TW201946660A - 靶向ｇａｓｐ－１顆粒之結合蛋白及嵌合抗原受體ｔ細胞以及其用途 - Google Patents

靶向ｇａｓｐ－１顆粒之結合蛋白及嵌合抗原受體ｔ細胞以及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於偵測細胞之方法，該等細胞具有表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)或其片段之顆粒。偵測方法可包含：(a)使細胞與有效量之結合蛋白接觸，其中結合蛋白包含與GASP-1特異性結合之抗原結合片段；及(b)識別具有結合於結合蛋白之顆粒的細胞。GASP-1顆粒可在細胞溶質中或細胞表面上。亦提供用於產生包含嵌合抗原受體、抗GASP-1抗體或雙特異性結合蛋白之T細胞之方法。亦提供用於治療GASP-1介導之疾病或失活化胞外體、微細小胞或癌小體之方法。

Description

靶向GASP-1顆粒之結合蛋白及嵌合抗原受體T細胞以及其用途
本發明係關於表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)之顆粒(亦稱為GASP-1顆粒)、靶向GASP-1顆粒之結合蛋白及嵌合抗原受體T (CAR-T)細胞，及結合蛋白與CAR-T細胞用於偵測及治療癌症之用途。
癌症在美國為第二常見之死亡原因且僅次於心臟病。若癌症未在其早期發展中被偵測到，則其發病率會顯著增加。在症狀出現之前的癌症之早期偵測為最有效的抵抗癌症的手段。舉例而言，歸因於能夠在結腸直腸息肉發展成癌症之前偵測且移除結腸直腸息肉之結腸直腸癌篩選測試，結腸直腸癌發病率在過去二十年的大部分時間裏持續降低(自1985年時的每1,000,000人中66.3個病例下降至2007年時的45.3個病例)。
自癌細胞釋放之細胞外囊泡(EV)與癌症發展及癌轉移有關。EV包括胞外體(exosome)(直徑為約30-100 nm)、微細小胞(microvesicle)(直徑為約100-1000 nm)及大型癌小體(直徑為約1-10 μm)。胞外體來源於晚期胞吞路徑之微細小胞集合體(multivesicular body，MVB)且藉由與細胞膜融合而釋放。另一方面，微細小胞及癌小體係藉由自細胞膜出芽而釋放。
癌症起始及癌症發展皆需要GASP-1之過表現。舉例而言，在使用三陰性乳癌(TNBC)細胞之阻斷基因表現實驗中，GASP-1表現量低之細胞明顯比野生型細胞長得慢。當完全下調GASP-1時，細胞死亡且無法繁殖。
為了追求安全且有效的癌症療法，研究者已試圖識別僅在癌細胞上而不在健康細胞上存在之抗原。但並未成功找到此類腫瘤特異性抗原(TSA)。當前CAR-T療法靶向僅係優先存在於癌細胞表面上之生物標記，意謂該等生物標記亦存在於正常細胞上。此產生非吾人所樂見且嚴重的副作用。另外，當前CAR-T治療僅對血液腫瘤有效，而對實體腫瘤無效。若干原因造成當前CAR-T療法對實體腫瘤無效。首先，實體腫瘤係異質的。與表面上幾乎遍佈CD19之癌性B細胞不同，未必所有實體腫瘤細胞皆攜帶CAR-T細胞經設計以攻擊之抗原。其次，即使單目標CAR-T療法成功消滅腫瘤，但癌症有時可在擺脫該抗原之後復發。第三，實體腫瘤含有厚度達到數百或甚至數千層之實體細胞塊，使得CAR-T細胞難以浸潤。
仍需要藉由靶向癌細胞(尤其實體腫瘤中之癌細胞)來進行、對正常細胞具有最小副作用之有效癌症治療。
本發明提供一種識別及治療癌症患者之新穎方法，其係藉由靶向表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)之顆粒(亦稱為GASP-1顆粒)，例如在細胞溶質中或在細胞表面上。
提供一種用於偵測細胞之方法，該等細胞具有表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)或其片段之顆粒。該偵測方法包含使細胞與有效量之結合蛋白接觸，及識別具有結合於結合蛋白之顆粒的細胞。結合蛋白包含特異性結合GASP-1之抗原結合片段。所識別之細胞為具有GASP-1顆粒之細胞。結合蛋白可為人類化抗體或嵌合抗原受體(CAR)。
根據偵測方法，細胞中之GASP-1顆粒的直徑可在0.1至5.0 µm範圍內。細胞中GASP-1顆粒之平均數目可在每個細胞20至150個範圍內。GASP-1顆粒可在細胞溶質中或在細胞表面上。
根據偵測方法，細胞可在腫瘤中。腫瘤可為實體腫瘤或血液腫瘤。細胞可為癌細胞。
根據偵測方法，細胞可在患有癌症之個體中。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。個體可已接受癌症治療。
偵測方法可進一步包含偵測細胞中之癌症生物標記。癌症生物標記可選自由以下組成之群：CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT及CEA。
提供一種結合蛋白。該結合蛋白包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)。抗GASP-1 scFv可包含可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈。
VH鏈可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。VH鏈可包含由SEQ ID NO:2之胺基酸序列組成之第一互補決定區1 (VHCDR1)、由SEQ ID NO:3之胺基酸序列組成之第二互補決定區2 (VHCDR2)、由SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成之第三互補決定區3 (VCCDR3)或其組合。
VL鏈可包含SEQ ID NO:9或17。VL鏈可包含由SEQ ID NO:10或18之胺基酸序列組成之第一互補決定區(VL1CDR1)、由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成之第二互補決定區(VL1CDR2)及由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成之第三互補決定區(VL1CDR3)。
在結合蛋白中，VH鏈可藉由連接子連接至VL鏈。連接子可包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
抗GASP-1 scFv可特異性結合GASP-1之免疫顯性抗原決定位且該免疫顯性抗原決定位可包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。
結合蛋白可為選自由以下組成之群的抗體：重組型單株抗體、多株抗體、人類化抗體及其抗原結合片段。結合蛋白可為人類化抗體。
結合蛋白可為包含抗GASP-1 scFv之嵌合抗原受體(CAR)。抗GASP-1 scFv可包含選自由SEQ ID NO:36及43組成之群的胺基酸序列。
結合蛋白可包含至少一個選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1-4、9-12及17-18。
結合蛋白可與化學治療劑結合。化學治療劑可選自由以下組成之群：阿那曲唑(Anastrozole)、依西美坦(Exemestane)、來曲唑(Letrozole)、帕博西林(Palbociclib)、利波西利(Ribociclib)、奈拉替尼(Neratinib)、阿貝西利(Abemaciclib)、奧拉帕利(Olaparib)、癌瑞格(Regorafenib)、視網酸(Tretinoin)、迪蘭佐米(axicabtagene ciloleucel)、達沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、波舒替尼(Bosutinib)、伊布替尼(Ibrutinib)、伊德利塞(Idelalisib)、維奈克拉(Venetoclax)、泊那替尼(Ponatinib)、米哚妥林(Midostaurin)、伊那尼布(Enasidenib)、司利弗明(Tisagenlecleucel)、艾伏尼布(Ivosideni)、度維利塞(Duvelisib)、伊馬替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、阿比特龍(Abiraterone)、克里唑替尼(Critozinib)、維莫非尼(Vemurafenib)、放射性同位素(諸如111 In及90 Y)、毒素(諸如奧瑞他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、阿黴素(doxorubicin)、紫杉醇(taxols)、順鉑(cisplatin)、長春鹼(vinblastine)、卡奇黴素(calicheamicin)及假單胞菌外毒素A (Pseudomonas exotoxin A))。
