CN117924498A

CN117924498A - Siglec-15抗体及其用途

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Publication number: CN117924498A
Application number: CN202410205909.4A
Authority: CN
Inventors: 袁青; 刘琴; 李林; 年四季; 叶迎春
Original assignee: Southwest Medical University
Current assignee: Southwest Medical University
Priority date: 2024-02-26
Filing date: 2024-02-26
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明公开了抗体或其抗原结合片段，其能够结合Siglec‑15蛋白。本发明从构建的全人源scFv噬菌体免疫抗体文库中成功筛选并构建出2株全人源抗siglec‑15‑IgG1抗体S131‑IgG1、S194‑IgG1，这两株抗体特异性好，亲和力高，且具有良好的ADCC作用，在一定程度上可恢复CD8⁺T细胞功能。PBMC人源化荷瘤小鼠模型中，抗siglec15S131‑IgG1重组抗体使肿瘤组织中浸润淋巴细胞增加，以抑制肿瘤生长。

Description

Siglec-15抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及一种Siglec-15抗体及其用途。

背景技术

当前肿瘤免疫治疗开发的重点在于如何纠正肿瘤微环境中的免疫耐受，主要有增强正常抗癌免疫机制和恢复肿瘤微环境中存在的免疫耐受两种方法，但是被动的增强免疫力通常会带来相关的免疫不良反应。因此，癌症免疫疗法正在从传统的免疫增强方法转变为基于肿瘤诱导的免疫逃逸机制靶向肿瘤微环境，探索更有效，毒性更小的免疫正常化治疗。

PD-1(程序性死亡受体1)是一种重要的免疫抑制分子，在许多情况下参与免疫反应和炎症过程。PD-1免疫疗法是指程序性死亡蛋白-1抑制剂疗法，是一种免疫治疗方法。PD-1抑制剂属于一种新兴的抗肿瘤的免疫治疗药物，PD-1抑制剂在临床上属于一种单克隆抗体类药物，主要能够阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，从而解除PD-1/PD-L1结合所介导的免疫功能的抑制，使人体的T细胞能够重新被激活,最大限度地发挥杀伤肿瘤细胞的功效。目前PD-1治疗的成功强调了在肿瘤微环境(TME)中把恢复受抑制的免疫反应作为癌症免疫治疗正常化原则的重要性。根据最近用于TME中肿瘤免疫分类的定义，只有不到40％的人类实体肿瘤是由B7-H1/PD-1通路引起的免疫功能失调。大量证据表明，除了B7-H1的上调外，许多其他分子或细胞机制也可导致TME的免疫功能失调。作为癌症免疫治疗领域的新参与者，siglec-15可能代表了一类新型免疫抑制剂，具有肿瘤相关表达和对PD-L1的不同作用机制，对抗PD-1/PD-L1耐药患者具有潜在意义。

免疫球蛋白样凝集素(SIGLECs)是一类表达于免疫细胞表面的受体(又称糖免疫检查点)，可以识别唾液化的聚糖，该家族的大部分成员参与免疫抑制调控。SIGLECs的配体主要为唾液酸化聚糖，广泛分布于哺乳类细胞、细菌、病毒以及肿瘤细胞表面。异常糖基化所致肿瘤进展和转移是恶性肿瘤的特征之一，配体通过与免疫细胞的SIGLECs相互作用实现病原微生物及肿瘤的免疫逃逸。SIGLECs是继PD-1/PD-L1和CTLA-4之后的新型抗肿瘤免疫治疗靶点，对该领域的全面了解可拓宽肿瘤免疫治疗研究新思路。

Siglec-15作为Ι型跨膜蛋白，具典型唾液酸与免疫球蛋白型凝集素相结合结构。Siglec-15在人体脾脏和淋巴结的巨噬细胞和/或树突状细胞上表达，研究表明Siglec-15的表达虽然通常局限于髓系细胞，但在许多人类癌症中可以上调，在肝、肺、甲状腺癌和膀胱癌组织以及肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中高表达。Siglec-15的表达具有TAM和基质细胞局限，表明Siglec-15有可以作为一种主要在TME中起作用的免疫抑制分子，有助于Siglec-15阻断法的安全性。此外，Siglec-15与B7-H1表达互斥，是关键的免疫抑制因子。对Siglec-15在膀胱癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、甲状腺癌、肾透明细胞癌等肿瘤中的作用也持续有探索和新发现，这都表明Sigle-15在肿瘤免疫治疗正常化中是一个极具潜力的靶点。

肿瘤微环境宿主抗体分泌细胞(ASCs)与几种癌症的良好预后相关，患者源性抗体具有诊断和治疗潜力。针对肿瘤上高表达的抗原，肿瘤患者体内可能存在高亲和力的抗体，以抑制肿瘤生长。

单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性，并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。scFv抗体比完整抗体具有更好的细胞穿透性。然而，单价结合的单链抗体分子量小、亲和力较低，并且体内半衰期短。众所周知，IgG类抗体是血液中含量最丰富的免疫球蛋白，也是治疗性抗体的主要形式。全长IgG分子量约为150kDa，在人体中其血药清除半衰期(T1/2)为21天。当全长IgG作为放射性核素的载体时，缓慢的血液清除增加了其在放免治疗期间对正常组织的辐射剂量。

发明内容

本发明从构建的全人源scFv噬菌体免疫抗体文库中成功筛选并构建出2株全人源抗siglec-15-IgG1抗体(S131-IgG1、S194-IgG1)，这两株抗体特异性好，亲和力高，且具有良好的ADCC作用，在一定程度上可恢复CD8⁺T细胞功能。PBMC人源化荷瘤小鼠模型中，抗siglec15-IgG1重组抗体S131-IgG1使肿瘤组织中浸润淋巴细胞增加，以抑制肿瘤生长。基于此，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一方面提供一种抗体或其抗原结合片段，其能够结合Siglec-15蛋白，所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LCDR2的氨基酸序列为GQN，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、重组抗体、全人源抗体；

其中所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fv、ScFv和IgG。

优选地，其中所述抗体包含抗体轻链或其片段，以及抗体重链或其片段；优选所述抗体轻链或其片段包含如SEQ ID NO.6的氨基酸序列或与SEQ ID NO.6具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL，所述抗体重链或其片段包含如如SEQ ID NO.7的氨基酸序列或与SEQ ID NO.7具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的的重链可变区VH。

