CN116590243A - 一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

发明公开了一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株，其亲本毒株微生物保藏号为CCTCC NO:V202318，其基因组中，MGF_505‑1R基因、MGF_505‑2R基因、MGF_505‑3R基因、MGF_360‑12L基因、MGF_360‑13L基因、MGF_360‑14L基因和EP402R基因为失活的基因。本发明还公开了该基因工程病毒毒株的制备方法，含有该基因工程病毒毒株的疫苗组合物，以及该基因工程病毒毒株的在制备用于预防非洲猪瘟的制剂中的用途。该基因工程病毒毒株安全性好，免疫有效性好，具备制备临床应用的疫苗的潜质。

Description

一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株及其制备与应用
技术领域
本发明属于兽医病毒学领域，涉及一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株及其制备与应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种严重威胁全球养猪业的毁灭性猪传染病(www.woah.org)。非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)属于非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属。ASFV B646L基因编码病毒衣壳蛋白P72，P72在病毒吸附宿主细胞和病毒粒子装配中发挥重要作用。B646L基因的C-末端序列核苷酸一致性为86.2％-99.5％，根据该序列，ASFV目前被分为24种基因型。所有24种基因型的ASFV都在撒哈拉以南的非洲被检测到，但只有两种基因型传播到非洲以外地区。1957年，基因I型的非洲猪瘟病毒被传入欧洲，并在许多欧洲国家引起非洲猪瘟暴发。2007年，格鲁吉亚出现了一种高致死性基因II型ASFV(Georgia07)，迅速蔓延到邻国(www.woah.org)。2018年，类似Georgia07的ASFV传播到中国和亚洲其他国家。基因II型ASFV造成欧亚国家700多万头猪的损失(www.woah.org)。
由于缺乏有效的非洲猪瘟疫苗，因此无法制定有效的控制策略，导致ASFV在许多国家广泛传播并继续演变。自2018年以来，我们一直在积极监测非洲猪瘟病毒在中国的变化。2020年，在中国检测到致病力降低的基因II型自然变异株。CD2v蛋白是基因II型ASFV的一个重要毒力因子。该毒株致病力降低是由于其EP402R基因的突变或缺失导致编码的CD2v蛋白不能正常表达所造成的。2021年，在中国又检测到低毒力基因I型ASFV，该毒株无血吸附活性，与二十世纪六十年代葡萄牙报告的NH/P68毒株在基因组上高度相似。至此，在中国猪群中同时存在基因I型和基因II型ASFV。
尚无基因I型和基因II型非洲猪瘟病毒自然重组体的报道，更无针对该类重组ASFV疫苗的报道。
发明内容
为了改进现有技术中的不足，本发明第一方面提供了一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株，在所述基因工程病毒毒株中，MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种为失活的基因；
所述基因工程病毒毒株的亲本毒株选自：
S1：微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株；
S2：临床致病性与免疫原性相对于微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株没有变化的传代病毒株或突变病毒株；以及
S3：与微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株实质相同的病毒株。
针对本发明所请求保护的基因工程病毒毒株的亲本毒株(微生物保藏号为CCTCCNO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株，JS/LG/21株)，JS/LG/21株的没有突变的基因组完全相同的传代病毒株应当视为经过微生物保藏的JS/LG/21株。临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株主要指基于JS/LG/21株传代以及传代中积累微小突变的病毒株。实质相同的病毒株主要指JS/LG/21株的其他同源病毒株。
JS/LG/21株经传代应用不可避免引入微小突变，临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株应当属于本发明的贡献范围。临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化，比如，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为临床致病性与免疫原性是相同的。
需要用动物测定JS/LG/21株后代的临床致病性与免疫原性，由于动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。
JS/LG/21株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，可以合理预期的是当这些微小变化没有明显影响后代毒株的临床致病性与免疫原性的情况下，仍然在本发明的实质技术贡献范围内，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。
本发明JS/LG/21株的原代猪肺泡巨噬细胞等细胞传代病毒株，可合理预期的是，与其他病毒一样，不可避免引入微小突变，当其临床致病性与免疫原性没有实质性变化时，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
JS/LG/21株来自发病猪，必然在多地有可能分离到与JS/LG/21株具有共同基因I型和基因II型非洲猪瘟病毒重组体祖先的同源毒株，它们基因组与JS/LG/21株可能完全相同，也可能有微小的差别。
当这些同源毒株与JS/LG/21株的差别程度相当于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株与JS/LG/21株的差别程度时，这些同源毒株与JS/LG/21株相同或视为临床致病性与免疫原性没有差别，这些同源毒株属于与JS/LG/21株实质相同的病毒株。
进一步来说，当敲除的基因少于7种时，也会降低JS/LG/21的毒性而保留免疫原性，仍属于根据本发明可预见的贡献之处。
在一些实施方式中，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，B646L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些实施方式中，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，B646L基因的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
在一些实施方式中，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种、任两种或三种：
B602L基因的编码序列如SEQ ID NO.17所示；
C122R基因的编码序列如SEQ ID NO.18所示；以及
D345L基因的编码序列如SEQ ID NO.19所示。
在一些实施方式中，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种或任两种：
MGF_100-1L基因的编码序列如SEQ ID NO.20所示；以及
I9R基因的编码序列如SEQ ID NO.21所示。
在一些实施方式中，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种、任两种或三种：
NP1450L基因的编码序列如SEQ ID NO.22所示；
MGF_360-8L基因的编码序列如SEQ ID NO.23所示；以及
MGF_505-5R基因的编码序列如SEQ ID NO.24所示。
非洲猪瘟病毒毒株传代过程中，前述基因中有部分发生了同义突变，并不会影响临床致病性与免疫原性，有部分与其他具有基因I型和基因II型非洲猪瘟病毒重组体祖先的同源毒株之间有相对的同义突变，并不会影响临床致病性与免疫原性。JS/LG/21株的传代病毒中必然会保留这些序列特征，也难免存在微小的不影响生长周期、临床致病性与免疫原性的突变。它们也都与本发明的贡献相匹配。
同理，JS/LG/21-7GD传代过程中，不会影响临床致病性与免疫原性的突变，仍与本发明的贡献相匹配。
在一些实施方式中，所述失活的基因片段为缺失突变、插入突变或替换突变。
在一些实施方式中，所述MGF_505-1R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示；
所述MGF_505-2R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示；
所述MGF_505-3R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示；
所述MGF_360-12L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.10所示；
所述MGF_360-13L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.12所示；
所述MGF_360-14L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.14所示；
所述EP402R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明第二方面提供了一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株，所述基因工程病毒毒株是临床致病性与免疫原性相对于本发明第一方面所述基因工程病毒毒株没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
对于本发明所得到的基因工程病毒毒株JS/LG/21-7GD，进行了基因工程改造，其传代病毒株或突变病毒株相对于JS/LG/21更能体现本发明的贡献。临床致病性与免疫原性相对于JS/LG/21-7GD株没有变化的传代病毒株或突变病毒株，应当视为本发明的直接贡献。
本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的基因工程病毒毒株的制备方法，所述制备方法为：使所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种失活。
在一些实施方式中，所述制备方法为：敲除所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种。
在一些实施方式中，所述制备方法为：通过同源重组方法，敲除所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种。
本发明第四方面提供了一种基因工程疫苗组合物，所述基因工程疫苗组合物以本发明第一方面或第二方面所述的基因工程病毒毒株或通过本发明第三方面所述的制备方法制备得到的基因工程病毒毒株为唯一免疫原，多价疫苗中的一种免疫原，或多联疫苗中的一种免疫原。
在一些实施方式中，所述基因工程疫苗组合物为活病毒疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述基因工程疫苗组合物还包括辅料。
本发明第五方面提供了本发明第一方面或第二方面所述的基因工程病毒毒株，本发明第三方面所述的制备方法，或本发明第四方面所述的基因工程疫苗组合物，在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以预防、减缓和/或控制非洲猪瘟的制剂中的用途。
本发明相对于现有技术的优点在于：
1、JS/LG/21-7GD的构建为非猪猪瘟免疫机理的研究提供了一种模型。
2、JS/LG/21-7GD的构建有望同时对基因I型和基因II毒株提供保护。
附图说明
图1示出了JS/LG/21株与ASFV p72多克隆抗体特异性反应(IFA)的荧光照片。
图2示出了JS/LG/21株的HAD效应照片。
图3示出了JS/LG/21株的系统发育树。
图4示出了一些JS/LG/21株的SNPs。
图5示出了一些JS/LG/21株的全基因组图谱。
图6示出了重组病毒分离株JS/LG/21株对猪的致病性和传播力。
图7示出了JS/LG/21-7GD接种猪后的毒力和传播力。
图8示出了HLJ/18-7GD疫苗对HLJ-18或重组病毒分离株JS/LG/21攻击的保护效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明没有说明的材料与仪器为本领域常规材料与仪器，本发明没有说明的操作细节为本领域常规操作，本发明所用软件参照软件提供者的使用说明通过常规方法进行操作，本发明所用试剂盒参照试剂盒使用说明书通过常规方法进行操作。
本发明所示核酸序列均是按照5’到3’的方向从左到右书写，蛋白按照N端到C端的方向从左到右书写。
实验设施和伦理学声明
