CN102288770B - 一种基于量子点的免疫荧光检测己烯雌酚的方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于量子点的免疫荧光检测己烯雌酚的方法及专用试剂盒。本发明提供的用于检测己烯雌酚的免疫荧光检测试剂盒，包括己烯雌酚包被原和量子点标记的己烯雌酚抗体。本发明方法能实现对己烯雌酚残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在己烯雌酚的检测领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于量子点的免疫荧光检测己烯雌酚的方法及专用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基于量子点的免疫荧光检测己烯雌酚的方法及专用试剂盒。

背景技术

己烯雌酚(Diethylbestrol，DES)是一种人工合成的非甾体类雌激素，因其能促进蛋白合成，加快增重和骨骼钙化，并减少饲料消耗，被作为动物促生长剂应用于畜禽生产和水产养殖等方面。但许多科学试验证实了己烯雌酚是一种致癌物质，对人和动物的健康危害较大，因此，许多国家包括我国已规定在畜禽及水产养殖中禁用己烯雌酚。目前，用于己烯雌酚残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其样品前处理过程繁琐费时，检测费用高。基于竞争性酶联免疫反应原理的ELISA方法不需进行复杂的样品前处理过程，检测时间相对短，但其精度不够，只能用于定性筛查，无法用于定量确证。当前畜产品和水产品中检测己烯雌酚残留及其污染状况调查的样品数量大，任务重，花费高，检测周期过长。因此，急需检测结果稳定、快速、经济的标准方法。

量子点(Quantum Dots，QDs)标记材料是近年来发展起来的一类新型材料，包括II-VI族和III-V族半导体纳米晶。由于量子点突出的发光和吸收特性，使其具有荧光寿命长、宽激发光谱、窄发射光谱、可精确调谐的发射波长、很高的光化学稳定性、可进行多色标记等优越特性，采用其作为标记材料，可实现对靶标分子的超微量检测。

由于适用于免疫诊断试剂的量子点标记材料必须满足量子产率高、荧光强、生物相容性好、高度稳定及成本低等要求，而现行国外商业化的量子点其量子产率多在40％以下，其尺寸偏小，需要用激光光学仪器来照射激发，目前仅能应用在细胞免疫荧光检测和流式细胞检测和分选等方面，因此国际市场上还没有量子点免疫检测试剂问世。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测己烯雌酚的免疫荧光检测试剂盒。

本发明所提供的用于检测己烯雌酚的免疫荧光检测试剂盒，包括己烯雌酚包被原和量子点标记的己烯雌酚抗体。

上述试剂盒中，所述己烯雌酚抗体为抗体效价为10⁶以上(具体为10⁶)、抗体亲和常数为10⁶～10⁸M^-1或10⁷～10⁸M^-1或10⁸M^-1的己烯雌酚单克隆抗体；具体为抗体效价为10⁶、抗体亲和常数为10⁸M^-1的己烯雌酚单克隆抗体，所述己烯雌酚单克隆抗体购自广州市江森生物科技有限公司，产品目录号为JS-23-0004。

所述量子点为表面羧基含量为1×10^-3～9×10^-3mmol/mg或1×10^-3～6×10^-3mmol/mg或5×10^-3mmol/mg的水溶性CdSe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40～70％或50～70％或60％；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是620nm。

上述任一所述试剂盒中，所述量子点的粒径为10～20nm，所述粒径具体为13～20nm，所述粒径尤其优选为20nm；其粒径的偏差(CV)在10～30％之间，具体为10～20％之间，再具体为15％；

上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的己烯雌酚抗体中，所述量子点上的羧基与所述己烯雌酚抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述己烯雌酚抗体连接。

上述任一所述试剂盒中，所述己烯雌酚包被原为己烯雌酚与载体蛋白的偶联物，其中所述己烯雌酚与所述载体蛋白通过向己烯雌酚中引入的羧基与载体蛋白中的氨基形成的肽键而连接；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白原和兔和鸡的丙种球蛋白中的任一种。