提供一種產生包含嵌合抗原受體之T細胞(CAR-T細胞)之方法。CAR-T細胞產生方法包含將編碼包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)之CAR的基因引入T細胞中，藉由T細胞表現抗GASP-1 scFv，及分離表現抗GASP-1 scFv之T細胞。抗GASP-1 scFv可包含選自由SEQ ID NO:36及43組成之群的胺基酸序列。
提供一種用於產生抗GASP-1抗體之方法。抗GASP-1抗體產生方法包含用GASP-1肽作為免疫原使宿主免疫。GASP-1肽可包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。
提供一種用於產生雙特異性結合蛋白之方法。雙特異性結合蛋白產生方法包含將本發明之結合蛋白與額外的人類化抗體組合。所得雙特異性結合蛋白展示比人類化抗體更好的免疫療法特異性及/或功效。結合蛋白可為人類化GASP-1抗體或嵌合抗原受體(CAR)。該額外的人類化抗體可選自由以下組成之群：利妥昔單抗(Rituximab)、阿侖珠單抗(Alemtuzumab)、阿達木單抗(Adalimumab)、依法珠單抗(Efalizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、雷珠單抗(Ranibizumab)、伊匹木單抗(Ipilimumab)、貝利木單抗(Belimumab)、阿托珠單抗(Obinutuzumab)、培妥珠單抗(Pertuzumab)、維多珠單抗(Vedolizumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、依伏庫單抗(Evolocumab)、匹博利單抗(Pembrolizumab)、尼沃單抗(Nivolumab)、阿替利單抗(Atezolizumab)、瑞利珠單抗(Reslizumab)、奈昔木單抗(Necitumumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、培妥珠單抗(Pertuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、度伐單抗(Durvalumab)、硼替佐米(Bortezomib)、依洛珠單抗(Elotuzumab)、阿維路單抗(Avelumab)、測米匹單抗(Cemiplimab)及奧拉妥單抗(Olaratumab)。
對於各雙特異性結合蛋白製備方法，提供所製備之雙特異性結合蛋白。
提供一種醫藥組合物。醫藥組合物包含本發明之結合蛋白或雙特異性結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
提供一種用於治療有需要之個體中的GASP-1介導之疾病或病症之方法。該治療方法包含向個體投與有效量之本發明之醫藥組合物。GASP-1介導之疾病或病症可為腫瘤。腫瘤可為實體腫瘤。腫瘤可為血液腫瘤。GASP-1介導之疾病或病症可為癌症。個體可已接受癌症之治療。GASP-1可表現於個體的細胞中之顆粒中。GASP-1顆粒可在細胞溶質中或在細胞表面上。
提供一種用於抑制表現GASP-1的細胞生長之方法。抑制方法包含向細胞投與有效量之本發明之醫藥組合物。細胞可為癌細胞。細胞可在患有癌症之患者中。
提供一種失活化(inactivating)表現GASP-1的胞外體、微細小胞或癌小體之方法。失活化方法包含向胞外體、微細小胞或癌小體投與有效量之本發明之醫藥組合物。胞外體、微細小胞或癌小體可在患有癌症之個體中。胞外體、微細小胞或癌小體可在個體之血液循環中。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年5月11日申請之美國臨時申請案第62/670,182號及2018年11月16日申請之美國臨時申請案第62/768,325號之權利，各申請案的內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
本發明提供一種結合蛋白，其包含抗G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)單鏈可變片段(scFv)，及抗GASP-1 scFv之用途，其係用於偵測表現GASP-1或其片段(例如在細胞中之顆粒中或顆粒表面上)之細胞，及用於產生包含用於靶向表現GASP-1的癌細胞之嵌合抗原受體的抗體或T細胞(CAR-T)。本發明係基於本發明人出乎意料地發現抗GASP-1單鏈可變片段(scFv)以及高度富含GASP-1之顆粒(GASP-1顆粒)。GASP-1顆粒具有不同尺寸，其範圍涵蓋粉末狀顆粒、精細顆粒至表面不光滑之粗糙顆粒。粗糙顆粒之尺寸可為粉末狀顆粒之尺寸的約數百倍。已發現GASP-1顆粒廣泛分佈於癌細胞之細胞膜內或細胞膜上，例如細胞膜下、細胞溶質中、聚集於細胞核周圍或細胞核內。已在來自乳癌、三陰性癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤或結腸癌之細胞中發現各種尺寸之GASP-1顆粒。
本發明人亦已出乎意料地發現，隨著癌症發展，GASP-1顆粒之數目及尺寸均可上升。在癌症早期，GASP-1顆粒可主要為粉末狀至精細顆粒。在高侵襲性及侵略性癌症(諸如三陰性乳癌(TNBC)及神經膠母細胞瘤)之晚期，GASP-1顆粒可主要為粗糙GASP-1顆粒。
在正常細胞中，GASP-1可僅最低限度地表現於細胞溶質中或不表現，且若存在，則可呈粉末狀形式。GASP-1顆粒可最低限度地存在於正常細胞之細胞溶質中，但不存在於細胞膜上。GASP-1顆粒可存在於一些正常細胞之細胞核中。GASP-1顆粒僅存在於癌細胞表面上，而不存在於正常細胞表面上之驚人發現提供腫瘤特異性抗原(TSA)之首個實例。此發現使得GASP-1成為使用例如CAR-T細胞或含有GASP-1 scFv序列的人類化單株抗體之癌症免疫療法的理想目標，因為靶向GASP-1顆粒以進行癌症治療將對正常細胞具有最小副作用。
術語「表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)之顆粒」及「GASP-1顆粒」在本文中可互換使用且係指含有GASP-1或其片段之顆粒。視其尺寸而定，存在三種形式之GASP-1顆粒：粉末狀、精細及粗糙顆粒。
如本文所用，術語「粉末狀GASP-1顆粒」係指直徑在0.1至0.4 μm範圍內之GASP-1顆粒。如本文所用，術語「精細GASP-1顆粒」係指直徑在0.4-1.0 μm範圍內之GASP-1顆粒。如本文所用，術語「粗糙GASP-1顆粒」係指直徑在1.0-5.0 μm範圍內之GASP-1顆粒。GASP-1粗糙顆粒之直徑大於細胞外微細小胞。GASP-1顆粒可在細胞溶質中或在細胞表面上。GASP-1顆粒可為核內體。
術語「單鏈Fv」及「scFv」在本文中可互換使用且係指包含針對抗原之抗體的VH鏈及VL鏈之單鏈肽。舉例而言，抗GASP-1 scFv係指包含抗GASP-1抗體之VH鏈及VL鏈的單肽。scFv可進一步包含VH鏈與VL鏈之間的多肽連接子，使得scFv能夠形成用於結合抗原之所需結構。當抗體為人類化抗體時，包含抗體之VH鏈及VL鏈的單鏈肽為人類單鏈Fv或hscFv。
如本文所用，術語「微細小胞」係指由細胞膜形成且自細胞(例如癌細胞)之細胞膜表面釋放之細胞外囊泡(EV)。微細小胞具有0.1-1 μm之直徑。微細小胞存在於諸如血液、唾液、尿液及腦脊髓液之生物體液中。微細小胞可表現GASP-1。
如本文所用，術語「胞外體」係指來源於晚期內吞路徑之微細小胞集合體(MVB)的細胞外囊泡(EV)且係藉由與細胞膜融合而釋放。胞外體具有30-100 nm之直徑。胞外體存在於諸如血液、唾液、尿液及腦脊髓液之生物體液中。胞外體可表現GASP-1。
如本文所用，術語「癌小體」係指由細胞膜形成且自細胞(例如癌細胞)之細胞膜表面釋放之細胞外囊泡(EV)。癌小體具有1-10 µm之直徑。癌小體存在於諸如血液、唾液、尿液及腦脊髓液之生物體液中。癌小體可表現GASP-1。
如本文所用，術語「有效量」係指實現既定目標(例如偵測具有GASP-1顆粒之細胞、治療有需要之個體中的GASP-1介導之疾病或病症、抑制表現GASP-1的細胞生長及失活化胞外體、微細小胞或癌小體)所需之包含結合蛋白或雙特異性結合蛋白之醫藥組合物的量。醫藥組合物之有效量可視既定目標及組合物之物理特徵而變化。