优选地，所述抗体为ScFv，其重链可变区VH与轻链可变区VL由连接肽linker连接，优选所述连接肽linker的氨基酸序列为(Gly₄Ser)₃，所述抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示。

优选地，所述抗体为抗siglec-15重组抗体，所述重组抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；优选所述重组抗体为抗siglec15-IgG重组抗体，重组抗体的重(H)链包含权利要求3所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH和IgG抗体的重链恒定区氨基酸序列，轻(L)链包含权利要求3所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL和IgG抗体的轻链恒定区氨基酸序列；

进一步优选所述重组抗体为抗siglec15-IgG1重组抗体，重组抗体的重链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO:12的人IgG1重链恒定区CH的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列；重组抗体的轻链恒定区为氨基酸序列为SEQ ID NO:13的人IgG1轻链恒定区CL的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列；

进一步优选所述重组抗体为S131-IgG1，其重链和轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15所示。

本发明的第二方面提供一种编码上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子。

本发明的第三方面提供一种包含上述的多核苷酸分子的重组DNA表达载体。

本发明的第四方面提供上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备抗肿瘤药物中的用途。

在所述的用途技术方案中，所述药物为抗肿瘤免疫治疗药物；优选所述肿瘤为膀胱癌、肺癌、前列腺癌，进一步优选为肺腺癌。

本发明的第五方面提供一种药物组合物，其包含上述任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及任选地药学上可接受的佐剂。

本发明的有益效果是：

本发明针对siglec-15从全人源肺癌文库中筛选到1株亲和力高、特异性好的全长抗体S131-IgG1，分别从体内外探讨了S131-IgG1的生物学功能，从体内结果表明，重组抗体可以介导良好的细胞毒活性；而体外实验结果表明，在小鼠免疫系统人源化的前提下，抗体给药组小鼠不管是肿瘤体积和体重都比对照组相比显著降低，且通过对肿瘤淋巴细胞浸润分析，给药组小鼠肿瘤有更多的人淋巴细胞浸润，其中CD8⁺T细胞浸润情况较突出，说明siglec-15重组抗体可以将淋巴细胞靶向肿瘤细胞，具有良好的靶向性。本发明验证了从肿瘤病人来源的文库中筛选出针对siglec-15靶点抗体的可行性，重抗体的亲和力、特异性得到确定，还对重组抗体生物学功能进行了分析，表明筛选出的siglec-15重组抗体S131-IgG1具有良好的靶向治疗肿瘤的潜力。

附图说明

图1显示scFvs噬菌体免疫文库的构建及多样性分析：(A)M为DL2000bp的DNAmarker，1-20条为扩增出的VH基因条带,21-25为扩增出的Vκ基因条带；(B)M为DL2000bp的DNA marker，1-5为扩增出的V_κ基因条带,6-18条为扩增出的Vλ基因条带；(C)通过胶回收试剂盒回收VH/VL基因，PCR验证纯度，1-2为VH基因条带，3-5为Vκ基因条带,6-8为Vλ基因条带；(D)通过重叠延伸PCR将VH-Linker-Vκ和VH-Linker-Vλ进行拼接，获得了大小约800bp的scFv(VH-Linker-VL)M为DL2000bp的DNA marker，1-3为VH-Vκ基因扩增带，4-6为VH-Vλ基因扩增带；(E)M为DL2000bp的DNA marker，1-20为噬菌体文库中不同单克隆菌落的编号；(F)用限制性内切酶BstNⅠ随机酶切噬菌体文库中的scFv所形成的DNA指纹图谱M为DL2000bp的DNA marker，1-20为不同单克隆菌落的编号。

图2是高亲和力scFvs的筛选：(A-B)针对Siglec-15抗原的的噬菌体抗体文库筛选及其输入、输出和输入输出比；(C)噬菌体ELISA鉴定初次筛选的35个scFvs与靶抗原siglec-15的结合活性；(D)噬菌体细胞ELISA鉴定筛选的35个scFvs与A549细胞的结合；(E)噬菌体细胞ELISA鉴定筛选的35个scFvs与PC-3细胞的结合。

图3显示重组抗体纯化与抗原结合活性鉴定：(A)SDS-PAGE鉴定重组抗体siglec15-IgG1，1为S131-IgG1，2为S194-IgG1；(B)S194-IgG1和S131-IgG1与生物素标记的Siglec-15蛋白结合及解离曲线；(C)S194-IgG1和S131-IgG1与生物素标记Siglec-15蛋白结合的大分子相互作用数据，Ka代表结合常数；Kd代表解离常数；KD代表解离平衡常数；(D)重组抗体S131-IgG1与siglec-15、EphA2、B7-H3、Trop2、CD24蛋白结合反应曲线；(E)S194-IgG1与siglec-15、EphA2、B7-H3、Trop2、CD24蛋白结合反应曲线。

图4是流式细胞术及细胞免疫荧光检测重组抗体与肿瘤细胞结合活性：(A)流式细胞术检测重组抗体与正常上皮细胞系16-HBE、肿瘤细胞系T24、PC-3、NCI-H157、A549以及过表达siglec-15 A549(S15-A549)肿瘤细胞系结合情况，灰色虚线为control组，黑色实线为IgG1组；(B)细胞免疫荧光检测重组抗体S131-IgG1与siglec-15表达阳性的肿瘤细胞系结合。

图5显示S131-IgG1、S194-IgG1细胞水平的抗肿瘤活性检测：(A)S131-IgG1、S194-IgG1在24H、48H、72H时对S15-A549肿瘤细胞的增殖抑制作用；(B)效应细胞与靶细胞之间的比值为20：1时，S131-IgG1、S194-IgG1介导的对PC-3、A549、S15-A549肿瘤细胞的杀伤活性；(C)流式细胞术检测S131-IgG1、S194-IgG1对逆转siglece-15介导的人CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T增殖抑制的作用。