上述任一所述试剂盒中，所述试剂盒中还包括己烯雌酚标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；

所述己烯雌酚标准品为(E)-4，4′-(1，2-二乙基-1，2-亚乙烯基)双苯酚；

所述稀释液为PBS缓冲液；具体为0.02M、pH7.4的PBS缓冲液。

所述洗涤液为PBST缓冲液；具体按照如下方法制备：取0.2ml Tween20及0.1g的NaN3溶于所述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。

所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；具体为0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液。

所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；所述用于包被的蛋白为BSA、卵清蛋白和血蓝蛋白中的任一种。具体按照如下方法制备：将10g BSA和0.2mlTween20溶于上述稀释液中，溶解后用稀释液定容至1L。

上述任一所述试剂盒中，所述标准品为如下溶液形式的标准品：用所述稀释液将所述(E)-4，4′-(1，2-二乙基-1，2-亚乙烯基)双苯酚稀释成如下各个浓度的溶液：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/L。

上述任一所述试剂盒中，所述己烯雌酚包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述己烯雌酚包被原得到10μg/ml的包被液，每孔中加100μl。

上述任一所述试剂盒中，所述量子点标记的己烯雌酚抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中：将每25ug所述量子点标记的己烯雌酚抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。

本发明的另一个目的是提供一种检测样品中己烯雌酚的方法。

本发明所提供的检测样品中己烯雌酚的方法，包括如下步骤：用上述任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样或饲料。所述待测样品具体为猪尿。

本发明检测方法的原理：采用量子点作为荧光信号标记分子，将己烯雌酚抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入己烯雌酚标准品或检测样品，以及量子点标记的己烯雌酚抗体，使其形成抗原-抗体二元发光免疫复合物，用荧光检测仪激发并检测该免疫荧光复合物的荧光强度，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测己烯雌酚的浓度。

抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是加入量子点标记的己烯雌酚抗体后，包被的己烯雌酚抗原与检测样品中的己烯雌酚竞争性地结合己烯雌酚抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物。

抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是同时加入量子点标记的己烯雌酚抗体及检测样品后，包被在聚苯乙烯微孔中的己烯雌酚抗原与检测样品中的己烯雌酚竞争性地与己烯雌酚抗体结合，其中与检测样品结合剩余的己烯雌酚抗体与包被在微孔板中的己烯雌酚抗原发生特异结合后形成固定在微孔板中的抗原-抗体二元免疫复合物。

本发明的己烯雌酚免疫荧光检测试剂与量子点标记的免疫荧光检测技术相关，是采用量子点作为荧光信号标记材料，进行免疫荧光定量测定的一类方法，该技术整合了荧光量子点纳米材料化学合成、表面修饰及标记技术、间接竞争式免疫检测技术等相关领域的研究。

本发明之所以能检测己烯雌酚，在于采用了一种基于量子点标记的免疫荧光定量测定的方法，即将己烯雌酚抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子点标记的间接竞争免疫荧光检测法的测定原理，在加入己烯雌酚标准品或检测样品，以及量子点标记的己烯雌酚抗体后，通过检测结合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗体二元免疫复合物的荧光强度来实现对己烯雌酚的检测：结合到聚苯乙烯板微孔的量子点标记抗体的数量不同，所产生的荧光强度也不同。在一定浓度范围内荧光强度值的高低与样品中的己烯雌酚的含量成反比。通过添加不同浓度的己烯雌酚标准品可制成标准曲线，根据此标准曲线查询各检测样品的荧光强度值可得到对应的己烯雌酚药物的浓度值。

其具体的技术步骤包括：

(一)荧光量子点标记探针的制备：采用适合的水溶性荧光量子点，活化其表面的羧基后，采用化学偶联的方式将己烯雌酚抗体定向连接到量子点表面。

(二)包被抗原：采用与牛血清白蛋白偶联的己烯雌酚抗原作为包被抗原，通过物理吸附的方法将此抗原直接包被于聚苯乙烯板微孔中。

(三)抗原-抗体荧光免疫复合物的形成：于上述包被好的聚苯乙烯板微孔中加入己烯雌酚标准品或检测样品，以及量子点标记的己烯雌酚抗体，吸附在孔内的己烯雌酚抗原与标准或样品中的己烯雌酚竞争性的与己烯雌酚抗体相结合，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元发光免疫复合物。

