KR20210039985A - Gasp-1 과립을 표적으로 하는 결합 단백질 및 키메라 항원 수용체 t 세포, 및 이의 용도 - Google Patents

Gasp-1 과립을 표적으로 하는 결합 단백질 및 키메라 항원 수용체 t 세포, 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1) 또는 이의 단편을 발현하는 과립을 갖는 세포를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 검출 방법은 (a) 세포를 유효량의 결합 단백질과 접촉시키는 단계로서, 결합 단백질이 GASP-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하는, 단계; 및 (b) 결합 단백질에 결합된 과립을 갖는 세포를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재할 수 있다. 또한, 키메라 항원 수용체, 항-GASP-1 항체 또는 이중-특이적 결합 단백질을 포함하는 T-세포를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 추가로 GASP-1-매개된 질환을 치료하거나 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀을 비활성화시키기 위한 방법이 제공된다.

Description

GASP-1 과립을 표적으로 하는 결합 단백질 및 키메라 항원 수용체 T 세포, 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 5월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/670,182 및 2018년 11월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/768,325의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 모든 목적에 있어서 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 또한 GASP-1 과립으로 불리는 G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1)을 발현하는 과립, GASP-1 과립을 표적으로 하는 결합 단백질 및 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포, 및 암 검출 및 치료를 위한 결합 단백질 및 CAR-T 세포의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
암은 미국에서 두 번째로 가장 흔한 사망 원인이며 심장 질환만이 이를 넘어선다. 암은 이의 진행 초기에 검출되지 않는다면 암 이환율이 현저하게 증가한다. 증상이 나타나기 전에 암을 조기에 발견하는 것이 암에 대한 가장 효과적인 제지이다. 예를 들어, 결장직장암 발병률은 결장직장 용종이 암으로 진행되기 전에 이를 검출하고 제거하게 하는 결장직장암 선별 검사로 인해 지난 20년 동안 대부분 감소하였다(1985년 1,000,000명 당 66.3건에서 2007년에서 45.3건으로).
암 세포로부터 방출된 세포외 비히클(EV)은 암 진행 및 전이와 관련이 있었다. EV는 엑소좀(직경 약 30 - 100 nm), 미세소포(직경 약 100 - 1000 nm) 및 큰 온코좀(직경 약 1 - 10 μm)을 포함한다. 엑소좀은 후기 식균작용 경로의 다소포체(MVB)로부터 기원하며, 세포막과의 융합에 의해 방출된다. 반면 미세소포와 온코좀은 세포막으로부터의 발아에 의해 방출된다.
GASP-1의 과발현은 암 개시와 암 진행 둘 모두에 필요하다. 예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 사용한 녹다운 실험에서 낮은 수준의 GASP-1을 발현하는 세포는 야생형 세포보다 훨씬 느리게 성장하였다. GASP-1이 완전히 하향조절되는 경우, 세포는 죽고 증식할 수 없다.
안전하고 효과적인 암 치료법을 추구하는데 있어서, 연구자들은 암세포에서만 발견되고 건강한 세포에서는 발견되지 않은 항원을 식별하고자 하였다. 이러한 종양-특이적 항원(TSA)에 대한 탐구는 성공적이지 못하였다. 현재 CAR-T 치료법은 암세포 표면에 단지 우선적으로 존재하는 바이오마커를 표적으로 하고 있으며, 이는 이들이 또한 정상 세포에도 존재함을 의미하다. 이는 원치 않는 심각한 부작용을 발생시켰다. 또한, 현재 CAR-T 치료는 고형 종양이 아닌 혈액 종양에 대해서만 효과적이다. 현재 CAR-T 요법이 고형 종양에 대해 비효과적인 것에는 몇 가지 이유가 있다. 첫 번째, 공양 종양은 이질성이다. 표면 상에 전반적으로 거의 CD19를 갖는 암성 B 세포와 달리, CAR-T 세포가 공격하도록 설계되는 항원을 모든 고형 종양 세포가 반드시 수반하는 것은 아니다. 두 번째, 단일-표적 CAR-T 요법이 종양 박멸에 성공적이라고 하더라도, 암은 종종 해당 항원을 제거한 후 재발될 수 있다. 세 번째, 고형 종양은 수백 또는 심지어 수천개 층 두께를 가져 CAR-T 세포가 침투하기 어렵게 하는 세포의 고형 덩어리를 함유한다.
정상 세포에 대한 부작용을 최소화하면서 암 세포, 특히 고형 종양에 있는 암 세포를 표적으로 하는 효과적인 암 치료가 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 예를 들어, 세포의 표면 상에서 또는 세포질에서 GASP-1 과립으로도 알려진 G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1)을 발현하는 과립을 표적으로 함으로써 암 환자를 식별하고 치료하는 신규한 방법을 제공한다.
G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1) 또는 이의 단편을 발현하는 과립을 갖는 세포를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 검출 방법은 세포를 유효량의 결합 단백질과 접촉시키고, 결합 단백질에 결합된 과립을 갖는 세포를 식별하는 것을 포함한다. 결합 단백질은 GASP-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 식별된 세포는 GASP-1 과립을 갖는 세포이다. 결합 단백질은 인간화된 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다.
검출 방법에 따르면, 세포 중의 GASP-1 과립은 0.1 내지 5.0 μm 범위의 직경을 가질 수 있다. 세포 중의 GASP-1 과립의 평균 수는 세포 당 20 내지 150개 범위일 수 있다. GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 또는 세포질에 있을 수 있다.
검출 방법에 따르면, 세포는 종양에 존재할 수 있다. 종양은 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 세포는 암 세포일 수 있다.
검출 방법에 따르면, 세포는 암을 갖는 대상체에 존재할 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다. 대상체는 암 치료를 받았을 수 있다.
검출 방법은 세포에서 암 바이오마커를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 암 바이오마커는 CA125, CA19-9, CA15-3, CA27.29, AFP, BRCA1/BRCA2, EGFR, HER-2, KIT 및 CEA로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
결합 단백질이 제공된다. 결합 단백질은 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함한다. 항-GASP-1 scFv는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다.
VH 사슬은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된 제1 상보성-결정 영역 1(VHCDR1), SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 구성된 제2 상보성-결정 영역 2(VHCDR2), SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 구성된 제3 상보성-결정 영역 3(VCCDR3) 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.
VL 사슬은 SEQ ID NO: 9 또는 17을 포함할 수 있다. VL 사슬은 SEQ ID NO: 10 또는 18의 아미노산 서열로 구성된 제1 상보성-결정 영역(VL1CDR1), SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성된 제2 상보성-결정 영역(VL1CDR2), 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성된 제3 상보성-결정 영역(VL1CDR3)을 포함할 수 있다.
결합 단백질에서, VH 사슬은 링커에 의해 VL 사슬에 연결될 수 있다. 링커는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 GASP-1의 면역우성 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 면역우성 에피토프는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
결합 단백질은 재조합 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체일 수 있다. 결합 단백질은 인간화된 항체일 수 있다.