图6显示重组抗体对耗竭CD8⁺T细胞的恢复作用：(A)重组抗体S131-IgG1、S194-IgG1与PEMC共培养后检测CD8⁺T细胞凋亡百分比；(B)重组抗体S131-IgG1、S194-IgG1与PEMC共培养后CD8⁺T细胞凋亡百分比；(C)重组抗体S131-IgG1、S194-IgG1与PEMC共培养后检测CD8⁺T细胞产生IFN-γ、GranzymeB百分比；(D)重组抗体S131-IgG1、S194-IgG1与PEMC共培养后CD8⁺T细胞产生IFN-γ百分比；(E)重组抗体S131-IgG1、S194-IgG1与PEMC共培养后CD8⁺T细胞产生GranzymeB百分比；(ns无统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。成组设计的t检验用于统计分析)。

图7表明重组抗体抑制人源化荷瘤小鼠肿瘤生长：(A)人源化荷瘤小鼠模型构建及抗体给药流程；(B)对照组与实验组小鼠肿瘤对比；(C)对照组和实验组小鼠肿瘤重量；(D)注射抗体后小鼠肿瘤体积变化曲线；(E)注射抗体后小鼠重量变化曲线；(F)对照组和实验组小鼠血液HuCD45⁺T细胞比例；(G)小鼠肿瘤HuCD45⁺T、HuCD4⁺T、HuCD8⁺T细胞比例。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用生物、化学试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，均可通过商购获得。

实施例1中筛选得到的单链抗体S131-scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，构建的重组抗体S131-IgG1的H链和L链的氨基酸序列如SEQ ID NO.14、15所示，S131-IgG1是将人IgG1上的重链和轻链可变区通过同源重组替换为S131的重链和轻链可变区得到的重组抗体。

实施例1

1材料与方法

1.1组织和体液

在征得患者和其家属同意后，从西南医科大学附属医院胸外科采集30例经临床诊断的肺癌患者术后肿瘤组织和淋巴组织，以及肺癌患者的胸腔积液，本实验已获得西南医科大学附属医院临床试验伦理委员会的批准(伦理审查编号：KY2023277)。

表1肿瘤患者信息汇总表

1.2细胞系

人前列腺癌细胞PC-3、人肝细胞癌细胞HepG2、人肺腺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7、正常人支气管上皮细胞16HBE、HEK293F、HEK293T真核细胞购买自ATCC，人膀胱移行细胞癌细胞T24、人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H157均购自泰勒生物(Talent,China)。在A549细胞系中建立S15过表达模型。

1.3肺癌病人淋巴结RNA提取及轻链和重链基因的扩增

使用TRIzol试剂(TaKaRa，大连，中国)从30余例肺癌患者(患者信息总结在表1)的淋巴结中提取RNA，并以纯化的RNA为模板逆转录合成第一链cDNA。采用PCR扩增含重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL，包括Vλ和V_κ)抗体片段的编码区。纯化后，将不同患者的VH或VL DNA混合，实现后续VH和VL连接。

1.4构建全人源scFv噬菌体文库

以纯化的VH和VL作为模板通过重叠PCR扩增，获得VH-Vκ和VH-Vλ基因。上游引物和下游引物使用参考文献1、2。将VH-V_κ和VH-Vλ基因按比例混合，酶切后与噬菌体载体PCANTAB-5E(SinoZhongyuan，中国)连接。转化TG1大肠杆菌细胞(Gene，中国香港)，收集菌液并保存，随机挑选文库单菌落进行PCR鉴定，以评估scFv文库的多样性。

[文献1]Yang Y,Nian S,Li L,et al.Fully human recombinant antibodiesagainst EphA2 from a multi-tumor patient immune library suitable for tumor-targetedtherapy[J].Bioengineered,2021,12(2):10379-10400.[文献2]Little M,Welschof M,Braunagel M,et al.Generation of a large complex antibody libraryfrom multiple donors[J].Journal of Immunological Methods,1999,231(1-2):3-9.

1.5人抗Siglec-15抗体的噬菌体筛选

通过液相筛选法进行筛选，将生物素化的siglec-15抗原(Obiosh,中国)在液体反应体系中先与scFv文库相互作用，然后加入Dynabeads M-280(Invitrogen,USA)，富集能与抗原结合的scFvs。siglec-15-scFv文库的富集及筛选进行三轮，随机挑取20个单克隆菌落进行siglec-15-scFv文库多样性鉴定，方法参考文献3。

[文献3]：Frenzel A,Kügler J,Wilke S,et al.Construction of humanantibody gene libraries and selection of antibodies by phage display[J].Methods In Molecular Biology(Clifton,N.J.),2014,1060:215-243。

1.6初步筛选噬菌体阳性克隆

取siglec-15-scFv文库甘油菌液，涂布于LBAG固体培养基。37℃培养过夜。随机挑选48个单克隆菌落对其噬菌体进行扩增，噬菌体扩增方法参考文献4、5。Siglec-15抗原(终浓度3ug/ml)4℃包被过夜。弃去包被液，洗板3次。5％脱脂奶粉封闭，室温孵育1h。洗板3次。加入噬菌体表达上清和封闭液，置于湿盒中室温孵育1h。孵育结束，洗板3次。加入用封闭液1﹕5000稀释Anti-M13 Antibody(HRP)(SinoBiological，中国)单克隆抗体，每孔100μL，室温孵育1h。洗板3次后加入TMB底物显色试剂(Thermo,USA)，室温避光显色30min。显色结束，加入2M H₂SO₄溶液终止反应，使用全波长酶标仪测量OD450值。通过OD值比阴性对照OD值大2.5倍鉴定出阳性杂交瘤克隆并提取质粒测序，测序正确的siglec-15-scFv作为候选克隆。

[文献4]Froude J W,Pelat T,Miethe S,et al.Generation andcharacterization of protective antibodies to Marburg virus[J].MAbs,2017,9(4):696-703.

[文献5]Diebolder P,Krawczyk A.Detailed Protocols for the Selection ofAntiviral Human Antibodies from Combinatorial Immune Phage Display Libraries[C],2017.