(四)定量荧光检测：采用荧光酶标仪激发并检测上述所形成的抗原-抗体荧光免疫复合物的荧光强度；激发波长：345nm；发射波长：620nm；通过测定系列对应标准品的荧光强度形成标准曲线，通过与测定形成的标准曲线对比获得待测己烯雌酚的浓度。

所述抗原-抗体二元发光免疫复合物的形成是：加入量子点标记的己烯雌酚抗体后，包被的己烯雌酚抗原与标准或样品中的己烯雌酚竞争性地结合己烯雌酚抗体，通过抗原-抗体的特异性结合形成抗原-抗体二元免疫复合物，其上标记的量子点经激发后可发荧光，本发明使用的激发光波长是345nm，发射波长是620nm，得到发红光的抗原-抗体免疫复合物。

所述荧光强度的检测是用荧光酶标仪激发并检测所形成的抗原-抗体二元发光免疫复合物的荧光强度，由于所采用的抗体是固定浓度的，通常待测样品中的己烯雌酚药物的浓度越高，被抗体捕获的药物量越多，与包被的己烯雌酚抗原结合的抗体越少，测得的荧光强度值越低。

由于量子点在与抗体进行偶联中要用超速离心进行分离纯化，粒径太小的量子点如8nm和10nm的无法离心，偶联后无法纯化，使用效果较差；粒径太大的量子点如60nm以上的比较容易聚集，用在试剂盒上均一性较差。

所述量子点的粒径为10～20nm，所述粒径具体为13～20nm，所述粒径尤其优选为20nm；其粒径的偏差(CV)在10～30％之间，较好为10～20％之间，优选15％。

量子点的荧光量子产率及其荧光强度直接决定了检测灵敏度及其准确性的高低，传统方法制备的量子点的荧光量子产率通常都低于40％，荧光强度较弱。

为提高其灵敏度及准确性，所述量子点的量子产率为40～70％，所述量子点的荧光量子产率具体为50～70％，所述量子点的荧光量子产品尤其优选为60％。

为用于己烯雌酚残留物检测，量子点表面需带有易于与己烯雌酚抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优化的基团是带羧基的表面官能团，通常采用化学方法连接抗体，即用EDC和NHS活化量子点后，再与抗体发生羧合反应而完成偶联反应。

在将己烯雌酚抗体和量子点以肽键共价结合形成的聚合体前，还包括活化所述量子点表面官能团的步骤。量子点表面的羧基含量不同会影响到检测的灵敏度，为提高灵敏度，所述官能团具体为羧基，所述羧基的含量为1×10^-3～9×10^-3mmol/mg，所述羧基的含量具体为1×10^-3～6×10^-3mmol/mg，所述羧基的含量尤其优选为5×10^-3mmol/mg。

在免疫检测中，抗体的性能指标对于检测的准确性至关重要，通常而言，特异性强、亲和力高的抗体，可以显著地提高检测的准确性。研究发现，为提高灵敏度，所述己烯雌酚抗体亲和常数为10⁶～10⁸M^-1；所述己烯雌酚抗体亲和常数具体为10⁷～10⁸M^-1；所述己烯雌酚抗体亲和常数尤其优选为10⁸M^-1。

由于己烯雌酚是小分子物质，其分子表面特性不利于与聚苯乙烯微孔板的直接结合，需要将其与载体蛋白进行偶联后才能借助于载体蛋白的表面特性而达成与聚苯乙烯微孔板的良好结合。可用作载体蛋白的有各种动物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，还有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白。研究发现，BSA理化性质稳定，赖氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂(如吡啶、DMF等)的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态，是作为载体蛋白的极佳选择，故本发明选用BSA作为偶联蛋白。

