CN104569396A - 肝癌诊断试剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肝癌诊断试剂及其用途。具体而言，发明涉及TGFβ1或TGFβ1与甲胎蛋白或TGFβ1与其它常规肝癌检测指标之一或多种的组合或TGFβ1与甲胎蛋白以及其它常规肝癌检测指标之一或多种的组合在制备诊断肝癌的试剂中的用途。发明的TGFβ1肝癌诊断标志物单指标使用即可分区肝癌组和正常组，基区分肝癌组和其它癌症组以及肝癌组和肝炎组，与其它常规肝癌检测指标联合使用则效果更佳。
Description
技术领域
本发明涉及肝癌诊断试剂及其用途。具体而言，本发明涉及TGFβ1或TGFβ1与其它常规肝癌检测指标的组合在制备诊断肝癌的试剂中的用途。
背景技术
肝癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一，其中90％为肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)。在世界范围内，其发病率呈现上升的趋势。我国是肝癌大国，也是全球肝癌发病率最高的国家。据统计，目前我国肝癌发病人数占全球的55％，而死亡人数约占全世界肝癌死亡人数的45％，因此，肝癌在我国素有“癌中之王”的称号，对我国人民健康构成严重威胁。肿瘤的发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络。目前临床上主要使用甲胎蛋白(AFP)作为肝癌患者的诊断标志物。80％的原发肝癌患者血清中AFP>400ng/ml，但也有近20％肝癌患者AFP含量较低；此外，有些非肝癌患者，尤其是部分病毒性肝炎、肝硬化等患者，他们的AFP含量也偏高，产生假阳性，造成误诊。
近年来研究发现，肝脏转化生长因子β1(TGFβ1)可诱发肝癌起始细胞和促进肝癌发生。在大鼠肝癌发生过程中以及HCCs患者身上，肝脏祖细胞(liverprogenitorcells，或LPCs)可检测到肿瘤起始细胞(Tumor-initiating cell,或T-IC)标志物的共表达，而且TGFβ1的水平与T-IC标志物的表达量呈正相关，这表明TGFβ1在T-IC的形成过程中发挥了重要的作用。但是到目前为止，仍未将TGFβ1的表达水平与临床肝癌诊断建立联系，主要原因包括：1)在多种癌症或者代谢疾病中TGFβ1表达量提高，特别是TGFβ1在结直肠癌、肺癌等其它肿瘤，以及心衰、炎症等疾病情况下也会升高；2)肝癌病因复杂，病程长，仅仅依赖TGFβ1作为诊断标志物，很难准确区分肝炎患者，容易导致误诊、漏诊等问题。因此，本领域仍然存在对能够准确、及时诊断肝癌的试剂的需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及TGFβ1或其与甲胎蛋白(AFP)的组合或其与其它常规肝癌检测指标物的组合或其与AFP和其它常规肝癌检测指标物的组合在制备诊断受试者肝癌的试剂中的用途。
在一些实施方案中，所述其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶的一种、多种或全部。
在一些实施方案中，所述其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素和γ-谷氨酰转移酶。
在一些实施方案中，TGFβ1是蛋白或mRNA。
在一些实施方案中，TGFβ1或其与甲胎蛋白(AFP)或其与其它常规肝癌检测指标物的组合或其与AFP和其它常规肝癌检测指标物的组合可以将肝癌患者与正常人区分开、将肝癌患者与其它癌症患者区分开、将肝癌患者与肝炎患者区分开，优选地，其它癌症患者选自胃癌、肺癌、直肠癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫内膜癌、骨髓癌、宫颈癌、淋巴癌、恶性畸胎瘤和胰腺癌。
在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，肝癌是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，试剂是试剂盒，其包含用于检测TGFβ1和/或甲胎蛋白(AFP)和/或一种或多种其它常规肝癌检测指标物的成分。
本领域技术人员知晓，上述实施方案中所述的TGFβ1或其与甲胎蛋白(AFP)的组合或其与其它常规肝癌检测指标物的组合或其与AFP和其它常规肝癌检测指标物的组合在制备诊断受试者肝癌的试剂中的用途并非指所述TGFβ1、AFP、其它常规肝癌检测指标物本身直接作为检测物用于检测肝癌，而是指使用用于检测TGFβ1、AFP、其它常规肝癌检测指标物的试剂来诊断、区分肝癌。当用于诊断、区分肝癌时，单独使用时，组织样品中TGFβ1的含量高于16000pg/mL表明受试者患有肝癌，优选地，高于16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，更优选地，高于20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL；联合使用时，TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆红素含量在8μmol/L以上，优选地，8.5μmol/L，9μmol/L，9.5μmol/L以上，更优选地，10μmol/L，10.5μmol/L，11μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18000pg/mL以上，优选地，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，更优选地，22500pg/mL，23000pg/mL，23500pg/mL以上，γ-谷氨酰转移酶含量在28U/L以上，优选地，29U/L，30U/L，31U/L，32U/L，33U/