1.7抗体表达、纯化和鉴定

筛选得到的抗体序列以ScFv(Single-Chain Variable Fragment)-Fc的形式与人IgG1恒定区Fc段融合，克隆到商业真核表达载体PCDNA3.4(SinoZhongyuan，中国)上：以筛选到的结合活性和特异性较好的抗siglec-15-scFv为模板，PCR扩增siglec-15scFv的VH、VL片段。通过同源重组，将单克隆噬菌体的重链和轻链可变区DNA序列插入到已含有人抗体IgG1恒定区CH段或CL段的pcDNA3.4载体中，构建sp-VH-CH-pcDNA3.4、sp-VL-CL-pcDNA3.4载体。

同源重组构建sp-VH-CH-pcDNA3.4、sp-VL-CL-pcDNA3.4载体，针对筛选到的亲和力高的siglec-15-scFv(第S131号)构建载体时所用引物如SEQ ID NO.16～19所示。

用大规模质粒试剂盒提取质粒。采用PEI转染试剂将抗体表达载体转染293F细胞，培养7天，使用ProteinA(GE Healthcare,USA)通过亲和层析柱(Sangon Biotech,中国)纯化培养上清中的重组抗体。通过SDS-PAGE检测抗体纯度和分子量。得到纯化后的重组抗体。

1.8抗体结合活性和交叉反应性鉴定

将human-siglec-15蛋白(hsiglec-15)、EphA2、Trop2、CD24、B7-H3蛋白(Novoprotein，China)稀释至1μg/mL,4℃包被过夜。通过ELISA分析，检测S15重组抗体与siglec-15抗原的结合活性以及与其它肿瘤高表达蛋白的交叉反应，详细方案参考文献6。

[文献6]：Yin Z,Mao Y,Zhang N,et al.A fully chimeric IgG antibody forROR1 suppresses ovarian cancer growth in vitro and in vivo[J].Biomedicine&Pharmacotherapy＝Biomedecine&Pharmacotherapie,2019,119:109420.

1.9亲和力的鉴定

通过生物层干涉测量法(BLI)检测了重组抗体与siglec-15蛋白的结合亲和力。BLI实验如前所述文献1进行。生物素化siglec-15蛋白在1×PBST中稀释并偶联到SA生物传感器(Pall ForteBio,Fremont,CA,USA)。随后，使用200μL纯化的重组scFv-Fc或针对siglec-15的全长IgG1抗体(5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL)来评估抗原-抗体相互作用。通过系统分析抗原-抗体结合和解离计算平衡解离常数(KD)值。抗原(siglec-15)和抗体(scFv-Fc或全长抗体IgG1)之间的相互作用由Octet RED96(Pall ForteBio，USA)分析。使用定制的ForteBio软件Data Acquisition 9.0对采集的数据进行分析。

1.10流式细胞术检测抗体结合活性

准备肿瘤细胞1×10⁵cells/每管，将20μg/mL siglec-15抗体2倍梯度稀释，分别加入100μL于肿瘤细胞中,4℃孵育1h；加入1:500稀释的Rabbit Anti-Human IgG H&L/Alexa Fluor 647 antibody(Bioss,China)，4℃孵育1h；洗涤2次后，采用BD FACSAria II流式细胞仪检测荧光。采用Flowjo 10.2软件对结果进行分析。

1.11稳定过表达细胞系构建

将商业化慢病毒载体质粒pSLenti-EF1-EGFP-P2A-PurO-CMV-MCS-3XFLAG-WPRE(Obiosh，China)，转染至HEK293T细胞进行病毒包装，收集48h、72h上清，即病毒原液，用0.45μm过滤器过滤后感染A549细胞，病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光情况，后续使用嘌呤霉素进行加压筛选，构建稳转细胞株S15-A549。

1.12细胞免疫荧光检测抗体结合活性

1×10⁵个细胞，平铺于多聚赖氨酸盖玻片(直径20mm)，24h后,弃去培养基，1×PBS洗涤3次，4％多聚甲醛室温固定10min，使用封闭液(1×PBST含10％山羊血清)室温封闭30min。加入20ug/ml S131-IgG1，4℃过夜孵育；洗涤后加入GoatAnti-Human IgG H&L/AF594 antibody(Bioss,China)1:200避光孵育1h。洗涤后用含DAPI抗荧光淬灭剂的封片液(beyotime，China)封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.13 ADCC活性

使用人外周血淋巴细胞分离液(Cytiva，USA)分离健康人外周血的PBMC为效应细胞，A549、PC-3、S15-A549为靶细胞。共培养PBMC和靶细胞，加或不加抗siglec15 IgG1抗体，具体方案参考文献1。使用CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega,USA)检测细胞毒性，计算公式为：细胞毒性％＝(实验孔-靶细胞自发释放LDH孔-效应细胞自发释放LDH孔)/(靶细胞最大LDH释放孔-靶细胞自发释放LDH孔)×100。

1.14淋巴细胞增殖

Ultra-LEAF^TMPurified anti-human CD3(Biolegend，USA)，加入96孔板终浓度为0.5μg/mL，100μL/孔，4℃过夜。取健康志愿者PBMC，用最终浓度为5μM的CFSE(Biolegend,USA)标记后调整细胞密度为3×10⁶cells/mL，每孔加入100μL。同时，每孔加入人siglec-15(终浓度为5μg/mL)蛋白，加或不加Siglec-15抗体(20μg/ml),培养72h,收集细胞进行流式细胞术分析。为进一步检测T细胞亚群的增殖，使用FITC anti-Human CD3 Antibody(Biolegend，USA)，APC/Cyanine7 anti-Human CD8 Antibody(Biolegend，USA)，APC anti-human CD4 Antibody(Biolegend，USA)4℃避光孵育30min进行细胞表面染色。洗涤后使用7AAD(BD，USA)排除死细胞，通过流式细胞仪(ACEA,USA)对标记细胞进行分析。

1.15动物实验

6～8周龄雌性NTG小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，置于SPF(SpecificPathogen Free)环境中适应性1周。在本次动物实验中，我们遵循动物伦理；小鼠的使用或治疗严格符合研究动物的护理和使用指南，并得到西南医科大学动物伦理委员会的批准。每只小鼠皮下接种A549(S15+)，接种密度为3×10⁶cells。当肿瘤体积达到约80mm³时，每只小鼠尾静脉注射1×10⁷健康志愿者PBMC，注射一周后，随机分为2组，每组6只小鼠。PBS作为阴性对照组，重组抗体S131-IgG1作为治疗组。每周腹腔给药3次，给药过程中监测肿瘤大小和小鼠体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm³)＝1/2×长×宽²。治疗结束后，对小鼠进行安乐死，将小鼠肿瘤制备成单细胞悬液后进行流式分析。