本发明通过对荧光量子点、己烯雌酚抗原和己烯雌酚抗体分子特性的研究，通过对各种水溶性荧光量子点制备、包覆及表面修饰条件的优化，选择适合的水溶性荧光量子点与特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得功能性的荧光量子点标记探针，并通过优化竞争性免疫反应的各种条件，达到对己烯雌酚残留药物的快速和高灵敏定量测定。实验证明，本发明试剂盒的灵敏度高、特异性好、准确度高。本发明方法能实现对己烯雌酚残留药物的定量检测，并且检测限低、检测灵敏度高、特异性好，还适用于多种样品的检测。因此，本发明在己烯雌酚的检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1水溶性CdSe/ZnS荧光量子点电镜(TEM)照片。

图2用量子点标记的间接竞争免疫荧光法检测己烯雌酚的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测试剂盒的组成及制备

己烯雌酚购自北京恒元启天化工技术研究院，产品目录号为30216CDCT-C12607000。其化学名称为(E)-4，4′-(1，2-二乙基-1，2-亚乙烯基)双苯酚。

1、己烯雌酚包被原

己烯雌酚与载体蛋白BSA的偶联物，己烯雌酚分子上有羟基，可据此引入羧基，再与BSA中的氨基形成的肽键而连接。

DES-BSA抗原的合成采用先将DES分子转化为中间体，再与BSA进行偶联。己烯雌酚包被原的制备方法如下：

(1)取26.8mg己烯雌酚(DES)、20mg琥珀酸酐和5ml吡啶混匀，在45℃下搅拌反应15h；得到反应液a，通过旋转蒸发仪除去反应液a中的吡啶，用氮气吹干残余吡啶后得到DES中间体；加入5mlDMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶解DES中间体，得到DES中间体溶液；

(2)将5mlDES中间体溶液、26.2μl(约0.1mmol)三丁基正胺(作束缚酸剂)在4℃下搅拌混合15min，得到反应液b；再向反应液b中加入1.5μl(约0.1mmol)氯甲酸异丁酯在25℃下搅拌活化1h，得到活化好的DES中间体溶液；

(3)取100mg BSA溶解于10ml浓度0.1mol/L，pH为8.5的硼酸钠溶液中得到BSA硼酸溶液；

(4)将5ml步骤3)得到的活化好的DES中间体溶液在冰浴下通过分液漏斗缓慢逐滴加入10ml步骤4)得到的所述BSA硼酸溶液中，搅拌反应过夜(温度为4℃，时间为12h)，得到混合液d；

(5)将混合液d于浓度为0.01mol/L、pH为7.4的PBS溶液中4℃透析2天，每6h更换一次透析液，除去未反应的小分子，收集透析产物，再将透析产物用SephadexG-25过柱(GE Healthcare，17-0034-01)纯化，制得DES-BSA。所得产品用冻干机冻干，于-20℃保存，得到己烯雌酚包被原(DES-BSA)。

2、己烯雌酚包被原的包被

采用包被缓冲液将己烯雌酚包被原稀释为浓度10μg/ml的包被液，在96孔聚苯乙烯微孔板条中每孔各加100μl，于4℃冰箱放置过夜。第二天弃去包被液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，各孔加入200μl封闭液，于37℃封闭处理2h。之后弃去封闭液、用洗涤液冲洗各板孔3次后，进行真空抽干、用铝箔袋密封后放置于-20℃保存。

3、量子点标记的己烯雌酚抗体：

己烯雌酚抗体为效价为10⁶、亲和常数为10⁸M^-1的己烯雌酚单克隆抗体，其购自广州市江森生物科技有限公司，产品目录号为JS-23-0004。

量子点购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为

LumiQD^TM 20。该量子点的表征如下：粒径为20nm、粒径的CV为15％，量子产率为60％，表面羧基含量为5×10^-3mmol/mg，水溶性，CdSe/ZnS核壳结构，激发光波长为345nm，发射波长是620nm；红色荧光量子点。量子点的扫描图如图2所示。