L，34U/L以上，更优选地，35U/L，36U/L，37U/L，38U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL以上，14500pg/mL以上，15000pg/mL以上，15500pg/mL以上，16000pg/mL以上，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL以上，白球比在1.2以下，优选地，1.1以下，更优选地，1.0以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18400pg/mL以上，优选地，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL，22500pg/mL以上，更优选地，23000pg/mL，23500pg/mL，24000pg/mL以上，胆碱酯酶含量在8400U/L以下，优选地，8200U/L，8000U/L，7800U/L，7600U/L，7400U/L，7200U/L以下，更优选，7000U/L，6800U/L，6600U/L，6400U/L，6200U/L，6000U/L以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL以上，腺苷脱氨酶含量在7U/L以上，优选地，7.5U/L，8U/L，8.5U/L以上，更优选地，9U/L，9.5U/L，10U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16800pg/mL以上，优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL以上，更优选地，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆汁酸含量在3.2μmol/L以上，优选地，3.4μmol/L，3.6μmol/L，3.8μmol/L以上，更优选地，4μmol/L，4.2μmol/L，4.4μmol/L，4.6μmol/L，4.8μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，AST同工酶含量在4.8U/L以上，优选地，5.0U/L，5.2U/L，5.4U/L，5.6U/L，5.8U/L以上，更优选地，6U/L，6.2U/L，6.4U/L，6.6U/L，6.8U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，优选地，13500pg/mL，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL3 -->
以上，更优选地，16300pg/mL，16500pg/mL，17000pg/mL以上，AFP含量在88μg/L以上，优选地，90μg/L，95μg/L，100μg/L，105μg/L以上，更优选地，110μg/L，115μg/L，120μg/L以上，则表明受试者患有肝癌而非肝炎；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL以上，而且总胆红素含量在8.8μmol/L以上，优选地，9.2μmol/L，9.5μmol/L，10μmol/L，10.5μmol/L以上，更优选地，11μmol/L，11.5μmol/L，12μmol/L以上，而且γ-谷氨酰转移酶在44U/L以上，优选地，46U/L，48U/L，50U/L，52U/L以上，更优选地，55U/L，57U/L，60U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者。所述试剂可以包含肝癌、肝炎和/或其它癌症样品的阳性对照，该阳性对照可以体现上述区分肝癌、正常人群、其它癌症患者和肝炎患者的相应数据指标。同时，请注意，本发明上述内容中，涉及数值限定的部分中，不管是数值的增加还是减少，其增加或减少的幅度均以所述数值的最小计量单位(即数值的最后一位)为准，例如，如果TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，则表明，符合所述要求的TGFβ1的含量可以为13001pg/mL，13002pg/mL…13005pg/mL…13010pg/mL…13100pg/mL等；如果AST同工酶含量在4.8U/L以上，则表明，符合所述要求的AST同工酶含量可以为4.9U/L，5.0U/L，5.1U/L…；如果白球比在1.2以下，则表明，符合所述要求的白球比可以为1.1，1.0，0.9…。这样的数值范围也都包括在本发明的范围内。
本发明的第二方面涉及一种诊断受试者肝癌的方法，其包括步骤：
a)任选地，获得待测受试者的组织样品；
b)检测组织样品中TGFβ1的含量；
c)任选地，检测AFP的含量；
d)任选地，检测其它常规肝癌检测指标物的含量；
e)任选地，得出待测受试者是否罹患肝癌，
其中单独使用时，组织样品中TGFβ1的含量高于16000pg/mL，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，更优选地，高于20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL，表明受试者患有肝癌。
在一些实施方案中，组织样品选自血液、组织液、唾液、尿液。
在一些实施方案中，组织样品是血液。
在一些实施方案中，TGFβ1的含量是指TGFβ1蛋白的含量，优选地，利用ELISA检测TGFβ1蛋白的含量。
在一些实施方案中，TGFβ1的含量是指TGFβ1mRNA的含量，优选地，利用NorthernBlotting或定量RT-PCR检测TGFβ1mRNA的含量并将该含量换算为相应的蛋白含量。