本发明所有活非洲猪瘟病毒实验均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所BSL-3/ABSL-3生物安全设施中进行，该设施经农业农村部批准。本发明遵守中华人民共和国科学技术部《实验动物护理与使用指南》进行操作。
实施例1：病毒分离
(1)病例
在中国某养猪场发生了疑似非洲猪瘟病例，取病例组织进行病毒鉴定与分离。
(2)病毒分离
将疑似非洲猪瘟发病猪肺脏研磨匀浆，按5％(v/v)接种原代猪肺泡巨噬细胞(Primary porcine alveolar macrophages，PAMs)，培养液为RPMI 1640完全培养基，在接种后第5天(p.i)，对细胞接种培养上清液采用WOAH推荐的qPCR检测ASFVs B646L基因，结果为阳性。收集阳性细胞接种培养上清液，采用常规有限稀释方法和前述qPCR检测方法，在PAMs细胞中进行3轮常规病毒纯化，最终分离到一株初步判断为非洲猪瘟病毒的病毒，命名为Pig/Jiangsu/LG/2021，简称JS/LG/21株。
(3)病毒增殖
将PAMs以5×107个细胞/75cm2细胞培养瓶的用量加入培养瓶，培养液为RPMI 1640完全培养基，20ml/瓶。置37℃5％CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，按MOI 0.1剂量接种JS/LG/21，96h后收获病毒培养液，置-70℃保存。
实施例2：病毒鉴定
(1)特异性及纯粹性鉴定
分离的病毒株JS/LG/21按MOI 0.1接种96孔板PAMs单层，置37℃5％CO2培养箱中培养48h。弃病毒培养液，加入4％多聚甲醛室温固定30min，PBS浸洗2次；加入0.25％Triton-X100室温透膜15min，PBS浸洗2次；加入兔抗非洲猪瘟病毒p72多克隆抗体，37℃孵育0.5h，PBS浸洗5次；加入FITC标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育0.5h，PBS浸洗5次；荧光显微镜下观察。结果显示JS/LG/21接种孔可见特异性绿色荧光(图1)，未接种孔没有荧光，表明分离株为非洲猪瘟病毒。
采用PCR或RT-PCR检测猪圆环病毒2型病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒、古典猪瘟病毒的方法扩增JS/LG/21样本，结果均为阴性。
参照《中华人民共和国兽药典》(2020年版，三部)附录3306和3308的方法对JS/LG/21样本进行细菌和支原体检验，结果均为阴性。
(2)红细胞吸附(HAD)效价的测定
用RPMI 1640完全培养基将JS/LG/21培养物上清进行10倍系列稀释，分别接种于96孔板含有0.1％猪红细胞的PBMCs(猪外周血单核细胞)的RPMI 1640完全培养基悬液中。每天在显微镜下观察HAD，连续观察7天。用Reed-Muench方法计算HAD效价。与2021年报道在中国检测到的SD/DY-I/21株等基因I型ASF病毒均为HAD阴性不同，JS/LG/21株具有HAD效应(图2)，效价为1×107.20HAD50/ml。
实施例3：基因组测序和遗传分析
使用一系列毒株间保守的特异性引物和高保真反应体系，通过PCR扩增，覆盖全基因组的一系列ASFV基因组片段，使用Sanger DNA测序方法进行测序，然后拼接出JS/LG/21株全基因组序列。
使用程序MAFFT v7中的EINS-i对所有ASFV基因组进行比对，使用Gblocks-0.91排除比对不明确的区域，构建系统发育树。将JS/LG/21株的全基因组序列用BLAST RingImage Generator(BRIG)软件绘制ASFV基因组图谱。JS/LG/21株的全基因组序列分别与基因II型病毒HLJ/18株(Pig/HLJ/2018，GenBank:MK333180.1)和基因I型病毒SD/DY-I/21株(Pig/SD/DY-I/2021，GenBank:MZ945537.1)的重组区域和开放读码框(ORFs)进行比较。采用4.1.8和MEGAX等生物软件对多个序列进行比对。
根据B646L基因序列分析，JS/LG/21株为基因I型。EP402R基因与我国首次分离的基因II型病毒HLJ/18株基因同源性为100％，而与我国发现的基因I型病毒SD/DY-I/21株的基因同源性仅为81％。表明，B646L基因和EP402R基因分别来自基因I型和基因II型病毒。
全基因组系列测定及分析表明，JS/LG/21的基因组长度分别为185431个碱基对(bps)，含有172个开放阅读框(ORFs)。本发明将JS/LG/21的基因组系列与GenBank中可获得的8种不同基因型的56个参考病毒进行了系统进化分析，结果显示JS/LG/21株在系统发生树中形成一个独特的分支，介于基因I型和基因II型病毒之间(图3)。
发现有20个基因组片段(F1到F20)依次在JS/LG/21上为基因I型与基因II型片段的交替排列，JS/LG/21株上20个基因组片段的起始碱基位置与长度，与HLJ/18株和SD/DY-I/21株的基因片段同源性和基因型数据参见表1。georgia07样基因II型和NH/p68样基因I型的ASFV在中国已经检出。它们各自的代表是基因II型病毒HLJ/18(GenBank:MK333180.1)和基因I型病毒SD/DY-I/21(GenBank:MZ945537.1)，两者的核苷酸同源性为97.38％。与SD/DY-I/21相比，HLJ/18基因组有21062bp的插入、4237bp的缺失和3840bp的突变。这两种病毒与JS/LG/21在其基因组的编码区和非编码区均有基因型特异性单核苷酸多态性(SNPs)(图4)。为了确定重组病毒分离株JS/LG/21的基因组特征，本发明进行了重组分析，根据基因I型和II型ASFV的特异性SNPs确定不同片段的可能亲本。详细比较结果显示，10个大的离散基因组片段具有基因I型特异性SNPs(图4)，与SD/DY-I/21的基因组片段的一致性为99.36％-100％，但与HLJ/18的基因组片段的一致性为71.28％-99.15％(表1)。其他10个离散基因组片段具有基因II型特异性SNPs(图4)，与HLJ/18基因组片段的一致性为99.95％-100％，与SD/DY-I/21基因组片段的一致性为27.50％-98.32％(表1)。来自基因I型的10个片段的总长度为80648bp，占其基因组的43.51％，而来自基因II型的10个片段的总长度为104694bp。需要注意的是，JS/LG/21株的基因型决定基因B646L均位于来自基因I型病毒的片段9(F9)中，而编码CD2v的EP402R基因位于来自基因II型病毒的片段6(F6)中(图5)。因此，JS/LG/21株是具有基因I型和基因II型ASFV嵌合基因组的复杂重组病毒。
图3中，重组病毒分离株与GenBank数据库中8种不同基因型56株参考ASFVs的全基因组序列，采用最大相似度和和IQ-tree构建系统发育树。图4中，两个重组片段连接区域的特异性单核苷酸多态性，其中基因组标号以SD/DY-I/21株为基准。采用SnapGene软件将重组ASFV的全基因组与NH/P68样基因I型代表株ASFV SD/DY-I/21和Georgia07样基因II型代表株ASFV HLJ/18全基因组进行比较。图5中，利用BLAST Ring Image Generator软件构建JS/LG/21全基因组图谱，空心弧线表示源自基因I型，实心弧线表示来自基因II型。
表1.重组病毒分离株JS/LG/21的基因片段与基因I型和基因II型非洲猪瘟病毒的相应片段的核苷酸同源性比对
发明人之前的研究发现，核苷酸突变、插入和缺失在ASFVs中频繁发生，一些变化导致了ORFs的改变。因此，本发明将JS/LG/21株的基因组与SD/DY-I/21和HLJ/18的基因组进行了比较。与SD/DY-I/21的同源片段相比，JS/LG/21株在4个不同片段的6个ORFs中有8个单核苷酸突变，其中F1的非编码区出现1个单核苷酸突变、4个单核苷酸缺失和1个3个核苷酸缺失。JS/LG/21存在MGF_110-13/14L的C缺失，在编码区存在一个独特的单核苷酸突变和36个核苷酸的缺失。与HLJ/18的同源基因组序列相比，JS/LG/21株存在2个单核苷酸插入。
JS/LG/21株典型基因序列：
B646L基因，位于JS/LG/21株基因组99,512-101,452位(基因I型，F9片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.1)：
ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATTGGCCCAAGACTTGCTTAATAGCAGGATTTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGACCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCACCATATATTGGGTGCATGTCATTCGTCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGGCACGGCCCAGATGGGGGCCCATGGTCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCCTTTGGAAGACCTATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTGGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACTAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACGTGCAGCCATACCAACCCGAAATTCCTTTCACAACATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACGGACGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGCTGCGCTTTTGGTTTAACGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCGGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTATACGCCAGTCGCGTTTTATACCTGGACGCCCCAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACATCAATAACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGATTTTCCCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCTACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCGGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAGTTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCAATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA
B646L基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.2)：
MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPVGFEYNKVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTAQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRPIVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVNLAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFIRQSRFIPGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST
MGF_505-1R(简称MGF505-1R)基因位于JS/LG/21株基因组23250-24845位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.3)：