所述量子点标记的己烯雌酚抗体中，所述量子点上的羧基与所述己烯雌酚抗体上的氨基形成肽键，进而使所述量子点与所述己烯雌酚抗体连接。

量子点标记方法是：

1)取2.5mg的上述量子点用0.1M的MES缓冲液(称取1.066g MES、0.45g NaCl溶于50ml纯水，调pH至4.7)洗涤并用20000rpm离心富集去上清后，用1ml浓度为0.1M、PH值为4.7的MES缓冲液重悬，加入0.96mg(终浓度为5mM)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1.15mg(终浓度为10mM)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)于其中。反应温度为37℃，反应半小时后，得到活化后的量子点；

2)用50mM pH＝8.5的硼砂缓冲液洗涤，取0.15mg己烯雌酚单克隆抗体和2.5mg活化后量子点混合到0.8ml 50mM pH＝8.5的硼砂缓冲液(称取1.9g Na₂B₄O₇.10H₂O溶于100ml纯水，调pH至8.5)中充分混匀。室温(25℃)下反应3.5小时，让抗体和量子点形成稳定的肽键共价结合，得到含有偶联后量子点的反应液；

3)反应结束后，向步骤2)得到的反应液中加入终浓度为5％(质量百分含量)的BSA(Sigma-Aldrich，85041C)对剩余活性氨基位点进行封闭，反应在37℃下进行0.5小时，得到含有封闭后量子点的反应液；完成后，用pH＝7.4的0.02M PBS缓冲液(称取2.3g Na₂HPO₄、0.524g NaH₂PO₄.H₂O、8.77g NaCL溶于1L纯水，调pH至7.4)洗涤，20000rpm离心富集去上清，重悬后4℃保存待用，得到量子点标记己烯雌酚抗体。

4、己烯雌酚标准品：用稀释液将己烯雌酚稀释成如下各个浓度的溶液：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/L；

5、稀释液：0.02M、pH7.4的PBS缓冲液；

配制：称取2.3g Na₂HPO₄、0.524g NaH₂PO₄.H₂O和8.77g NaCL溶于1L纯水，调pH至7.4。

6、洗涤液：PBST缓冲液；取0.2ml Tween20及0.1g的NaN₃溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用上述PBS缓冲液定容至1L。

7、包被缓冲液：0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液。

8、封闭液：将10g BSA和0.2ml Tween20溶于上述PBS缓冲液中，溶解后用PBS缓冲液定容至1L。

实施例2、标准曲线的制备方法

在制备好的己烯雌酚微孔板条中加入浓度为0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/L的己烯雌酚标准溶液，50ul/孔，将量子点标记DES抗体用PBS-T稀释液1∶50稀释[即25ug(微克)标记抗体：5ml稀释液]，每个微孔中加入50ul，室温振荡1小时，洗涤液洗3次后用荧光酶标仪检测其荧光强度数值。荧光酶标仪设置为激发波长345nm，发射波长620nm。

将竞争检测的检测限定为B0/B＝1.2时(B0为0标准样检测值，B为待测样检测值)的竞争药物的质量浓度，根据曲线回归方程确定检测体系的灵敏度。检测结果如下表1所示，将检出限定为0.005ug/L。

表1 己烯雌酚不同浓度样品的量子点试剂盒检测值

实施例3、交叉反应的测定

选择双烯雌酚(Sigma-aldrich，46190-100MG)、己烷雌酚(Sigma-aldrich，46320-100MG-R)、葡糖苷酸己烯雌酚(Sigma-aldrich，D8647)、雌三醇(北京恒元启天化工技术研究院，13783 NIC-100934)和己炔雌二醇(Sigma-aldrich，E4876-100MG)5种药物，分别配成系列浓度，用量子点试剂盒条进行检测。计算各竞争物的IC50，用以下公式分别计算这5种药物与己烯雌酚量子点试剂盒的交叉反应率。计算公式为：交叉反应率(％)＝[IC50(己烯雌酚)/IC50(待测药物)]×100。