결합 단백질은 항-GASP-1 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 항-GASP-1 scFV는 SEQ ID NO: 36 및 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
결합 단백질은 SEQ ID NO: 1-4, 9-12 및 17-18로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
결합 단백질은 화학요법제와 컨쥬게이션될 수 있다. 화학요법제는 아나스트로졸(Anastrozole), 엑세메스탄(Exemestane), 레트로졸(Letrozole), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(Ribociclib), 네라티닙(Neratinib), 아베마시클립(Abemaciclib), 올라파립(Olaparib), 레고라페닙(Regorafenib), 트레티노인(Tretinoin), 악시캅타젠 실로류셀(axicabtagene ciloleucel), 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 보수티닙(Bosutinib), 이브루티닙(Ibrutinib), 이델라리십(Idelalisib), 베네토클락스(Venetoclax), 포나티닙(Ponatinib), 미도스타우린(Midostaurin), 에나시데닙(Enasidenib), 티사젠렉류셀(Tisagenlecleucel), 이보시데니(Ivosideni), 두벨리십(Duvelisib), 이마티닙(Imatinib), 제피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 소라페닙(Sorafenib), 아비라테론(Abiraterone), 크리토지닙(Critozinib), 베무라페닙(Vemurafenib), 방사성 동위원소 예컨대, 111In 및 90Y, 독소, 예컨대 오리스타틴(auristatin), 마이탄시노이드(maytansiNOid), 독소루비신(doxorubicin), 탁솔(taxol), 시스플라틴(cisplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 칼리체아미신(calicheamicin), 및 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)를 생성하는 방법이 제공된다. CAR-T 세포 생성 방법은 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함하는 CAR을 인코딩하는 유전자를 T 세포에 도입시키고, T 세포에 의해 항-GASP-1 scFv를 발현시키고, 항-GASP-1 scFv를 발현하는 T 세포를 분리하는 것을 포함한다. 항-GASP-1 scFV는 SEQ ID NO: 36 및 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 항체를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 항-GASP-1 항체 생성 방법은 면역원으로서 GASP-1 펩티드로 숙주를 면역화시키는 것을 포함한다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
이중-특이적 결합 단백질을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 이중-특이적 결합 단백질 생성 방법은 본 발명의 결합 단백질을 추가적인 인간화된 항체와 조합시키는 것을 포함한다. 생성된 이중-특이적 결합 단백질은 인간화된 항체보다 더욱 우수한 면역요법 특이성 및/또는 효능을 나타낸다. 결합 단백질은 인간화된 GASP-1 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 추가의 인간화된 항체는 리툭시맙(Rituximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 에팔리주맙(Efalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 벨리무맙(Belimumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 두르발루맙(Durvalumab), 보르테조밉(Bortezomib), 엘로투주맙(Elotuzumab), 아벨루맙(Avelumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 및 올라라투맙(Olaratumab)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
각 이중-특이적 결합 단백질 제조 방법에 있어서, 제조된 바와 같은 이중-특이적 결합 단백질이 제공된다.
약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질 또는 이중-특이적 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
GASP-1-매개된 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에서 GASP-1-매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 치료 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. GASP-1-매개된 질환 또는 장애는 종양일 수 있다. 종양은 고형 종양일 수 있다. 종양은 혈액 종양일 수 있다. GASP-1-매개된 질환 또는 장애는 암일 수 있다. 대상체는 암 치료를 받았을 수 있다. GASP-1은 대상체의 세포에서 과립으로 발현될 수 있다. GASP-1 과립은 세포 표면 상에 또는 세포질에 존재할 수 있다.
GASP-1을 발현하는 세포의 성장을 억제하기 위한 방법이 제공된다. 억제 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함한다. 세포는 암 세포일 수 있다. 세포는 암에 걸린 환자에 존재할 수 있다.
GASP-1을 발현하는 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀을 비활성화하기 위한 방법이 제공된다. 비활성화 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀에 투여하는 것을 포함한다. 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀은 암에 걸린 대상체에 존재할 수 있다. 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀은 대상체의 순환 혈액(blood circulation)에 존재할 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다.
도 1은 세포막으로부터 돌출된 막 수포를 통해 전립선암 세포로부터 방출된 세포외 온코좀을 보여 주지만(오른쪽 패널), 정상 전립선 세포는 그렇지 않다(왼쪽 패널).
도 2는 고등급 DCIS 유방암 세포의 세포질에서 다양한 크기의 GASP-1 과립의 축적을 보여 주지만(오른쪽 패널), 정상 유방암 세포는 그렇지 않다(왼쪽 패널).
도 3은 고등급 DCIS 유방암 세포의 세포막 또는 막 단편에 부착된 많은 GASP-1 과립을 보여준다.
도 4는 삼중 음성 유방암 세포의 세포막 상의 다양한 크기의 GASP-1 과립을 보여준다.
도 5는 비-소세포 성 폐암(NSCLC) 세포의 세포질에서 다양한 크기의 GASP-1 과립의 축적을 보여 주지만(오른쪽 패널), 정상 폐 세포는 그렇지 않다(왼쪽 패널).
도 6은 아교모세포종 세포의 세포막 상에 및 세포질에서 GASP-1 과립의 축적을 보여 주지만(오른쪽 패널), 정상 뇌 세포는 그렇지 않다(왼쪽 패널).
도 7은 VL 특이적 프라이머(레인 1) 또는 VH 특이적 프라이머(레인 2)를 사용한 PCR 생성물을 보여준다. 레인 M: 2000 DNA 마커, 위에서부터 아래로: 각각 2000, 1000, 750, 500, 250, 100bp.
도 8은 신호 서열, 가변 경쇄(VL), 링커, 가변 중쇄(VH) 및 인간 IgG1 Fc(HIgG1-Fc)를 포함하는 4911bp의 scFv1-Fc 또는 scFv2-Fc 발현 벡터의 개략도를 보여준다.
도 9는 일차 항체로서 scFv1-Fc(오른쪽 패널) 또는 scFv2-Fc(왼쪽 패널) 및 2차 항체로서 PE-항-인간 IgG Fc 항체로 염색된 PC3 세포의 흐름 세포측정 분석(FACS)을 보여준다.
도 10은 일차 항체로서 GASP-1 모노클로날 항체와 이차 항체로서 Alexa Fluor-A-항-인간 IgG Fc 항체로 염색된 A549 폐암 세포(왼쪽 패널) 또는 SKOV3 난소암 세포(오른쪽 패널)의 흐름 세포측정 분석(FACS)을 보여준다.
도 11은 10,228bp의 키메라 항원 수용체(CAR) Lenti-EF1a-scFv1-CD28-CD3z-T2A-EGFRt의 개략도를 보여준다.
도 12는 T 세포의 34.9%가 CAR-양성임을 보여준다.
