CN116026666B - 一种用于d-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及检测稀释液领域，更具体地说，它涉及一种用于D‑二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液及其制备方法。一种用于D‑二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，包括以下组分：4‑8g/L三羟基氨基甲烷；3‑6g/L氨基磺酸；5‑10g/L无机盐；10‑20g/L牛血清白蛋白；50‑75g/L抗原稳定剂；0‑0.50mL/L防腐剂；35‑70mL/L表面非离子活性剂；水；血浆样本稀释液的pH为7.0‑7.8。本申请具有提高检测结果的准确性的优点。
Description
技术领域
本申请涉及检测稀释液领域，更具体地说，它涉及一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液及其制备方法。
背景技术
磁微粒化学发光免疫分析仪中，发光原理为形成“磁微粒-包被抗体—待测样本—抗体酶标记物”免疫复合物。引入磁场，经过磁吸附-洗涤-分离系列过程，洗去未结合的组分；再向免疫复合物中加入化学发光底物液，底物液被碱性磷酸酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，激发态中间体回到基态时释放出光子，利用发光仪检测到发光强度。
其中待测样本的吸样量的准确度对结果影响很大，全自动免疫分析仪因其操作简单，自动化程度高，检测速度快，重复性好，精密度高，可以在不需要分离的条件下，可以分别单独定量测定存在于血清或血浆样本中数十种具有临床意义的微量蛋白质。但是，临床检验中许多免疫学指标由于方法学的局限性和生物学差异性，需要进行一定比例稀释才能得到精确的检测结果。而且在实际实验中我们所需要的样本量很少，而机器的精密度不能到达。
因此，为了解决这一个问题，通常是将样本量增加后进行稀释，而稀释液的选用是否合适则会直接影响结果的准确性和可靠性。常见的是利用PBS、Tris缓冲液、生理盐水、去离子水、等建立的稀释液体系，但这些在早期的报道中检测出来的值于实际值存在较大的误差。因此，还有待改善。
发明内容
为了提高检测结果的准确性，本申请提供一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液及其制备方法。
第一方面，本申请提供一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，采用如下的技术方案：
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，包括以下组分：
4-8g/L三羟基氨基甲烷（Tris）；
3-6g/L氨基磺酸；
5-10g/L无机盐；
10-20g/L牛血清白蛋白；
50-75g/L抗原稳定剂；
0-0.50mL/L防腐剂；
35-70mL/L表面非离子活性剂；
水；
血浆样本稀释液的pH为7.0-7.8。
三羟基氨基甲烷可以为4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L。
氨基磺酸可以为3g/L、4g/L、5g/L、6g/L。
牛血清白蛋白可以为10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L。
表面非离子活性剂可以为40mL/L、45mL/L、50mL/L、55mL/L、60mL/L、65mL/L。
无机盐可以为NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、ZnCl2、FeCl2、FeCl3、CuCl2、AgCl、BaCl2、NH4Cl、AlCl3中的一种。
通过采用上述技术方案，在三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的共同配合下，可以长效稳定维持pH7.0-7.8的一个缓冲环境，在该环境下，有利于使D-Dimer待测物保持天然的状态，不凝集或裂解成片段。
并且，该配方中含有牛血清白蛋白，三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的配合同时也使牛血清白蛋白可以维持强劲的生物活性状态。进一步促进牛血清白蛋白作为D-Dimer维持正常形态的保护蛋白，进一步提高后续的检测D-Dimer的结果准确性和可靠性。
