CN106383229A - 乙肝相关性肝细胞癌早期诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速、简便、高诊断敏感度和精准度的乙肝相关性HCC早期诊断的酶联免疫法试剂盒，该试剂盒包括抗Gal‑3BP捕获抗体、抗Gal‑3BP检测抗体、抗AFP捕获抗体和抗AFP检测抗体，可以实现对受试者的血清中Gal‑3BP和AFP表达水平的综合考量，提高了诊断的敏感度和精确度，从而使患者在疾病早期就知晓疾病风险并可以及时采取相应的治疗措施，具有广阔的应用前景。

Description

乙肝相关性肝细胞癌早期诊断试剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断领域，涉及一种乙肝相关性肝细胞癌早期诊断试剂盒。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)作为全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，具有恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强等特点。全球每年新增和死亡的HCC病例中约50％发生在我国。自1975年第一次报道了乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)感染与HCC发生有密切关系之后，陆续有研究证实了全球乙肝表面抗原(HBsAg)阳性人群的分布与HCC的发生有密切关系。我国是慢性乙型病毒性肝炎的高发区，HCC的发生和死亡人群中有一半以上归咎于HBV感染。

HCC发病隐匿，早期诊断较为困难，多数患者临床确诊时已属中晚期，从而丧失了最佳的手术治疗机会。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是目前临床上应用最普遍的HCC诊断标志物，但其敏感度存在一定的局限性，约有超过30％的HCC患者AFP检测结果为阴性。早期诊断是治疗HCC的重要先决条件，因而寻找敏感度更高的新一代HCC早期诊断标志物的需求显得尤为迫切。

半乳糖凝集素3结合蛋白(Galectin-3Binding Protein，Galectin-3BP)作为清道夫受体超家族的一员，是一种富含半胱氨酸的单体糖蛋白，可以影响肿瘤生物学和炎症反应从而在炎性疾病和肿瘤发生过程中均发挥重要作用。据报道，Gal-3BP与HCC的发生密切相关，其表达水平在丙型病毒性肝炎患者以及HCC患者的血清当中升高。我们前期的研究结果表明，Gal-3BP作为怀槐凝集素(Maackiaamurensislectin，MAL)可识别的具有唾液酸结构(N-acetylneuraminic acid，Sialic Acid)修饰的糖蛋白，在乙肝相关性HCC患者的血清中表达水平增高，因此作为一种潜在的HCC诊断标志物，可以通过检测其血清表达水平并联合血清AFP表达水平，判断受试者是否患有乙肝相关性HCC，以期帮助提高乙肝相关性HCC的诊断敏感度和精确度。

发明内容

为了弥补AFP作为HCC诊断标志物敏感度不足，本发明旨在提供一种快速、简便、高诊断敏感度和精准度的乙肝相关性HCC早期诊断方法和酶联免疫法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)试剂盒，可以实现对受试者的血清中Gal-3BP和AFP表达水平的综合考量，提高诊断的敏感度和精确度，从而使患者在疾病早期就知晓疾病风险并可以及时采取相应的治疗措施。

为实现上述目的，本发明提供了一种联合检测血清Gal-3BP和AFP表达水平的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，该试剂盒包括抗Gal-3BP捕获抗体、抗Gal-3BP检测抗体、抗AFP捕获抗体和抗AFP检测抗体；其中，所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体用于分别包被微孔板，所述抗Gal-3BP检测抗体和所述抗AFP检测抗体为生物素标记抗体。本发明的检测原理如图1所示。

进一步地，所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体可以单独的试剂形式存在或以包被在微孔板上的形式存在。

进一步地，所述乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒还包括至少一块微孔板。

在本发明的一种优选实施方式中，所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体分别包被在同一块微孔板的不同微孔内，形成Gal-3BP联合AFP定量检测微孔板。

进一步地，所述乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒还包括封闭剂、血清样本稀释液、标准品、清洗液、显色液、终止液中的至少一种。

优选地，所述封闭剂为含有1％牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)和0.05％NaN₃的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)。

优选地，所述血清样本稀释液为含1mM EDTA、0.5％Triton X-100的PBS溶液，pH7.2-7.4。

优选地，所述标准品分别为50ng/瓶的Gal-3BP和200ng/瓶的AFP。

优选地，所述清洗液为含有0.05％Tween 20的PBS溶液，pH 7.2-7.4。

优选地，所述的显色液为TMB显色液，由显色液A和显色液B组成。

优选地，所述的终止液为2mM硫酸溶液。

进一步地，所述乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒还包括预测模型：

$P=\frac{\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}{1+\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}$

