CN109270268A - 一种组织多肽抗原tpa检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法，包括以下组分：TPA包被板条、TPA标准品及质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。本发明还涉及TPA检测试剂盒的制备及使用方法。本发明中检测试剂盒具有高灵敏度、高敏感性、特异性和较宽的线性范围，将其用来检测TPA可大大提高检测率。

Description

一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及免疫检测分析技术领域，具体涉及一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术
组织多肽抗原(TPA)的分子量17,000-43,000，由B1、B2和C三个亚基组成，其活性主要在B1。TPA主要存在于胎盘和大部分肿瘤组织中，各种恶性肿瘤(卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、睾丸肿瘤等)患者血清TPA的检出率(以>130U/L血清为阳性)可从20％至90％，有人认为高达80％-100％，它的存在与肿瘤发生部位、组织类型均无相关性,,然而在观察疗效上则有较高的敏感性。
TPA最早于1957年在恶性肿瘤组织中被发现。目前认为TPA属于细胞骨架蛋白类，与细胞内的中间丝状体，细胞分裂素具同源性。在体外实验中，抗TPA抗体可与细胞分裂素8，18和19起抗原抗体反应。体外培养时有丝分裂期间的增殖细胞TPA分泌活跃，因此血液内TPA水平与细胞分裂增殖程度密切相关，恶性肿瘤细胞分裂，增殖活跃，所以血清中TPA水平增高，临床上常用于迅速增殖的恶性肿瘤的辅助诊断，特别是已知肿瘤的疗效监测。
组织多肽抗原升高见于肺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性肝炎、胰腺炎、肺炎、消化道肿瘤，另外，正常人阳性率4.7％，但有相当一部分非恶性肿瘤患者血清中有TPA存在，其阳性率约为14％-35％，以下呼吸道、肝胆及尿路感染者多见，故TPA亦非肿瘤所特有的标志。在恶性肿瘤者中，TPA的增高往往是持续性的，因此，若进行连续监测，常常有利于恶性肿瘤与非恶性病变的鉴别。
TPA作为一项肿瘤标志尚有以下临床意义：肿瘤患者术前TPA增高非常显著者，常提示预后不良；经治疗病情好转后，TPA量再次增高，提示有肿瘤复发；与CEA同时检测可明显提高乳腺癌诊断的正确性，有腹于恶性与非恶性乳腺病变之间的鉴别诊断。
恶性肿瘤患者血清TPA水平可显著升高。经治疗好转后，TPA水平降低；若TPA再次增高，提示有肿瘤复发。TPA与CEA同时检测可有利于恶性与非恶性乳腺病的鉴别诊断。80％的卵巢癌患者血中TPA升高。此外，肺癌、急性肝炎、胰腺炎、肺炎等TPA水平也可增高。
目前组织多肽抗原的检测方法主要有酶联免疫法、放射免疫分析法等，然而这些方法具有线性范围窄，检测时间长等缺点，无法满足临床需求，因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明的第一个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种可定量检测、高灵敏度、高敏感性、高特异性的组织多肽抗原TPA检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒及其制备和使用方法，所述试剂盒包括以下组分：TPA包被板条、TPA标准品及质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B，所述TPA包被板条为包被有TPA抗体的化学发光板，所述TPA抗体为鼠源的单克隆抗体，所述TPA抗体的包被浓度为1-5μg/mL；所述TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体，所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000-1:3000的比例稀释；所述TPA标准品及质控品均由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，所述TPA抗体的包被浓度为3μg/mL；所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2500的比例稀释；所述浓缩洗涤液为pH7.4磷酸盐缓冲液，且每1L磷酸盐缓冲液中还含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.4％-0.6％v/v Proclin-300；所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g、KCl 6.0g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备TPA包被板条
用pH7.4的磷酸盐缓冲液将TPA单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被缓冲溶液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置22-24h，将TPA单克隆抗体吸附于微孔板上，再用步骤(1)中浓缩洗涤液稀释后进行洗涤、用封闭液进行封闭和保护，经过干燥制得TPA包被板条；
(3)配制TPA标准品和质控品
用标准品稀释液将TPA标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量标准品；用标准品稀释液将TPA标准品稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
(4)配制TPA酶结合物
将辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液稀释按照1:2000-1:3000的比例配制；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g进行配制；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.15-0.3ml进行配制；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、标准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B进行分装。
作为一种优选的技术方案，所述步骤(3)中标准品稀释液为pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液，且每1LTris-HCl缓冲溶液中还含有8-12g牛血清白蛋白。