本申请技术方案提供了一种新的缓冲体系。本申请方案作为血浆样本稀释液，为D-Dimer待测物提供了一个蛋白电荷、渗透压等环境条件都更适宜的保存条件，有利于维持D-Dimer待测物的形态及稳定性。同时，血浆样品稀释液为待检样本提供了较佳的抗原抗体反应所需胶体渗透压环境(250~380m0sm/Kg)，从而更好地提高了稀释后样本检测准确度和精密度。
优选的，所述三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的质量比为1：（0.7-1.0）。
通过采用上述技术方案，进一步限定三羟基氨基甲烷与氨基磺酸之间的比例关系，有利于加强两者之间的配合关系，进一步加强对牛血清白蛋白、D-Dimer待测物形态的维持。
优选的，所述表面非离子活性剂为吐温-20、吐温-60、吐温-80中的一种或多种混合。
通过采用上述技术方案，选用合适的表面非离子活性剂有利于降低抗体与抗原的非特异性结合。
优选的，所述表面非离子活性剂为吐温-20。
尤其是进一步限定表面非离子活性剂为吐温-20时，吐温-20在三羟基氨基甲烷与氨基磺酸营造的缓冲体系中，可以进一步提高与牛血清白蛋白之间的配合效果，有效降低非特异性结合之间蛋白的结合牢固程度，从而降低抗体与抗原的非特异性结合，使检测数据更加准确。
优选的，所述血浆样本稀释液还包括2-5g/L的琥珀酸酯磺酸盐。
优选的，所述表面非离子活性剂与琥珀酸酯磺酸盐的比例为（35-38）mL/L：（2-5）g/L。
发明人发现，在吐温-20与琥珀酸酯磺酸盐特定比例的配合下，既不破坏D-Dimer待测物的结构，又可以提高对非特异性结合蛋白的清洗效果，使非特异性结合或结合不牢固的蛋白脱落，大幅度降低了对待测物检测的干扰，从而提高检测精确度。
并且两者的配合可以降低表面活性剂在血浆样本稀释液中的使用量，有利于降低成本。
优选的，所述抗原稳定剂为蔗糖、葡萄糖中的一种。
优选的，所述抗原稳定剂为蔗糖。
经过筛选和优化后，发明人发现选用蔗糖为抗原稳定剂时，整个体系的活性最为稳定，不容易受影响，有利于保护抗原避免失活。
第二方面，本申请提供一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，采用如下的技术方案：
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，包括以下步骤：
将三羟基氨基甲烷、氨基磺酸、牛血清白蛋白、抗原稳定剂、防腐剂、表面非离子活性剂、无机盐加入到水中，混匀，得到血浆样本稀释液。
通过采用上述技术方案，将各种原料混合加水配置，均匀后便得到血浆样品稀释液，制备过程简单便捷，条件要求低，适合在本领域推广使用。
优选的，将所述三羟基氨基甲烷、氨基磺酸先溶于水中，混匀后，使其pH保持在6.8-7.3之间；然后再依次加入无机盐、牛血清白蛋白、抗原稳定剂、防腐剂和表面非离子活性剂混匀。
通过采用上述技术方案，提前将三羟基氨基甲烷、氨基磺酸预混，旨在建立基础缓冲体系。然后再依次加入各种原料来调整整个体系，使各种原料充分配合、发挥效果。
优选的，所述琥珀酸酯磺酸盐与表面非离子活性剂共同加入到水中混匀。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、在三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的共同配合下，可以长效稳定维持pH7.0-7.8的一个缓冲环境，在该环境下，有利于使D-Dimer待测物保持天然的状态，不凝集或裂解成片段。
2、本申请方案作为血浆样本稀释液，为D-Dimer待测物提供了一个蛋白电荷、渗透压等环境条件都更适宜的保存条件，有利于维持D-Dimer待测物的形态及稳定性。同时，血浆样品稀释液为待检样本提供了较佳的抗原抗体反应所需胶体渗透压环境(250~380m0sm/Kg)，从而更好地提高了稀释后样本检测准确度和精密度。
3、在吐温-20与琥珀酸酯磺酸盐在特定比例的配合下，既不破坏D-Dimer待测物的结构，又可以提高对非特异性结合蛋白的清洗效果，大幅度降低了对待测物检测的干扰。并且可以促进吐温-20与牛血清白蛋白之间的配合效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
以下实施例及对比例中所用的原料均为市售产品。
实施例1
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，包括以下组分：
6.057g三羟基氨基甲烷、4.25g氨基磺酸、9.0g无机盐、13.0g牛血清白蛋白、50.0g抗原稳定剂、0.50mL防腐剂、50.0mL表面非离子活性剂、水。