ATGTTCTCTCTCCAGAACTTATGTCGAAAAACATTACCTAACCGTAAACTTCCTGAATTTTTTGACGAATATATATTACAACTGCTGGGATTATACTGGGAAAACCATGGAACTATTCAACGAGCAGGAAACAACTGTGTGCTTATACAGCAACATACCCTCATTCCCGTAAATGAAGCCCTGAGAACAGCAGCATCTGAAGAAAATTATGAGATCGTGAGCCTTTTATTAGCGTGGGAGGGGAACCTTTACTATGCTATTATAGGGGCTCTAGAGGGCAACCGCCACGACTTAATTCGTAAATATGATGACCAAATCAAGGACCATCATGAAATTCTGCCATTCATTGACGATCCAGTCATATTTCACAAATGCCATATCATGCGGCAATGCTTTTTTGATTGTATTTTATATCAAGCTGTAAAATATAGTAAGTTTCGCGTTCTTCTTTACTTTAAACATAGATTAGAGGATGATTTGCCCTTCACTCATTTACTTATTGAAAAGGCATGTAAAGATCATAATTATGAAGTTATTAAATGGATATATGAAAACCTACATATCTACAATATGATAGATACCTTTGAATGTGCTATTGCCCATAAGGATCTACATCTATATTGTTTGGGGTATAGATTTATATATAACAGAATCGTACCCGATAAGTATCATCATTTAGATATTCGCATGCTTTCAAGCCTACAACTCCTACATAAGGTGGCAGCCAAAGGATACTTAGATTTTATCCTAGAAACCTTAAAGTATGATCATAATAAAGATAATATAAATATTATTCTAACACAAGCTGCAACCTATAACCATAGAAAAATTTTAATCTATTTCATTCCTCAATCAACCCACGCACAGATAGAACAATGTTTACTAGTGGCGATAAAAGCAAAATCTTCCAGGAAAACCTTGAACTTACTACTGTCTCACCTAAACCTTTCCATCAACCTCATCAAAAAAATAAGCCATTATGTTGCCACTTACAATTCAACAAATATAATAGGCATTCTGAGTATGCGGCGGAAAAAGAAGATATATTTAGATATCATATTGACAAAATTTGTAAAAAAAGCTATTTTTAATAAGTTTGTCGTTCGATGTATGGATACATTTTCTATAAACCCGGAAAGAATCCTTAAAATAGCCGCGCGAATAAATAGGATGATGTTAGTGAAAAAAATATCTGAACATGTTTGGAAAAATCATGCGGTTAGACTTAAATACCTTAAACATGCGGTACACACGATGAAGCATAAAGATGGGAAAAATAGACTCATGAACTTTATCTATGATCGCTGTTATTACCATATGCAAGGGGAAGAAATCTTTAGCCTCGCAAGATTTTATGCAATCCATCATGCACCAAAGTTGTTTGACGTTTTTTATGATTGTTGTATCCTAGATACGATACGATTCAAAAGCCTTCTTTTAGATTGTTCACATATCATAGGTAAAAACGCTCATGATGCTACCAATATCAACATCGTGAACAAGTATATCGGCAACCTGTTTGTTATGGGAGTTCTTAGCAAAAAAGAAATCTTACAGGACTATCCATCCATTTATTCTAAACAATACATGCCTTAG
MGF_505-1R基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.4)：
MFSLQNLCRKTLPNRKLPEFFDEYILQLLGLYWENHGTIQRAGNNCVLIQQHTLIPVNEALRTAASEENYEIVSLLLAWEGNLYYAIIGALEGNRHDLIRKYDDQIKDHHEILPFIDDPVIFHKCHIMRQCFFDCILYQAVKYSKFRVLLYFKHRLEDDLPFTHLLIEKACKDHNYEVIKWIYENLHIYNMIDTFECAIAHKDLHLYCLGYRFIYNRIVPDKYHHLDIRMLSSLQLLHKVAAKGYLDFILETLKYDHNKDNINIILTQAATYNHRKILIYFIPQSTHAQIEQCLLVAIKAKSSRKTLNLLLSHLNLSINLIKKISHYVATYNSTNIIGILSMRRKKKIYLDIILTKFVKKAIFNKFVVRCMDTFSINPERILKIAARINRMMLVKKISEHVWKNHAVRLKYLKHAVHTMKHKDGKNRLMNFIYDRCYYHMQGEEIFSLARFYAIHHAPKLFDVFYDCCILDTIRFKSLLLDCSHIIGKNAHDATNINIVNKYIGNLFVMGVLSKKEILQDYPSIYSKQYMP
MGF_505-2R(简称MGF505-2R)基因位于JS/LG/21株基因组28637-30217位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.5)：
ATGTTTTCCCTTCAAGACCTTTGCCGAAAGCATCTTTTTATTCTTCCCGATGTTTTTGGCGAGCATGTACTACAACGATTAGGACTGTATTGGAGATGTCACGGCTCCCTTCAACGCATAGGAGACGACCACATACTCATACGACGGGATCTCATCCTTTCCACCAACGAGGCCTTAAGAATGGCGGGAGAGGAAGGAAACAATGAAGTAGTAAAGCTCTTGTTACTGTGGAAGGGAAATCTTCATTACGCCGTCATAGGAGCCTTGCAGGGTGATCAATATGACCTGATCCATAAGTATGAAAACCAAATCGGCGACTTTCATTTTATCTTACCATTGATTCAAGACGCGAATACGTTTGAAAAATGCCACGCTTTAGAACGTTTTTGTGGTGTTTCATGTCTGCTAAAACATGCTACAAAATACAACATGCTCCCTATTCTCCAAAAATACCAAGAAGAGCTGTCTATGAGAGCGTATCTTCACGAAACCCTATTTGAACTAGCATGCCTATGGCAGAGGTATGATGTCCTTAAATGGATAGAGCAAACCATACATGTTTACGACCTAAAGATTATGTTTAATATTGCCATCTCCAAGAGGGATCTGACTATGTACTCCTTAGGATATATTTTCCTTTTTGATAGAGGGAACACCGAAGCTACGTTGCTAACGCAACATCTCAAGAAGACAGCGGCCAAAGGGCTCCTCCACTTTGTGCTAGAAACGTTAAAATACGGCGGCAaCATAGATACCGTCCTGACCCAAGCCGTaAAGTACAATCATAGAAAACTTTTAGATTATTTTCTGCGTCAaCTACCTCGTAAACATATTGaAAAACTTTTGTTGCTGGCCGTGCAGGAAAAGGCTTCTAAAAAAACATTGAACTTACTGTTGTCACATTTAAACTACTCCGTGAAACGCATCAAAAAACTACCGCGCTATGTGATAGAGTACGAGTCCACCTTGGTGATAAAGATTTTATTAAAAAAAAGAGTGAACCTGATAGATGCCATGTTGGAAAAGATGGTAAGATATTTTTCTGCGACGAAAGTGAGGACGATCATGGATGAGCTTTCGATTAGTCCGGAAAGAGTCATTAAGATGGCTATACAGAAAATGAGAACGGATATCGTAATCCATACTTCTTATGTTTGGGAGGATGATCTAGAACGTCTTACTCGTCTTAAAAATATGGTATACACCATAAAGTACGAACATGGGAAAAAAATGTTAATTAAAGTCATGCACGGCATATACAAAAACTTAtTATACGGCGAAAGGGAAAAAGTCATGTTTTATTTAGCCAAGCTCTATGTTGCTCAAAACGCGGCCACCCAATTCAGAGACATTTGTAAGGACTGTTACAAACTGGATGTGGCACGGTTTAAACCGCGGTTTAAGCAACTAATATTAGACTGTTTAGAAATTATTACTAAAAAATCTTGCTATAGTATCCTGGAAATCTTAGAAAAACATATTATTTCCCTGTTTACTATGAAAGTTATGACTGAAGAAGAAAAAAACCTATGTTTAGAAATATTATATAAAGTAATTCATTATAAAACAATACAATGTTAA
MGF_505-2R基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.6)：
MFSLQDLCRKHLFILPDVFGEHVLQRLGLYWRCHGSLQRIGDDHILIRRDLILSTNEALRMAGEEGNNEVVKLLLLWKGNLHYAVIGALQGDQYDLIHKYENQIGDFHFILPLIQDANTFEKCHALERFCGVSCLLKHATKYNMLPILQKYQEELSMRAYLHETLFELACLWQRYDVLKWIEQTIHVYDLKIMFNIAISKRDLTMYSLGYIFLFDRGNTEATLLTQHLKKTAAKGLLHFVLETLKYGGNIDTVLTQAVKYNHRKLLDYFLRQLPRKHIEKLLLLAVQEKASKKTLNLLLSHLNYSVKRIKKLPRYVIEYESTLVIKILLKKRVNLIDAMLEKMVRYFSATKVRTIMDELSISPERVIKMAIQKMRTDIVIHTSYVWEDDLERLTRLKNMVYTIKYEHGKKMLIKVMHGIYKNLLYGEREKVMFYLAKLYVAQNAATQFRDICKDCYKLDVARFKPRFKQLILDCLEIITKKSCYSILEILEKHIISLFTMKVMTEEEKNLCLEILYKVIHYKTIQC
MGF_505-3R(简称MGF505-3R)基因位于JS/LG/21株基因组30304-31146位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.7)：
ATGTCCTCTTCTCTTCAGGAACTTTGTCGAAAAAAGCTGCCTGACTGCATACTTCCAGAGTTTTTTGACGACTATGTATTGCAACTGTTAGGACTGCACTGGCAAGATCATGGTTCCCTTCAGCGTATCGAGAAGAACCAGATACTTGTTCAACAGGAACCCATCCATATCAATGAAGCACTCAAAGTAGCAGCATCGGAAGGGAACTATGAAATCGTAGAGCTGTTGTTGTCATGGGAGGCAGATCCCCGCTACGCCGTCGTAGGAGCCCTAGAAAGCAAATACTATGACCTGGTTTACAAATACTATGACCAAGTTAAAGACTGCCATGATATCTTGCCGCTGATTCAAAATCCGGAAACATTCGAAAGATGTCATGAGTTAAACAGCACCTGTTCACTGAAATGCTTATTCAAGCATGCTGTGATAAATGACATGCTGCCGATTCTTCAAAAATATACAGACTATCTGGATAGGTGGGAGTATTGCAGCCAGATGCTGTTCGAACTGGCATGTAGTAAAAAAAAATATGAGATGGTTGTGTGGATAGAGGGAGTTCTAGGCGTCGGCAAAGTTACATCTCTTTTCACCATTGCGATTAGCAACAGAGACCTACAGCTGTATTCTCTGGGCTACTCAATTATCCTTGAGAATTTGTACTCCTGTGGACAGGACCCCAAGTTTTTACTAAATCATTTCCTGCGAGACGTTTCAATAAAAGGGCTTCTACCCTTTGTAATCAAAACCATAGAATATGGTGGAAGCAAGGAGATAGCCATAACTCTGGCTAAAAAATATCAGCATAAACATATTTTGAAATACTTCGAAACCTGGGAAAGCTAG
MGF_505-3R基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.8)：
MSSSLQELCRKKLPDCILPEFFDDYVLQLLGLHWQDHGSLQRIEKNQILVQQEPIHINEALKVAASEGNYEIVELLLSWEADPRYAVVGALESKYYDLVYKYYDQVKDCHDILPLIQNPETFERCHELNSTCSLKCLFKHAVINDMLPILQKYTDYLDRWEYCSQMLFELACSKKKYEMVVWIEGVLGVGKVTSLFTIAISNRDLQLYSLGYSIILENLYSCGQDPKFLLNHFLRDVSIKGLLPFVIKTIEYGGSKEIAITLAKKYQHKHILKYFETWES
JS/LG/21株MGF_360-12L(简称MGF360-12L)基因位于JS/LG/21株基因组24898-25950位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.9)：
ATGTTGCCTTCCCTGCAATCTCTGACCAAAAAGGTGTTGGCTGGACAATGCGTGCCCACGAACCAACATTATCTTTTAAAGTGTTATGACCTATGGTGGCATGATGCTCCGATCACGTTTGATCATAACCTAAGGCTCATAAAATCAGCAGGTATTAAAGAGGGCTTAAACCTAAATACGGCGTTAGTGAAGGCTGTAAGGGAAAACAACTACAACCTTATAAAACTGTTTGCAGAGTGGGGGGCGGACATCAACTACGGGCTGGTATCTGTCAACACGGAGCACACCTGGGACCTCTGTCGAGAGCTAGGTGCCAAGGAAACCTTGAATGAAGAAGAAATTTTACAAATTTTTATAGATCTAAAGTTTCATAAAACTAGTAGTAACATTATTTTATGCCATGAGGTGTTTTCCAACAATCCGATATTACAAAAAGTAAATAATATAAAAATGAGGATAGAAATTTTCTGGGAGTTAAGGGAGTTAATAGTAAAAACCGATCTGCTAAATAATGAGTTTTCGCTCAGTACATTACTACTCAAATACTGGTACGCTATAGCCATACGCTATAACCTGAAAGAGGCCATACAGTATTTTTACCAAAAATATACACACCTGAATACGTGGCGGTTAACATGTGCTCTTTGTTTTAATAATGTGTTTGACCTTCATGAGGCGTATGAAAAGGACAAGATCCATATGGACATAGAAGAGATGATGCGGATCGCCTGCATCAAAGACCACAACCTTTCAACCATGTACTACTGCTATGTCCTGGGCGCCAACATCAATCAAGCCATGCTTAGCTCAATACAGTACTATAATATAGAAAACATGTTCTTTTGTATAGATCTGGGGGCTGATGTTTTCGAAGAGGGTACTACAGCTTTAGGGGAAGGGTATGAGCTTATAAAGAACATTTTATCCCTAAAGATTTATAGTCCGGCCACCACCCCGTTGCCTAAAAGCACGGACCCTGAAATCATAGATCATGCGTTAAAAAATTACGTTTCAAAAAATATGATGATCTTCCTTACCTATGATTTAAGATGA