1.16统计分析

使用Prism 9.0 GraphPad软件进行统计分析。数据以平均值±标准差(Mean±SD)来表示。通过t检验对两组之间的对比进行显著性计算。P>0.05被认为无统计学意义(ns)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2结果

2.1构建了库容量大、多样性好的全人源scFv噬菌体免疫抗体文库。

从20余名肺癌患者的淋巴结中提取mRNA合成第一链cDNA，以合成的cDNA为模板，扩增出的VH、Vλ和Vκ基因条带大小约为400bp(图1A-C)。通过两轮重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得VH-linker-VL基因库(约800bp)(图1D)，成功构建了全人源scFv噬菌体免疫文库。将scFv文库中的DNA与噬菌体载体PCANTAB-5E连接并转化大肠杆菌TG1，随机挑选21个单克隆菌落，PCR鉴定scFvs插入片段(图1E)。结果表明，所有的单克隆菌落均插入了全长scFvs基因，通过BstNⅠ酶切scFv的DNA，DNA指纹图谱显示每个scFvs是不同的(图1F)，构建的人scFvs噬菌体免疫文库具有多样性，抗体文库中的基因序列是丰富的。

2.2特异性好、亲和力高的全人源抗siglec-15-IgG1重组抗体的筛选

2.2.1 Siglec-15-scFv的亲和力筛选

经过三轮富集筛选，输入的文库量逐步减少，而得到富集后，输出的文库量则越来越多，极大的丰富了针对靶抗原的抗体克隆(图2A-B)。

三轮富集亲和筛选后，随机选取230个单克隆菌落进行表达，使用ELISA方法检测siglec-15 scFv的结合活性，根据OD450结果共筛选出51个阳性菌株。将阳性菌株再次进行ELISA实验，检测菌株是否稳定表达scFvs(图2C)，以筛选与靶抗原siglec-15有高结合活性的scFvs。结果显示约69％呈ELISA阳性反应，阳性反应的OD值为阴性值的2倍。

分别固定肿瘤细胞PC-3，A549与酶标板上，将噬菌体ELISA中与靶抗原siglec-15高结合的scFv作为一抗，anti-M13-HRP作为二抗进行细胞ELISA，检测筛选的scFv与肿瘤细胞(PC-3，A549)结合活性，如图所示(图2D-2E),最终筛选出10株进行测序分析鉴定。

2.2.2 siglec-15-IgG1的同源重组及表达

在多次ELISA筛选和DNA测序结果的基础上，筛选出6个基因序列不同，亲和力高的scFvs用于构建为IgG1型抗体。将抗siglec15-scFv的VH和VL分别同源重组到含人CL和CH的pcDNA3.4载体中，构建全长siglec-15-IgG1抗体的重链和轻链。经DNA测序验证，siglec-15-IgG1构建成功。将构建的表达载体瞬时共转染HEK 293F真核细胞，第七天收集细胞上清并纯化。进行SDS-PAGE鉴定，结果表明(图3A),目的蛋白纯化效果良好，siglec-15-IgG1的的H链和L链分子大小为55kDa和35kDa左右。

2.2.3重组抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。

利用大分子相互作用技术进一步检测不同序列的阳性scFvs的抗原抗体亲和力，其中S131-IgG1和S194-IgG1亲和力较高(图3B-C)，分别达到了纳摩尔(10^-9)和皮摩尔(10^-12)。ELISA结合实验表明，S131-IgG1、S194-IgG1均以剂量依赖的形式识别siglec-15抗原(图3D)，不识别EphA2、B7-H3、Trop2、CD24这四种肿瘤高表达抗原(图3E)。重组抗体的高亲和力和良好的特异性为后续的抗肿瘤功能验证提供了依据。

2.2.4流式细胞术和免疫荧光检测重组抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合活性。

我们先前利用大分子相互作用技术检测了重组抗体siglec-15-IgG1与可溶性siglec-15抗原的结合亲和力。筛选出了亲和力高的S131-IgG1和S194-IgG1抗体，再使用流式细胞术来检测两个重组抗体与正常上皮细胞系16-HBE、肿瘤细胞系T24、PC-3、NCI-H157、A549结合活性。结果显示(图4A)：S131-IgG1结合效率相对较高，且与肺腺癌细胞系A549、NCI-H157结合效率更佳，有发挥作用的潜力。

文献表明siglec15在大多数正常组织和免疫细胞亚群中表达很少，而在肿瘤微环境中的M2型巨噬细胞以及在包括肺癌、卵巢癌、头颈癌、肠癌、子宫内膜样癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾癌和肝癌等肿瘤中都有显著表达。构建的免疫文库来源于肺癌患者，从肺癌全人源文库中筛选到针对siglec-15靶点的高亲和力抗体可能对肺癌有更好的治疗效果，因此我们对A549细胞系进行了siglec-15的过表达。通过荧光观察细胞表达靶点抗原siglec-15的情况，利用Weston blot进行验证，表明过表达siglec-15蛋白的A549细胞系(S15-A549)成功构建，并将用于后续细胞功能实验。

通过构建稳定表达siglec-15蛋白的A549细胞株，我们发现S131-IgG1和S194-IgG1重组抗体的结合活性得到进一步提高，而随着肿瘤细胞表达siglec-15蛋白的增加，抗体的结合效率也进一步增强(图4A)。细胞免疫荧光结果也显示重组抗体能够与siglec-15表达阳性的肿瘤细胞结合(图4B)。

2.2.5过表达siglec-15细胞系的构建

2.3重组抗体具有良好的ADCC作用，并在一定程度上恢复CD8⁺T细胞功能

2.3.1抗体依赖的细胞毒性作用及肿瘤细胞增殖抑制作用。

为了评估全长抗体S131-IgG1、S194-IgG1在过表达siglec-15蛋白的A549细胞系(S15-A549)中的细胞毒性作用，我们使用CCK8法检测不同浓度的抗体对肿瘤细胞的抑制作用。结果发现，S131-IgG1、S194-IgG1对S15-A549肿瘤细胞没有直接的抑制作用(图5A)。而通过研究全长抗体S131-IgG1、S194-IgG1发挥的ADCC作用，我们发现当效应细胞与靶细胞之间的比值为20:1时，S131-IgG1、S194-IgG1对PC-3、A549、S15-A549均可以介导人PBMC对S15-A549肿瘤细胞的杀伤活性，其中对S15-A549介导的细胞毒性最强(图5B)，表明重组抗体主要通过抗体介导的细胞毒发挥作用，而不是通过抑制肿瘤细胞的增殖。