提供一種偵測細胞之方法，該等細胞具有表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)或其片段之顆粒。該偵測方法包含使細胞與有效量之結合蛋白接觸，及識別具有結合於結合蛋白之顆粒的細胞。結合蛋白包含特異性結合GASP-1之抗原結合片段。所識別之細胞為具有GASP-1顆粒之細胞。
根據偵測方法，GASP-1顆粒可在細胞溶質中或在細胞表面上。在一個實施例中，GASP-1顆粒可在細胞之細胞溶質中。在另一實施例中，GASP-1顆粒在細胞表面上。在另一實施例中，GASP-1顆粒可不在細胞核中。
根據偵測方法，細胞中GASP-1顆粒之數目可變化。每個細胞中可存在約10-1,000個、20-500個或20-200個GASP-1顆粒。細胞中GASP-1顆粒之平均數目在20至150個範圍內。GASP-1顆粒可具有不同尺寸，其範圍涵蓋粉末狀顆粒、精細顆粒及粗糙顆粒。粗糙GASP-1顆粒可係相同細胞中的粉末狀顆粒之至少10、50、100或500倍大。GASP-1顆粒之直徑可在約0.1-10、0.1-0.4、0.4-1.0、1.0-5.0、0.1-1.0、0.1-5.0、0.4-5.0、0.2-10、0.2-3.0、0.2-5.0、0.5-1.0或0.5-5.0 µm範圍內。在一個實施例中，GASP-1顆粒之直徑在0.2至3.0 µm範圍內。吾人已發現，隨著癌症發展，可發現更多的粗糙GASP-1顆粒，其可歸因於粉末狀(及/或精細顆粒)之成熟或此等GASP-1顆粒之聚集。在一個實施例中，癌細胞中至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之GASP-1顆粒可為粗糙GASP-1顆粒。在來自侵略性更強的癌症(例如高度DCIS、三陰性乳癌及神經膠母細胞瘤)之細胞中，至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%之GASP-1顆粒可為粗糙GASP-1顆粒。粗糙GASP-1顆粒可在核膜周圍及/或在細胞膜上聚集。
根據偵測方法，具有GASP-1顆粒之細胞可在腫瘤中。腫瘤可為實體腫瘤或血液腫瘤。腫瘤可在個體中。個體可患有癌症。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。舉例而言，癌症可為膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌或前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。個體可已接受癌症治療。
根據偵測方法，具有GASP-1顆粒之細胞可為癌細胞。細胞可在個體中。個體可患有癌症。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。舉例而言，癌症可為膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌或前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。個體可已接受癌症治療。
偵測方法可進一步包含偵測具有GASP-1顆粒或GASP-1或其片段之細胞中的癌症生物標記。癌症生物標記可為以下之任何適合的生物標記：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。舉例而言，癌症可為膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌或前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。例示性癌症生物標記包括CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT、VEGF、KRAS、ALK、PSA、HE4、CYFRA 21-1、NSE、PD-L1、TIMP-1、TIMP-2、HGF、OPN、MSLN、MMP2及CEA。
根據該偵測方法，結合蛋白可包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)。結合蛋白可為抗GASP-1抗體或嵌合抗原受體(CAR)。抗GASP-1抗體為能夠結合於GASP-1或其片段(例如GAPS-1肽EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22))之抗體。抗GASP-1抗體可為重組型抗體或其抗原結合片段。抗體可為單株抗體、多株抗體或人類化抗體。
亦提供一種包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)之結合蛋白。抗GASP-1 scFv包含可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈。結合蛋白可為抗體或嵌合抗原受體(CAR)。
抗GASP-1 scFv之VH鏈可包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。VH鏈可由SEQ ID NO:1之胺基酸序列組成。VH鏈可包含第一互補決定區1 (VHCDR1)、第二互補決定區2 (VHCDR2)及第三互補決定區3 (VHCDR3)。VHCDR1可包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列。VHCDR1可由SEQ ID NO:2之胺基酸序列組成。VHCDR2可包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列。VHCDR2可由SEQ ID NO:3之胺基酸序列組成。VHCDR3可包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列。VHCDR3可由SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成。VHCDR1可由包含SEQ ID NO:6之核苷酸序列編碼。VHCDR1可由SEQ ID NO:6之核苷酸序列編碼。VHCDR2可由包含SEQ ID NO:7之核苷酸序列編碼。VHCDR2可由SEQ ID NO:7之核苷酸序列編碼。VHCDR3可由包含SEQ ID NO:8之核苷酸序列編碼。VHCDR3可由SEQ ID NO:8之核苷酸序列編碼。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列。VL鏈可由SEQ ID NO:9之胺基酸序列組成。VL鏈可包含第一互補決定區1 (VLCDR1)、第二互補決定區2 (VLCDR2)及第三互補決定區3 (VLCDR3)。VLCDR1可包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列。VLCDR1可由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成。VL1CDR2可包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。VL1CDR2可由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。VL1CDR3可包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。VL1CDR3可由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列。VL鏈可由SEQ ID NO:17之胺基酸序列組成。VL鏈可包含第一互補決定區1 (VLCDR1)、第二互補決定區2 (VLCDR2)及第三互補決定區3 (VLCDR3)。VLCDR1可包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。VLCDR1可由SEQ ID NO:18之胺基酸序列組成。VL1CDR2可包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列。VL1CDR2可由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成。VL1CDR3可包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。VL1CDR3可由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成。