MGF_360-12L基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.10)：
MLPSLQSLTKKVLAGQCVPTNQHYLLKCYDLWWHDAPITFDHNLRLIKSAGIKEGLNLNTALVKAVRENNYNLIKLFAEWGADINYGLVSVNTEHTWDLCRELGAKETLNEEEILQIFIDLKFHKTSSNIILCHEVFSNNPILQKVNNIKMRIEIFWELRELIVKTDLLNNEFSLSTLLLKYWYAIAIRYNLKEAIQYFYQKYTHLNTWRLTCALCFNNVFDLHEAYEKDKIHMDIEEMMRIACIKDHNLSTMYYCYVLGANINQAMLSSIQYYNIENMFFCIDLGADVFEEGTTALGEGYELIKNILSLKIYSPATTPLPKSTDPEIIDHALKNYVSKNMMIFLTYDLR
MGF_360-13L(简称MGF360-13L)基因位于JS/LG/21株基因组26111-27172位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.11)：
ATGTCGTTGCCGCTCTCTCTGCAGACCCTCGTCAAAAAGACGATAGCCAGCCAGTGTTTGTCAATAGATGAACACTGCATTTTGAAATATTGTGGCCTATGGTGGCATGATGCTCCTCTCAAGCTTTGTATGGATCGTGGCCGAATACAAATAAAATCAGGATTTTTAGGAGAAGATATAGACCTTCGTGTGGCATTAATAATAGCTGTTAAGGAAAACAACTATAGTCTGATAAAGCTCTTTACAGAGTGGGGCGCAAATATCAACTATGGTTTGCTTTCTATCAATACGAAGCACATCCGAGAGTTGTGTAGACAGCTAGGCGCCAAAGAAACTCTAGAGGACAACGATATTTTCCGTATTTTTACCAGGATAATGCACAATAAAACCAGCGGCAGTATTATTTTGTGCCATGAAATTTTTATGAATAATCCTATTTTAGAAAACAAATTTGTTATACAATTAAGGGGCTTAATTTATAAAAGACTATGGGGGCTCATAGAAATAAAAGAAACGGACGAGTTAAATGGTTTACTAGTGAAGTATTGGTACGCCAAAGCAGTACAATACGATTGTAAGGACGCCATTTGTTTTCTAGATGAGAAATATACGGATCTTAATGAATGGCGATTAAAATGTCTCCTGTATTATAACAAAATATATGAGCTTCATGAGATGTACCACAAGGAAAACATCCAAATAGACGTCCATGACATGATATGTCTGGCTTCTACCAAGGATAACAATCCATTAACAATATATTACTGTTACGCGCTGGGGGGCAACATCAACCAAGCTATGCTTACTTCAGTACAATATTATAACATCGGTAATATATTTTTCTGTATAGATTTGGGTGGTAATGCCTTtGAAGAGGGTCGTGCCATAGCGGAACAAAAAGGTTATAATTTTCTGAGCCATAGTTTGGCTTTGGATATTTACAGCTCAGATGCTTCCTTGCCACTAAACTTAAAGGACCCCGAAGAAATAAGCAGTTTATTAAAAGATTATAAATCAAAAAACTTATCCATCATTTGGGAATATTCTCATAATATACTATAG
MGF_360-13L基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.12)：
MSLPLSLQTLVKKTIASQCLSIDEHCILKYCGLWWHDAPLKLCMDRGRIQIKSGFLGEDIDLRVALIIAVKENNYSLIKLFTEWGANINYGLLSINTKHIRELCRQLGAKETLEDNDIFRIFTRIMHNKTSGSIILCHEIFMNNPILENKFVIQLRGLIYKRLWGLIEIKETDELNGLLVKYWYAKAVQYDCKDAICFLDEKYTDLNEWRLKCLLYYNKIYELHEMYHKENIQIDVHDMICLASTKDNNPLTIYYCYALGGNINQAMLTSVQYYNIGNIFFCIDLGGNAFEEGRAIAEQKGYNFLSHSLALDIYSSDASLPLNLKDPEEISSLLKDYKSKNLSIIWEYSHNIL
MGF_360-14L(简称MGF360-14L)基因位于JS/LG/21株基因组27568-28431位(基因II型F2片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.13)：
ATGTTGTCTTTACAAACGTTGGCCAAAAAAGTTGTGGCATGCAATTATCTTTCAAGTGACTATGATTATACGTTGCAGCGTTTTGGTTTGTGGTGGGATTTAGGTCCTATTCACCTATGTAACAATTGTAAGCAAGTTTTTTCGTATAAACATTTACAGTGTTTTTCTGAGGATGATCTTTGTCTCGAAGCGGCGCTAGTAAAGGCCGTGAAGAGCGATAATCTTGAACTTATACGTTTATTTGTGGATTGGGGCGCAAATCCTGAATATGGGCTTATACGTGTTCCTGCCGTGTATCTAAAGCGGCTGTGTGCGGAACTGGGAGGCTTAACGCCTGTATCCGAACCCCGTCTTCTGGAAATTTTAAAAGAAGTGGCCAGGCTAAAATCCTGTGCAGGAGTTCTGCTGGGTTATGACATGTTTTGTCATAATCCACTCTTGGAAACCGTAACTAGAACCACTTTAGACACAGTTACGTACACCTGTTCAAACATTCCGTTGACGGGGGATACGGCGCACCACCTATTAACAAAGTTTTGGTTTGCCCTGGCATTACGACATAATTTTACAAAGGCTATTCACTATTTCTATAAAAGGCATAAAAATCACCTCTATTGGCGGGTAGCTTGTAGCCTTTATTTTAATAACATTTTTGACATACACGAGTTGTGTCGTGAAAAAGAGATTTGCATCAGCCCTAATCTGATGATGAAATTTGCTTGCTTGCGGGAAAAAAATTACGCGGCCATTTATTACTGTCATAGGTTGGGGGCTAGTCTCGATTATGGCATGAATCTTTCTATCTATAACAATAATACTTTAAACATGTTTTTCTGTATTGATTTGGGGGGCTGCCGATTTTGAMGF_360-14L基因蛋白序列如下(SEQ IDNO.14)：
MLSLQTLAKKVVACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCKQVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKAVKSDNLELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKRLCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVARLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTYTCSNIPLTGDTAHHLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNHLYWRVACSLYFNNIFDIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIYYCHRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNMFFCIDLGGCRF
EP402R基因(编码CD2v蛋白)位于JS/LG/21株基因组68885-69967位(基因II型F6片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.15)：
ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATTATATTCCATTAAGCATCATAATTGGGATAACAATAAGTATTCTTCTTATATCCATCATAACTTTTTTATCTTTACGAAAAAGAAAAAAACATGTTGAAGAAATAGAAAGTCCACCACCTGAATCTAATGAAGAAGAACAATGTCAGCATGATGACACCACTTCCATACATGAACCATCTCCCAGAGAACCATTACTTCCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGTATAATACACCTATTTACTACATGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACCCATTTCCCTTACCTAAACCGTGTCCTCCACCCAAACCATGTCCGCCACCCAAACCATGTCCTCCACCTAAACCATGTCCTTCAGCTGAATCCTATTCTCCACCCAAACCACTACCTAGTATCCCGCTACTACCCAATATCCCGCCATTATCTACCCAAAATATTTCGCTTATTCACGTAGATAGAATTATTTAA
EP402R基因蛋白序列如下(SEQ ID NO.16)：
MIILIFLIFSNIVLSIDYWVSFNKTIILDSNITNDNNDINGVSWNFFNNSFNTLATCGKAGNFCECSNYSTSIYNITNNCSLTIFPHNDVFDTTYQVVWNQIINYTIKLLTPATPPNITYNCTNFLITCKKNNGTNTNIYLNINDTFVKYTNESILEYNWNNSNINNFTATCIINNTISTSNETTLINCTYLTLSSNYFYTFFKLYYIPLSIIIGITISILLISIITFLSLRKRKKHVEEIESPPPESNEEEQCQHDDTTSIHEPSPREPLLPKPYSRYQYNTPIYYMRPSTQPLNPFPLPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPSAESYSPPKPLPSIPLLPNIPPLSTQNISLIHVDRII
B602L基因，Blast per identity最高为98.21％，位于JS/LG/21株基因组96,225-98,201位(基因I型，F9片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.17)：。