2.3.2重组抗体可一定程度阻断siglec-15抗原对T淋巴细胞增殖抑制。

抗CD3/CD28 T细胞共刺激剂激活淋巴细胞，存在人siglec-15抗原的情况下，设置有或无抗siglec15重组抗体干预，72h后观察CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T的增殖情况。结果显示，与正常淋巴细胞增值对照组相比，siglec-15抗原组的CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T增殖均受到了抑制(图5C)，说明siglec15在一定程度上抑制了淋巴细胞增值。当加入S131-IgG1/S194-IgG1，CD3⁺T、CD4⁺T、CD8⁺T的增殖情况与正常增殖组没有明显差异，而与抗原组差异明显(图5C)，表明重组抗体可以逆转由siglece-15介导的人淋巴细胞增殖抑制，对T细胞的功能具有一定的恢复作用。

2.3.3重组抗体可恢复耗竭CD8+T细胞的凋亡促进颗粒酶B的产生

从西南医科大学附属医院胸外科收集肿瘤病人胸腔积液，即胸水，从恶性胸水中提取从西南医科大学附属医院胸外科收集肿瘤病人胸腔积液，即胸水，从恶性胸水中提取单个核细胞(PEMC)，用CD3/CD28 T细胞共刺激剂对PEMC中的T细胞进行刺激，促进T细胞耗竭，同时加入抗体观察抗体的离体阻断作用，设置对照组和实验组，判断重组抗体对逆转T细胞的耗竭是否有效(图6A、C)。从细胞凋亡结果可知S131-IgG1、S194-IgG1实验组与对照组相比都降低了T细胞的凋亡，其中S131-IgG1逆转T细胞凋亡的效果较好(图6B)，具有统计学意义。而对胞内因子的分析反映，S131-IgG1、S194-IgG1实验组对CD8⁺T细胞分泌IFN-γ没有明显作用，但是都促进CD8⁺T细胞分泌GZMB(图6D、E)。可以表明siglec-15重组抗体在离体实验中，能较好的发挥阻断作用，减少CD8⁺T细胞的凋亡，并在一定程度上促进CD8+T细胞产生GZMB，逆转T细胞耗竭以减少T细胞凋亡，可以更好的发挥免疫治疗的作用。

2.4重组抗体可以抑制免疫系统人源化荷瘤小鼠肿瘤生长

2.4.1人源化小鼠模型构建。

小鼠外周血中HuCD45⁺T比例＞25％即标志着人源化模型构建成功，而小鼠人源化程度的高低可能与供体有关，且不同的供体如果进行混合有可能会出现互为抗原的情况，所以在进行人源化荷瘤小鼠实验之前，我们通过流式细胞术进行了Donor的筛选，观察注射供体PBMC后小鼠外周血中HuCD45⁺T、HuCD8⁺T、HuCD4⁺T的比例变化，以保证在后续体内实验过程中，实验小鼠均能达到较为理想的人源化程度。从Donor筛选结果发现，小鼠人源化程度确实与供体有关，在PBMC注射一周左右时，与供体1相比，供体2的HuCD45⁺T的比例较低，而在2周之后，供体2 HuCD45⁺T比例大幅提高，且HuCD8⁺T的趋势也与之一致，这种变化对于持续性的体内实验是有利的，最终我们将选择供体1的PBMC来进行小鼠人源化构建。此外，随着人源化程度的升高，小鼠体重也在逐步下降，人源化程度越高，小鼠体重下降的越快，直至死亡，需要控制实验周期，在PBMC注射后四周内完成实验。

2.4.2人源化荷瘤小鼠中抑制肿瘤生长

实验发现，筛选出的重组抗体主要是通过介导ADCC发挥作用，离体阻断实验中一定程度上可以逆转CD8⁺T细胞耗竭，为此选择人源化荷瘤小鼠作为小鼠体内实验模型，使用功能较好的S131-IgG1进行抗体给药。将来自同一个供体的PBMC经尾静脉注射重度免疫缺陷NTG小鼠，使小鼠免疫系统人源化并皮下注射A549肿瘤细胞(图7A)，通过对小鼠肿瘤浸润HuCD45⁺T、HuCD4⁺T、HuCD8⁺T细胞比例的变化来观察重组抗体的体内抗肿瘤功能。通过实验我们发现，一方面，实验组与对照组相比，肿瘤生长更慢(图7D)，肿瘤重量更轻(图7B、C)，表明我们的重组抗体在体内具有抗肿瘤的作用。另一方面，在免疫重建程度一致的情况下(图7F)，实验组肿瘤比对照组有更多的HuCD45⁺T细胞浸润(图7G)，而HuCD4⁺T与HuCD8⁺T相比浸润情况则相反，实验组肿瘤HuCD8⁺T浸润更多(图7G)，说明重组抗体具有良好的靶向作用，且主要作用于CD8⁺T细胞。此外实验组和对照组小鼠在实验开始第三周，也就是在抗体注射后的第9天开始体重下降(图7E)，说明此时小鼠可能开始出现比较严重的移植物抗宿主病(GVHD)，而到实验结束，实验小鼠并没有因为GVHD死亡，说明实验周期合理，能够在实验小鼠出现严重的GVHD之前完成实验。

3总结与分析

具有高亲和力和特异性的抗体药物对癌症和自身免疫性疾病等难治性疾病有效且安全，通过噬菌体展示技术，可以在体外产生高亲和力抗体，有助于提高抗体功效。抗PD疗法树立了免疫正常化治疗的榜样，可以在最小化免疫不良事件的同时增加抗肿瘤作用，但通过PD-1/PD-L1通路发挥作用同样存在较大局限，还需探索其它作用于免疫逃逸的机制和分子。Siglec-15作为一种重要的致癌蛋白和新兴的药物靶点，在免疫系统的细胞上表达且可以识别唾液酸配体，还可以通过跨膜区域的赖氨酸残基与活化适配体分子DAP12和DAP10相互作用，表明siglec-15具有激活信号传导潜力以及参与肿瘤免疫监测的可能。因此，在本研究中，我们以20余例肺癌患者肿瘤淋巴结样本为来源，通过噬菌体展示技术，构建出具有大容量和多样性的全人源scFvs文库，从中筛选出针对siglec-15抗原的scFv并将其改造为IgG1型全抗。其中，重组siglec-15抗体S194-IgG1的亲和力达到了10^-12(pmol)，表明从本文库可以筛选出来亲和力较高的抗体。且筛选出的抗体都能与人siglec-15蛋白特异性结合。综合来说，使用噬菌体显示技术生产了抗原亲和力高、免疫原性低的单克隆抗体，并对siglec-15抗原引起的T淋巴细胞增殖抑制具有一定逆转作用，同时能够通过ADCC作用增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。为后续基于抗体的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础。