도 13은 CAR-10217-SIA-CAR-T 세포에 노출시 암 세포에 의한 IFN-γ(왼쪽 패널) 및 IL-2(오른쪽 패널)의 방출을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항-G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1) 단일-사슬 가변 단편(scFv)을 포함하는 결합 단백질, 및 예를 들어, 세포 중의 과립에 또는 이의 표면 상에서 GASP-1 또는 이의 단편을 발현하는 세포를 검출하기 위한 및 GASP-1 발현 암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T) 또는 항체를 생성하기 위한 항-GASP-1 scFv의 용도를 제공한다. 본 발명은 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(scFv) 및 GASP-1이 고농축된 과립(GASP-1 과립)의 본 발명자들의 놀라운 발견을 기반으로 한다. GASP-1 과립은 분말 과립, 미세 과립으로부터 표면이 매끄럽지 않은 거친 과립에 이르기까지 크기가 다양하다. 거친 과립의 크기는 분말 과립의 크기의 약 수백배일 수 있다. GASP-1 과립은 암 세포의 내부 또는 세포막 상에, 예를 들어, 세포막 아래에, 세포질에, 핵 주위에 클러스터링되어 또는 핵 내부에 광범위하게 분포되는 것으로 발견되었다. 다양한 크기의 GASP-1 과립은 유방암, 삼중 음성암, 전립선암, 폐암, 간암, 췌장암, 난소암, 아교모세포종, 방광암, 흑색종 또는 결장암의 세포에서 발견되었다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도, 암이 진행됨에 따라 GASP-1 과립이 수와 크기 둘 모두에 있어서 증가할 수 있음을 발견하였다. 암의 초기 단계에서, GASP-1 과립은 주로 분말 내지 미세 과립일 수 있다. 삼중 음성 유방암(TNBC) 및 아교모세포종과 같은 고도로 침습적이고 공격적인 암의 후기 단계에서, GASP-1 과립은 주로 거친 GASP-1 과립일 수 있다.
정상 세포에서, GASP-1은 세포질에서 최소로만 발현되거나 발현되지 않을 수 있으며, 존재하는 경우 분말 형태일 수 있다. GASP-1 과립은 정상 세포의 세포질에 최소로 존재할 수 있으나, 세포막에는 존재하지 않을 수 있다. GASP-1 과립은 일부 정상 세포의 핵에 존재할 수 있다. 정상 세포에는 존재하지 않으며 암 세포의 표면에서만 GASP-1 과립이 존재한다는 놀라운 발견은 종양-특이적 항원(TSA)의 첫 번째 예를 제공한다. 이러한 발견은 GASP-1을 예를 들어, GASP-1 scFv 서열을 포함하는 인간화된 모노클로날 항체 또는 CAR-T 세포를 사용하는 암 면역치료에 대한 이상적인 표적이 되게 하는데, 이는 암 치료를 위한 GASP-1 과립의 표적화가 정상 세포에 대한 최소의 부작용을 가질 것이기 때문이다.
용어 "G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1)을 발현하는 과립" 및 "GASP-1 과립"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, GASP-1 또는 이의 단편을 함유하는 과립을 지칭한다. 이들의 크기에 따라, 3개 형태의 GASP-1 과립이 존재한다: 분말, 미세 및 거친 과립.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분말 GASP-1 과립"은 0.1 내지 0.4 μm 범위의 직경을 갖는 GASP-1 과립을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "미세 GASP-1 과립"은 0.4 내지 1.0 μm 범위의 직경을 갖는 GASP-1 과립을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "거친 GASP-1 과립"은 1.0 내지 5.0 μm 범위의 직경을 갖는 GASP-1 과립을 나타낸다. GASP-1 거친 과립은 세포외 미세소포보다 직경이 더 크다. GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재할 수 있다. GASP-1 과립은 엔도좀일 수 있다.
용어 "단일-사슬 Fv" 및 "scFv"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 항원에 대한 항체의 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는 단일 사슬 펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 항-GASP-1 scFv는 항-GASP-1 항체의 VH 사슬 및 VL 사슬을 포함하는 단일 펩티드를 지칭한다. ScFv는 VH 및 VL 사슬 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있어, scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. 항체가 인간화된 항체인 경우, 항체의 VH 및 VL 사슬을 포함하는 단일-사슬 펩티드는 인간 단일-사슬 Fv 또는 hscFv이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "미세소포"는 세포막에 의해 형성되고 세포, 예를 들어 암 세포의 세포막 표면으로부터 방출되는 세포외 소포(EV)를 지칭한다. 미세소포의 직경은 0.1 - 1 μm이다. 미세소포는 혈액, 타액, 소변 및 뇌척수액과 같은 생물학적 유체에 존재한다. 미세소포는 GASP-1을 발현할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "엑소좀"은 후기 식균작용 경로의 다중소포체(MVB)로부터 기원하며 세포막과의 융합에 의해 방출되는 세포외 소포(EV)를 지칭한다. 엑소좀의 직경은 30 - 100 nm이다. 엑소좀은 혈액, 타액, 소변 및 뇌척수액과 같은 생물학적 유체에 존재한다. 엑소좀은 GASP-1을 발현할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "온코좀"은 세포막에 의해 형성되고, 세포, 예를 들어 암 세포의 세포막 표면으로부터 방출되는 세포외 소포(EV)를 지칭한다. 온코좀의 직경은 1 - 10 μm이다. 온코좀은 혈액, 타액, 소변 및 뇌척수액과 같은 생물학적 유체에 존재한다. 온코좀은 GASP-1을 발현할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 명시된 목표(예를 들어, GASP-1 과립을 갖는 세포를 검출하고, GASP-1-매개된 질환 또는 장애를 이의 치료를 필요로하는 대상체에서 치료하고, GASP-1을 발현하는 세포의 성장을 억제하고, 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀을 비활성화시킴)를 달성하는데 필요한 결합 단백질 또는 이중-특이적 결합 단백질을 포함하는 약학적 조성물의 양을 지칭한다. 약학적 조성물의 유효량은 언급된 목표 및 조성물의 물리적 특성에 따라 달라질 수 있다.
G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1) 또는 이의 단편을 발현하는 과립을 갖는 세포를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 검출 방법은 세포를 유효량의 결합 단백질과 접촉시키고, 결합 단백질에 결합된 과립을 갖는 세포를 식별하는 것을 포함한다. 결합 단백질은 GASP-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함한다. 식별된 세포는 GASP-1 과립을 갖는 세포이다.
검출 방법에 따르면, GASP-1 과립은 세포의 세포질에 또는 표면 상에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, GASP-1 과립은 세포의 세포질에 존재할 수 있다. 또 다른 구체예에서, GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, GASP-1 과립은 세포의 핵에 존재하지 않을 수 있다.