在一些实施方案中，联合使用时，TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，优选地，13500pg/mL，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL以上，更优选地，16300pg/mL，16500pg/mL，17000pg/mL以上，AFP含量在88μg/L以上，优选地，90μg/L，95μg/L，100μg/L，105μg/L以上，更优选地，110μg/L，115μg/L，120μg/L以上，则表明受试者患有肝癌而非肝炎。
在一些实施方案中，其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶的一种、多种或全部。
在一些实施方案中，其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素和γ-谷氨酰转移酶。
在一些实施方案中，通过该方法可以将肝癌患者与正常人区分开、将肝癌患者与其他癌症患者区分开、将肝癌患者与肝炎患者区分开，优选地，其他癌症患者选自胃癌、肺癌、直肠癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌、脑癌、卵巢癌、子宫内膜癌、骨髓癌、宫颈癌、淋巴癌、恶性畸胎瘤和胰腺癌。
在一些实施方案中，联合使用时，TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆红素含量在8μmol/L以上，优选地，8.5μmol/L，9μmol/L，9.5μmol/L以上，更优选地，10μmol/L，10.5μmol/L，11μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18000pg/mL以上，优选地，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，更优选地，22500pg/mL，23000pg/mL，23500pg/mL以上，γ-谷氨酰转移酶含量在28U/L以上，优选地，29U/L，30U/L，31U/L，32U/L，33U/L，34U/L以上，更优选地，35U/L，36U/L，37U/L，38U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL以上，14500pg/mL以上，15000pg/mL以上，15500pg/mL以上，16000pg/mL以上，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL以上，白球比在1.2以下，优选地，1.1以下，更优选地，1.0以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18400pg/mL以上，优选地，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL，22500pg/mL以上，更优选地，23000pg/mL，23500pg/mL，24000pg/mL以上，胆碱酯酶含量在8400U/L以下，优选地，8200U/L，8000U/L，7800U/L，7600U/L，7400U/L，7200U/L以下，更优选，7000U/L，6800U/L，6600U/L，6400U/L，6200U/L，6000U/L以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL以上，腺苷脱氨酶含量在7U/L以上，优选地，7.5U/L，8U/L，8.5U/L以上，更优选地，9U/L，9.5U/L，10U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16800pg/mL以上，优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL以上，更优选地，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆汁酸含量在3.2μmol/L以上，优选地，3.4μmol/L，3.6μmol/L，3.8μmol/L以上，更优选地，4μmol/L，4.2μmol/L，4.4μmol/L，4.6μmol/L，4.8μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，AST同工酶含量在4.8U/L以上，优选地，5.0U/L，5.2U/L，5.4U/L，5.6U/L，5.8U/L以上，更优选地，6U/L，6.2U/L，6.4U/L，6.6U/L，6.8U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，优选地，13500pg/mL，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL以上，更优选地，16300pg/mL，16500pg/mL，17000pg/mL以上，AFP含量在88μg/L以上，优选地，90μg/L，95μg/L，100μg/L，105μg/L以上，更优选地，110μg/L，115μg/L，120μg/L以上，则表明受试者患有肝癌而非肝炎；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL以上，而且总胆红素含6 -->