测定及计算结果如表2所示。结果显示己烯雌酚量子点试剂盒对双烯雌酚、己烷雌酚、葡糖苷酸己烯雌酚有一定交叉，其余2种药物交叉反应率都小于0.1％。

表2 己烯雌酚量子点试剂盒与其它药物的交叉反应

实施例4、准确性的测定

(一)样品提取：

1、组织试样：称取5g肌肉组织(精确到0.01g)绞碎(小于5mm)，放入50ml具塞离心管中，加10ml，甲醇，充分搅拌，振荡20min，于4000g离心10min，将上清液移出，残渣中再加10ml甲醇，混匀后振荡20min，于4000g离心10min，合并上清液，用氮气吹干，加入1ml甲醇溶解残余物，再加入1ml 0.02M PBS混匀后用于检测。

2、尿液试样：澄清的尿液可直接用于检测，若尿液混浊需要先离心(4000g)10min，取上清进行检测。

3、饲料：称取饲料5g(精确到0.01g)，置于50ml离心管中，加入10ml 0.2mol/L的乙酸铵缓冲溶液，均质1min。加入10ml乙醚，旋涡振荡提取3min，于4000g离心5min，吸取乙醚层于另一试管中。重复乙醚提取一次，合并的乙醚相在常温下用氮气吹干，加入1ml甲醇溶解残余物，再加入1ml 0.02M PBS混匀后用于检测。

(二)回收率的测定

检测30份阴性猪尿样品，其中5份阴性尿样添加不同浓度的DES标准液(0.1、0.5、1、2、5ug/L)。添加样品每个测试5次，并计算回收率。

回收率测定结果见表3，己烯雌酚添加样的回收率为85％～95％，平均回收率91.14％，变异系数5.87％～10.59％，平均变异系数8.33％，准确度较好。

表3 回收率测定

Claims (4)

1.一种用于检测己烯雌酚的免疫荧光检测试剂盒，包括己烯雌酚包被原和量子点标记的己烯雌酚抗体；

所述己烯雌酚抗体为抗体效价为10⁶以上、抗体亲和常数为10⁶～10⁸M^-1的己烯雌酚单克隆抗体；

所述量子点为表面羧基含量为1×10^-3～9×10^-3mmol/mg的水溶性CdSe/ZnS核壳结构的量子点；所述量子点的量子产率为40～70%；所述量子点的激发光波长为345nm，发射波长是620nm；

所述量子点的粒径为10～20nm，其粒径的偏差在10～30%之间；

所述己烯雌酚包被原为己烯雌酚与载体蛋白的偶联物；

所述试剂盒中还包括己烯雌酚标准品、稀释液、洗涤液、含有孔的聚苯乙烯板、包被缓冲液和封闭液；

所述己烯雌酚标准品为(E)-4,4'-(1,2-二乙基-1,2-亚乙烯基)双苯酚；

所述稀释液为PBS缓冲液；

所述洗涤液为PBST缓冲液；

所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；

所述封闭液为含有用于包被的蛋白的PBS缓冲液；

所述标准品为如下溶液形式的标准品：用所述稀释液将所述(E)-4,4'-(1,2-二乙基-1,2-亚乙烯基)双苯酚稀释成如下各个浓度的溶液：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ug/L。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述己烯雌酚包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法为用所述包被缓冲液稀释所述己烯雌酚包被原得到10μg/ml的包被液，每孔中加100μl。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述量子点标记的己烯雌酚抗体以如下溶液形式存在于试剂盒中：将每25ug所述量子点标记的己烯雌酚抗体用5ml所述稀释液稀释得到的溶液。

4.一种检测样品中己烯雌酚的方法，包括如下步骤：用权利要求1-3中任一所述的试剂盒对待测样品进行检测，所述待测样品为动物肌肉组织样本、动物尿样或饲料。

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