其中，无机盐为氯化钠；抗原稳定剂为蔗糖；防腐剂为Proclin300；表面非离子活性剂为吐温-20。
血浆样品稀释液的pH保持在7.4。
本申请还公开一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1）：将三羟基氨基甲烷、氨基磺酸先溶于500mL的水中，混匀，得到预混液。然后测量pH，使pH保持在7.0。
步骤2）：再依次加入氯化钠、牛血清白蛋白、抗原稳定剂、防腐剂和表面非离子活性剂，然后加水定容至1L，混合均匀、测量pH值，得到血浆样本稀释液。
实施例2
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的质量比为1：1.0，即三羟基氨基甲烷为6.057g，氨基磺酸为6.057g。
实施例3
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的质量比为1：0.5，即三羟基氨基甲烷为6.057g，氨基磺酸为3g。
实施例4
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，表面非离子活性剂为吐温-60。
实施例5
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，表面非离子活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚。
实施例6
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，吐温-20为35mL；
血浆样本稀释液还包括5g的琥珀酸酯磺酸钠，琥珀酸酯磺酸钠与表面非离子活性剂共同加入至预混液中混合。
实施例7
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，吐温-20为38mL；
血浆样本稀释液还包括2g的琥珀酸酯磺酸钠，琥珀酸酯磺酸钠与表面非离子活性剂共同加入至预混液中混合。
实施例8
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，吐温-20为70mL；
血浆样本稀释液还包括5g的琥珀酸酯磺酸钠，琥珀酸酯磺酸钠与表面非离子活性剂共同加入至预混液中混合。
对比例1
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，将氨基磺酸替换为磺酸。
对比例2
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，将三羟基氨基甲烷替换为磷酸二氢钠。
对比例3
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，三羟基氨基甲烷为1g/L，氨基磺酸为9.307g/L。
对比例4
一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，与实施例1的不同之处在于，三羟基氨基甲烷为10g/L，氨基磺酸为0.307g/L。
1、回收率：
1）检测方法：选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3—4份。在其中2—3份样本中加入不同浓度、相同体积的待测物标准液或纯品制备待回收分析样本，加入体积小于原体积的10%，制成2—3个不同加入浓度的待回收分析样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样体积的无待测物的溶剂，制成基础样本。用待评价系统分别重复测定待回收分析样本和基础样本3次，计算回收率（%）并记录在表1。
2）计算公式：
加入浓度n=标准液浓度n×[标准液加入体积/（样本体积+标准液体积）]
回收率n=（测定待回收分析样本浓度均质n-测定基础样本浓度均质）/加入浓度n×100%
常规检测样本为实施例1-8、对比例1-4。
常规检测样品的合适浓度为0.1、0.5、1.50、3.0μg/mL FEU。
待测物标准液是已知DD浓度的抗原溶液。
3）对照样品1的制备方法如下：收集已知低浓度的血浆样本（市售），将样本混合后，进行实验测量其浓度，确认浓度为零值或低值。
对照样品2为浓度0.9%的生理盐水。
表1-不同浓度实施例1-8、对比例1-4、对照样品1-2的回收率
对照样品1为使用低浓度血清稀释的结果，所以可以视为最接近实际的结果。根据表1中实施例1、对照样品2与对照样品1的检测结果对比可知，本领域常用的稀释液（生理盐水）在浓度3.0μg/mL FEU时，与对照样品1的接近度较好，但是在浓度为0.1μg/mL FEU、0.5μg/mL FEU、1.5μg/mL FEU时，与对照样品1的接近程度较弱。说明常用的稀释液在适用范围上有一定的限制。而实施例1的稀释液在多种浓度下都与对照样品1有较好的接近程度，说明实施例1的稀释液较对照样品2有更好的稀释效果。