검출 방법에 따르면, 세포 중의 GASP-1 과립의 수가 다를 수 있다. 세포 당 약 10 - 1,000, 20 - 500 또는 20 - 200개의 GASP-1 과립이 존재할 수 있다. 세포 중 GASP-1 과립의 평균 수는 20 내지 150개 범위이다. GASP-1 과립은 분말 과립, 미세 과립으로부터 거친 과립에 이르기까지 크기가 다양할 수 있다. 거친 GASP-1 과립은 동일한 세포에 있는 분말 과립보다 적어도 10, 50, 100 또는 500배 더 클 수 있다. GASP-1 과립의 직경은 약 0.1 - 10, 0.1 - 0.4, 0.4 - 1.0, 1.0 - 5.0, 0.1 - 1.0, 0.1 - 5.0, 0.4 - 5.0, 0.2 - 10, 0.2 - 3.0, 0.2 - 5.0, 0.5 - 1.0 또는 0.5 - 5.0 μm 범위일 수 있다. 일 구현예에서, GASP-1 과립은 0.2 내지 3.0 μm 범위의 직경을 갖는다. 본 발명자들은 암이 진행됨에 따라 분말(및/또는 미세 과립)의 성숙 또는 이러한 GASP-1 과립의 응집으로 인한 것일 수 있는 보다 거친 GASP-1 과립이 발견됨을 발견하였다. 일 구현예에서, GASP-1 과립의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 암 세포 중의 거친 GASP-1 과립일 수 있다. GASP-1 과립의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%는 보다 공격적인 암, 예를 들어 고등급 DCIS, 삼중 음성 유방암 및 아교모세포종으로부터의 세포 중 거친 GASP-1 과립일 수 있다. 거친 GASP-1 과립은 핵막 주변 및/또는 세포막 상에 클러스터링될 수 있다.
검출 방법에 따르면 GASP-1 과립을 갖는 세포는 종양에 존재할 수 있다. 종양은 고형 종양 또는 혈액 종양일 수 있다. 종양은 대상체에 존재할 수 있다. 대상체는 암을 가질 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암일 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다. 대상체는 암 치료를 받았을 수 있다.
검출 방법에 따르면 GASP-1 과립을 갖는 세포는 암 세포일 수 있다. 이러한 세포는 대상체에 존재할 수 있다. 대상체는 암을 가질 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암일 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다. 대상체는 암 치료를 받았을 수 있다.
검출 방법은 GASP-1 과립 또는 GASP-1 또는 이의 단편을 갖는 세포에서 암 바이오마커를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 암 바이오마커는 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 또는 위 선암종에 대한 임의의 적합한 바이오마커일 수 있다. 예를 들어, 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 또는 전립선암일 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다. 예시적인 암 바이오마커는 CA125, CA19-9, CA15-3, CA27.29, AFP, BRCA1/BRCA2, EGFR, HER-2, KIT, VEGF, KRAS, ALK, PSA, HE4, CYFRA 21-1, NSE, PD-L1, TIMP-1, TIMP-2, HGF, OPN, MSLN, MMP2 및 CEA를 포함한다.
검출 방법에 따르면, 결합 단백질은 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 항-GASP-1 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 항-GASP-1 항체는 GASP-1 또는 이의 단편, 예를 들어 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)의 GAPS-1 펩티드에 결합할 수 있는 항체이다. 항-GASP-1 항체는 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함하는 결합 단백질이 또한 제공된다. 항-GASP-1 scFv는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함한다. 결합 단백질은 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VH 사슬은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VH 사슬은 제1 상보성-결정 영역 1(VHCDR1), 제2 상보성-결정 영역 2(VHCDR2) 및 제3 상보성-결정 영역 3(VHCDR3)을 포함할 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VHCDR2는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VHCDR2는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VHCDR3은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VHCDR3은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 6을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. VHCDR2는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. VHCDR2는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. VHCDR3은 SEQ ID NO: 8을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다. VHCDR3은 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL 사슬은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL 사슬은 제1 상보성-결정 영역 1(VLCDR1), 제2 상보성-결정 영역 2(VLCDR2) 및 제3 상보성-결정 영역 3(VLCDR3)을 포함할 수 있다. VLCDR1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL1CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL1CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL1CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL1CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL 사슬은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL 사슬은 제1 상보성-결정 영역 1(VLCDR1), 제2 상보성-결정 영역 2(VLCDR2) 및 제3 상보성-결정 영역 3(VLCDR3)을 포함할 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VHCDR1은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL1CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL1CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. VL1CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. VL1CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 구성된 링커로 VL 사슬에 연결될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 구성된 GASP-1의 면역우성 에피토프에 대해 선택된 항체일 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 구성된 링커로 VL 사슬에 연결될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 구성된 GASP-1의 면역우성 에피토프에 대해 선택된 항체일 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열로 구성된 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 구성된 링커로 VL 사슬에 연결될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 구성된 GASP-1의 면역우성 에피토프에 대해 선택될 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성된 가변 중쇄(VH) 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열로 구성된 가변 경쇄(VL)를 포함할 수 있다. VH 사슬은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 구성된 링커로 VL 사슬에 연결될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 구성된 GASP-1의 면역우성 에피토프에 대해 선택될 수 있다.
항-GASP-1 항체 또는 scFv의 VH 사슬은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된 CDR1, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR2, 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR3을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 항체 또는 scFv의 VH 사슬은 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR1, SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VHCDR2 및 SEQ ID NO: 8의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VHCDR3을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열로 구성된 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR1, SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR3을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열로 구성된 CDR1, SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성된 CDR2, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성된 CDR3을 포함할 수 있다.
항-GASP-1 scFv의 VL 사슬은 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR1, SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 CDR3을 포함할 수 있다.
결합 단백질에서, VH 사슬은 링커에 의해 VL 사슬에 연결될 수 있다. 링커는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 링커는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
항-GASP-1 scFv는 GASP-1의 면역우성 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역우성 에피토프는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 면역우성 에피토프는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
결합 단백질은 재조합 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 결합 단백질은 인간화된 항체일 수 있다.