量在8.8μmol/L以上，优选地，9.2μmol/L，9.5μmol/L，10μmol/L，10.5μmol/L以上，更优选地，11μmol/L，11.5μmol/L，12μmol/L以上，而且γ-谷氨酰转移酶在44U/L以上，优选地，46U/L，48U/L，50U/L，52U/L以上，更优选地，55U/L，57U/L，60U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者。同时，请注意，本发明上述内容中，涉及数值限定的部分中，不管是数值的增加还是减少，其增加或减少的幅度均以所述数值的最小计量单位(即数值的最后一位)为准，例如，如果TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，则表明，符合所述要求的TGFβ1的含量可以为13001pg/mL，13002pg/mL…13005pg/mL…13010pg/mL…13100pg/mL等；如果AST同工酶含量在4.8U/L以上，则表明，符合所述要求的AST同工酶含量可以为4.9U/L，5.0U/L，5.1U/L…；如果白球比在1.2以下，则表明，符合所述要求的白球比可以为1.1，1.0，0.9…。这样的数值范围也都包括在本发明的范围内。
在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，肝癌是肝细胞肝癌。
本发明的第三方面涉及一种肝癌诊断试剂盒，其包含诊断TGFβ1含量的试剂，任选地，其还包含检测AFP和/或其它常规肝癌检测指标物的试剂。
在一些实施方案中，诊断TGFβ1含量的试剂为诊断TGFβ1蛋白含量的试剂，优选地，该试剂为诊断TGFβ1蛋白含量的ELISA试剂。
在一些实施方案中，诊断TGFβ1含量的试剂为诊断TGFβ1mRNA含量的试剂，优选地，该试剂为诊断TGFβ1mRNA含量的Northern Blotting试剂或定量RT-PCR试剂。
在一些实施方案中，其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶的一种、多种或全部。
在一些实施方案中，其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素和γ-谷氨酰转移酶。
在一些实施方案中，受试者是人类。
在一些实施方案中，肝癌是肝细胞肝癌。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括肝癌、肝炎和/或其它癌症样品的阳性对照，该阳性对照可以体现区分肝癌、正常人群、其它癌症患者和肝炎患者的相应数据指标。所述指标指，当用于诊断、区分肝癌时，单独使用时，组织样品中TGFβ1的含量高于16000pg/mL表明受试者患有肝癌，优选地，高于16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，更优选地，高于20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL；联合使用时，TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆红素含量在8μmol/L以上，优选地，8.5μmol/L，9μmol/L，9.5μmol/L以上，更优选地，10μmol/L，10.5μmol/L，11μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18000pg/mL以上，优选地，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，更优选地，22500pg/mL，23000pg/mL，23500pg/mL以上，γ-谷氨酰转移酶含量在28U/L以上，优选地，29U/L，30U/L，31U/L，32U/L，33U/L，34U/L以上，更优选地，35U/L，36U/L，37U/L，38U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL以上，14500pg/mL以上，15000pg/mL以上，15500pg/mL以上，16000pg/mL以上，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL以上，白球比在1.2以下，优选地，1.1以下，更优选地，1.0以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在18400pg/mL以上，优选地，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL，22500pg/mL以上，更优选地，23000pg/mL，23500pg/mL，24000pg/mL以上，胆碱酯酶含量在8400U/L以下，优选地，8200U/L，8000U/L，7800U/L，7600U/L，7400U/L，7200U/L以下，更优选，7000U/L，6800U/L，6600U/L，6400U/L，6200U/L，6000U/L以下，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL以上，腺苷脱氨酶含量在7U/L以上，优选地，7.5U/L，8U/L，8.5U/L以上，更优选地，9U/L，9.5U/L，10U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16800pg/mL以上，优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL，20000pg/mL，20500pg/mL以上，更优选地，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，总胆汁酸含量在3.2μmol/L以上，优选地，3.4μmol/L，3.6μmol/L，3.8μmol/L以上，更优选地，4μmol/L，4.2μ8 -->