作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g酪蛋白、9-11％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0g的酶稳定剂。
本发明的第三个目的在于是：针对现有技术存在的不足，提供一种检测组织多肽抗原的检测方法。
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟；
(2)加样检测
S1.将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2.将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3.根据TPA标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4.取TPA标准品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5.取50μL TPA酶结合物加入各孔，用振荡器振荡25-30秒，盖上封板膜，置37℃水浴25分钟；
S6.取出微孔板，用应用洗涤液洗板3-5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7.根据使用量，将发光底物液A、B按1:1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20-25秒，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果；
(3)检测结果
根据各标准品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线即可计算出样本中TPA的浓度。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明试剂盒是将双抗体夹心法免疫测定原理与酶标记技术和酶催化化学发光免疫分析相结合的定量检测产品，由于本发明试剂盒体系中所采用的各溶液配方和各组分的制备方法均是该反应体系下的最优方案，为试剂盒的检测性能和使用有效期提供了有力保障，使得本发明试剂盒具有较宽的线性范围，在0.05ng/mL～20ng/mL之间成良好的线性关系；检测灵敏度小于0.1ng/mL，而且批内和批间差均符合检测标准，准确程度优于目前市场上其它类型的TPA试剂盒，检测时间与目前市场上其它类型的TPA试剂盒相比至少缩短了20分钟，大大提高了检测效率。
(2)本发明试剂盒具有无创、灵敏度高、线性范围宽、特异性好、准确性高(相关性r为0.9995)等优点，而且能够对TPA进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒，包括以下组分：TPA包被板条、TPA标准品及质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B。其中TPA包被板条为包被有抗TPA单克隆抗体的化学发光板，抗TPA抗体为鼠源的单克隆抗体，抗TPA抗体的包被浓度为1-5μg/mL(优选包被浓度为3μg/mL)；TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体，TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000-1:3000的比例稀释(优选工作浓度为1:2500)；TPA标准品由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；TPA质控品由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
浓缩洗涤液为含有0.15％v/v吐温20和0.5％v/v Proclin-300的pH7.4磷酸盐缓冲液。
发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.05g、对位碘酚0.0075g；发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、过氧化氢0.25ml。
实施例2
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g，用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备TPA包被板条
用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗TPA单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被缓冲溶液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置22-24h，将抗TPA单克隆抗体吸附于微孔板上，再用步骤(1)中浓缩洗涤液进行洗涤、用封闭液(具体配制：称量NaCl 9.0g、Na2HPO4.12H2O29.0g、NaH2PO4.2H2O 2.96g、100g蔗糖加入容量瓶，先适量纯水溶解，量取100mL小牛血清、0.3Proclin-300加入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得封闭液)进行封闭保护，经过干燥制得TPA包被板条；
(3)配制TPA标准品和质控品
用标准品稀释液将TPA标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量标准品；用标准品稀释液将TPA标准品稀释成0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
其中标准品稀释液的配制：称取6.057g Tris溶于1L纯水中，用盐酸调节pH为7.5；称取10g牛血清白蛋白溶于1L的Tris-HCl缓冲液中
(4)配制TPA酶结合物
用酶结合物稀释液将辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体溶液稀释配制为1:2000-1:4000的工作浓度；