抗GASP-1 scFv可包含由SEQ ID NO:5之核苷酸序列編碼的可變重(VH)鏈及由SEQ ID NO:13之核苷酸序列編碼的可變輕(VL)鏈。VH鏈可借助於由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之連接子連接至VL鏈。抗GASP-1 scFv可為針對由SEQ ID NO:22之胺基酸序列組成的GASP-1之免疫顯性抗原決定位而選擇的抗體。
抗GASP-1 scFv可包含由SEQ ID NO:5之核苷酸序列編碼的可變重(VH)鏈及由SEQ ID NO:19之核苷酸序列編碼的可變輕(VL)鏈。VH鏈可借助於由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之連接子連接至VL鏈。抗GASP-1 scFv可為針對由SEQ ID NO:22之胺基酸序列組成的GASP-1之免疫顯性抗原決定位而選擇的抗體。
抗GASP-1 scFv可包含由SEQ ID NO:1之胺基酸序列組成的可變重(VH)鏈及由SEQ ID NO:9之胺基酸序列組成的可變輕(VL)鏈。VH鏈可借助於由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之連接子連接至VL鏈。可針對由SEQ ID NO:22之胺基酸序列組成的GASP-1之免疫顯性抗原決定位來選擇抗GASP-1 scFv。
抗GASP-1 scFv可包含由SEQ ID NO:1之胺基酸序列組成的可變重(VH)鏈及由SEQ ID NO:17之胺基酸序列組成的可變輕(VL)鏈。VH鏈可借助於由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成之連接子連接至VL鏈。可針對由SEQ ID NO:22之胺基酸序列組成的GASP-1之免疫顯性抗原決定位來選擇抗GASP-1 scFv。
抗GASP-1抗體或scFv之VH鏈可包含由SEQ ID NO:2之胺基酸序列組成的CDR1、由SEQ ID NO:3之胺基酸序列組成的CDR2及由SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成的CDR3。
抗GASP-1抗體或scFv之VH鏈可包含由SEQ ID NO:6之核苷酸序列編碼的CDR1、由SEQ ID NO:7之核苷酸序列編碼的VHCDR2及由SEQ ID NO:8之核苷酸序列編碼的VHCDR3。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含由SEQ ID NO:10之胺基酸序列組成的CDR1、由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成的CDR2及由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成的CDR3。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含由SEQ ID NO:14之核苷酸序列編碼的CDR1、由SEQ ID NO:15之核苷酸序列編碼的CDR2及由SEQ ID NO:16之核苷酸序列編碼的CDR3。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含由SEQ ID NO:18之胺基酸序列組成的CDR1、由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成的CDR2及由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成的CDR3。
抗GASP-1 scFv之VL鏈可包含由SEQ ID NO:20之核苷酸序列編碼的CDR1、由SEQ ID NO:15之核苷酸序列編碼的CDR2及由SEQ ID NO:16之核苷酸序列編碼的CDR3。
在結合蛋白中，VH鏈可藉由連接子連接至VL鏈。連接子可包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。連接子可由SEQ ID NO:21之胺基酸序列組成。
抗GASP-1 scFv可特異性結合GASP-1之免疫顯性抗原決定位。免疫顯性抗原決定位可包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。免疫顯性抗原決定位可由SEQ ID NO:22之胺基酸序列組成。
結合蛋白可為選自由以下組成之群的抗體：重組型單株抗體、多株抗體、人類化抗體及其抗原結合片段。在一個實施例中，結合蛋白可為人類化抗體。
結合蛋白可為抗GASP-1抗體，可為能夠結合於GASP-1或其片段(例如GASP-1肽EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22))之抗體。抗GASP-1抗體可為重組型抗體或其抗原結合片段。抗體可為單株抗體、多株抗體或人類化抗體。
結合蛋白可為包含抗GASP-1 scFv之嵌合抗原受體(CAR)。抗GASP-1 scFv可包含有包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。抗GASP-1 scFv可由SEQ ID NO:36之胺基酸序列組成。抗GASP-1 scFv可包含有包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列。抗GASP-1 scFv可由SEQ ID NO:43之胺基酸序列組成。
結合蛋白可包含至少一個選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1-4、9-12及17-18。結合蛋白可包含SEQ ID NO:1及9之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:1及17之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:2-4之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:10-12之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:11、12及18之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:1及10-12之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:1、11、12及18之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:2-4及9之胺基酸序列。結合蛋白可包含SEQ ID NO:2-4及17之胺基酸序列。
結合蛋白可與化學治療劑結合。化學治療劑可選自由以下組成之群：阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、帕博西林、利波西利、奈拉替尼、阿貝西利、奧拉帕利、癌瑞格、視網酸、迪蘭佐米、達沙替尼、尼洛替尼、波舒替尼、伊布替尼、伊德利塞、維奈克拉、泊那替尼、米哚妥林、伊那尼布、司利弗明、艾伏尼布、度維利塞、伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼、索拉非尼、阿比特龍、克里唑替尼、維莫非尼、放射性同位素(諸如111 In及90 Y)、毒素(諸如奧瑞他汀、類美登素、阿黴素、紫杉醇、順鉑、長春鹼、卡奇黴素及假單胞菌外毒素A)。
提供一種產生包含嵌合抗原受體之T細胞(CAR-T細胞)之方法。CAR-T細胞產生方法包含將編碼CAR之基因引入T細胞中。CAR包含本發明之抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)。CAR產生方法進一步包含藉由T細胞表現抗GASP-1 scFv及分離表現抗GASP-1 scFv之T細胞。
根據CAR-T細胞產生方法，抗GASP-1 scFv可包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。抗GASP-1 scFv可由SEQ ID NO:36之胺基酸序列組成。抗GASP-1 scFv可包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列。抗GASP-1 scFv可由SEQ ID NO:43之胺基酸序列組成。