mol/L，4.4μmol/L，4.6μmol/L，4.8μmol/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在16000pg/mL以上，优选地，16500pg/mL，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL，18500pg/mL，19000pg/mL，19500pg/mL以上，更优选地，20000pg/mL，20500pg/mL，21000pg/mL，21500pg/mL，22000pg/mL以上，AST同工酶含量在4.8U/L以上，优选地，5.0U/L，5.2U/L，5.4U/L，5.6U/L，5.8U/L以上，更优选地，6U/L，6.2U/L，6.4U/L，6.6U/L，6.8U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者；TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，优选地，13500pg/mL，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL以上，更优选地，16300pg/mL，16500pg/mL，17000pg/mL以上，AFP含量在88μg/L以上，优选地，90μg/L，95μg/L，100μg/L，105μg/L以上，更优选地，110μg/L，115μg/L，120μg/L以上，则表明受试者患有肝癌而非肝炎；TGFβ1的含量在13600pg/mL以上，优选地，14000pg/mL，14500pg/mL，15000pg/mL，15500pg/mL，16000pg/mL，16500pg/mL以上，更优选地，17000pg/mL，17500pg/mL，18000pg/mL以上，而且总胆红素含量在8.8μmol/L以上，优选地，9.2μmol/L，9.5μmol/L，10μmol/L，10.5μmol/L以上，更优选地，11μmol/L，11.5μmol/L，12μmol/L以上，而且γ-谷氨酰转移酶在44U/L以上，优选地，46U/L，48U/L，50U/L，52U/L以上，更优选地，55U/L，57U/L，60U/L以上，则表明受试者患有肝癌而非健康人，也不是肺癌等其他癌症患者。同时，请注意，本发明上述内容中，涉及数值限定的部分中，不管是数值的增加还是减少，其增加或减少的幅度均以所述数值的最小计量单位(即数值的最后一位)为准，例如，如果TGFβ1的含量在13000pg/mL以上，则表明，符合所述要求的TGFβ1的含量可以为13001pg/mL，13002pg/mL…13005pg/mL…13010pg/mL…13100pg/mL等；如果AST同工酶含量在4.8U/L以上，则表明，符合所述要求的AST同工酶含量可以为4.9U/L，5.0U/L，5.1U/L…；如果白球比在1.2以下，则表明，符合所述要求的白球比可以为1.1，1.0，0.9…。这样的数值范围也都包括在本发明的范围内。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于指导使用者使用所述试剂的说明书。
换言之，本发明的核心思想是联合监测TGFβ1和一种或多种其它肝脏代谢产物，形成一组能够互补的标志物来诊断肝癌。本发明的方法可分为两步：1)联合使用两类产物，例如代谢产物和TGFβ1的含量或活性来监测肝脏是否正常，初步判断是否是肝癌，其中代谢产物可以是γ-谷氨酰转移酶、总胆红素、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等任意一种或多种；2)为了准确、灵敏区分肝癌与肝炎，可以将TGFβ1与甲胎蛋白(AFP)或将TGFβ1与AFP和一种或多种其它肝脏代谢产物联合使用。
即，本发明涉及一种多指标的肝癌诊断方法及相应的诊断试剂盒。本申请通过酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA，或者Elisa)直接在人类血清样本中检测各种生长因子或分泌因子蛋白的含量，这些样本分为四组：正常人、肝癌患者、肝炎患者以及其它种类癌症患者；然后，检测结果通过SPSS软件处理，绘制ROC曲线，发现诊断效果最好的是TGFβ1，其中所述TGFβ1为I型转化生长因子B。本申请的核心方法是：(1)获取待测人少量血液，如1-5毫升，血清样本分为四组：正常人，肝癌患者，肝炎患者，以及其它种类癌症患者；(2)检测血液中TGFβ1的含量；(3)任选地，检测AFP含量；(4)任选地，检测总胆红素含量、γ-谷氨酰转移酶活性等其它常规肝癌检测指标之一或多种；(5)综合衡量多指标，得出待测人患肝癌的概率。
本发明证明，TGFβ1单独使用并辅以相应的含量指标基本可以将肝癌与正常人群、其它癌症患者或肝炎患者区分开，但通过将TGFβ1与常规肝癌诊断方法联合使用可克服TGFβ1特异性的问题，其中常规肝脏检测指标，如总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等更多的是检测肝脏代谢产物，而TGFβ1反应肝脏的生理或病理指标，通过结合二者的互补性，成功建立了肝癌的可信检测方法和相应的试剂盒。
本发明提供的TGFβ1作为肝癌诊断标志物的用途以及综合分析TGFβ1、总胆红素、γ-谷氨酰转移酶等多指标的肝癌诊断方法具有以下优点：
1、敏感性高，能够在肝癌发生的早期将其检出；
2、检测方法简便、结果稳定，重现性好；
3、取样检测创伤小，便于医生操作，患者依从性好；
4、检测结果一目了然，便于诊断下结论；
5、诊断结果准确率高，达到90％以上。
附图说明
图1.区分肝癌组与正常组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.927，而TGFB1与总胆红素联合使用ROC曲线面积为0.980，TGFB1与γ-谷氨酰转移酶联合使用ROC曲线面积为0.986。
图2.区分肝癌组与正常组，TGFB1分别于白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等六种代谢指标联合使用，ROC曲线面积分别0.965,0986,0984,0.981,0.987。