根据表1中实施例1与对比例1-2的检测数据对比可知，实施例1在各浓度下的数值都较对比例1-2的更加接近对照样品1的，说明由实施例1充当血浆样本稀释液时，所得到的结果更加准确。也就是说，在三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的共同配合下，为D-Dimer待测物保持良好状态提供合适的环境，三羟基氨基甲烷与氨基磺酸任意缺少都对稀释效果有较大的影响。再结合对比例3、4的检测结果对比可知，对比例3-4的回收率较对比例1-2的回收率与对照样品1的更加接近，但是对比例3-4的与实施例1的相差较远。说明即使使用了三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的组合也无法充分发挥两者之间的配合效果，必须要严格限定两者之间的使用量及使用比例才能起到更好的稀释效果。
根据表1中实施例1、2与实施例3的检测数据对比可知，在一定范围的使用量内，进一步限定三羟基氨基甲烷与氨基磺酸之间的质量比，可以进一步提高稀释液的稀释准确性。
根据表1中实施例1、4和实施例5的检测结果对比可知，在与对照样品1的接近程度上，实施例1、4的较实施例5的更为接近。说明非离子表面活性剂的不同对稀释准确性有比较大的影响。再结合实施例6-8的检测结果可知，选用特定的琥珀酸酯磺酸盐与吐温-20配合，可以在降低表面活性剂总用量的情况下达到较好的稀释效果。发明人猜测，两者之间可能发生了某些配合，使得体系的表面张力、电荷平衡等方面发生了改变。
2、三菱化学发光试剂的稀释液组分更改对比：
将三菱试剂（市售）中的稀释液替换为实施例1-8、对比例1-4的血浆样本稀释液，在三菱化学发光仪上进行检测，比较实施例1-8、对比例1-4的血浆样本稀释液与三菱试剂稀释液的效能。
结果详见表2、表3。
表2-实施例1-8、对比例1-4血浆样本稀释液与三菱试剂稀释液的效能
表3-实施例1-8、对比例1-4血浆样本稀释液效能回归方程
根据表2、3中实施例1-8的检测数据可知，使用实施例1的稀释液将三菱原有的稀释液替换后，所得到的结果符合要求，具有一致性，说明本申请技术方案制备出来的血浆样本稀释液可在市面上流通使用。而对比例1-4的稀释液稀释效果均不及实施例1的。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，其特征在于，包括以下组分：
4-8g/L三羟基氨基甲烷；
3-6g/L氨基磺酸；
5-10g/L无机盐；
10-20g/L牛血清白蛋白；
50-75g/L抗原稳定剂；
0-0.50ml/L防腐剂；
35-70ml/L表面非离子活性剂；
水；
血浆样本稀释液的pH为7.0-7.8；
所述三羟基氨基甲烷与氨基磺酸的质量比为1：（0.7-1.0）；
所述表面非离子活性剂为吐温-20。
2.根据权利要求1所述的用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，其特征在于：所述血浆样本稀释液还包括2-5g/L的琥珀酸酯磺酸盐。
3.根据权利要求1所述的用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液，其特征在于：所述抗原稳定剂为蔗糖。
4.一种基于权利要求1、3任一项所述的用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将三羟基氨基甲烷、氨基磺酸、牛血清白蛋白、抗原稳定剂、防腐剂、表面非离子活性剂、无机盐加入到水中，混匀，得到血浆样本稀释液。
5.根据权利要求4所述的用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，其特征在于：将所述三羟基氨基甲烷、氨基磺酸先溶于水中，混匀后，使其pH保持在6.8-7.3之间；然后再依次加入无机盐、牛血清白蛋白、抗原稳定剂、防腐剂和表面非离子活性剂混匀。
6.根据权利要求4或5所述的用于D-二聚体磁微粒酶促化学发光试剂盒的血浆样本稀释液的制备方法，其特征在于：所述血浆样本稀释液还包括2-5g/L的琥珀酸酯磺酸盐，琥珀酸酯磺酸盐与表面非离子活性剂共同加入到水中混匀。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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