AMH时，在样品垫窗口上加入校准液和样品液(50ul)，全血为100ul,在毛细现象作用下，样品液向吸水垫方向泳动，当样品液中含有AMH移动到结合垫时，AMH与AMH抗体-荧光微球结合，形成AMH-AMH抗体-荧光微粒复合物，随着层析作用，复合物向前移动，到达硝酸纤维素膜检测线处，此处AMH抗体进一步结合，形成AMH抗体-AMH-AMH抗体-荧光微球夹心复合物，聚集在检测线上；而未结合AMH的AMH抗体-荧光微球继续前移，到达质控线时，此处抗鼠IgG抗体与AMH抗体-荧光微球结合，在质控线处出现抗鼠IgG抗体-AMH抗体-荧光微球复合物聚集。检测线和质控线都会产生相应的荧光信号，使用TRFIA分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，其中发射荧光在延时200us后,测量荧光强度。TRFIA定量测定试纸卡的检测线及质控线上铕螯合物发出荧光强度，并计算出样品中AMH含量。整个反应在15-20分钟内完成。

(五).建立TRFIA分析仪自动显示检测AMH浓度程序

1、建立AMH浓度标准曲线

用PBS,pH7.5,0.02％Tween20,稀释Flag-AMH，制成不同浓度AMH校准品(0，0.5，1，2，5，10，20ng/ml),加50ulAMH校准品到AMH免疫层析试纸卡样品窗口部位，再加150ul实验液(PBS,pH7.4,0.02％Tween20)到实验液窗口，进行膜层析反应，15分钟后，用TRFIA分析仪,选定激发波长420nm,检测波长615nm，延迟测定时间200us，测定试纸条卡检测线及质控线荧光强度。以AMH校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度为横坐标，建立AMH校准品浓度标准曲线，得到方程式，y＝0.3327-2.6598，R²＝0.8597，看图3，通过此标准曲线得到AMH浓度标准卡，作为对样品中所含AMH浓度进行定量分析的基础。

AMH ng/ml	0	0.5	1	2	5	10	20
								荧光强度	0.86	6.35	12.35	20.15	36.37	45.56	56.87
X100000	0.78	7.82	11.68	19.27	31.24	43.42	54.26
									0.68	7.46	10.98	18.45	30.21	46.74	53.59
Average	0.773333	7.21	11.67	19.29	32.60667	45.24	54.90667

输入上述标准卡参数到TRFIA分析仪，建立自动运行系统，TRFIA分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中AMH浓度。

测定0-0.5ng/ml AMH校准品荧光强度,0.05-0.5ng/ml之间有线关系，TRFIA测定0.1ng/ml AMH校准品荧光强度(2.29)与0mg/ml AMH校准品荧光强度(0.81)相差约3倍，确定此试剂盒TRFIA测定AMH敏感度为0.1ng/ml。

AMH ng/ml	0	0.01	0.02	0.05	0.1	0.2	0.5
								荧光强度	0.97	0.66	0.78	0.97	2.33	4.26	6.84
X100000	0.64	0.45	1.11	1.35	2.65	3.87	8.32
									0.82	0.65	0.45	1.42	1.89	4.15	7.58
Average	0.81	0.586667	0.78	1.246667	2.29	4.093333	7.58

2.用TRFIA层析试纸卡检测血清中AMH浓度

加50ul血清样品到测定AMHTRFIA试纸卡加样窗口部位，再加150ul实验液到实验液窗口，进行膜层析反应，15分钟后，用TRFIA分析仪自动检测系统，测定血清样品中AMH浓度，结果如下：

Claims (7)

1.一种建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：包括试纸卡和时间分辨荧光分析仪；所述试纸卡在底板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有AMH抗体-荧光微球的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸板，然后切割成2-5mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料外壳形成试纸卡；所述TRFIA分析仪是一种光学检测系统，可在激发光波长350-430nm作用后，延时100-400uS，发射光波长600-650nm，测定荧光强度；对AMH检测范围为0.1-50ng/mL。

2.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：制备AMH校准品：提取HGL5细胞 RNA，合成HGL5 cDNA基因库，用PCR扩增出AMH DNA（核酸序列1-1683），构建pFastBac-Flag-AMH载体，转导到HD10Bac 细菌中，产生重组Flag-AMH AcNPV（昆虫病毒）质粒；再转导此质粒进到昆虫细胞（SF9细胞），产生重组Flag-AMHAcNPV；此病毒感染SF9细胞后，表达出Flag-AMH蛋白；用Anti-Flag 抗体亲和层析法纯化出自然结构Flag-AMH蛋白，此纯化Flag-AMH蛋白作为校准品。

3.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：制备AMH抗体-荧光微球：选用稀土元素荧光标记羧基修饰微球，稀土元素可以是铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)等中的任意一种或几种；碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)处理羧基修饰荧光微球后，AMH抗体偶联到荧光微球上，AMH抗体与荧光微球重量比为1：50-1：5，用喷膜仪将AMH抗体-荧光微球喷涂于结合垫上，干燥后，封存备用。

4.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：所述稀土元素荧光微球激发光波长是420nm，发射光波长是615nm；荧光微球直径范围是100-500nmn。

5.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：喷涂检测线和质控线：将AMH抗体和抗IgG 抗体浓度调整到0.2-2mg/ml, 膜液量0.5-2ul/cm,将抗体分别喷洒在硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，两线间隔为4-6mm,干燥后，密封备用。

6.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：预处理样品垫和结合垫：本发明选用玻璃纤维样品垫，侵泡在20mmolTris缓冲液（pH7.5）含0.02% Tween-20，0.02% NaN3，室温下，1 小时，再37°C，烘干5小时，干燥封闭，备用；选用玻璃纤维结合垫，侵泡在, 10mmolTris缓冲液（pH8.0），含0.2% PVP，0.2% PEG,10% Sucrose, 0.02% Tween-20，0.01% NaN3)，室温下，1 小时，再37°C，烘干5小时，干燥封闭，备用。

7.权利要求1所述的建立时间分辨荧光免疫层析法检测抗缪勒氏管激素试剂盒，其特征在于：Flag-AMH为校准品，用TRFIA分析仪测定不同浓度AMH校准品试纸卡检测线上呈现荧光强度，制备AMH浓度标准曲线，建立AMH浓度标准卡，输入到TRFIA分析仪，建立TRFIA分析仪自动显示样品中AMH浓度检测系统。