其中酶结合物稀释液的配制：准确称量NaCl 9.0g、Na2HPO4.12H2O 29.0g、NaH2PO4.2H2O 2.96g加入容量瓶，先加适量纯水，轻摇使之溶解完全，称量10g酪蛋白、0.5g酶稳定剂，量取100ml小牛血清、0.3ml Proclin-300，轻摇，使之完全混匀，以纯水定容至1000mL；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.05g、对位碘酚0.0075g进行配制；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.5g、三羟甲基氨基甲烷1.5g、过氧化氢0.25ml进行配制；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、标准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B进行分装。
实施例3
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测。
(2)加样检测步骤
S1、将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2、将浓缩洗涤液按1：40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3、根据TPA标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4、直接取TPA标准品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5、取50μL TPA酶结合物加入各孔，用振荡器振荡30秒，盖上封板膜，置37℃水浴60分钟；
S6、取出微孔板，用应用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7、根据使用量，将底物液A、B按1：1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟测定结果。
(3)检测结果
根据各标准品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线。最后根据标准曲线即可计算出样本中TPA的浓度。
(4)结果分析
正常参考值:＜2.8ng/mL。
实施例4
一种多肽组织抗原TPA检测试剂盒的主要产品性能指标为：
(1)试剂盒的最低检测限(灵敏度)
10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限，本试剂盒的最低检测限指标检测结果见表1。
表1试剂盒最低检测限的测定
结论：测定的TPA样本稀释液的平均发光值M＝1659.50，SD＝724.96，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.029ng/mL(<0.1ng/mL)，符合要求。
(2)试剂盒的剂量-反应曲线的线性1
复孔测定试剂盒的标准品(S0-S5，浓度依次为0、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL)，用四参数进行拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900；本试剂盒的剂量-反应曲线的线性检测结果见表2。
表2试剂盒剂量-反应曲线的线性
结论：测定的TPA剂量-反应曲线线性相关系数(r)为：0.9996(>0.9900)，符合要求。
(3)试剂盒的准确度
检测浓度为2ng/mL和10ng/mL的标准品，每浓度标准品检测3次，计算测定结果的均值M，测定值与靶值的相对偏差(Bias％)应不超过15.0％，本试剂盒的准确度检测结果见表3。
表3试剂盒的准确度
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL准确度标准品的相对偏差(Bias％)分别为：4.00％和5.20％(均<15.0％)，符合要求。
(4)试剂盒的精密度
a.分析内精密度：浓度分别为2ng/mL和10ng/mL的标准品重复检测，其变异系数(CV)均应不高于15.0％；本试剂盒的分析内精密度检测结果见表4。
表4试剂盒分析内精密度的测定
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CV
2ng/mL 1.91 1.89 1.99 2.02 2.15 2.2 1.92 2.11 2.21 2.07 5.84％
10ng/mL 10.21 10.26 9.98 9.15 10.04 10.17 9.87 9.92 10.44 10.32 3.59％
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度标准品的分析内变异系数(CV)分别为：5.84％和3.59％(均<15.0％)，符合要求。
b、分析间精密度：同一批号试剂盒，用浓度分别为2ng/mL和10ng/mL的标准品检测，3次独立分析，其变异系数(CV)均应不高于20.0％；本试剂盒的分析间精密度检测结果见表5。
表5试剂盒分析间精密度的测定
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度标准品的分析间变异系数(CV)分别为：6.45％和3.29％(均<20.0％)，符合要求。
c、批间精密度：用3个批号的试剂盒分别检测浓度为2ng/mL和10ng/mL的标准品，各重复10次，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)均应不高于20.0％。本试剂盒的分析间精密度检测结果见表6。
表6试剂盒批间精密度的测定
结论：测定的2ng/mL和10ng/mL精密度标准品的批间变异系数(CV)分别为：5.91％和3.32％(均<20.0％)，符合要求。
通过上述检测结构可以得出，本发明设计的一种TPA蛋白检测试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等各项质量参数均处于领先地位。
实施例5
一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的临床检测实例如下：
采用本发明试剂盒进行检测，总共检测样本240例。其中阳性样本约80例(用索灵诊断产品(上海)有限公司的TPA检测试剂盒(直接化学发光法)确诊为TPA阳性的血清样本)；阴性样本约160例，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)，检测结果见表7。
表7TPA考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,239，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