图3、区分肝癌组与肝炎组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.818，而总胆红素、γ-谷氨酰转移酶等两种代谢指标ROC曲线面积分别为0.597，0.506。
图4、区分肝癌组与肝炎组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.818，而白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等六种代谢指标ROC曲线面积分别为0.702，0.658，0.683，0.490，0.673。
图5、区分肝癌组与肝炎组。AFP指标ROC曲线面积分别为0.808。
图6、区分肝癌组与正常组。TGFB1、总胆红素、γ-谷氨酰转移酶等三指标联用，ROC曲线面积为0.996。
图7、区分肝癌组与肝炎组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.818，而TGFB1、总胆红素、γ-谷氨酰转移酶等三指标联用，ROC曲线面积为0.886。
图8、区分肝癌组与其它癌组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.814，而TGFB1、总胆红素、γ-谷氨酰转移酶等三指标联用，ROC曲线面积为0.963。
图9、区分肝癌组与肝炎组。TGFβ1单一指标ROC曲线面积为0.827，而TGFB1与AFP联用，ROC曲线面积为0.943。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的临床组织样本、人类血清样本均通过正规途径从三甲医院获得，均签署过病人知情同意书。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Elisa试剂配制
1X洗涤液：如果浓缩洗涤液中有结晶析出，恢复至室温使结晶完全溶解后方可使用。将25X浓缩洗涤液用蒸馏水稀释25倍后备用。(美国RD公司，DB100B)
1X标准稀释液RD5-53：将20ml浓缩液RD5-53加入60ml蒸馏水中配制成80ml 1X标准稀释液RD5-53备用，用前混匀。
基质液：将显色剂A与显色剂B 1:1混匀，避光保存。注意配好后15min内使用。
TGFβ1标准品：用2ml 1X标准稀释液RD5-53将TGFβ1标准品粉末(美国RD公司，DB100B)溶解，所得标准品浓度为2000pg/ml。
标准品的稀释：准备小试管6只，依次编好号码，先在各试管中加入1X标准稀释液RD5-53100ul，然后取配制好的标准品100ul加入试管一中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第二只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第三只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第四只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第五只试管中，充分混匀；再在该试管中取100ul加入第六只试管中，充分混匀。稀释后的各管浓度分别是：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml。
实施例2、人体血清样本处理
与三甲医院合作，得到人体的血清样本，人体血清样本保存在-80℃。血清样本的获得均签署了患者知情同意书。血清样本检测前，使用1X标准稀释液RD5-53(美国RD公司)将样本稀释20倍(10ul样本原液+190ul 1X标准稀释液RD5-53)。
实施例3、El isa检测实验
1.准备好所有试剂及包被板并将其平衡至室温备用。
2.将多余的包被板从架子上取下，装入铝箔袋中密封保存。
3.在每孔中加入50ul样本稀释液RD1-73。
4.在每孔中加入50ul标准品或样品，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后室温孵育2小时。
5.揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加400ul洗涤液，静置一会后弃去，如此重复洗涤4遍，拍干。
6.在每孔中加入100ul TGFβ1酶标试剂。用新的封板膜封板后室温孵育2小时。
7.操作同5。
8.每孔中加入100ul基质液。室温避光孵育30min。
9.每孔中加入100ul终止液。轻轻晃动混匀。
10.450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后30min内完成。
11.以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘出标准曲线，计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以相应的稀释倍数，即为相应的样品浓度。
实施例4、其它常规肝癌检测指标的检测及实验结果的统计分析