결합 단백질은 항-GASP-1 항체일 수 있으며, GASP-1 또는 이의 단편, 예를 들어 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)의 GAPS-1 펩티드에 결합할 수 있는 항체일 수 있다. 항-GASP-1 항체는 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
결합 단백질은 항-GASP-1 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 36을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 43을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
결합 단백질은 SEQ ID NO: 1-4, 9-12 및 17-18로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1 및 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1 및 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 2-4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 10-12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 11, 12 및 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1 및 10-12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 1, 11, 12 및 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 2-4 및 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 결합 단백질은 SEQ ID NO: 2-4 및 17의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
결합 단백질은 화학요법제와 컨쥬게이션될 수 있다. 화학요법제는 아나스트로졸, 엑세메스탄, 레트로졸, 팔보시클립, 리보시클립, 네라티닙, 아베마시클립, 올라파립, 레고라페닙, 트레티노인, 악시캅타젠 실로류셀, 다사티닙, 닐로티닙, 보수티닙, 이브루티닙, 이델라리십, 베네토클락스, 포나티닙, 미도스타우린, 에나시데닙, 티사젠렉류셀, 이보시데니, 두벨리십, 이마티닙, 제피티닙, 엘로티닙, 라파티닙, 소라페닙, 아비라테론, 크리토지닙, 베무라페닙, 방사성 동위원소 예컨대, 111In 및 90Y, 독소, 예컨대 오리스타틴, 마이탄시노이드, 독소루비신, 탁솔, 시스플라틴, 빈블라스틴, 칼리체아미신, 및 슈도모나스 엑소톡신 A로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)를 생성하기 위한 방법이 제공된다. CAR-T 세포 생성 방법은 CAR을 인코딩하는 유전자를 T 세포에 도입하는 것을 포함한다. CAR은 본 발명의 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함한다. CAR 생성 방법은 T 세포에 의해 항-GASP-1 scFv를 발현시키고 항-GASP-1 scFv를 발현하는 T 세포를 분리하는 것을 추가로 포함한다.
CAR-T 세포 생성 방법에 따르면, 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항-GASP-1 scFv는 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
CAR은 신호 펩티드(SEQ ID NO: 35), CD8 힌지(SEQ ID NO: 37), CD28 트랜스멤브레인 세포내 도메인(SEQ ID NO: 38), CD3 제타(SEQ ID NO: 39), T2A(SEQ ID NO: 36) 및 EGFRt(SEQ ID NO: 41)를 추가로 포함할 수 있다. 인터류킨, 케모카인, 면역 체크포인트 억제제와 같은 요소는 공동-발현되는 경우 CAR-T의 효능을 향상시킬 수 있다. 인터류킨-12(IL-12)를 예로 사용하면, CAR 서열은 CAR-T2A-EGFRt-T2A-IL-12, CAR-T2A-EGFRt-IRES-IL-12 또는 CAR-T2A-EGFRt-T2A-PGK 프로모터-IL-12일 수 있다. 공동-자극 도메인은 4-1BB, OX40 등일 수 있으며, 이러한 요소는 CAR-T 치료도 향상시킬 수 있다. 공동-자극 도메인(4-1BB, OX40 등)은 다음 예를 포함하는 CAR의 공동-자극 도메인에 추가될 수 있다:
(a) CD8 힌지, CD28 트랜스멤브레인, 4-1BB 세포내 도메인, CD3 제타;
(b) CD8 힌지, CD8 트랜스멤브레인, 4-1BB 세포내 도메인, CD3 제타;
(c) CD8 힌지, CD28 트랜스멤브레인, OX40 세포내 도메인, CD3 제타;
(d) CD8 힌지, CD8 트랜스멤브레인, OX40 세포내 도메인, CD3 제타; 및
(e) CD8 힌지, CD28 트랜스멤브레인 세포내 도메인, 4-1BB 또는 OX40, CD3 제타.
현재 이용가능한 CAR-T 요법이 고형 종양에 대해 다소 비효과적이라는 점에서, GASP-1 CAR-T 요법은 티사젠렉류셀(Kymriah) 또는 악시캅타젠 실로류셀(Yescarta)과 같은 현재 승인된 CAR-T 치료제와 이러한 CAR-T 치료제를 개선하기 위해 조합될 수 있으며, 그 후 CD19 생성 세포가 뒤따른다. CD19 또는 또 다른 암 표면 항원에 대해 지시된 추가 CAR 서열을 포함하는 GASP-1 CAR-T도 또한 사용될 수 있다. GASP-1 CAR-T와 체크포인트 억제제로 불리는 또 다른 면역요법의 조합이 또한 제안된다. 체크포인트 억제제는 이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙 또는 세미플리맙일 수 있다.
항-GASP-1 항체를 생성하기 위한 방법이 제공된다. 항체 생성 방법은 면역원으로서 GASP-1 펩티드로 숙주를 면역화시키는 것을 포함한다. GASP-1 펩티드는 GASP-1에서 유래된 임의의 펩티드일 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 22-26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 22-26으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GASP-1 펩티드는 SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
이중-특이적 결합 단백질을 생성하기 위한 방법. 이중-특이적 결합 단백질 생성 방법은 본 발명의 결합 단백질을 추가적인 인간화된 항체와 조합시켜 이중-특이적 결합 단백질을 생성시키는 것을 포함한다. 이중-특이적 결합 단백질은 추가적인 인간화된 항체보다 더욱 우수한 면역요법 특이성 및/또는 효능을 가질 수 있다. 결합 단백질은 본 발명의 GASP-1 항체 또는 CAR일 수 있다. 추가의 인간화된 항체는 리툭시맙, 알렘투주맙, 아달리무맙, 에팔리주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 나탈리주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 이필리무맙, 벨리무맙, 오비누투주맙, 퍼투주맙, 베돌리주맙, 라무시루맙, 에볼로쿠맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 레슬리주맙, 네시투무맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 오파투무맙, 두르발루맙, 보르테조밉, 엘로투주맙, 아벨루맙, 세미플리맙 및 올라라투맙으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
각 이중-특이적 결합 단백질 생성 방법에 있어서, 생성된 이중-특이적 결합 단백질이 제공된다. 이중-특이적 결합 단백질은 본 발명의 결합 단백질 및 추가적인 인간화된 항체를 포함한다. 이중-특이적 결합 단백질은 추가적인 인간화된 항체보다 더욱 우수한 면역요법 특이성 및/또는 효능을 가질 수 있다. 결합 단백질은 본 발명의 GASP-1 항체 또는 CAR일 수 있다. 추가의 인간화된 항체는 리툭시맙, 알렘투주맙, 아달리무맙, 에팔리주맙, 세툭시맙, 베바시주맙, 나탈리주맙, 파니투무맙, 라니비주맙, 이필리무맙, 벨리무맙, 오비누투주맙, 퍼투주맙, 베돌리주맙, 라무시루맙, 에볼로쿠맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 레슬리주맙, 네시투무맙, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 오파투무맙, 두르발루맙, 보르테조밉, 엘로투주맙, 아벨루맙, 세미플리맙 및 올라라투맙으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 결합 단백질 또는 이중-특이적 결합 단백질 각각에 있어서, 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 본 발명의 결합 단백질 또는 이중-특이적 결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
GASP-1-매개된 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에서 GASP-1-매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 치료 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
치료 방법에 따르면, GASP-1-매개된 질환 또는 장애는 종양일 수 있다. 종양은 고형 종양일 수 있다. 종양은 혈액 종양일 수 있다.
치료 방법에 따르면, GASP-1-매개된 질환 또는 장애는 암일 수 있다. 대상체는 암 치료를 받았을 수 있다. GASP-1은 대상체의 세포에서 과립으로 발현될 수 있다. GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재할 수 있다. 일 구현예에서, GASP-1 과립은 세포의 세포질에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, GASP-1 과립은 세포의 표면 상에 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, GASP-1 과립은 세포의 핵에 존재하지 않을 수 있다.