TPA考核试剂与对比试剂阳性符合率为97.46％，阴性符合率为98.75％，总符合率为98.33％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：TPA包被板条、TPA标准品及TPA质控品、TPA酶结合物、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B；所述TPA包被板条为包被有抗TPA单克隆抗体的化学发光板，所述抗TPA单克隆抗体为鼠源的单克隆抗体，所述抗TPA单克隆抗体的包被浓度为1-5μg/mL；所述TPA酶结合物为辣根过氧化酶标记的与包被配对的另一株TPA单克隆抗体，所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2000-1:3000的比例稀释；所述TPA标准品及TPA质控品分别由TPA标准品和标准品稀释液配制而成，所述TPA标准品的浓度分别为0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；所述TPA质控品的浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；所述TPA抗体的包被浓度为3μg/mL；所述TPA酶结合物的浓度按照其与酶结合物稀释液1:2500的比例稀释；所述浓缩洗涤液为pH7.4的磷酸盐缓冲液，每1L磷酸盐缓冲液中含有0.1％-0.2％v/v吐温-20和0.4％-0.6％v/v Proclin-300；所述发光底物液A为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06和对位碘酚0.006-0.008g；所述发光底物液B为每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g和过氧化氢0.15-0.3ml。
2.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)配制浓缩洗涤液
称取NaCl 240g、Na2HPO4.12H2O 107.4g、NaH2PO4.2H2O 8.1g用纯水溶解，再量取1.5mL吐温-20、5mL Proclin-300分别放入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000mL，即得浓缩洗涤液；
(2)制备TPA包被板条
用pH7.4的磷酸盐缓冲液将抗TPA单克隆抗体稀释至浓度为1-5μg/mL作为包被缓冲溶液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3-3.5h后在2～8℃条件下静置24h，将抗TPA单克隆抗体吸附于微孔板上，再用步骤(1)中浓缩洗涤液稀释后进行洗涤、用封闭液进行封闭和保护，经过干燥制得TPA包被板条；
(3)配制TPA标准品品和TPA质控品
用标准品品稀释液将TPA标准品按比例稀释成0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，建立定量标准品；用标准品稀释液将TPA标准品稀释成2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的系列浓度，建立定量质控品；
(4)配制TPA酶结合物
将辣根过氧化酶标记的TPA单克隆抗体溶液与酶结合物稀释液按照1:2000-1:3000的比例配制；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B
发光底物液A：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、3-氨基邻苯二甲酰肼0.03-0.06g、对位碘酚0.006-0.008g进行配置；
发光底物液B：按照每250ml溶液含有N,O-双三甲硅基乙酰胺2.3-2.6g、三羟甲基氨基甲烷1.3-1.6g、过氧化氢0.15-0.3ml进行配置；
(6)将所述步骤(1)、(3)、(4)和(5)中配制的酶结合物、标准品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B进行分装。
3.根据权利要求2所述的一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中标准品稀释液为pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液，且每1LTris-HCl缓冲溶液中还含有8-12g牛血清白蛋白。
4.根据权利要求2所述的一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中酶结合物稀释液为pH7.5的PBS缓冲液，且每1LPBS缓冲液中还含有8-11g酪蛋白、9-11％v/v的小牛血清、0.02-0.04％v/v的Proclin-300和0.3～1.0g的酶稳定剂。
5.一种组织多肽抗原TPA检测试剂盒的使用方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟；
(2)加样检测
S1.将在冷藏环境中贮存的试剂室温平衡15分钟以上；
S2.将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
S3.根据TPA标准品、质控品及待测标本确定所需孔数；
S4.取TPA标准品、质控品及样本各50μL加入相应孔内；
S5.取50μL TPA酶结合物加入各孔，用振荡器振荡25-30秒，盖上封板膜，置37℃水浴25分钟；
S6.取出微孔板，用应用洗涤液洗板3-5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
S7.根据使用量，将发光底物液A、B按1:1混匀，每孔加入100μL，用振荡器振荡20-25秒，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果；
(3)检测结果
根据各标准品溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；或采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线；最后根据标准曲线即可计算出样本中TPA的浓度。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111077321A (zh) * 2020-01-02 2020-04-28 北京森美希克玛生物科技有限公司 抗mcv抗体定量检测试剂盒及其制备方法
CN115792229A (zh) * 2022-01-28 2023-03-14 华中科技大学同济医学院附属同济医院 鼻分泌物中tPA在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用

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