ATGGCAGAATTTAATATTGATGAGCTTCTCAAAAACGTATTGGAGGATCCCTCTACTGAAATATCCGAAGAAACGCTTAAACAGCTTTATCAAAGGACGAACCCTTACAAACAGTTCAAAAATGATAGCAGGGTGGCCTTTTGCTCTTTTACAAATTTGCGGGAGCAGTATATTCGACGTCTTATAATGACTAGCTTTATTGGATATGTCTTCAAAGCTCTGCAGGAATGGATGCCTTCCTATTCAAAACCTACCCACACGACCAAAACTCTTCTCAGTGAGCTAATAACGTTAGTTGATACTTTGAAACAGGAAACTAATGATGTTCCCTCTGAATCGGTAGTAAATACAATTTTATCTATAGCGGATAGCTGCAAAACCCAGACGCAGAAAAGCAAGGAAGCTAAAACAACGATCGATAGCTTTTTACGAGAACATTTTGTGTTTGATCCTAATCTTCATGCTCAAAGTGCGTATACTTGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACAGGTGCAAGCACAGGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACTTGTGCAAGCACAGGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACTTGTGCAGATACCAATGTAAACACTTGTGCAAGCATGTGTGCAGATACCAATGTAGACACCTGTGCAAGCACCTGTGCAAACACCTGTGCAAGCACAGAATACACCGATTTAGCAGATCCTGAGCGCATCCCTTTACACATCATGCAAAAAACATTAAATGTGCCTAATGAGCTTCAGGCCGATATTGATGCAATTACCCAAACCCCACAGGGCTATAGGGCAGCAGCCCACATATTACAAAATATAGAACTTCATCAAAGCATTAAACATATGCTTGAAAATCCGAGGGCGTTTAAACCCATTCTCTTTAACACAAAAATTACTAGATATCTTTCGCAGCATATTCCACCTCAGGATACTTTTTATAAGTGGAATTATTACATTGAGGATAATTACGAAGAGTTGCGGGCCGCTACGGAAAGCATCTACCCAGAAAAGCCCGACCTAGAGTTTGCCTTCATTATTTATGATGTGGTGGATAGCAGCAACCAACAAAAGGTTGATGAATTTTATTATAAATATAAAGACCAGATTTTCTCAGAGGTTTCATCCATTCAATTAGGCAACTGGACACTCCTGGGAAGCTTTAAGGCCAACAGAGAGCGCTACAATTATTTTAATCAAAATAATGAAATAATAAAACGGATTTTGGACCGTCATGAGGAAGACCTAAAGATAGGAAAAGAGATTCTACGAAATACCATTTACCACAAAAAAGCAAAAAATATACAAGAAACCGGCCCGGATGCTCCGGGGCTCTCCATCTATAATTCAACCTTTCACACGGATAGCGGGATTAAGGGACTGCTTTCCTTTAAGGAGCTAAAAAACCTAGAAAAAGCATCTGGAAATATCAAAAAAGCTCGAGAGTATGATTTTATAGACGACTGCGAAGAAAAAATTAAGCAACTGCTTAGTAAAGAAAATTTAACCCCCGATGAAGAAAGCGAGCTGATAAAAACAAAAAAACAGTTAAATAATGCGCTTGAAATGCTCAATGTGCCTGATGATACGATACGGGTAGATATGTGGGTCAACAATAATAATAAACTCGAAAAAGAAATTTTATATACAAAAGCAGAATTGTAA
C122R基因，Blast per identity最高为99.69％，位于JS/LG/21株基因组79,743-80,060位(基因I型，F7片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.18)：
ATGAAAATTTGTAAGGCTTGCAGTTCTTGTATGGTCAGAACCTATGTCGATGGAAACATTATTTTTCGCTGCAGCTGCGGCGAAAGCGTTCAAGGGGATAGTCAAAACTTGCTCGTCTCTAGCAAGGTGTACCACACCGGGGAAATGGAAAATAAGTACAAGATTTTTATTAAAAATGCACCCTTTGACCCCACGAATTGCCAAATAAAAAAGGATTGCCCGAATTGTCATTTAGACTATTTGACACAAATCTGTATTGGAAGCCAAAAAATCATTATATTGGTGTGCCGCTGTGGCTATATGAGCAACAGAGGATAA
JS/LG/21株D345L基因，Blast per identity最高为99.81％，位于JS/LG/21株基因组140,959-141,996位(基因I型，F17片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.19)：
ATGGAAACCTTTGTACGCCTGTTTAAAGACTCTCCTCAGCAGCGCTCCGATGCCTGGCATGCTATTCGTCGCACTCAGGTGGGTGGCTCTGACCTTGCTAGCGTTTTAGGTTTAAACCCTTACAAAAGCTATTATATAATCTTGGCGGAAAAAGCAAATCTTTTTAAGAAGAATTTGAACCGCGCTGCTTGTAGCTGGGGAACCCTTTTTGAGCGAGTTAGTAAAGATCTGCTTGAGTTGTTCTGCCAAACCACCGTCATAGGTGACAATATTCATATTGATGGGACCTATTTGGGATACCCCGGACATAGTAATAGCCCCGATGGGTTTTGTCACCTAACGCTGGGATACACTCAACAGTCCTGGGAAATCAAAACAATTTTTAACAACGTACGCTATGAGGCCACGAAACGCATCCCCGTGCTGGTAGAAATAAAGTCCCCATTCAACCGAAAAATAAAAAACTCGGTGCCCTCCTACTATATGCCGCAAATACAATCCGGTCTTGCCCTTTCGCCGCCTATCTCTATGGGCATCTACGTCGAGGCCATGTTTCGCGTGTGCGGCATTCATCAGCTGGGATCGAATAATGAGACCAATACGGATATCCACCCTCCAGAGTCCATGCTCCCGCTTGCCTGGGGAATCATCACGATCTGCTCTACACAGGAGCACACCGAGGCTCCTCAAGATTTTGGCACGCTCGACGCGGAAACATTTCGCCAACTACTTGAAACGCTGTATCAAAAAGATCAGTACACTATTCACTATTCTATGCCTTATGAAACCGCGTGTCCCGAAATGCCAAATGTGGTTGGCTACTTTGGATGGAAGGTCTTTATCTTTCAAATAATTCCAGTTATGAAACATCCCCAGTTTTTAAAAGACAAATATCCCATCATACAACAGTTCTTACGTGACCTACATACTATTAAAGCCTCGCCATCTCCCATGGAGACGTATGAAAAAATCTGCTGCTCAGAGGAAAGCGCTCTATCCACAGAGGACATCGACAATTTTACAGATATGCTTACTTAG
MGF_100-1L基因，Blast per identity最高为99.77％，位于JS/LG/21株基因组175,428-175,853位(基因II型，F20片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.20)：
ATGGGAAACAAAGAAAGTAAGTATCTGGAGATGTGCTCGGAAGAAGCATGGTTAAACATTCCCAATATTTTCAAATGCATTTTCATAAGAAAACTGTTTTATAACAAATGGCTTAAATACCAGGAAAAAAAACTAAAAAAGAGTTTGAAACTGCTGAGTTTTTACCATCCCAAAAAAGATTTTGTAGGAATAAGAGACATGCTACAAATGGCTCCAGGAGGATCTTATTTTATTACAGATAATATGACTGAGGAGTTTTTAATGTTAGTTGTAAAGCATCCAGAAGATGGGAGTGCTGAGTTTACTAAATTATACCTTAAAGGAAGTTGCATTGTGATTGATGGATACTACTATGATAATCTTCATATCTTTATTTCAGAAACTCCTGATATATACAAATATCCCTTGATTCGTTATGATAGATAA
I9R基因，Blast per identity最高为99.68％，位于JS/LG/21株基因组177,653-177,964位(基因II型，F20片段)，编码序列如下(SEQ ID NO.21)：
ATGGGAACTTTTTCAGTAACTGCCTCTGCAAAAAGTGACGATGCTGTTTGTAAGTATTTAGAAGAACCAATAGATGAAAATTACAGAAACATATTAAGAAATGAGCATGTTAAAAAAAATTTAAATGAGGCTCTGAATCGACATATTACTACCTATAATCCAGTAGTTGATTGGTGTAATAACTATTCAACATTTTCATCTCAGGATTTCGATGAATATAAAATTTATATACATAGCGATCTTATGGATGGACGACCTCGTCCAAAAAAAAACATGGTGTGTCATCATGTAATGTTTGTTAGTTTTATATAA
NP1450L基因，Blast per identity最高为99.86％，位于JS/LG/21株基因组124,998-129,350位(基因I型与基因II型接头部分，跨越了F12和F13)，编码序列如下(SEQ IDNO.22)：
ATGGAGGCTGGATATGCCGAAATAGCCGCCGTTCAGTTCAATATTGCCGGTGACAATGACCATAAGAGGCAAGGCGTTATGGAGGTTACCATTTCTAATTTATTTGAGGGCACCCTTCCCGCCGAGGGGGGTATCTATGATGCGCGAATGGGAACCACCGATCACCATTATAAATGCATCACTTGCTCACACCAGCGCAAGCAATGTATGGGACACCCTGGGATACTGCAGATGCATGCTCCGGTGCTTCAGCCGCTCTTCATCGCCGAAATACGACGATGGTTAAGGGTTATATGCCTCAACTGCGGGGCTCCCATTGTTGACCTAAAGAGGTACGAGCATCTTATTAGGCCTAAGCGTCTTATTGAAGCGGCTTCAAGCCAAACCGAAGGAAAGCAGTGCTACGTCTGTAAGGCAGTACACCCCAAAATTGTTAAGGACTCGGAAGATTATTTTACCTTTTGGGCGGATCAGCAGGGCAAGATTGACAAACTGTACCCGCAGATCATCAGAGAGATTTTTTCGCGCGTAACCTACGACACCGTTGTAAAACTGGGGCGAAGTAAAAACTCCCATCCCGAAAAACTTGTGCTTAAGGCCATTCAGATCCCCCCCATCAGCATACGACCTGGCATCAGATTGGGAATCGGGTCAGGCCCCCAAAGCTTTCACGACATTAACAACGTGATTCAGTATCTGGTTCGAAAGAATCTGCTGATCCCGAAGGACCTACAAATCGTGCGCGGCCAAAAAATACCTTTAAATATTGACCGCAATTTGCAAACCATACAGCAACTTTACTATAACTTTTTGTTGGATTCCGTTTCCACCACCGCAACCCAGGGAGGCACGGGAAAGCGTGGGATCGTCATGGGGGCACGCCCTGCTCCCTCCATCATGCGAAGACTTCCTCGCAAGGAGGGAAGAATTCGTAAATCCCTACTGGGCAGCCAGGTATGGTCGATCAGCCGGTCCACCATCTGCGGGAACTCAGACCTTCACCTGGACGAGGTTGGCTATCCCATTTCCTTTGCACGAACGCTGCAAGTTGCGGAAACAGTGCAACATTATAATATTAATAGATTAATGCCCTATTTTTTAAATGGAAAGCGCCAGTACCCTGGTTGTTCAAGAGTGTATAAGCAAATAACACAATCCGTTCACGACATTGAGGGTCTCAAACAAGACTTTAGGCTGGAGGTAGGAGACATCCTTTACCGTGACGTCGTCACTGGCGACGTCGCGTTTTTTAATCGCCAGCCTTCTCTCGAACGAAGCAGCATAGGGGTTCACCGGATTGTCGTTTTTGAAAACCCAAAAATTTCTACGTTTCAAATGAATGTCAGCGCATGTGCCTGGTATAATGCGGACTTTGACGGGGATCAGATGAATCTCTGGGTTCCCTGGAGCGTCATGAGCCGCGTTGAGGCCGAACTACTTTGTTCTGTGCGAAACTGGTTCATTTCCACAAAGAGCTCGGGTCCCGTTAATGGGCAGGTGCAGGACTCCACGGTGGGAAGCTTTTTGCTTACACGCACGAACACCCCCATGGGGAAAAATGTGATGAACAAGCTGCACGCCATGGGGTTGTTTCAAACAACCCAAACCGACCCACCTTGTTTTGCCAACTACTCCCCAACTGACCTGCTGGATGGCAAATCGGTTGTATCTATGCTACTGAGGCAGACCCCCATCAATTATCAACGAGCCCCCACATGGTACTCAGAAGTGTATGCACCCTACATGCATTATAACAAGCAGGACATCTCTACACAAATACGCAACGGCGAACTCATTGAAGGCGTCCTTGACAAAAAGGCCGTCGGAGCGGGTTCCTCCGGTGGAATCTATCACCTTATTTCGCGTAGGTATGGGCCGCAGCAGGCCTTGAAAATGATATTTGCGACCCAGCAGCTCGCCCTAAACTACGTGCGCAACGCCGGATTCACAGTGTCCACGGCCGACATGCTCCTAACCCCGGAGGCACATCAGGAGGTCCAAGAAATTATCAATGAACTGCTGCTTGAGTCGGAGGAAATAAACAACCGGCTGCTTCATGGAGACATCATGCCGCCTATAGGCCTGACAACGCATGACTTCTACGAAAAATTGCAGCTGAATGCGCTTAAATTTCCCGATAGAATTTTAAAGCCGATTATGAATTCCATTAATCCGGAAACCAATGGGCTTTTTCAGATGGTGGCCACTGGCGCCAAGGGCTCAAACCCCAATATGATTCACATCATGGCGGGCATCGGCCAAATTGAAATTAATACACAACGCATTCAACCCCAGTTTTCCTTCGGTAGGACCCTGGTGTACTACCCCAGGTTTGCCCTGGAGGCGCAGGCCTACGGGTTCATCTGCAACAGCTATATTGCGGGCCTTACCTCCCCTGAATTTATCTTTGGGGAAATGAATGGAAGATTCGACTTGATCAACAAAGCATTATCGACATCATCCACAGGCTATGCCAACCGTAAAGCCATCTTTGGCCTTCAATCCTGTATTGTGGATTATTACCGACGGGTTTCCATCGATACGCGTCTTGTGCAGCAGTTGTACGGAGAGGACGGCCTTGATGCGCGCCAGCTTGAAACCGTACGGTTTGAAACCATCATGCTGTCGGACCAGGAACTTGAAGACAAATTCAAGTACACCGGGATACAATCGCCCTTGTTTGAAGAAGAATTTTCACGCCTTAAAAAGGATAGAGATAAATATCGACAGATCTTCCTAAACGTCGAAAATTTTAATTTCAGTCAGCTGCTTACAGATGTTAGACAGGTGCCGGTAAACGTGGCCAGCATCGTAAAAAACATTCTACTGAGCTCCACCAGTGGCGTGCTTCCCTTCGACGAAAAAAGTATTCTACAAAAATACGCGATGGTCAAAACGTTTTGCAAAAATCTTCCATACGTGTTTATTAACAACATTCAGGAACGACTACAAACGCCCATACCCGTTTATCTTAAACGGGCTGCCTCTCTGATGCGCATGCTTATTCGCATCGAACTGGCAACCGTTAAAACATTAAACATTACCTGCGAGCAGATGAGTGCCATCCTGGACCTCATAAGGCTACAATATACTCAAAGTCTTATTAACTACGGTGAGGCAGTGGGAATCCTGGCGGCGCAGTCCGTATCAGAGCCCTTGACACAATATATGCTGGACTCCCACCACCGGTCCGTGGCCGGGGGAACCAACAAGTCGGGAATTGTGCGGCCCCAGGAGATCTTTAGCGCGAAGCCCGTAGAGGCTGAACAATCCTCTGAAATGCTTTTACGTCTAAAGAACCCGGAAGTGGAAACAAATAAAACATATGCGCAAGAAATTGCTAACAGCATAGAGCTTATAACGTTCGAACGGTTGATATTGCAGTGGCACCTATTGTACGAAACGTATTCAAGCACAAAAAAAAATGTGATGTACCCCGATTTTGCAAGTGATGTGGAATGGATGACGGATTTTCTGGAAAACCATCCTCTACTACAGCCCCCAGAGGATATTGCAAACTGGTGTATCCGCTTGGAATTAAACAAAACAACCATGATATTAAAAAGCATTAGTCTAGAAAGTATTATTAATAGTCTAAGAGCTAAACACCCCAACACCTACATCATGCATTCTGTGGAAAACACGGCCTCAGGGATTCCCATCATTATTCGCATATACCTACGGGAAAGCGCCTTTAGACGCAGTACCAATACCCGAATGGCTACGGATGAAAAAATTGCCGTAAATGTGGTGGATAAACTATTAAATAGCACGATTAGAGGAATACCAGGCATCAAAAATGCGAATGTTGTTAAGCTTATGCGCCACCGTGTGGATGCCCAGGGGAAACTGGTAAGACTAGACAATATCTACGCCATCAAAACAAACGGGACTAATATTTTTGGCGCAATGCTTGATGATAACATCGACCCATACACCATCGTATCGTCCTCTATAGGAGACACCATGGAGCTTTACGGCATAGAAGCGGCACGGCAAAAAATTATTAGTGAAATTAGAACGGTTATGGGGGACAAGGGTCCCAACCATCGTCATTTACTCATGTACGCAGATCTCATGACAAGAACGGGACAGGTTACCTCTCTAGAAAAGGCAGGGCTTAATGCAAGAGAGCCTTCCAACGTGTTGTTGCGAATGGCCTTGTCGTCTCCAGTCCAGGTCTTGACAGATGCTGCGGTTGACTCCGCCGTGAATCCCATTTACGGTATTGCCGCGCCTACCCTTATGGGCTCTGTTCCTCGCATAGGGACCATGTACTCTGACATCATTATGGATGAAAAATATATTACGGAAAATTATAAAAGTGTTGATTCCTTGATTGATATGTTATAG
MGF_360-8L基因，Blast per identity最高为99.69％，位于JS/LG/21株基因组18,557-19,516位(基因I型与基因II型接头部分，跨越了F1和F2)，编码序列如下(SEQ IDNO.23)：
ATGCTCTCCTTGCAAACCCTGGCCAAAAAGGCTGTGGCCAAACAGAGCGTGCCTGAGGAGTATCATTATATTTTAAAATATTGTGGCTTATGGTGGCAAAACAAGCCCATTAGCTTATGTCACTACTGTAATTACGTTATTTTAAGCTCAACCCCCTTTAAGGGGGAACTTCTTCATCTTGATGTGGCATTAATCATGGCCATAAAAGAAAATAACTATGACGTAATAAGGCTGTTCACCGAGTGGGGAGCAAACATTTATTATGGGCTGACCTGTGCTAGGACGGAACAAACTCAGGAGCTGTGTCGAAAGTTAGGAGCTAAAGATGGTTTAAATAATAAGGAAATTTTCGCCGGTTTAATGCGTCATAAAACGAGTAATAACATTATTTTATGTCATGAAATATTTGATAAAAATCCTATGTTGGAAGCTCTAAATGTGCAGGAAATGGGAGAGGAGATTCATCGAGAGTTAAAGCTTTTCATATTTTATATCTTGGATAATGTACCCATGAACATATTCGTTAAATACTGGTATGCCATAGCAGTAAAATATAAGCTTAAAAGAGCTATCTTCTTTTTCTATCAAACATATGGGCACCTTAGTATGTGGCGACTCATGTGCGCCATTTACTTCAACAATGTATTTGACCTTCATGAAATATACGAGCAAAAGATCGTTCATATGGACATCGATAAAATGATGCAGTTGGCTTGTATGCAAGATTACAACTTTTTAACGATATACTACTGTTTTGTCTTGGGAGCTGATATTGATCAAGCCATCACTGTAACACAGTGGCATTATCATACGAACAATCTATATTTTTGTAAGGATTTAAAGGATCTTAAGCAAAATACTTTAACGGCACGTCCTCTTTTATTACCTAATATAACGGATCCTAAAAAAATATATACCATGTTAAAAAATTACCTACCAACATCGTCAAATTCTCTATGA
MGF_505-5R基因，Blast per identity最高为99.53％，位于JS/LG/21株基因组32,863-34,359位(基因I型与基因II型接头部分，跨越了F2和F3)，编码序列如下(SEQ IDNO.24)：
ATGTTCTCCCTCCAGGAGATCTGTCGAAAGAACATCTACTTTCTACCTGACTGGCTCGGTGAGCATGTGATTCAGCGACTAGGTCTGTACTGGGAAAAACATGGTTCTCTTCAGCGAATCGGAGACAACTATGTACTTATACAACAGGACCTCATCATCCCCATCAATGAAGCCCTAAGAATGGCAGGGGAGGAGGGGAATGATGAGGTGGTACAACTCCTATTACTATGGGAGGGAAACATTCATTATGCCATCATAGGAGCTTTGGAGAGTGACCATTATAGCCTAATACGTAAGCTCTATGACCAAATCGAAGACTGTCACGACATCCTTCCCTTGATTCAAGACCCAAAACTCTTTGAAAAATGCCATGAATTAGATAAATCTTGTAACATTTTATGTCTCGTATTACACGCCGTAAAAAACGATATGCTTTGCATTCTTCAAGAGTATAAAATGCATCTAAGTGGAGAGGATATTCAAGTGGTGTTTGAAACAGCATGCCGTTCACAAAAAAACGATATTGTGTCATGGATGGGACAAAATATTGCAATATACAACTCCGGAGTTATTTTTGATATTGCCTTTGATAAGATGAATGTGTCCTTATTATCTATAGGGTACACGCTTCTTTTCAATCATCATATAAATAATACGAACGAAAATATTAATTCTTTATTGACACAACATCTTGAATGGGCTGCCGGCATGGGCCTTCTTCATTTTATGCTGGAAACTTTAAAGTATGGCGGGGATGTAACGATAATAGTTTTGTCTGAGGCCGTAAAATATGACCACAGAAAGATTTTAGATTATTTTCTCCGTCGAAAAAACTTGTACCAAGAAGATCTTGAAGAACTATTATTGTTGGCGATACGTGCAGATTGTTCTAAAAAGACCTTAAACTTGTTATTATCTTACTTAAACTATTCCATAAACAATATCCGTAAAAAAATATTACAATGTGTAAAAGAATATGAAACGACCGTTATTATAAAAATTCTATGGAAAAGAAAGATAAATCTGATAGAGCCCATTTTGGCAGACTTTATAGGATATCATAGCTATACCTATATGGTAGATTTTATGCGCGAGTTTTCCATCCATCCGGAAAAAATGATCAAAATGGCTGCGCGAGAATCGAGGGAGGACTTAATCATAAAATTTTCCAAAAAAGTTTGCAAAGAGCCTAAAGATAGACTTCACTATCTCAAAAGCTTAGTGTATACTATGCGACATAAAGAAGGCAAACAACTGTTAATTTATACAATCCATAACTTATACAAAGCTTGTCATCTAGAGAGTAAAGAAATGTTTAATTTGGCACGATTTTATGCACGGCATAATGCAGTGATCCAGTTCAAATCGATTTGTCACGATCTCTCCAAGCTGAATATTAATATCAAAAACTTGTTGTTAGAATGTTTAGGTATTGCTATTAAAAAAAATTACTTTCAACTTATCAAAACAATAGAAACGGATATGCGTTATGAGTAA
本发明将所分离培养得到的非洲猪瘟病毒JS/LG/21株提交专利程序认可保藏机构保藏。保藏单位为中国典型培养物保藏中心；地址为中国，武汉，武汉大学；微生物保藏号为CCTCC NO:V202318；培养物名称为非洲猪瘟病毒ASFV JS/LG/21ASFV Pig/Jiangsu/LG/2021；保藏时间为2023年3月29日；鉴定存活时间为2023年3月29日。
实施例4：致病力分析
为评价JS/LG/21株对猪的毒力，从中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心选取7周龄SPF级猪，肌肉注射103HAD50或106HAD50，每个剂量接种6头猪。从感染第1天开始，每组再选取2头SPF级猪与感染猪共同饲养，以评估JS/LG/21的传播能力。每天监测所有猪的生存情况和临床体征。在接种后(p.i)或接触后(p.ct)的指定时间，采集口腔拭子、直肠拭子和EDTA抗凝血液，利用qPCR，采用qPCR检测p72基因来反映病毒载量。对死亡或安乐死的猪进行剖检，采集脑、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾、扁桃体、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结和纵隔淋巴结，采用qPCR检p72基因来反映测病毒载量。
重组病毒分离株JS/LG/21分别以106HAD50，103HAD50接种6头猪，同时各组从第一天引入2头不接种伴养猪。图6中，a-f示出了106HAD50计量接种猪与伴养猪的相应指标，g-I示出了103HAD50计量接种猪与伴养猪的相应指标，a和g示出了接种后直肠体温，b和h示出了接种后存活率。c和i示出了口腔拭子病毒DNA含量、d和j示出了肛门拭子病毒DNA含量，e和k示出了血液病毒DNA含量，f和l示出了10种组织病毒DNA含量。黑线虚线表示猪的正常直肠体温(40℃)。LN1，腹股沟淋巴结；LN2，下颌淋巴结；LN3，纵隔淋巴结。
在106HAD50组中，所有6头接种猪在p.i.的第4天开始发热，并在p.i.的第5天和第8天之间死亡(图6)。2头接触猪在接触后第9天开始发热，并在第12天死亡(图6)。在所有接种猪和接触猪的口腔拭子、直肠拭子和血液中均检测到病毒DNA(图6)。在死亡猪的器官中，包括脑、心、肝、脾、肺、肾和扁桃体，以及三个不同的淋巴结(腹股沟淋巴结、颌下淋巴结和纵隔淋巴结)也检测到高水平的病毒DNA(图6)。
在103HAD50组中，所有猪均在第6天至第15天死亡(图6)。2头接触猪在感染后第9天和第10天开始发热，分别于接种后第12天和14天死亡(图3)。所有接种猪和接触猪的口腔拭子、直肠拭子、血液中均检测到病毒DNA，但水平略低于106HAD50组(图6)。这些结果表明，重组病毒分离株JS/LG/21具有高致死性和传播性。