치료 방법은 암 치료 전에 대상체의 세포에서 GASP-1 과립의 평균 수, 및/또는 평균 직경, 및/또는 안정성을 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 치료 방법은 암 치료 후 대상체의 세포에서 GASP-1 과립의 평균 수, 평균 직경 및/또는 안정성을 결정하고, 선택적으로 암 치료 전 대상체의 세포에서의 GASP-1 과립의 평균 수, 평균 직경 및/또는 또는 안정성을 암 치료 후의 것과 비교하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
치료 방법에 따르면, 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다.
GASP-1을 발현하는 세포의 성장을 억제하기 위한 방법이 제공된다. 억제 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함한다. 세포는 암 세포일 수 있다. 세포는 암에 걸린 환자에 존재할 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다.
GASP-1을 발현하는 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀을 비활성화시키기 위한 방법이 제공된다. 비활성화 방법은 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀에 투여하는 것을 포함한다. 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀의 비활성화는 표면 바이오마커, 예컨대 엑소좀에 있어서 CD63, CD9 또는 CD81; 미세소포에 있어서 CD45, CD47; 및 온코좀에 있어서 열 충격 단백질 HSPA5 및 HSPA9의 수의 감소에 의해 입증될 수 있다. 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀은 암에 걸린 대상체에 존재할 수 있다. 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀은 대상체의 순환 혈액에 존재할 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유방암은 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암일 수 있다. 폐암은 비-소세포 폐암(NSCLC)일 수 있다.
실시예 1. 전립선암에서 GASP-1 온코좀 또는 미세소포의 식별
전립선암 세포에서 GASP-1 발현은 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 검사하였다. GASP-1 온코좀 또는 미세소포는 세포막으로부터의 발아에 의해 방출되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 정상 전립선 세포는 GASP-1 온코좀 또는 미세소포를 방출하지 않지만(왼쪽 패널), GASP-1 온코좀은 암 세포막으로부터 돌출되는 막 수포 형성을 통해 세포막으로부터 발아된 후 방출됨을 볼 수 있다(오른쪽 패널의 화살표 참조). 온코좀 또는 미세소포는 초기에 암 세포막의 특정 영역에 집중된 GASP-1로부터 기원하는 것으로 보였다. 완전히 방출된 온코좀 또는 미세소포는 또한 방출 영역 근처에서 볼 수 있다(오른쪽 패널).
실시예 2. 암 세포에서 다양한 크기의 GASP-1 과립의 존재
다양한 암 세포에서 GASP-1 발현은 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 검사하였다. 상기 실시예 1에 기술된 방출된 세포외 GASP-1 온코좀과 달리, GASP-1을 발현하는 과립은 유방암, 삼중 음성 유방암, 전립선암, 폐암, 간암, 난소암, 아교모세포종, 위암, 방광암, 흑색종 또는 결장암을 포함하는 암 세포의 표면 상에서 또는 세포질에서 발견되었다. GASP-1 과발현이 암 개시 및 진행에 필요하기 때문에 GASP-1 과립의 생성은 암 진행에 필요한 단계일 될 수 있다.
도 2는 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 고등급 DCIS 유방암의 면역조직화학(IHC) 염색을 보여준다. 정상 유방 세포에서 GASP-1은 세포질이 아닌 일부 핵에서만 발현된다(도 2 왼쪽 패널). 암세포에서 GASP-1 과립은 세포막, 세포질, 핵막 주위 클러스터링 및 핵 내부와 관련되었다(도 2 오른쪽 패널 및 도 3).
GASP-1 과립은 엔도좀으로부터 기원할 수 있다. 그러나, 성숙했을 때 직경이 0.5 μm인 엔도좀과 달리, 이 암에는 분말 과립, 미세 과립으로부터 거친 과립에 이르기까지 다양한 크기의 GASP-1 과립이 존재한다(도 3). 직경 1.0 내지 5.0 μm의 거친 GASP-1 과립은 엔도좀보다 클 수 있다. 또한, 도 1에 기재된 세포외 GASP-1 온코좀과 달리, 거친 GASP-1 과립은 여전히 세포막에 부착되어 있으며(도 3의 화살표 참조) 세포막으로부터 방출되지 않는다. GASP-1 과립은 또한 온코좀의 특징인 세포막으로부터 돌출된 막 수포를 형성하지 않는다. 거친 GASP-1 과립은 아마도 더 작은 과립의 성숙 또는 더 작은 과립의 응집에 의해 형성될 것이다. 세포막 상의 매우 많은 거친 GASP-1 과립의 결합은 막의 불안정화 및 세포막의 파괴(또는 단편화)를 유발할 수 있음이 가능하다. 단편화된 세포막 조각은 여전히 이들에 부착된 많은 GASP-1 과립을 포함하고 있다(도 3). 세포막 파괴의 한 가지 결과는 원래 세포 내부(세포질, 핵막 상의 클러스터링 또는 핵)에 존재하는 많은 GASP-1 과립이 종양 미세환경으로 방출되고 후에 순환 혈액으로 방출되는 것이다. 본 발명자들은 또한 암이 더욱 심각해짐에 따라 GASP-1 과립의 크기가 더 커지고 거칠어짐을 발견하였다.
GASP-1 과립이 암세포 표면에 존재하고 정상 세포 표면에 부재하면 암세포를 특이적으로 표적화하고 정상 세포를 스페어링할 수 있는 기회를 제공한다. 암세포 표면 상의 거친 GASP-1 과립의 풍부한 존재는 또한 GASP-1 표적화된 암 치료를 더욱 효과적으로 만들 수 있다. DCIS 유방암 및 기타 암과 같은 고형 종양에서 GASP-1 과립은 다른 세포층의 표면에서도 발견되었다. 이는 또한 GASP-1 과립을 표적으로 하는 면역요법이 암-표적화제에 접근할 수 있기 때문에 오히려 더욱 효과적이게 할 것이다.
유방암의 매우 공격적인 형태인 삼중 음성 유방암은 고등급 DCIS와 거의 동일한 GASP-1 과립 패턴을 보여준다(도 4). 또한, 과립 분말, 미세 과립으로부터 거친 과립에 이르는 다양한 크기의 GASP-1 과립이 이러한 암에 존재한다. 화살표는 세포막 또는 막 단편에 여전히 부착된 GASP-1 과립을 가리킨다.