CAR可進一步包含信號肽(SEQ ID NO:35)、CD8鉸鏈(SEQ ID NO:37)、CD28跨膜細胞內域(SEQ ID NO:38)、CD3ζ (SEQ ID NO:39)、T2A (SEQ ID NO:36)及EGFRt (SEQ ID NO:41)。諸如介白素、趨化細胞素、免疫檢查點抑制劑之元素若與CAR-T共表現，則可增強CAR-T之功效。使用介白素12 (IL-12)作為實例，CAR序列可為CAR-T2A-EGFRt-T2A-IL-12、CAR-T2A-EGFRt-IRES-IL-12或CAR-T2A-EGFRt-T2A-PGK啟動子IL-12。共刺激域可為4-1BB、OX40等，此等元素亦可改良CAR-T治療。可將共刺激域(4-1BB、OX40等)添加至CAR之共刺激域，包括以下實例：
(a) CD8鉸鏈、CD28跨膜、4-1BB細胞內域、CD3ζ；
(b) CD8鉸鏈、CD8跨膜、4-1BB細胞內域、CD3ζ；
(c) CD8鉸鏈、CD28跨膜、OX40細胞內域、CD3ζ；
(d) CD8鉸鏈、CD8跨膜、OX40細胞內域、CD3ζ；
(e) CD8鉸鏈、CD28跨膜細胞內域、4-1BB或OX40、CD3ζ。
鑒於當前可供使用的CAR-T療法對實體腫瘤幾乎無效，GASP-1 CAR-T療法可與當前認可之CAR-T療法(諸如司利弗明(tisagenlecleucel) (Kymriah)或迪蘭佐米(axicabtagene ciloleucel) (Yescarta)，其針對產生CD19之細胞)組合以改良此類CAR-T治療之有效性。亦可使用含有針對CD19或另一癌症表面抗原之額外CAR序列的GASP-1 CAR-T。亦提出GASP-1 CAR-T與稱為檢查點抑制劑的另一免疫療法之組合。檢查點抑制劑可為伊匹木單抗、奈昔木單抗、匹博利單抗、阿替利單抗、阿維路單抗、度伐單抗或測米匹單抗。
提供一種用於產生抗GASP-1抗體之方法。抗體產生方法包含用GASP-1肽作為免疫原使宿主免疫。GASP-1肽可為任何衍生自GASP-1之肽。GASP-1肽可包含選自由SEQ ID NO:22-26組成之群的胺基酸序列。GASP-1肽可由選自由SEQ ID NO:22-26組成之群的胺基酸序列組成。GASP-1肽可包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列。GASP-1肽可由SEQ ID NO:23之胺基酸序列組成。GASP-1肽可包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。GASP-1肽可由SEQ ID NO:24之胺基酸序列組成。GASP-1肽可包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列。GASP-1肽可由SEQ ID NO:25之胺基酸序列組成。GASP-1肽可包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。GASP-1肽可由SEQ ID NO:26之胺基酸序列組成。
一種用於產生雙特異性結合蛋白之方法。雙特異性結合蛋白產生方法包含將本發明之結合蛋白與額外的人類化抗體組合以產生雙特異性結合蛋白。雙特異性結合蛋白可具有比額外的人類化抗體更好的免疫療法特異性及/或功效。結合蛋白可為本發明之GASP-1抗體或CAR。額外的人類化抗體可選自由以下組成之群：利妥昔單抗、阿侖珠單抗、阿達木單抗、依法珠單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、那他珠單抗、帕尼單抗、雷珠單抗、伊匹木單抗、貝利木單抗、阿托珠單抗、培妥珠單抗、維多珠單抗、雷莫蘆單抗、依伏庫單抗、匹博利單抗、尼沃單抗、阿替利單抗、瑞利珠單抗、奈昔木單抗、曲妥珠單抗、培妥珠單抗、奧法木單抗、度伐單抗、硼替佐米、依洛珠單抗、阿維路單抗、測米匹單抗及奧拉妥單抗。
對於各雙特異性結合蛋白產生方法，提供所產生之雙特異性結合蛋白。雙特異性結合蛋白包含本發明之結合蛋白及額外的人類化抗體。雙特異性結合蛋白可具有比額外的人類化抗體更好的免疫療法特異性及/或功效。結合蛋白可為本發明之GASP-1抗體或CAR。額外的人類化抗體可選自由以下組成之群：利妥昔單抗、阿侖珠單抗、阿達木單抗、依法珠單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、那他珠單抗、帕尼單抗、雷珠單抗、伊匹木單抗、貝利木單抗、阿托珠單抗、培妥珠單抗、維多珠單抗、雷莫蘆單抗、依伏庫單抗、匹博利單抗、尼沃單抗、阿替利單抗、瑞利珠單抗、奈昔木單抗、曲妥珠單抗、培妥珠單抗、奧法木單抗、度伐單抗、硼替佐米、依洛珠單抗、阿維路單抗、測米匹單抗及奧拉妥單抗。
對於本發明之各結合蛋白或雙特異性結合蛋白，提供醫藥組合物。醫藥組合物包含本發明之結合蛋白或雙特異性結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
提供一種用於治療有需要之個體中的GASP-1介導之疾病或病症之方法。治療方法包含向個體投與有效量之本發明之醫藥組合物。
根據治療方法，GASP-1介導之疾病或病症可為腫瘤。腫瘤可為實體腫瘤。腫瘤可為血液腫瘤。
根據治療方法，GASP-1介導之疾病或病症可為癌症。個體可已接受癌症之治療。GASP-1可表現於個體的細胞中之顆粒中。GASP-1顆粒可在細胞溶質中或在細胞表面上。在一個實施例中，GASP-1顆粒可在細胞之細胞溶質中。在另一實施例中，GASP-1顆粒可在細胞表面上。在另一實施例中，GASP-1顆粒可不在細胞核中。
治療方法可進一步包含測定在癌症治療前，個體之細胞中之GASP-1顆粒的平均數目及/或平均直徑及/或穩定性。治療方法可進一步包含測定在癌症治療後，個體之細胞中之GASP-1顆粒的平均數目、平均直徑及/或穩定性，且視情況比較癌症治療前與癌症治療後個體之細胞中之GASP-1顆粒之平均數目、平均直徑及/或穩定性。
根據治療方法，癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。
提供一種抑制表現GASP-1的細胞生長之方法。抑制方法包含向細胞投與有效量之本發明之醫藥組合物。細胞可為癌細胞。細胞可在患有癌症之患者中。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。
提供一種失活化表現GASP-1的胞外體、微細小胞或癌小體之方法。失活化方法包含向胞外體、微細小胞或癌小體投與有效量之本發明之醫藥組合物。胞外體、微細小胞或癌小體之失活化可藉由以下證明：對於胞外體，諸如CD63、CD9或CD81之表面生物標記之數目減少；對於微細小胞，諸如CD45、CD47之表面生物標記之數目減少；及對於癌小體，諸如熱休克蛋白HSPA5及HSPA9之表面生物標記之數目減少。胞外體、微細小胞或癌小體可在患有癌症之個體中。胞外體、微細小胞或癌小體可在個體之血液循環中。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。癌症可選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。乳癌可為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。肺癌可為非小細胞肺癌(NSCLC)。
實例1. 識別前列腺癌中之GASP-1癌小體或微細小胞。
使用針對EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22)之多株抗體檢測前列腺癌細胞中之GASP-1表現。GASP-1癌小體或微細小胞係藉由自細胞膜出芽來釋放。如圖1中所示，儘管正常前列腺細胞不釋放GASP-1癌小體或微細小胞(左圖)，但可發現GASP-1癌小體在釋放前經由形成自細胞膜突出之膜泡而自細胞膜出芽(參見右圖中之箭頭)。癌小體或微細小胞似乎來源於最初在癌細胞膜之某些區域中集中之GASP-1。亦可在釋放區附近發現完全釋放之癌小體或微細小胞(右圖)。
實例2. 癌細胞中存在各種尺寸之GASP-1顆粒。
使用針對EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22)之多株抗體檢測各種癌細胞中之GASP-1表現。與以上實例1中所描述之釋放的細胞外GASP-1癌小體不同，在癌細胞(包括乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、胃癌、膀胱癌、黑色素瘤或結腸癌)之細胞溶質中或表面上發現表現GASP-1之顆粒。因為癌症起始及發展需要GASP-1過表現，所以產生GASP-1顆粒可為癌症發展所需之步驟。