在本研究中，从20余例肺癌患者的淋巴结中提取mRNA，构建scFv噬菌体免疫文库。虽然肿瘤种类来源单一，但是抗体基因类型并没有出现偏倚，随机挑选20个单克隆子scFvs基因进行PCR检验，酶切电泳结果显示了肺癌文库的多样性。单克隆抗体特异性结合靶抗原并中和或刺激其活性的能力是治疗性抗体领域快速生长和发展的基础。对于筛选出的重组抗体，通过生物膜干涉技术以及ELISA检测了抗体的亲和力，均达到了纳摩尔，并通过测试抗体对EphA2、B7-H3等肿瘤高表达抗原的结合情况对抗体特异性进行了验证，反映了重组抗体良好的靶向目的抗原的能力。

首先，我们利用细胞毒活性检测试剂盒分别检测了重组抗体介导的人外周血单核细胞(PBMC)对PC-3、A549、S15-A549这三个细胞系的杀伤活性，发现随着siglec-15表达量的增加，重组抗体介导的细胞毒活性也在随之增加，而CCK8实验显示重组抗体并没有对肿瘤细胞的直接作用，这说明重组抗体主要是通过介导ADCC来发挥作用，并且与siglec-15的表达有关。研究表明当使用ADCC和CDC等细胞毒性机制治疗癌症时，理想的抗原应局限于肿瘤，以尽量减少对健康组织的损害。Siglec-15局限于TAM和基质细胞表达，仅在部分髓系细胞上正常表达，而在人类癌细胞和肿瘤浸润髓系细胞上广泛上调，有助于重组抗体发挥作用的安全性。

Lieping Chen等人利用基因组规模的T细胞活性阵列，确定了siglec-15是一种关键的免疫抑制因子，且与B7-H1表达互斥。通过将OT-I/RAG-1基因敲除(KO)小鼠的脾细胞静脉注射入野生型(WT)、Siglec-15 KO和LysM-Cre KO小鼠，第二天用OVA257-264肽加poly(I:C)作为佐剂免疫小鼠，用流式细胞仪分析外周血和脾中的OT-I T细胞，表明siglec-15应该主要是通过调节细胞生长而非凋亡来抑制抗原特异性T细胞反应，展示了siglec-15作为标准化癌症免疫治疗靶点的潜力。通过T淋巴增殖实验,我们发现siglec-15抗原对T淋巴细胞的增殖产生了抑制，这与陈教授等人的研究一致，而加入重组抗体后这种增殖抑制得到缓解，表明重组抗体对siglec-15抗原进行了一定程度的阻断，降低了siglec-15抗原对T淋巴细胞的增殖抑制。

恶性胸腔积液(MPE)是一种独特的液体肿瘤微环境(TME)，在这种环境中，天然杀伤细胞(NK)等先天免疫途径和CD8⁺T细胞等适应性免疫途径的抗肿瘤活性被抑制。DawenZhao等人开发了一种负载环二核苷酸(LNP-CDN)的脂质体纳米抗体，在胸膜内给药时，可以减轻积液和胸膜肿瘤中的免疫抑制，并与PD-1联合治疗，有效减少了MPE体积，不仅抑制了胸膜腔和肺实质中的肿瘤生长还延长了携带MPE小鼠的生存期。本研究中，在知情同意的前提下，我们从临床收集了10余例MPE样本，并提取其中的单核细胞(PEMC)，在抗体加入PEMC共培养3天后，CD8⁺T细胞凋亡降低而胞内因子GZMB增加明显，表明筛选出的重组抗体可以阻断微环境中的抑制信号，通过恢复CD8⁺T细胞的部分功能，在一定程度上逆转了CD8⁺T细胞的耗竭。在动物实验中，考虑到我们的抗体筛选自肺癌来源的全人源文库，因此主要验证的是重组抗体对A549成瘤的影响，并对肿瘤体积、大小、浸润T淋巴细胞进行了检测和分析，表明重组抗体对肺癌来源的肿瘤具有一定的抑制作用，有作为治疗肺癌抗体的潜力。此外，Xuejun Xiao等人通过构建并表征了一种嵌合S15特异性单克隆抗体(S15-4E6A)，发现抗siglec-15抗体通过在体外和体内促进极化，同时抑制/>极化来发挥作用，对肺腺癌细胞和异种移植物具有有效的肿瘤抑制作用。

以上研究表明，基于Siglec-15靶点的抗体研究在探索肿瘤免疫微环境中免疫治疗正常化、改善肿瘤治疗方式、提高肿瘤治疗效果方面是极其重要的，通过对siglec-15抑制信号的阻断，来恢复免疫系统的正常功能。本研究针对siglec-15从全人源肺癌文库中筛选出了亲和力高，特异性好的全长抗体，分别从体内外探讨了重组抗体的生物学功能，从体外结果看，重组抗体可以介导良好的细胞毒活性，而体内实验表明，在小鼠免疫系统人源化的前提下，给药组小鼠不管是肿瘤体积和体重都比对照组的小鼠低，且通过对肿瘤淋巴细胞浸润分析，给药组小鼠肿瘤有更多的人淋巴细胞浸润，其中CD8⁺T细胞浸润情况较突出，说明siglec-15重组抗体增加了肿瘤部位淋巴细胞的浸润，增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。综上所诉，我们验证了从肿瘤病人来源的文库中筛选出针对siglec-15靶点抗体的可行性，重抗体的亲和力、特异性得到确定，还对重组抗体生物学功能进行了分析，表明筛选出的siglec-15重组抗体具有靶向治疗肿瘤的潜力。