其中，C_Gal-3BP表示血清样本中Gal-3BP的浓度(μg/ml)，C_AFP表示血清样本中AFP的浓度(ng/ml)。

将检测并计算获得的C_Gal-3BP值和C_AFP值带入模型中计算受试者血清样本检测对应的乙肝相关性HCC早期诊断预测模型的P值，该模型区分正常人和乙肝相关性HCC患者的判定值(Cut off)为0.6108，P大于等于0.6108时，判定为乙肝相关性HCC患者，P小于0.6108时，判定为正常人。

本发明试剂盒根据分别以检测Gal-3BP和AFP各标准品光密度(optical density，OD)值分析获得的Gal-3BP和AFP的标准曲线以及各受试者血清样本实际Gal-3BP和AFP的OD值(各受试者血清样本OD值减去空白孔对应OD值)计算出受试者血清样本中Gal-3BP和AFP的浓度。

本发明所述的Gal-3BP蛋白是由前期蛋白质组学及生物化学与分子生物学相关研究工作确定，与健康人相比，其在乙肝相关性HCC患者血清中的表达水平上调。本发明可以同时定量检测并联合分析受试者血清中Gal-3BP和AFP的表达水平，结合检测数据和临床资料的回顾性研究，由此建立乙肝相关性HCC早期诊断模型并应用于乙肝相关性HCC的早期诊断。

本发明主要是建立并优化了Gal-3BP和AFP定量检测ELISA方法，分别确立了Gal-3BP-ELISA和AFP-ELSIA的检测范围和重复性，构建了兼可用于基础性研究和临床血清样本筛查诊断的定量检测系统。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

据报道，AFP作为目前临床上最为广泛应用的HCC患者血清学诊断标志物，其敏感度仅为30.9％-75.0％。本发明首次公开了血清Gal-3BP的表达水平与乙肝相关性HCC的相关关系，并通过ELISA的方法同时检测和联合分析受试者血清中Gal-3BP和AFP的蛋白表达水平，结合对临床资料的回顾分析，建立Gal-3BP联合AFP诊断乙肝相关性HCC的诊断模型并获得受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)及判别值，由此预测和判定乙肝相关性HCC的发生。该模型对乙肝相关性HCC的诊断敏感度和精确度分别为82.50％和88.75％，优于单独使用AFP进行诊断，因而具有广阔的应用前景。

本发明采用Gal-3BP联合AFP定量检测微孔板可以在一块板上同时检测受试者血清中Gal-3BP和AFP的表达水平，简化了操作，提高了检测效率，并尽可能避免了两批次检测带来的操作误差和环境影响。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的检测原理示意图；

图2是本发明一个较佳实施例的Gal-3BP联合AFP定量检测微孔板排布示意图；

图3是Gal-3BP-ELISA的标准曲线图；

图4是AFP-ELISA的标准曲线图；

图5是单独Gal-3BP检测系统构建的ROC曲线图；

图6是单独AFP检测系统构建的ROC曲线图；

图7是Gal-3BP和AFP联合诊断预测模型构建的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1乙肝相关性HCC诊断试剂盒的组成

(1)至少一块微孔板；所述微孔板可包括Gal-3BP联合AFP定量检测微孔板，该微孔板由Gal-3BP-ELISA部分和AFP-ELISA部分组成，其排布方式如图2所示；其中，Gal-3BP-ELISA部分的微孔内包被有抗Gal-3BP捕获抗体，AFP-ELISA部分的微孔内包被有抗AFP捕获抗体；

(2)抗Gal-3BP捕获抗体、抗Gal-3BP检测抗体、抗AFP捕获抗体以及抗AFP检测抗体；

(3)血清样本稀释液：1mM EDTA、0.5％Triton X-100的PBS溶液，pH 7.2-7.4；

(4)标准品：Gal-3BP(50ng/瓶)和AFP(200ng/瓶)；

(5)封闭剂：1％BSA、0.05％NaN₃的PBS溶液，pH7.2-7.4；

(6)清洗液：0.05％Tween 20的PBS溶液，pH7.2-7.4；

(7)显色液：TMB显色液，由显色液A和显色液B组成；

(8)终止液：2mM硫酸溶液；

(9)辣根素过氧化物酶标记链霉亲和素(HRP-streptavidin)。

(10)封板膜及操作说明书；

(11)乙肝相关性HCC早期诊断预测模型：

$P=\frac{\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}{1+\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}$

根据分别以Gal-3BP和AFP各标准品测得的Gal-3BP和AFP的标准曲线以及各受试者血清样本实际OD值(各受试者血清样本OD值减去空白孔对应OD值)计算出受试者血清样本中Gal-3BP的浓度C_Gal-3BP以及AFP的浓度C_AFP。将上述计算获得的C_Gal-3BP和C_AFP带入模型中计算受试者血清样本检测对应的乙肝相关性HCC早期诊断预测模型的P值，该模型区分正常人和乙肝相关性HCC患者的判定值为0.6108，P大于等于0.6108时，判定为乙肝相关性HCC患者，P小于0.6108时，判定为正常人。