圖2展示使用針對EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22)之多株抗體進行的高度DCIS乳癌之免疫組織化學(IHC)染色。在正常乳房細胞中，GASP-1僅表現於一些細胞核中且不表現於細胞溶質中(圖2左圖)。在癌細胞中，GASP-1顆粒與細胞膜結合，在細胞溶質中，聚集在核膜周圍及細胞核內(圖2右圖及圖3)。
GASP-1顆粒可來源於核內體。然而，不同於在成熟時具有0.5 µm直徑之核內體，此癌症中存在不同尺寸精細顆粒及粗糙顆粒之GASP-1顆粒(範圍涵蓋粉末狀顆粒、精細顆粒及粗糙顆粒)(圖3)。直徑為1.0至5.0 µm之粗糙GASP-1顆粒可大於核內體。此外，不同於描述於圖1中之細胞外GASP-1癌小體，粗糙GASP-1顆粒仍與細胞膜連接(參見圖3中之箭頭)且不自細胞膜釋放。GASP-1顆粒亦不形成可作為癌小體標誌之自細胞膜突出之膜泡。粗糙GASP-1顆粒可能係由較小顆粒之成熟或藉由較小顆粒之聚集而形成。細胞膜上許多粗糙GASP-1顆粒之結合有可能引起膜不穩定及細胞膜破裂(或片段化)。片段化細胞膜片仍含有許多與其連接之GASP-1顆粒(圖3)。細胞膜破裂的一個後果為許多最初存在於細胞內(在細胞溶質中，聚集於核膜上，或在細胞核中)之GASP-1顆粒釋放至腫瘤微環境中且隨後釋放至血液循環中。吾人亦已發現，隨著癌症變得更嚴重，GASP-1顆粒之尺寸變得更大且粗糙。
GASP-1顆粒存在於癌細胞表面上且不存在於正常細胞表面上可提供特異性靶向癌細胞且不影響正常細胞之機會。在癌細胞表面上存在大量粗糙GASP-1顆粒亦可使得GASP-1靶向癌症治療更有效。在如DCIS乳癌之實體腫瘤及其他癌症中，亦可在不同細胞層之表面上發現GASP-1顆粒。此亦將使得靶向GASP-1顆粒之免疫療法更有效，因為癌症治療劑將能夠找到該等GASP-1顆粒。
三陰性乳癌(其為侵略性極強之乳癌)展示與高度DCIS幾乎相同之GASP-1顆粒模式(圖4)。同樣地，此癌症中存在不同尺寸的GASP-1顆粒，其範圍涵蓋粉末狀顆粒、精細顆粒及粗糙顆粒。箭頭指出仍與細胞膜或膜片段連接之GASP-1顆粒。
對於男性及女性而言，肺癌均為最致命的癌症。其死亡率超過三種最常見癌症(結腸癌、乳房癌及胰臟癌)的死亡率之總和。非小細胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例之約85%且大部分新近診斷之肺癌患者為晚期。早期偵測非常重要且在可獲得活檢樣品時，細胞溶質中GASP-1顆粒之存在及豐度可代表早期偵測。圖5展示NSCLC之代表性IHC染色。雖在正常肺細胞中，GASP-1顆粒僅存在於一些細胞核中且不存在於細胞溶質中(左圖)，但在NSCLC中，各種尺寸之GASP-1顆粒存在於細胞溶質中或與細胞膜連接(右圖)。右圖中之箭頭指出GASP-1顆粒與細胞膜及膜片段之結合。因此，對來自懷疑罹患肺癌之個體的肺組織進行針對GASP-1顆粒之IHC染色將證實是否存在肺癌。
圖6展示神經膠母細胞瘤細胞中之GASP-1顆粒。GASP-1顆粒不存在於正常腦細胞中(左圖)，但在神經膠母細胞瘤細胞中大量存在(右圖)。各種尺寸之GASP-1顆粒存在於神經膠母細胞瘤細胞之細胞溶質中及表面上。
發現在卵巢癌、結腸癌、黑色素瘤、胃癌及前列腺癌細胞之細胞溶質中或表面上存在類似的大量GASP-1顆粒。
癌細胞內存在如此多的不同尺寸之GASP-1顆粒為出人意料的。GASP-1顆粒存在於吾人所研究之所有癌細胞表面上；可假定其亦將存在於其他癌細胞表面上，諸如子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、喉癌、卵巢黏質囊腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。因此，GASP-1為普遍性癌症生物標記且產生GASP-1顆粒可代表癌症發展中之必要步驟。因此，可使用GASP-1顆粒之存在、其次細胞定位、其豐度等來評估癌症及癌症嚴重程度。
實例3. GASP-1 scFv序列
製備針對GASP-1肽片段EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22)之單株抗體。分離若干純系。純系14B8展示針對GASP-1肽之最高效價。將來自純系14B8之細胞溶解物儲存於TriZol溶液中。自細胞溶解物中之全部RNA反轉錄cDNA，隨後進行抗體之可變區(重鏈(VH)及輕鏈兩者)之PCR擴增。圖7展示使用VL特異性引子(泳道1)或VH特異性引子泳道2)之PCR產物的凝膠分析。隨後將所得PCR片段分別選殖至標準選殖載體中且測序。使用PCR，對純系14B8之重鏈及輕鏈進行測序，且發現兩個可變輕鏈序列。
表1展示純系14B8之各種胺基酸序列及核苷酸序列，例如可變重(VH)鏈(包括其第一、第二及第三互補決定區(VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3))、第一可變輕(VL1)鏈(包括其第一、第二及第三互補決定區(VL1CDR1、VL1CDR2及VL1CDR3))以及第二可變輕(VL2)鏈(包括其第一、第二及第三互補決定區(VL2CDR1、VL2CDR2及VL2CDR3))。兩個輕鏈序列的不同之處僅為CDR1中之一個胺基酸(比較SEQ ID NO:9及17)。N至Y之變化係歸因於如SEQ ID NO:13及19中所描述的自TAT至AAT之密碼子變化。此差異可能係歸因於目標次選殖之多重選殖性。核苷酸及胺基酸之變化以粗體突出顯示且加下劃線。
表1 純系14B8之序列
實例4 抗GASP-1 scFv-Fc蛋白
基於純系14B8之序列產生抗GASP-1 scFv-Fc蛋白。使用不同可變輕(VL)鏈序列，製備兩種scFv-Fc表現載體scFv1-Fc及scFv2-Fc。表現載體構築體設計展示於圖8中。scFv1-Fc之VL為1468輕鏈#2 (SEQ ID NO:9)，而scFv2-Fc之VL為1468輕鏈#1 (SEQ ID NO:17)。將表現載體短暫轉染至HEK293細胞中，且scFv-Fc蛋白藉由Gibco® FreeStyle™ 293表現培養基表現於HEK293細胞中。
藉由蛋白A親和性層析法純化scFv-Fc蛋白且分析其對於目標PC-3癌細胞之親和性。在流式細胞分析(FACS)中，5×105 個PC-3細胞用scFv1-Fc或scFv2-Fc蛋白，隨後用作為二級抗體之PE抗人類IgG Fc抗體進行染色。圖9展示scFv1-Fc蛋白識別49.4%之PC-3細胞，而scFv2-Fc蛋白僅識別8.39%之PC-3細胞，表明scFv1對PC-3細胞具有顯著更高的親和性。
實例5 癌細胞表面上之GASP-1表現
使用針對EEASPEAVAGVGFESK (SEQ ID NO:22)之抗GASP-1單株抗體研究GASP-1在各種癌細胞中之表現。在肺癌及卵巢癌細胞之表面上發現GASP-1 (圖10)。在肺癌表面上出現GASP-1證實免疫組織化學(IHC)分析之結果(圖5)，其展示癌細胞表面上存在GASP-1顆粒。亦藉由流式細胞分析在所檢測之其他癌細胞(例如結腸癌、乳癌、白血病、黑色素瘤、神經膠母細胞瘤及胰臟癌細胞)之表面上發現GASP-1。基於此等結果，GASP-1可為普遍性癌症生物標記且出現在其他癌症之細胞表面上，該等癌症包括子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。GASP-1顆粒與許多癌症的細胞膜之極穩定結合將使GASP-1顆粒成為用於治療癌症(包括許多實體腫瘤)的CAR-T與人類化重組型抗體兩者之良好目標。
實例6 構築CAR載體
因為GASP-1顆粒存在於不同癌細胞層之表面上(參見圖3及圖4)而非包埋於細胞層內，且不存在於正常細胞表面上，用scFv1合成全長嵌合抗原受體(CAR)且將其次選殖至慢病毒載體中(圖11)。藉由桑格測序(Sanger sequencing)確認插入物。