利用本领域公知的技术手段临床检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶、AFP等指标的一种、多种或全部。临床检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶、AFP等指标的方法是本领域熟知的，在此不再赘述，可参见例如Lee,Mary(2009-03-10).Basic Skills in Interpreting Laboratory Data.ASHP.pp.259–.ISBN 978-1-58528-180-0；Johnston DE(1999)."Special considerations ininterpreting liver function tests".Am Fam Physician 59(8):2223–30.PMID10221307；McClatchey,Kenneth D.(2002).Clinical laboratory medicine.Lippincott Williams & Wilkins.pp.288–.ISBN 978-0-683-30751-1；Mengel,MarkB.；Schwiebert,L.Peter(2005).Family medicine:ambulatory care & prevention.McGraw-Hill Professional.pp.268–.ISBN 978-0-07-142322-9；Nyblom H,E,Simrén M,Aldenborg F,Almer S,Olsson R(September 2006)."TheAST/ALT ratio as an indicator of cirrhosis in patients with PBC".Liver Int.26(7):840–845.doi:10.1111/j.1478-3231.2006.01304.x.PMID 16911467；MedlinePlus Encyclopedia Liver function tests；《临床检验诊断手册》石同才编人民军医出版社出版时间：2011-06-01；《临床检验诊断手册》王鸿利等编世界图书出版公司出版时间：2006-1-1。
上述检测指标的检测结果整理如下：
表1、130例健康者三指标统计结果
表2、100例肝癌患者三指标统计结果
表3、21例肝炎(非肝癌)患者三指标统计结果
表4、55例其它癌症(非肝癌)患者三指标统计结果
表5四种分类的受试者的TGFB1、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等指标统计结果
表6肝炎及肝癌患者TGFB1、AFP指标统计
| 状态 | TGFB1(pg/mL) | AFP(ug/L) |
| 肝炎 | 5271.48 | 1.5 |
| 肝炎 | 5602.55 | 11.23 |
| 肝炎 | 8519.39 | 5.93 |
| 肝炎 | 9518.13 | 2.78 |
| 肝炎 | 12414.81 | 2.49 |
| 肝炎 | 13381.48 | 145.4 |
| 肝炎 | 14088.03 | 6.51 |
| 肝炎 | 14624.93 | 1.33 |
| 肝炎 | 15638.15 | 3.31 |
| 肝炎 | 15743.28 | 2.83 |
| 肝炎 | 16887.67 | 6.77 |
| 肝炎 | 17537.98 | 1.93 |
| 肝炎 | 17647.18 | 79.68 |
| 肝炎 | 18031.24 | 2.36 |
| 肝炎 | 20512.93 | 2.2 |
| 肝炎 | 23328.66 | 8.25 |
| 肝炎 | 25341.64 | 2.37 |
| 肝癌 | 11592 | 2.37 |
| 肝癌 | 12376 | 916.8 |
| 肝癌 | 12616 | 1210 |
| 肝癌 | 13589 | 50.38 |
| 肝癌 | 14232 | 1210 |
| 肝癌 | 14984 | 1210 |
| 肝癌 | 15003 | 143.2 |
| 肝癌 | 15096 | 1526.53 |
| 肝癌 | 15144 | 610 |
| 肝癌 | 15208 | 389.6 |
| 肝癌 | 16264 | 0.99 |
| 肝癌 | 17560 | 1131 |
| 肝癌 | 19229 | 17.08 |
| 肝癌 | 19379 | 204 |
| 肝癌 | 19544 | 1210 |
| 肝癌 | 19880 | 14.05 |
| 肝癌 | 19960 | 1210 |
| 肝癌 | 20146 | 1210 |
| 肝癌 | 20823 | 1210 |
| 肝癌 | 20838 | 3.38 |
| 肝癌 | 21003 | 2.74 |
| 肝癌 | 22221 | 1210 |
| 肝癌 | 22371 | 11.41 |
| 肝癌 | 22454 | 1.05 |
| 肝癌 | 22492 | 1210 |
| 肝癌 | 22507 | 1210 |
| 肝癌 | 22554 | 12.36 |
| 肝癌 | 22582 | 524.21 |
| 肝癌 | 22657 | 1210 |
| 肝癌 | 22958 | 37.28 |
| 肝癌 | 23093 | 3000 |
| 肝癌 | 23208 | 246.1 |
| 肝癌 | 23794 | 3000 |
| 肝癌 | 23800 | 3000 |
| 肝癌 | 24040 | 130.7 |
| 肝癌 | 24281 | 10.59 |
| 肝癌 | 24634 | 3000 |
| 肝癌 | 24774 | 136.7 |
| 肝癌 | 24934 | 365.5 |
| 肝癌 | 25094 | 1210 |
| 肝癌 | 25304 | 2.11 |
| 肝癌 | 25514 | 37.43 |
| 肝癌 | 25734 | 1210 |
| 肝癌 | 26714 | 173.7 |
| 肝癌 | 26898 | 510.6 |
| 肝癌 | 27319 | 82.87 |
| 肝癌 | 27394 | 1210 |
| 肝癌 | 27754 | 788.7 |
| 肝癌 | 27774 | 565.73 |
| 肝癌 | 28274 | 283.8 |
| 肝癌 | 29274 | 34.64 |
| 肝癌 | 29416 | 1210 |
| 肝癌 | 29554 | 876.5 |
| 肝癌 | 29554 | 4.25 |