实施例2乙肝相关性HCC诊断试剂盒Gal-3BP-ELISA板及AFP-ELISA板的制备和预处理

(1)取空白96孔微孔板一块，上下两部分各48孔，分别用作Gal-3BP-ELISA板和AFP-ELISA板(如图2)；

(2)将所述抗Gal-3BP捕获抗体(2μg/mL)及抗AFP捕获抗体(2μg/mL)分别加入Gal-3BP-ELISA板和AFP-ELISA板，每孔0.1mL，37℃孵育2小时或4℃孵育过夜。

(3)用清洗液清洗上述微孔板，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(4)用封闭剂封闭上述微孔板，200μL/孔，室温封闭1小时；置25-35℃，湿度＜40％的干燥间内干燥20-24小时，得到Gal-3BP-ELISA板和AFP-ELISA板，用于后续操作。

实施例3标准曲线的绘制

用PBS溶解稀释所述Gal-3BP和AFP标准品，使Gal-3BP标准品的浓度分别为：25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL、1.56ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL、0ng/mL，使AFP标准品的浓度分别为：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.313ng/mL、0ng/mL。

检测步骤如下：

(1)编号：将标准品对应微孔按序编号。

(2)加样：分别在相应孔中加入标准品溶液50μL/孔，轻轻振荡混匀。

(3)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育2小时。

(4)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(5)检测试剂：用1％BSA的PBS溶液(pH 7.2-7.4)稀释抗Gal-3BP检测抗体及抗AFP检测抗体分别加入相应孔内，100μL/孔。

(6)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育2小时。

(7)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(8)酶结合物工作液：向相应孔内加入辣根素过氧化物酶标记链霉亲和素HRP-streptavidin(1％BSA的PBS溶液，pH 7.2-7.4，1:10000稀释)，100μL/孔。

(9)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育0.5小时。

(10)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(11)显色：显色前15分钟内将显色液A、B混合，向相应孔内加入混合液200μL/孔，轻轻振荡混匀，室温孵育至液体呈现蓝色。

(12)终止：向相应孔内加终止液50μL/孔，加入顺序与之前操作相同，轻轻振荡混匀，液体呈现黄色。

(13)测定：设定200 Pro NanoQuant(TECAN)酶标仪检测波长450nm，测量各孔OD值。

(14)数据处理：

分别以各标准品的浓度为横坐标轴(X轴)和各标准品的实际OD值(各标准品检测所得OD值减去空白孔对应OD值)为纵坐标轴(Y轴)作图，得到Gal-3BP和AFP的标准曲线，分别如图3、图4所示。

Gal-3BP标准曲线的方程为：

y＝0.0642x+0.1111，相关系数R＝0.9964。

AFP标准曲线的方程为：

y＝0.1018x+0.056，相关系数R＝0.9986。

实施例4血清样本检测

用血清样本稀释液按照1：500的比例稀释各待测血清样本(血清标本来自于广西医科大学附属第一医院及大连医科大学第一附属医院体检中心及肝外科住院病人)。

检测步骤如下：

(1)编号：将样本品对应微孔按序编号。

(2)加样：在Gal-3BP-ELISA板相应孔中加入1：500比例稀释的各待测血清样本；在AFP-ELISA板相应孔中对应加入1：5-20比例稀释的各待测血清样本，轻轻振荡混匀。

(3)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育2小时。

(4)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(5)检测试剂：分别向相应孔内加入抗Gal-3BP检测抗体及抗AFP检测抗体(1％BSA的PBS溶液，pH 7.2-7.4稀释)，100μL/孔。

(6)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育2小时。

(7)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(8)酶结合物工作液：向相应孔内加入辣根素过氧化物酶标记链霉亲和素HRP-streptavidin(1％BSA的PBS溶液，pH 7.2-7.4，1:10000稀释)，100μL/孔。

(9)孵育：用封板膜封板后置于室温孵育0.5小时。

(10)洗涤：甩干孔内液体，用清洗液清洗，300μL/孔，浸泡时间为2分钟/次，共洗四次并拍干孔内残存清洗液。

(11)显色：显色前15分钟内将显色液A、B混合，向相应孔内加入混合液200μL/孔，轻轻振荡混匀，室温孵育至液体呈现蓝色。

(12)终止：向相应孔内加终止液50μL/孔，加入顺序与之前操作相同，轻轻振荡混匀，液体呈现黄色。

(13)测定：设定200 Pro NanoQuant(TECAN)酶标仪检测波长450nm，测量各孔OD值。

注：据相关研究报导，唾液中存在有较高浓度的Gal-3BP，所以全程实验过程中需佩戴口罩，防止污染。

实施例5Gal-3BP联合AFP定量检测诊断乙肝相关性HCC分析

将各受测血清样本检测所得OD值减去空白孔对应OD值，得出受测血清样本实际OD值。将各受测血清样本的Gal-3BP和AFP的实际OD值分别带入对应的Gal-3BP和AFP标准曲线方程，计算获得各受测血清样本中Gal-3BP和AFP的浓度。