实施例5：基因敲除毒株的构建
1.同源重组载体构建
参见图7a的示意图，为了将JS/LG/21株的MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-14L基因通过同源重组替换成mCherry基因，构建MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-14L基因敲除用同源重组转移载体，所述替换的基因组序列对应JS/LG/21株基因组全长序列的第23202-31159位。
将MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-14L基因上游对应JS/LG/21株基因组全长序列的第21702-23201位DNA序列作为同源重组左侧同源臂(序列参见下文的MGF-LR)，并将MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-14L基因下游对应JS/LG/21株基因组全长序列的第31160-32659位DNA序列作为同源重组右侧同源臂(序列参见下文的MGF-RR)，在该重组转移载体左同源臂基因序列、右同源臂基因序列中间插入p72mCherry表达盒(启动子为非洲猪瘟病毒p72基因的p72启动子，编码序列为mCherry基因)。pUC57-p72mCherry含有病毒P72启动子序列的mCherry基因表达盒序列委托吉林省库美生物科技有限公司合成。将左侧同源臂、右侧同源臂克隆至pUC57-p72mCherry，经DNA测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pUC57-MGF-Del。pUC57-MGF-Del以pUC57载体为骨架，用于同源重组的区域按顺序为左侧同源臂-p72启动子-mCherry基因编码序列-右侧同源臂。
左侧同源臂、右侧同源臂序列中的小写字母含义为left arm，right arm。
为了将JS/LG/21株的EP402R基因通过同源重组替换成Venus基因，构建EP402R基因敲除用同源重组转移载体，所替换的基因序列对应JS/LG/21株基因组全长序列的第68816-69967位。
将EP402R基因上游对应JS/LG/21株基因组全长序列的第67816-68815位DNA序列作为同源重组左侧同源臂(序列参见下文的EP402R-LR)，并将EP402R基因下游对应JS/LG/21株基因组全长序列的第69968-70967位DNA序列作为同源重组右侧同源臂(序列参见下文的EP402R-RR)，在该重组转移载体左同源臂基因序列、右同源臂基因序列中间插入p72Venus表达盒(启动子为非洲猪瘟病毒p72基因的p72启动子，编码序列为Venus基因)。pUC57-p72Venus含有病毒P72启动子序列的Venus基因表达盒序列委托吉林省库美生物科技有限公司合成。将左侧同源臂、右侧同源臂克隆至pUC57-p72Venus，经DNA测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pUC57-EP402R-Del。pUC57-EP402R-Del以pUC57载体为骨架，用于同源重组的区域按顺序为左侧同源臂-p72启动子-Venus基因编码序列-右侧同源臂。
2.重组非洲猪瘟病毒JS/LG/21-7GD的构建和鉴定
将同源重组质粒pUC57-EP402R-Del用TranslT-LT1 transfection reagent(购自美国Mirus Bio公司)转染至感染了JS/LG/21株ASFV的PAMs细胞，采用噬斑克隆方法纯化EP402R基因缺失、同时表达Venus所发出的绿色荧光蛋白的非洲猪瘟基因缺失病毒(单缺失毒株)。经PCR扩增验证了其中相对于非洲猪瘟JS/LG/21株的全长序列而言，第68816-69967位核苷酸被替换成p72启动子调控下的Venus基因。
将同源重组质粒pUC57-MGF-Del按照上述方法转染至前述单缺失毒株感染的PAMs细胞，通过多轮噬斑纯化获得EP402R和MGF_505-1R、MGF_505-2R、MGF_505-3R、MGF_360-12L、MGF_360-13L、MGF_360-14L基因双缺失的病毒，命名为JS/LG/21-7GD。其中相对于非洲猪瘟病毒JS/LG/21-7GD株的全长序列而言，第68816-69967位核苷酸被替换成p72启动子调控下的Venus基因的基础上，经PCR扩增验证了第23202-31159位核苷酸进一步被替换成p72启动子调控下的mCherry基因。
JS/LG/21-7GD株在荧光激发下能够发出mCherry引起的红色荧光和Venus引起的绿色荧光，结果参见图7c。
MGF-LR序列如下(SEQ ID NO.25)：
GATGTCTGCGCCCCATTCTgtaaacagTTTTATTAACTGATAGTTGTTTTCCTTTGTAGCCAACATTAGTGCCGTATTAAGGTCCAAGCCGTCTGCAAAGCTTGGCAGCTTTATCAGCATATGTTTGCAATCAAGGGAAATTGGGGCCTTATACCACCATAGTCCGCAGCGTTCTAAGATAACATGGTACTCAATAGATACTTGCTGTCTGGCTAGTACCTTTTTGGCGAAGGATTGTAAGGAAGGAAACATCCTGTTTCTTTTTTTTTTAAAAATCAATTATCTTTGTTCATAATCAAGAAAAATCCCCATATTTATTGAGTGATAATTTTTTAACATGCAATTTATTTTTTCAGGGTCCGTAACGATCGACAACAGAGAAATAACCGGATTGTAATGCTTTAATGATAAGGCATGGGCTATCAGATAATTTTCCTTTTGTTCTGCCAAAGCTTTGCCCTCCTCAAAGGCATCGGCACCCAGGTCTATACAAAAGAACAGGTTTCCAAGATTATAGTTTTGTATGGAAACAAGCATGGCTTGATTGATGTTGGCTCCCATGATAAAACAGTAGTAAATGGCCGAATAGCTATAATCTTGGATGCAGGCTATGTGCATCATTTCATCAATATCCATGCGGACCCTTTCTATTTCGTACAGCTCGTGAAGGTCGAACACGTTGTTGTAAAAAAGGGCGCACATGAGCCGCCACCTATGTAGACGCGGGTATTTCTGGTAAAAGTAGCGGATAGCATCTTTGAGGTCATAGTCCACCGCTATCGCGTACCAGTATTTGGTTAAAACAGTGCTAAAGCTATCATCATGGTCCAGCATGAAGGTTATCTCCATGAGCCCTCTTAACTCCCACATGATTTCCCCCCTCAGATCCAGATTATCTATAATCCTTAAATTGGGGTTATTGGAAAACACCTCGTGGCAAAAGATAATATTGCTACTGGTTTTATCGCGCGTTGTATCAAAGAAAATTTTTAAAATATACTCTCTTTCTAAATATTCTTTGGCTCCCAGCTCTTTGCACAGATCACGGGTATTTTCCGTGAGAGCACAAATCATTCCATAGTTAATATCTGCACCCCATTCAGTAAACAGCTTTATCAAGTCATGATTATTCTCCTTCACGGCTTTCATCAGTCCTATGTTTAACTCGATACCTTGACTAAAACAGGTTGACCTTATAAATAATTTATTGCGTCGAATATGAAGCATAATGGGGCCATTATGCCACCACAGGCCACAACACTTCAGGACATGATATTGATCTACCGGTATACACTGCCCGGCCAGTACTTTCTTCGTGAGGGATTGCAGGGAAGGCAACATGCCTTTCCATCCTTTGACGGAAATCAAATTATCTACTAATAACTATCAGTGTTTATATTAAGTATTTAGATATTATCCCGGGCTGGATACGTAGTATCGCTATTCACATGTACTTCCAACTCTAGCCggagcCTGCAGGGTCATTTATTTTTAATATTG
MGF-RR序列如下(SEQ ID NO.26)：
TACTCACTATTGTAGTGAATCGTATCCTGTAAATTTTGTAAAAAAGCTTAAACTTTTGACCACATCATATTGTTTTAGAAATCTCAAACCAGTGAACAACAGTCTTATCATACATTAAAATTCCAGTAAAATTTATATTTTTTTTGGTAAACAAATGTTTTCTCTTCAAGACATCTGTCGGAAACATCTTTTTCAACTTCCTGACGCTTTTGATGAATATATATTACAAGCGCTAGGACTATACTGGGAAAAACACGGATCTCTTCAACGAATAAGAAAGGACGCTGTGTTTGTACAGCGAAACATCGTCCTTTCTACCAATGAGGCCCTGAGAATCGCAGCCTCAGAGGGAAACGAAAGGGTAATAAAACTTCTGTTATCATGGGAGGGAAATTTTCATTATGTGATCATAGGAGCTCTAGAGGGTGACCAATATGACCTAATTCATAAGTATGATAGTCAAATTAAAGACTACCACATGATTTTATCATTGATCCAAAATGCAAATACCTTTGAAAAGTGTCATCAGTTATCCAATAGTAATATGTGGTGTCTTATACAGAATGCTATAAAATATAATATGCTCCCTATTCTCCAAAAACACAGAAATATTCTGACACATGAGGGAGAGAATCAGGAATTGTTTGAGATGGCATGTGAGGAACAGAAATATGACATAGTTTTATGGATAGGACAAACCCTAATGTTAAATGAGCCGGAGTTTATTTTTGATATCGCCTTCGAACGGATAGATTTTTCTTTATTAACAATGGGTTATAGCCTTCTTTTTGATAACAAGATGAGTAGTATAGACATTCATGATGAAGAAGATCTTACTTCATTACCAACAGAACACCTCGAAAAAGCAGCCACTAAGGGATGTTTCTTCTTTATGCTAGAAACTTTAAAACATGGTGGAAATGTAAATATGGCAGTCTTATCTAAAGCTGTTGAGTATAATCATAGAAAAATTTTAGACCATTTTATTCGGCGGCAAAAATGTTTATCACGTGAAGAGATTGAAAACCTATTATTAACCGCCATAACCAATTGTGCATCCATAAAAACGTTAAACTTACTCTTGTCTTACCTAAACTATTCCGTAAAAAATATCATTGGAAAAATAGTACAACATGTCATAAAAGATGGTGATTATACCATCATATTACTTTTAAAAAAAAAGAAAATAAACCTAGTGGAACCTGTTTTAACAGGTTTTATAGATTATTACTATAGCTATTGTTTTATAAAACATTTTATCCAAGAGTTTGCTATTCGTCCGGAAAAACTGATTAAAATGGCCGCGCGAAAAGGTAAACTAAATATGATTATCGAATTCCTTAACGAAAAATATGTTCATAAAGATGATCTTGGAACTATATTTAAATATCTCAAAACCCTAGTATGTACCATGAAACATAAAAAAGGAAAAGAGACATTAATTGTTCTTATTCATAAAATATATCAAgatATTCATCTGGAGACTAAAGAAAAATTTAA
EP402R-LR序列如下(SEQ ID NO.27)：
ATATTGTATGATAAATCAAACAATGTCTTATATATGTGGTTTATTATTTTAGGCGCCGCAAGATGTACTCCATTCTCATTGCATGCTTGGTGTTATTACTCTGTCTAGTTATATATGTCGGTCATCGTGCCGATCATGCACGAAAATATTTAGAAGGAATGTGGCATGGAGATCCGGTTTTTCTAAAACAGTCGGGGCTACAATCCTTTTATCTCTACATACAACCTGACCATACATGTTTTTTTAGCATTGTGAATAAAAATGGTGAAAAGCTGATGGAAACCAAAATACCTTGTACGATAACAAATAAAATATATATGTTTTTTAAACCTATTTTTGAATTTCATGTTGTGATGGAAGACATACATAGCTACTTCCCTAAGCAGTTTAACTTTCTGTTAGATAGTACAGAAGGTAAACTTATTTTAGAAAACAATCACGTTATTTATGCTGTATTGTATAAGGATAATTTCGCCACCGCACTAGGAAAAACGGTTGAAAAATATATAACACAAAATTAATCATGTTTTCTAACAAAAAGTACATCGGTCTTATCAATAAGAAGGAGGGTTTGAAAAAAAAAATAGATGATTATAGTATATTAATAATTGGAATATTAATTGGAACTAACATCTTAAGCCTTATTATAAATATAATAGGAGAGATTAATAAACCAATATGTTACCAAAATGATGATAAGATATTTTATTGCCCTAAAGATTGGGTTGGATATAATAATGTTTGTTATTATTTTGGCAATGAAGAAAAAAATTATAATAATGCAAGTAATTATTGTAAGCAATTAAATAGTACGCTTACTAATAATAATACTATTTTAGTAAATCTTACTAAAACATTAAATCTTACTAAAACATATAATCACGAATCTAATTATTGGGTTAATTATTCTTTAATTAAAAATGAGTCAGTACTATTACGTGATAGTGGATATTACAAAAAACAAAAACATGTAAGTTTATTATATATTTGTAGTAAATAA