| 肝癌 | 29560 | 1210 |
| 肝癌 | 29974 | 70.25 |
| 肝癌 | 31894 | 17.65 |
| 肝癌 | 32534 | 357.83 |
将上述表格中的数据输入到SPSS统计软件中，在分析选项中选中ROC曲线作图，作图结果如图1-9所示。根据上述表格及图1-9可以得出以下结论：
1.各种常规肝癌、肝炎检测指标，如总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶等单一指标不能很好区分肝癌组与肝炎组(图3，4)。
2.通过TGFβ1单指标评价，可以很好的区分肝癌组与正常组，曲线面积达到0.92以上。与常规肝癌检测指标联合使用(指检测TGFβ1的同时，任意检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶中的一种或多种)效果更佳(图1,2，6)。
3.通过TGFβ1单指标评价，基本可以区分肝癌组与肝炎组，曲线面积达到0.818，AFP单一指标，ROC曲线面积为0.808。TGFβ1与常规肝癌检测指标联合使用(指检测TGFβ1的同时，任意检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶中的一种或多种指标)可提高检测效果(AUC＝0.886)。TGFβ1与AFP联合使用，可以更好地区分肝癌组与肝炎组(AUC＝0.943)(图5，7，9)。
4.通过TGFβ1单指标评价，基本可以区分肝癌组与其它癌症组，曲线面积达到0.814。与常规肝癌检测指标联合使用(指检测TGFβ1的同时，任意检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶中的一种或多种)效果更佳；例如，TGFβ1、总胆红素和γ-谷氨酰转移酶联合使用(图8)。
实施例5利用TGFβ1与常规肝癌检测指标联合使用检测状况未知的患者的健康状况
检测方法：利用TGFβ1与常规肝癌检测指标联合使用(指检测TGFβ1的同时，任意检测总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶中的一种或多种)来初步确定是否是肝癌或肝炎患者，而不是正常人或其它癌症患者；再利用TGFβ1与AFP联合使用来区分到底是肝癌，还是肝炎患者。
下述表7所示内容为基于上述表格以及图1-9中的检测数据初步拟定的适用于区分肝癌患者与健康人群、肝炎患者、其它癌症患者的TGFβ1单独使用或TGFβ1与AFP联合使用或TGFβ1与一种或多种其它常规肝癌检测指标联合使用或TGFβ1与AFP以及一种或多种其它常规肝癌检测指标联合使用时，各个检测指标的可用范围。请注意，所述可用范围是基于当前数据确定的可明确诊断肝癌的数值，而非最低阈值。所述关键范围是指可有效区分肝癌的数值范围。本领域技术人员知晓，随着样本数量的增加，或者更多检测指标的联合使用，相应的数字可以适当的升高或降低而仍能实现本发明的诊断肝癌的目的。
表7.各种指标的有效值
其中，表格第二列和第三列的第一个数字为TGFβ1的含量，单位为pg/mL，第二个数字分别为对应行的第二种检测物的含量。总胆红素、总胆汁酸含量的单位为μmol/L，γ-谷氨酰转移酶、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、AST同工酶含量的单位为U/L，AFP含量的单位μg/L。
实施例6血清TGFβ1等诊断指标对肝癌患者的诊断能力验证
为了验证本发明涉及的诊断方法对肝癌患者的诊断能力，本发明人检测了另一独立样本人群(N＝16)的血清，检测指标包含TGFβ1、总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶以及AFP。其检测结果如表8所示。
表8.验证组的检测结果
判定为肝癌患者的临界值为：TGFβ1>20000(pg/mL)，总胆红素>10(μmol/L)，γ-谷氨酰转移酶>35(U/L)，白球比<1，胆碱酯酶<7000(U/L)，腺苷脱氨酶>9(U/L)，总胆汁酸>4(μmol/L)，AST同工酶>6(U/L)，AFP>110(μg/L)。
后经临床验证，肝癌1-6均为肝癌患者，正常组1-10均为正常人。
Claims (7)
1.一种肝癌诊断试剂盒，其包含诊断TGFβ1含量的试剂，任选地，其还包含检测AFP和/或其它常规肝癌检测指标物的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中诊断TGFβ1含量的试剂为诊断TGFβ1蛋白含量的试剂，优选地，该试剂为诊断TGFβ1蛋白含量的ELISA试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中诊断TGFβ1含量的试剂为诊断TGFβ1mRNA含量的试剂，优选地，该试剂为诊断TGFβ1mRNA含量的Northern Blotting试剂或定量RT-PCR试剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其中其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素、γ-谷氨酰转移酶、白球比、胆碱酯酶、腺苷脱氨酶、总胆汁酸、AST同工酶的一种、多种或全部。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中其它常规肝癌检测指标物选自总胆红素和γ-谷氨酰转移酶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其中受试者是人类。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其中肝癌是肝细胞肝癌。
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