参见图2与图3，Gal-3BP-ELISA线性检测范围为0.391ng/mL-25ng/mL；AFP-ELISA线性检测范围为0.313ng/mL-20ng/mL。

参见表1与表2，取3例健康人血清混合样本及3例乙肝相关性HCC患者血清混合样本(血清标本来自于广西医科大学附属第一医院及大连医科大学第一附属医院体检中心及肝外科住院病人，每例均由10例血清样本混合获得)用于检测乙肝相关性HCC诊断试剂盒Gal-3BP-ELISA检测系统与AFP-ELISA检测系统检测结果的重复性，每例混合血清样本重复检测3次，分别计算每例混合血清样本中Gal-3BP(μg/mL)和AFP的浓度平均值(ng/mL)、标准差和变异系数(coefficient of variation，CV)。

表1：Gal-3BP-ELISA检测系统三次重复检测结果

表2：AFP-ELISA检测系统三次重复检测结果

采用实施例1-4中的乙肝相关性HCC诊断试剂盒及检测方法，检测了80例健康人和80例乙肝相关性HCC患者血清中Gal-3BP和AFP的蛋白表达水平。通过AFP标准曲线方程和Gal-3BP标准曲线的方程计算获得受试者血清中Gal-3BP和AFP的浓度。

参见图5与图6，单独Gal-3BP检测系统构建的ROC曲线下面积和单独AFP检测系统构建的ROC曲线下面积分别为0.913和0.897。其中单独Gal-3BP检测系统敏感度为80.00％，准确度为87.50％；单独AFP检测系统敏感度为75.00％，准确度为87.50％。

参见图7，采用SPSS软件Logistic回归分析建立上述Gal-3BP和AFP联合诊断模型。该模型构建的ROC曲线下面积分别为0.928，其区分健康人和乙肝相关性HCC患者的判定值(Cut off)为0.6108，敏感度和准确度分别为82.50％和88.75％。

参见表3，比较了单独Gal-3BP检测系统，单独AFP检测系统及Gal-3BP和AFP联合诊断系统的检测分析结果：

表3：AFP，Gal-3BP及Gal-3BP联合AFP检测结果比较

利用所述乙肝相关性HCC早期诊断方法及试剂盒分析测试集的60例血清(血清标本来自于广西医科大学附属第一医院及大连医科大学第一附属医院肝外科住院病人)中Gal-3BP和AFP的浓度及Gal-3BP联合AFP水平，参考上述判定值，结果显示成功预测了54例患者，准确率为90％。由此，本发明对于肝相关性HCC的诊断具有较高的准确度和重要的基础及临床价值和广阔的应用前景。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于包括抗Gal-3BP捕获抗体、抗Gal-3BP检测抗体、抗AFP捕获抗体和抗AFP检测抗体；其中，所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体用于分别包被微孔板，所述抗Gal-3BP检测抗体和所述抗AFP检测抗体为生物素标记抗体。

2.如权利要求1所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体以单独的试剂形式存在或以包被在微孔板上的形式存在。

3.如权利要求1所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒还包括至少一块微孔板。

4.如权利要求1所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述抗Gal-3BP捕获抗体和所述抗AFP捕获抗体分别包被在同一块微孔板的不同微孔内，形成Gal-3BP联合AFP定量检测微孔板。

5.如权利要求1所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于还包括封闭剂、血清样本稀释液、标准品、清洗液、显色液、终止液中的至少一种。

6.如权利要求1所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于还包括预测模型：

$P=\frac{\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}{1+\exp (-12.250+0.954\×C_{Gal-3BP}+0.588\×C_{AFP})}$

其中，C_Gal-3BP表示血清样本中Gal-3BP的浓度，C_AFP表示血清样本中AFP的浓度；该模型区分正常人和乙肝相关性HCC患者的判定值为0.6108。

7.如权利要求5所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述封闭剂为含有1％牛血清白蛋白和0.05％NaN₃的磷酸缓冲盐溶液。

8.如权利要求5所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述血清样本稀释液为含1mM EDTA、0.5％Triton X-100的PBS溶液，pH 7.2-7.4。

9.如权利要求5所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述标准品分别为50ng/瓶的Gal-3BP和200ng/瓶的AFP。

10.如权利要求5所述的乙肝相关性HCC早期诊断试剂盒，其特征在于所述清洗液为含有0.05％Tween 20的PBS溶液，pH 7.2-7.4。