表2展示用於產生CAR卡匣之核苷酸及胺基酸序列。使用以下之核苷酸序列製備CAR構築體：Lenti-EF-1α啟動子(SEQ ID NO:27)、信號肽(SEQ ID NO:28)、scFv1 (SEQ ID NO:29)、CD28鉸鏈(SEQ ID NO:30)、CD28膜內序列(SEQ ID NO:31)、CD3z (SEQ ID NO:32)、T2A (明脈扁刺蛾(thosea asigna)病毒2A自裂解肽) (SEQ ID NO:33)及EGFRt (截短型人類表皮生長因子受體) (SEQ ID NO:34)。GASP-1 CAR構築體包含以下之胺基酸序列：信號序列(SEQ ID NO:35)、scFv1 (SEQ ID NO:36)或scFv2 (SEQ ID NO:43)、CD28鉸鏈(SEQ ID NO:37)、CD28跨膜序列(SEQ ID NO:38)、CD3z (SEQ ID NO:39)、T2A (SEQ ID NO:40)及EGFRt (SEQ ID NO:41)。scFv1可經scFv2取代(SEQ ID NO:42)。
表2 CAR構築體之序列
使用GASP-1顆粒作為CAR-T目標，靶向癌細胞表面GASP-1顆粒之CAR-T療法代表一種新方法且將有效對抗血液腫瘤及實體腫瘤。
實例7 CAR-T細胞
為評估CAR-T百分比，將CAR-T細胞用抗EGFR及PE結合之抗人類IgG染色。流式細胞儀分析表明34.9%的細胞為CAR陽性(圖12)。
為測試CAR-T之有效性，將CAR-T細胞與目標細胞株PC-3以不同E/T比率共培養24小時，收集上清液以確定細胞介素之釋放。資料表明在與目標腫瘤細胞接合之後，由CAR-T細胞分泌之IL-2及IFN-γ增加(圖13)。
實例8.構築含有抗GASP-1 scFv序列之人類化抗體。
製備含有scFv1序列之人類化抗體。第一抗體可包含重鏈(SEQ ID NO:44)之胺基酸序列(包括可變區VH (SEQ ID NO:1)及人類恆定區(SEQ ID NO:45))，及輕鏈(SEQ ID:46)(包括由人類恆定區(SEQ ID NO:47)結合之可變區VL1 (SEQ ID NO:9))。第二抗體可包含重鏈(SEQ ID NO:44)之胺基酸序列(包括可變區VH (SEQ ID NO:1)及人類恆定區(SEQ ID NO:45))，及輕鏈(SEQ ID:48)(包括由人類恆定區(SEQ ID NO:47)結合之可變區VL2 (SEQ ID NO:17))。表3展示用於製備抗GASP-1人類化抗體之各種序列。合成所設計之嵌合抗體鏈且將其次選殖至哺乳動物表現載體中且短暫轉染至HEK293細胞中。藉由蛋白A親和性層析法及SEC-HPLC純化mAb。在超濾之後，對最終產物進行0.2微米無菌過濾。蛋白質純度＞99%且內毒素低於1 EU/mg。
表3. 人類化抗GASP-1抗體序列
儘管本文中參考特定實施例說明及描述本發明，但所展示之細節並不意欲限制本發明。相反，可在不脫離本發明的情況下對申請專利範圍等效物的範疇及範圍內之細節進行各種修改。
圖1展示細胞外癌小體經由自細胞膜突出之膜泡自前列腺癌細胞釋放(右圖)，但不自正常前列腺細胞釋放(左圖)。
圖2展示不同尺寸之GASP-1顆粒在高度DCIS乳癌細胞之細胞溶質中積聚(右圖)，但不在正常乳房細胞之細胞溶質中積聚(左圖)。
圖3展示許多GASP-1顆粒與高度DCIS乳癌細胞之細胞膜或膜片段連接。
圖4展示三陰性乳癌細胞之細胞膜上的不同尺寸之GASP-1顆粒。
圖5展示不同尺寸之GASP-1顆粒在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞之細胞溶質中積聚(右圖)，但不在正常肺細胞之細胞溶質中積聚(左圖)。
圖6展示GASP-1顆粒在神經膠母細胞瘤細胞之細胞溶質中及細胞膜上積聚(右圖)，但不在正常腦細胞之細胞溶質中及細胞膜上積聚(左圖)。
圖7展示使用VL特異性引子(泳道1)或VH特異性引子(泳道2)之PCR產物。泳道M：2000 DNA標記，自上而下分別為：2000、1000、750、500、250、100 bp。
圖8展示具有4911 bp之scFv1-Fc或scFv2-Fc表現載體之示意圖，包括信號序列、可變輕鏈(VL)、連接子、可變重鏈(VH)及人類IgG1 Fc (HIgG1-Fc)。
圖9展示使用作為初級抗體之scFv1-Fc (右圖)或scFv2-Fc (左圖)及作為二級抗體之PE抗人類IgG Fc抗體染色的PC3細胞之流式細胞分析(FACS)。
圖10展示使用作為初級抗體之GASP-1單株抗體及作為二級抗體之Alexa Fluor-A抗人類IgG Fc抗體染色的A549肺癌細胞(左圖)或SKOV3卵巢癌細胞(右圖)之流式細胞分析(FACS)。
圖11展示具有10,228 bp之嵌合抗原受體(CAR) Lenti-EF1a-scFv1-CD28-CD3z-T2A-EGFRt的示意圖。
圖12展示34.9%之T細胞為CAR陽性。
圖13展示在暴露於CAR-10217-SIA-CAR-T細胞後，癌細胞釋放IFN-γ (左圖)及IL-2 (右圖)。

Claims (59)

  1. 一種用於偵測細胞之方法，該等細胞具有表現G蛋白偶合受體相關分選蛋白1 (GASP-1)或其片段之顆粒，該方法包含： (a)使該等細胞與有效量之結合蛋白接觸，其中該結合蛋白包含與GASP-1特異性結合之抗原結合片段；及 (b)識別具有結合於該結合蛋白之顆粒的細胞，其中該等所識別之細胞為具有GASP-1顆粒之細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中該等細胞中之GASP-1顆粒之直徑在0.1至5.0 µm範圍內。
  3. 如請求項1之方法，其中該等細胞中之GASP-1顆粒之平均數目在每個細胞20至150個範圍內。
  4. 如請求項1之方法，其中該等GASP-1顆粒係在該等細胞之細胞溶質中或表面上。
  5. 如請求項1之方法，其中該等細胞在腫瘤中。
  6. 如請求項5之方法，其中該腫瘤為實體腫瘤或血液腫瘤。
  7. 如請求項1之方法，其中該等細胞為癌細胞。
  8. 如請求項1之方法，其中該等細胞係在患有癌症之個體中。
  9. 如請求項8之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。
  10. 如請求項9之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該乳癌為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌()。
  12. 如請求項9或10之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
  13. 如請求項8之方法，其中該個體已接受癌症治療。
  14. 如請求項1之方法，其進一步包含偵測該等細胞中之癌症生物標記。
  15. 如請求項14之方法，其中該癌症生物標記係選自由以下組成之群：CA125、CA19-9、CA15-3、CA27.29、AFP、BRCA1/BRCA2、EGFR、HER-2、KIT、VEGF、KRAS、ALK、PSA、HE4、CYFRA 21-1、NSE、PD-L1、TIMP-1、TIMP-2、HGF、OPN、MSLN、MMP2及CEA。
  16. 如請求項1之方法，其中該結合蛋白為人類化抗體或嵌合抗原受體(CAR)。
  17. 一種結合蛋白，其包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)。
  18. 如請求項17之結合蛋白，其中該抗GASP-1 scFv包含可變重(VH)鏈及可變輕(VL)鏈。
  19. 如請求項18之結合蛋白，其中該VH鏈包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列。
  20. 如請求項17之結合蛋白，其中該VH鏈包含由SEQ ID NO:2之胺基酸序列組成之第一互補決定區1 (VHCDR1)、由SEQ ID NO:3之胺基酸序列組成之第二互補決定區2 (VHCDR2)、由SEQ ID NO:4之胺基酸序列組成之第三互補決定區3 (VCCDR3)或其組合。
  21. 如請求項17之結合蛋白，其中該VL鏈包含SEQ ID NO:9或17。
  22. 如請求項17之結合蛋白，其中該VL鏈包含由SEQ ID NO:10或18之胺基酸序列組成之第一互補決定區(VL1CDR1)、由SEQ ID NO:11之胺基酸序列組成之第二互補決定區(VL1CDR2)及由SEQ ID NO:12之胺基酸序列組成之第三互補決定區(VL1CDR3)。
  23. 如請求項17之結合蛋白，其中該VH鏈藉由連接子連接至該VL鏈。
  24. 如請求項17之結合蛋白，其中該連接子包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
  25. 如請求項17之結合蛋白，其中該抗GASP-1 scFv特異性結合GASP-1之免疫顯性抗原決定位且該免疫顯性抗原決定位包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。