폐암은 남성 및 여성 둘 모두에게 가장 치명적인 암에 속한다. 이의 사망률은 가장 흔한 세가지 암(결장암, 유방암 및 췌장암)을 합친것보다 높다. 비소세포 폐암(NSCLC)은 전체 폐암 사례의 약 85%를 차지하며, 새로 진단된 폐암 환자의 대부분은 말기이다. 조기 검출은 매우 중요하며, 생검 샘플의 이용가능성으로 인해, 세포질에서 GASP-1 과립의 존재 및 풍부함이 조기 검출을 나타낼 수 있다. 도 5는 NSCLC의 대표적인 IHC 염색을 보여준다. 정상 폐 세포에서 GASP-1 과립은 일부 핵에만 존재하고 세포질에는 존재하지 않으며(왼쪽 패널), 다양한 크기의 GASP-1 과립은 세포질에 존재하거나 NSCLC의 세포막에 부착된다(오른쪽 패널). 오른쪽 패널의 화살표는 GASP-1 과립과 세포막 및 막 단편의 결합을 가리킨다. 따라서, 폐암이 의심되는 개체로부터의 GASP-1 과립에 대한 폐 조직의 IHC 염색은 폐암의 존재를 확인시켜줄 것이다.
도 6은 아교모세포종 세포에서 GASP-1 과립을 보여준다. GASP-1 과립은 정상 뇌 세포에 부재하지만(왼쪽 패널), 아교모세포종 세포에서 매우 풍부하였다(오른쪽 패널). 다양한 크기의 GASP-1 과립은 세포질 및 아교모세포종 세포의 표면 상에 존재한다.
유사한 다량의 GASP-1 과립이 난소암, 결장암, 흑색종, 위암 및 전립선암 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
암 세포 내부의 다양한 크기의 매우 많은 GASP-1 과립의 존재는 예상치 못하였다. GASP-1 과립은 본 발명자들이 연구한 모든 암 세포 표면에 존재한다; 이들이 또한 자궁내막 암종, 식도 편평세포 암종, 후두암, 난소의 점소양 낭종암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종과 같은 다른 암 세포 표면에 존재할 것으로 추정될 수 있다. 따라서, GASP-1은 보편적인 암 바이오마커이며, GASP-1 과립 생성은 암 진행에 필요한 단계를 나타낼 수 있다. 따라서, GASP-1 과립의 존재, 이들의 세포내 국소화, 이들의 풍부함 등을 이용하여 암 및 암 중증도를 평가할 수 있다.
실시예 3. GASP-1 scFv 서열
GASP-1 펩티드 단편 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)에 대한 모노클로날 항체가 생성되었다. 여러 클론을 분리하였다. 클론 14B8은 GASP-1 펩티드에 대해 가장 높은 역가를 나타내었다. 클론 14B8로부터의 세포 용해물을 TriZol 용액에 보관하였다. cDNA를 세포 용해물에서 전체 RNA로부터 역전사시킨 후 항체의 가변 영역(중쇄(VH) 및 경쇄 모두)을 PCR 증폭시켰다. 도 7은 VL 특이적 프라이머(레인 1) 또는 VH 특이적 프라이머(레인 2)를 사용한 PCR 생성물의 겔 분석을 보여준다. 그 후, 생성된 PCR 단편을 표준 클로닝 벡터에 별도로 클로닝하고 시퀀싱하였다. PCR을 사용하여 클론 14B8의 중쇄 및 경쇄를 시퀀싱하고, 두 개의 가변 경쇄 서열을 발견하였다.
표 1은 클론 14B8의 다양한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 제1, 제2 및 제3 상보성-결정 영역(VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3)을 포함하는 가변 중쇄(VH), 제1, 제2 및 제3 상보성-결정 영역(VL1CDR1, VL1CDR2 및 VL1CDR3)을 포함하는 제1 가변 경쇄(VL1), 및 제1, 제2 및 제3 상보성-결정 영역(VL2CDR1, VL2CDR2 및 VL2CDR3)을 포함하는 제2 가변 경쇄(VL2)를 보여준다. 2개의 경쇄 서열은 CDR1에서 단 하나의 아미노산에서만 상이하다(SEQ ID NO: 9 및 17과 비교). N에서 Y로의 변화는 SEQ ID NO: 13 및 19에 기재된 바와 같이 TAT에서 AAT로의 코돈 변화 때문이다. 이러한 불일치는 표적 서브클론의 다중 콜리니얼러티(coloniality) 때문일 수 있다. 뉴클레오티드 및 아미노산에서의 변화는 굵게 강조하고 밑줄을 그었다.
표 1. 클론 14B8의 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 4. 항-GASP-1 scFv-Fc 단백질
항-GASP-1 scFv-Fc 단백질은 클론 14B8의 서열을 기반으로 생성하였다. 다양한 가변 경쇄(VL) 서열을 사용하여 2개의 scFv-Fc 발현 벡터, scFv1-Fc 및 scFv2-Fc를 제조하였다. 발현 벡터 작제물 디자인은 도 8에 도시되어 있다. ScFv1-Fc의 VL은 1468 경쇄# 2(SEQ ID NO: 9)이고 scFv2-Fc의 VL은 1468 경쇄 #1(SEQ ID NO: 17)이다. 발현 벡터를 HEK293 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, scFv-Fc 단백질을 Gibco® FreeStyleTM 293 Expression Medium을 사용하여 HEK293 세포에서 발현시켰다.
ScFv-Fc 단백질을 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하고, 표적 PC-3 암세포에 대한 이들의 친화성을 분석하였다. 흐름 세포측정 분석(FACS)에서 5 x 105개의 PC-3 세포를 scFv1-Fc 또는 scFv2-Fc 단백질로 염색한 다음 PE-항-인간 IgG Fc 항체를 2차 항체로 염색하였다. 도 9는 PC-3 세포의 49.4%가 scFv1-Fc 단백질에 의해 인식된 반면 PC-3 세포의 8.39%만이 scFv2-Fc 단백질에 의해 인식됨을 보여주며, 이는 scFv1이 PC-3 세포에 대해 상당히 높은 친화성을 가지고 있음을 나타낸다.
실시예 5. 암세포 표면 상의 GASP-1 발현
다양한 암 세포에서 GASP-1의 발현은 EEASPEAVAGVGFESK(SEQ ID NO: 22)에 대한 항-GASP-1 모노클로날 항체를 사용하여 연구하였다. GASP-1은 폐암 및 난소암 세포의 표면 상에서 발견되었다(도 10). 폐암 표면 상의 GASP-1의 출현은 암세포 표면 상의 GASP-1 과립의 존재를 보여주는 면역조직화학(IHC) 분석의 결과를 확인시켜준다(도 5). GASP-1은 또한 흐름 세포측정 분석에 의해 검사된 다른 암 세포 예를 들어, 결장암, 유방암, 백혈병, 흑색종, 아교모세포종 및 췌장암 세포의 표면에서도 발견되었다. 이러한 결과에 기초하여, GASP-1은 보편적인 암 바이오마커일 수 있으며, 자궁내막 암종, 식도 편평세포 암종, 신경아교종, 간세포 암종, 침윤 유관 유방 암종, 후두암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종을 포함하는 다른 암의 세포 표면 상에 나타난다. GASP-1 과립과 많은 암의 세포막의 다소 안정적인 결합은 GASP-1 과립을 많은 고형 종양을 포함하는 암 치료를 위한 CAR-T 및 인간화된 재조합 항체 둘 모두에 대한 우수한 표적이 되게 할 것이다.