EP402R-RR序列如下(SEQ ID NO.28)：
TATGTACTATATATTAATTATTTAACCTTTCAAGCTGGTCTTCATTTAAATTTAAAATCCACTAATAAAATGTATTTTCTAGTAGCAGATCATCGAGAACATCATGTGATTCCTTTTCTTAAAACCGATTTCCATCACATGCATCAAAATCCTATACAAAAAAATCAAGCTCTCCTAGAAATCAAACAGCTTTTTACTGGAGATTATCTCATCTGCAAAAGCCCTTCTACCATTCTGGCCTGTATTGAACGAAAAACCTACAAAGACTTTGCGGCTTCTTTGAAAGATGGACGTTATAAAAATCGCCAAAAAATGCTGTCGCTGCGAGAACAAACCAACTGTCAACTTTATTTTTTTGTAGAAGGCCCGGCATTTCCTAACCCTCAAAAAAAAATTAATCACGTTGCCTATGCAAGCATTATTACTGCTATGACGCATCTTATGGTTAGAGATCATATTTTTGTCATTCAAACGAAAAATGAGGCCCACAGTTCCCAAAAGCTTGTGCAGCTTTTTTATGCCTTTTCTAAGGAAATGGTGTGCGTCGTTCCCACCTCCCTCACCCCCACGGATGAAGAGCTATGCATCAAGCTATGGTCTTCTCTTTCTGGTATTTCAGGCGTGATAGGTAAAATCTTGGCAAACACTTGTTCCGTAGCTCATTTGGTTCATGGAAAGCTTTCATCGCAGAATATTGATCAGTTAAAAACTCCCTCCAACCGACCATTCCCCAAAAAAGTAAAACGTATGCTTATAAGCATTAGCAAAGGAAATAAGGAGTTAGAAATAAAATTGCTCTCGGGGGTTCCCAATATCGGGAAAAAATTAGCTGCCGAAATTTTAAAAGATCATGCGCTTCTTTTTTTTCTAAATCAGCCCGTAGAATGCTTGGCAAATATACAAATCGTTCAAAAAACCCGTACGATTAAGTTGGGAATGAAGCGAGCCGAAGCGATTCATTATTTTTTAAACTGGTGTGGCTCTGCCCATGTAACCGATG
本发明所用非洲猪瘟病毒的p72启动子(JS/LG/21株p72基因上游的-74nt到+1nt之间的序列)与非洲猪瘟病毒Pig/HLJ/2018株p72启动子序列相同，序列如下(SEQ IDNO.29)：
TTGTTATTATCAAGATCCTTCGCATAAACCGCCATATTTAATAAAAACAATAAATTATTTTTATAACATTATATA
实施例6：敲除毒株的测试
PAMs培养于24孔板(1.25×106细胞/孔)，100μl/孔，培养液为RPMI 1640完全培养基，待细胞贴壁后，分别接种JS/LG/21和JS/LG/21-7GD(MOI＝0.1)。37℃培养，每24h收集培养上清，采用qPCR检测p72基因来表征病毒含量，结果参见图7b。
由此可见，JS/LG/21和JS/LG/21-7GD的生长曲线接近于重叠，说明本发明七个基因敲除后，没有明显影响JS/LG/21株在原代细胞上的增殖能力和生长周期，JS/LG/21-7GD能够正常存活，具备制备疫苗的潜力。
JS/LG/21-7GD感染PAM 72h后，可以观察到Venus表达的绿色荧光和mCherry表达的红色荧光，且两种荧光位置完全重合(图7c)。
为评价JS/LG/21-7GD株对猪的毒力和免疫原性，从中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心选取7周龄SPF级猪，肌肉注射106TCID50/头，接种10头猪。
每天监测所有猪的生存情况和临床体征。在接种后28天内的直肠体温正常，未见发热，详情情况记录参见图7d，动物存活率为100％，参见图7e。由此可见，JS/LG/21-7GD株对接种猪是安全的。
以非洲猪瘟p22蛋白为抗原，包被检测板，通过阻断ELISA法检测10只猪接种后不同时间的针对p22蛋白的IgG抗体滴度，结果显示接种后10天后诱导特异性抗体，随后抗体滴度不断升高，至接种25天，抗体滴度达到最高，参见图7f。由此可见，JS/LG/21-7GD株能够激发猪产生特异性抗体，显示具有良好的免疫原性，具备制备疫苗的潜力。
在图7中，(a)示出了JS/LG/21-7GD基因缺失株构建示意图。将缺失的基因片段分别替换为p72mCherry和p72Venus报告基因表达盒。(b)示出了JS/LG/21和JS/LG/21-7GD在PAMs中的生长曲线。(c)JS/LG/21-7GD感染PAMs 72h后的荧光。(d)示出了10只SPF猪接种106TCID50 JS/LG/21-7GD后28天内监测直肠体温，(e)示出了存活率，(f)示出了特异性抗体。虚线表示猪的正常直肠体温(40℃)。
实施例7：免疫猪攻毒测试
研究资料表明，在低毒力ASFV感染后存活的猪可产生保护性免疫，能够抵抗同源病毒的攻击，但不能抵抗异源病毒的攻击。通过删除包括6个MGF_505/360基因和编码CD2v的EP402R基因在内的7个基因，获得了一株ASFV减毒活疫苗HLJ/18-7GD(HLJ/18-7GD株的改造过程记载在中国专利申请号为201910348878.7的专利文献当中，在其中对应的名称为rASFVΔCD2V/360-eGFP-mCherry株，保藏号为：CCTCC NO:V201924)，在猪体内的研究已经证明了该疫苗株安全，且能够保护基因II型ASFV致死性攻击。为了评价这HLJ/18-7GD能否提供针对JS/LG/21株的保护性。本发明用10头SPF级猪肌肉注射106TCID50的HLJ/18-7GD，在接种后第28天，5头肌肉注射103HAD50 JS/LG/21，5头肌肉注射103HAD50HLJ/18。每组设4头未接种疫苗的猪作为攻毒。
结果参见图8，SPF级猪10头，接种106TCID50的HLJ/18-7GD，于接种后第28天，5头肌内注射103HAD50的HLJ/18(结果见a-c)，5头肌肉注射103HAD50的重组病毒分离株JS/LG/21(结果见d-f)。每组设4只未接种疫苗的猪作为攻毒对照。每天监测直肠体温(结果见a、d)和存活情况(结果见b、e)，并在观察期结束时对存活猪实施安乐死，采集安乐死猪或发病死亡猪组织样本中病毒含量(结果见c、f)，采用qPCR检测病毒p72的DNA。黑线虚线表示猪的正常直肠体温(40℃)。LN1，腹股沟淋巴结；LN2，颌下淋巴结；LN3，纵隔淋巴结。
对照组猪在HLJ/18攻击后10天内出现高热并全部死亡，在主要器官和淋巴结中检测到病毒DNA(图8)。相比之下，接种疫苗的猪对同源病毒HLJ/18攻击有很好的保护作用。所有猪在28天观察期内没有出现临床症状(图8)，仅从观察期结束时安乐死的1头猪的肺、肾、2个淋巴结，和3头猪的扁桃体中检测到病毒DNA(图8)。对照组猪在JS/LG/21攻毒后8天内全部出现发热并死亡，在主要器官和淋巴结中均检测到病毒DNA(图8)。然而，惊讶地发现，所有HLJ/18-7GD疫苗接种猪在JS/LG/21攻毒后10天内出现发热并死亡(图8)，并且它们器官中的病毒复制水平与对照猪相当(图8)。结果表明HLJ/18-7GD减毒活疫苗不能对新分离株JS/LG/21提供有效保护。
分离株JS/LG/21由于来自基因I型与基因II型ASFV的天然重组，其能够逃避基因II型ASFV减毒活疫苗诱导的免疫。这说明针对重组型JS/LG/21株单独研发与制备疫苗十分重要。
由图8e可见，即使接种HLJ/18-7GD进行免疫，再用JS/LG/21攻毒，攻毒猪都会死亡，说明JS/LG/21是强毒。图7e中显示了，接种JS/LG/21-7GD的猪都活着且没有发烧，说明本发明的基因敲除有效地去除了分离株JS/LG/21的毒性。参见图8f，接种后猪良好地产生了抗p22蛋白抗体，说明JS/LG/21-7GD具备免疫保护功能，可用作疫苗使用。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株，在所述基因工程病毒毒株中，MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种为失活的基因；
所述基因工程病毒毒株的亲本毒株选自：
S1：微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株；
S2：临床致病性与免疫原性相对于微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株没有变化的传代病毒株或突变病毒株；以及
S3：与微生物保藏号为CCTCC NO:V202318的非洲猪瘟病毒毒株实质相同的病毒株。
2.如权利要求1所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，B646L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述B646L基因的编码序列优选如SEQ ID NO.2所示；
和/或
在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种、任两种或三种：
B602L基因的编码序列如SEQ ID NO.17所示；
C122R基因的编码序列如SEQ ID NO.18所示；以及
D345L基因的编码序列如SEQ ID NO.19所示；
和/或
在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种或任两种：
MGF_100-1L基因的编码序列如SEQ ID NO.20所示；以及
I9R基因的编码序列如SEQ ID NO.21所示；
和/或
在所述亲本毒株或所述基因工程病毒毒株的基因组中，基因编码序列满足如下序列中的任一种、任两种或三种：
NP1450L基因的编码序列如SEQ ID NO.22所示；
MGF_360-8L基因的编码序列如SEQ ID NO.23所示；以及
MGF_505-5R基因的编码序列如SEQ ID NO.24所示。
3.如权利要求1所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，所述失活的基因片段为缺失突变、插入突变或替换突变。
4.如权利要求1所述的基因工程病毒毒株，其特征在于，所述MGF_505-1R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示；
所述MGF_505-2R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.6所示；
所述MGF_505-3R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.8所示；
所述MGF_360-12L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.10所示；
所述MGF_360-13L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.12所示；
所述MGF_360-14L基因的蛋白序列如SEQ ID NO.14所示；
所述EP402R基因的蛋白序列如SEQ ID NO.16所示。
5.一种非洲猪瘟病毒的基因工程病毒毒株，所述基因工程病毒毒株是临床致病性与免疫原性相对于权利要求1-4所述基因工程病毒毒株没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
6.权利要求1-4所述的基因工程病毒毒株的制备方法，所述制备方法为：使所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种失活。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：敲除所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种；所述制备方法优选为：通过同源重组方法，敲除所述基因工程病毒毒株的所述亲本毒株的MGF_505-1R基因、MGF_505-2R基因、MGF_505-3R基因、MGF_360-12L基因、MGF_360-13L基因、MGF_360-14L基因和EP402R基因中任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种或七种。
8.一种基因工程疫苗组合物，所述基因工程疫苗组合物以权利要求1-5所述的基因工程病毒毒株或通过权利要求6-7所述的制备方法制备得到的基因工程病毒毒株为唯一免疫原，多价疫苗中的一种免疫原，或多联疫苗中的一种免疫原。
9.如权利要求8所述的基因工程疫苗组合物，其特征在于，所述基因工程疫苗组合物为活病毒疫苗组合物；所述基因工程疫苗组合物优选还包括辅料。
10.权利要求1-5所述的基因工程病毒毒株，权利要求6-7所述的制备方法，或权利要求8-9所述的基因工程疫苗组合物，在制备用于单独使用，用于与其他免疫制剂和/或药物联合使用，或用作与其他免疫制剂和/或药物组成的复方制剂的组分以预防、减缓和/或控制非洲猪瘟的制剂中的用途。
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