  26. 如請求項17之結合蛋白，其中該結合蛋白為選自由以下組成之群的抗體：重組型單株抗體、多株抗體、人類化抗體及其抗原結合片段。
  27. 如請求項26之結合蛋白，其中該結合蛋白為人類化抗體。
  28. 如請求項17之結合蛋白，其中該結合蛋白為包含該抗GASP-1 scFv之嵌合抗原受體(CAR)。
  29. 如請求項28之結合蛋白，其中該抗GASP-1 scFv包含選自由SEQ ID NO:36及43組成之群的胺基酸序列。
  30. 如請求項17之結合蛋白，其包含至少一個選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:1-4、9-12及17-18。
  31. 如請求項17之結合蛋白，其中該結合蛋白與化學治療劑結合。
  32. 如請求項31之結合蛋白，其中該化學治療劑係選自由以下組成之群：阿那曲唑(Anastrozole)、依西美坦(Exemestane)、來曲唑(Letrozole)、帕博西林(Palbociclib)、利波西利(Ribociclib)、奈拉替尼(Neratinib)、阿貝西利(Abemaciclib)、奧拉帕利(Olaparib)、癌瑞格(Regorafenib)、視網酸(Tretinoin)、迪蘭佐米(axicabtagene ciloleucel)、達沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、波舒替尼(Bosutinib)、伊布替尼(Ibrutinib)、伊德利塞(Idelalisib)、維奈克拉(Venetoclax)、泊那替尼(Ponatinib)、米哚妥林(Midostaurin)、伊那尼布(Enasidenib)、司利弗明(Tisagenlecleucel)、艾伏尼布(Ivosideni)、度維利塞(Duvelisib)、伊馬替尼(Imatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、埃羅替尼(Erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、阿比特龍(Abiraterone)、克里唑替尼(Critozinib)、維莫非尼(Vemurafenib)、諸如111 In及90 Y之放射性同位素、諸如奧瑞他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、阿黴素(doxorubicin)、紫杉醇(taxols)、順鉑(cisplatin)、長春鹼(vinblastine)、卡奇黴素(calicheamicin)及假單胞菌外毒素A (Pseudomonas exotoxin A)之毒素。
  33. 一種用於產生包含嵌合抗原受體之T細胞(CAR-T細胞)之方法，其包含： a) 將編碼包含抗GASP-1單鏈可變片段(抗GASP-1 scFv)之CAR的基因引入T細胞中， b) 藉由該等T細胞表現該抗GASP-1 scFv，及 c) 分離表現該抗GASP-1 scFv之T細胞。
  34. 如請求項33之方法，其中該抗GASP-1 scFv包含選自由SEQ ID NO:36及43組成之群的胺基酸序列。
  35. 一種用於產生抗GASP-1抗體之方法，其包含用GASP-1肽作為免疫原使宿主免疫。
  36. 如請求項35之方法，其中該GASP-1肽包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列。
  37. 一種用於產生雙特異性結合蛋白之方法，其包含組合如請求項16之結合蛋白與額外人類化抗體，從而產生相比於該人類化抗體具有更佳的免疫療法特異性及/或功效之雙特異性結合蛋白。
  38. 如請求項37之方法，其中該結合蛋白為人類化GASP-1抗體或嵌合抗原受體(CAR)。
  39. 如請求項37或38之方法，其中該額外人類化抗體係選自由以下組成之群：利妥昔單抗(Rituximab)、阿侖珠單抗(Alemtuzumab)、阿達木單抗(Adalimumab)、依法珠單抗(Efalizumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、貝伐單抗(Bevacizumab)、那他珠單抗(Natalizumab)、帕尼單抗(Panitumumab)、雷珠單抗(Ranibizumab)、伊匹木單抗(Ipilimumab)、貝利木單抗(Belimumab)、阿托珠單抗(Obinutuzumab)、培妥珠單抗(Pertuzumab)、維多珠單抗(Vedolizumab)、雷莫蘆單抗(Ramucirumab)、依伏庫單抗(Evolocumab)、匹博利單抗(Pembrolizumab)、尼沃單抗(Nivolumab)、阿替利單抗(Atezolizumab)、瑞利珠單抗(Reslizumab)、奈昔木單抗(Necitumumab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、培妥珠單抗(Pertuzumab)、奧法木單抗(Ofatumumab)、度伐單抗(Durvalumab)、硼替佐米(Bortezomib)、依洛珠單抗(Elotuzumab)、阿維路單抗(Avelumab)、測米匹單抗(Cemiplimab)及奧拉妥單抗(Olaratumab)。
  40. 一種雙特異性結合蛋白，其係根據如請求項37至39中任一項之方法製備。
  41. 一種醫藥組合物，其包含如請求項17至32中任一項之結合蛋白或如請求項40之雙特異性結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  42. 一種用於治療有需要之個體中的GASP-1介導之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項41之醫藥組合物。
  43. 如請求項42之方法，其中該GASP-1介導之疾病或病症為腫瘤。
  44. 如請求項43之方法，其中該腫瘤為實體腫瘤。
  45. 如請求項43之方法，其中該腫瘤為血液腫瘤。
  46. 如請求項42之方法，其中該GASP-1介導之疾病或病症為癌症。
  47. 如請求項42之方法，其中該個體已接受癌症之治療。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該GASP-1表現於該個體的細胞中之顆粒中。
  49. 如請求項48之方法，其中該等顆粒在該等細胞之細胞溶質中或表面上。
  50. 一種用於抑制表現GASP-1的細胞生長之方法，其包含向該等細胞投與有效量之如請求項41之醫藥組合物。
  51. 如請求項50之方法，其中該等細胞為癌細胞。
  52. 如請求項50之方法，其中該等細胞在患有癌症之患者中。
  53. 一種用於失活化表現GASP-1的胞外體、微細小胞或癌小體之方法，其包含向該胞外體、微細小胞或癌小體投與有效量之如請求項41之醫藥組合物。
  54. 如請求項53之方法，其中該胞外體、微細小胞或癌小體係在患有癌症之個體中。
  55. 如請求項54之方法，其中該胞外體、微細小胞或癌小體係在該個體之血液循環中。
  56. 如請求項46、52或54之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道鱗狀細胞癌、神經膠質瘤、頭部癌症、肝細胞癌、浸潤性乳腺管乳癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢黏質囊腺癌、頸部癌症、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、腎細胞癌、小腸惡性基質腫瘤及胃腺癌。
  57. 如請求項46、52或54之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、結腸癌、神經膠母細胞瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌及前列腺癌。
  58. 如請求項56或57之方法，其中該乳癌為高度乳腺管原位癌(DCIS)乳癌或三陰性乳癌。
  59. 如請求項56或57之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
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