Siglec-15重组抗体在TAM中对于CD8⁺T细胞的作用机制在本研究中尚未完全阐明，也没有对siglec-15与PD-L1在肺腺癌中的表达差异与协同作用进行探讨，在抗肿瘤药效与机制方面研究不太全面，后续我们将进行PD-1以及siglec-15抗体的联合药效探索，并收集小鼠肿瘤组织，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)对CD8⁺T细胞相关基因进行探讨，挖掘抗体发挥功能的通路机制。

本发明实施例中涉及到的氨基酸序列或者核苷酸序列如下：

1、抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH

HCDR1(SEQ ID NO.3)：GDSIRNW

HCDR2(SEQ ID NO.4)：IHDNGGT

HCDR3(SEQ ID NO.5)：AREGLPDGLDI

LCDR1(SEQ ID NO.1)：SLRSYY

LCDR2：GQN

LCDR3(SEQ ID NO.2)：GSRDTSDYRVL

2、S131-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQRKPGQAPILVMYGQNNRPSGIPDRFSGSNSRNTASLTITGAQAEDEADYYCGSRDTSDYRVLFGGGTKLTVL。

3、S131-VH氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：

QVQLQESGPGLVNPSGTLSLSCTVSGDSIRNWYSWVRQPPGKGLEWIGEIHDNGGTNHNPSLKSRVTMSVGKSTSQLSLILNSVTAADTAVYHCAREGLPDGLDIWGPGTMVTVSS。

4、S131-VL编码序列(SEQ ID NO.8)：

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTTAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCGGAAGCCAGGACAGGCCCCCATACTTGTCATGTATGGTCAAAACAATCGGCCGTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAACTCACGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCCCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTGGTTCCCGGGACACTAGTGATTATCGAGTGCTTTTCGGCGGCGGGACCAAGCTGACCGTCCTA。

5、S131-VH编码序列(SEQ ID NO.9)：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCGGGACTGGTAAACCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCAGTTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCAGGAACTGGTACAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATTCATGATAATGGGGGGACCAACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGGCAAGTCGACGAGCCAGCTGTCCCTGATTTTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTTTATCATTGTGCGAGGGAAGGTTTGCCTGATGGTCTTGATATCTGGGGCCCAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA。

6、S131-scFv氨基酸序列(SEQ ID NO.10)：

QVQLQESGPGLVNPSGTLSLSCTVSGDSIRNWYSWVRQPPGKGLEWIGEIHDNGGTNHNPSLKSRVTMSVGKSTSQLSLILNSVTAADTAVYHCAREGLPDGLDIWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQRKPGQAPILVMYGQNNRPSGIPDRFSGSNSRNTASLTITGAQAEDEADYYCGSRDTSDYRVLFGGGTKLTVL。

7、S131-scFv编码序列(SEQ ID NO.11)：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCGGGACTGGTAAACCCTTCGGGGACCCTGTCCCTCAGTTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCAGGAACTGGTACAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATTCATGATAATGGGGGGACCAACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGGCAAGTCGACGAGCCAGCTGTCCCTGATTTTGAACTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTTTATCATTGTGCGAGGGAAGGTTTGCCTGATGGTCTTGATATCTGGGGCCCAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTTAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCGGAAGCCAGGACAGGCCCCCATACTTGTCATGTATGGTCAAAACAATCGGCCGTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAACTCACGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCCCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTGGTTCCCGGGACACTAGTGATTATCGAGTGCTTTTCGGCGGCGGGACCAAGCTGACCGTCCTA。

8、IgG1的CH氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

9、IgG1的CL(lamda)氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示：

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。

10、S131-VH-CH(重组抗体S131-IgG1的H链)氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示：

QVQLQESGPGLVNPSGTLSLSCTVSGDSIRNWYSWVRQPPGKGLEWIGEIHDNGGTNHNPSLKSRVTMSVGKSTSQLSLILNSVTAADTAVYHCAREGLPDGLDIWGPGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

11、S131-VL-CL(重组抗体S131-IgG1的L链)氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQRKPGQAPILVMYGQNNRPSGIPDRFSGSNSRNTASLTITGAQAEDEADYYCGSRDTSDYRVLFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS。

12、构建载体时所用引物

S131-VH-F(SEQ ID NO.16):

5’TGCTGAAGGGCGTGCAGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG3’；

S131-VH-R(SEQ ID NO.17):

5’ATGGGCCCTTGGTCGACGC TGAAGAGACGGTGACCATTGT3’；

S131-Cλ-F(SEQ ID NO.18):

5’TGCTGAAGGGCGTGCAGTCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC3’；

S131-Cλ-R(SEQ ID NO.19):

5’GGGGCAGCCTTGGGCTGACC TAGGACGGTCAGCTTGGTCC3’。

Claims

1.抗体或其抗原结合片段，其能够结合Siglec-15蛋白，其特征在于：所述抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区VL和抗体重链可变区VH，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LCDR2的氨基酸序列为GQN，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，且所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、单链抗体、重组抗体、全人源抗体；

其中所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fv、ScFv和IgG。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：其中所述抗体包含抗体轻链或其片段，以及抗体重链或其片段；优选所述抗体轻链或其片段包含如SEQ IDNO.6的氨基酸序列或与SEQ ID NO.6具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区VL，所述抗体重链或其片段包含如如SEQ ID NO.7的氨基酸序列或与SEQ ID NO.7具有至少90％、93％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的的重链可变区VH。

4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

所述抗体为ScFv，其重链可变区VH与轻链可变区VL由连接肽linker连接，优选所述连接肽linker的氨基酸序列为(Gly₄Ser)₃，所述抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于：所述抗体为抗siglec-15重组抗体，所述重组抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区；

优选所述重组抗体为抗siglec15-IgG重组抗体，重组抗体的重链包含权利要求3所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区VH和IgG抗体的重链恒定区氨基酸序列，轻链包含权利要求3所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区VL和IgG抗体的轻链恒定区氨基酸序列；

进一步优选所述重组抗体为S131-IgG1，其重链和轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。

6.一种编码权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸分子。

7.一种包含权利要求6所述的多核苷酸分子的重组DNA表达载体。

8.权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述药物为抗肿瘤免疫治疗药物；优选所述肿瘤为膀胱癌、肺癌、前列腺癌，进一步优选为肺腺癌。

10.药物组合物，其包含权利要求1至5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及任选地药学上可接受的佐剂。