실시예 6. CAR 벡터의 작제
GASP-1 과립은 다양한 암세포 층의 표면 상에 존재하고(도 3 및 도 4 참조), 세포층 내부에 묻히지 않고 정상 세포 표면 상에 존재하지 않기 때문에, 전장의 키메라 항원 수용체(CAR)를 scFv1로 합성하고 렌티바이러스 벡터 내로 서브클로닝하였다(도 11). 삽입은 Sanger 시퀀싱에 의해 확인되었다.
표 2는 CAR 카세트의 생성에 사용되는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 보여준다. Lenti-EF-1알파 프로모터(SEQ ID NO: 27), 신호 펩티드(SEQ ID NO: 28), scFv1(SEQ ID NO: 29), CD28 힌지(SEQ ID NO: 30), CD28 막내 서열(SEQ ID NO: 31), CD3z(SEQ ID NO: 32), T2A(토세아 아사인아 바이러스 2A 자가-절단 펩티드)(SEQ ID NO: 33) 및 EGFRt(절두된 인간 표피 성장 인자 폴리펩티드)(SEQ ID NO: 34)에 대한 뉴클레오티드 서열을 사용하여 CAR 작제물을 제조하였다. GASP-1 CAR 작제물은 신호 서열(SEQ ID NO: 35), scFv1(SEQ ID NO: 36) 또는 scFv2(SEQ ID NO: 43), CD28 힌지(SEQ ID NO: 37), CD28 트랜스멤브레인 서열(SEQ ID NO: 38), CD3z(SEQ ID NO: 39), T2A(SEQ ID NO: 40) 및 EGFRt(SEQ ID NO: 41)에 대한 아미노산 서열을 포함한다. ScFv1은 scFv2(SEQ ID NO: 42)로 치환될 수 있다.
표 2. CAR 작제물의 서열
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
GASP-1 과립을 CAR-T 표적으로서 사용하여, 암세포 표면 GASP-1 과립을 표적으로 하는 CAR-T 요법은 새로운 접근 방식을 나타내며, 혈액 및 고형 종양 둘 모두에 대해 효과적일 것이다.
실시예 7. CAR-T 세포
CAR-T 백분율을 평가하기 위해 CAR-T 세포를 항-EGFR 및 PE-컨쥬게이션된 항-인간 IgG로 염색하였다. 흐름 세포측정 분석은 34.9% 세포가 CAR-양성이었음을 보여주었다(도 12).
CAR-T의 효과를 테스트하기 위해 CAR-T 세포를 24시간 동안 다양한 E/T 비율로 표적 세포주 PC-3과 공동-배양하고, 상청액을 수확하여 사이토카인 방출을 결정하였다. 데이터는 CAR-T 세포에 의해 분비되는 IL-2 및 IFN-γ가 표적 종양 세포와 맞물려진 후에 증가되었음을 보여주었다(도 13).
실시예 8. 항-GASP-1 scFv 서열을 포함하는 인간화된 항체의 작제.
ScFv1 서열을 포함하는 인간화된 항체를 제조하였다. 제1 항체는 가변 영역 VH(SEQ ID NO: 1) 및 인간 불변 영역(SEQ ID NO: 45)을 포함하는 중쇄(SEQ ID NO: 44), 및 인간 불변 영역(SEQ ID NO: 47)에 의해 연결된 가변 영역 VL1(SEQ ID NO: 9)을 포함하는 경쇄(SEQ ID NO: 46)에 대한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제2 항체는 가변 영역 VH(SEQ ID NO: 1) 및 인간 불변 영역(SEQ ID NO: 45)을 포함하는 중쇄(SEQ ID NO: 44), 및 인간 불변 영역(SEQ ID NO: 47)에 의해 연결된 가변 영역 VL2(SEQ ID NO: 17)을 포함하는 경쇄(SEQ ID NO: 48)에 대한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 표 3은 항-GASP-1 인간화된 항체를 만드는데 사용되는 다양한 서열을 보여준다. 설계된 키메라 항체 사슬을 합성하고, 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, HEK293 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. mAb는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 SEC-HPLC로 정제하였다. 한외여과 후, 최종 생성물을 0.2-미크론 멸균 여과로 처리하였다. 단백질의 순도는 > 99%이고, 내독소는 1 EU/mg 미만이다.
표 3. 인간화된 항-GASP-1 항체 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
본 발명이 특정 구현예를 참조하여 본원에 예시되고 설명되었지만, 본 발명은 제시된 세부 사항으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 오히려, 본 발명에서 벗어나지 않고 청구범위의 등가물의 범주 및 범위 내에서 세부 사항에 대한 다양한 수정이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Proplex Technologies, LLC Chang, Frank N. Tuszynski, George P. Luo, Solomon Yang, Jeff <120> BINDING PROTEINS AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELLS TARGETING GASP-1 GRANULES AND USES THEREOF <130> PRX-101WO <150> 62/670,182 <151> 2018-05-11 <150> 62/768,325 <151> 2018-11-16 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Trp His Asn Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr 1 5 <210> 5 <211> 351 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 gaggtgaagt tggtggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgaccatc 60 acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atctggcata atggaagcac agactataat 180 tcagctctca gatccagact gagcatcaac aaggacaagt ccaagaacca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccag agggggaagg 300 tccccctggt ttccttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gggttctcat taaccggcta t 21 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 tggcataatg gaagc 15 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gggggaaggt ccccctggtt tccttac 27 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn 1 5 10 15 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 13 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 14 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 aagtcaagtc agagcctctt agatagtgat ggaaagacat atttgaat 48 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 tggcaaggta cacattttcc gtggacg 27 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 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300 ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360 acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420 ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480 attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540 ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600 cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660 aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720 caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780 tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840 gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900 ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960 cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020 ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080 tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140 tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200 gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260 gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320 tttcaggtgt cgtga 1335 <210> 28 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccg 63 <210> 29 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 Gly Ala Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Gly Gly Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Gly Gly Ala 35 40 45 Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Cys Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Ala Gly Ala Thr Ala Gly Thr 85 90 95 Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr 100 105 110 Thr Gly Ala 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ctggatccac aggaactgga tattctgaaa 240 accgtaaagg aaatcacagg gtttttgctg attcaggctt ggcctgaaaa caggacggac 300 ctccatgcct ttgagaacct agaaatcata cgcggcagga ccaagcaaca tggtcagttt 360 tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca tccttgggat tacgctccct caaggagata 420 agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac 480 tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa 540 aacagctgca aggccacagg ccaggtctgc catgccttgt gctcccccga gggctgctgg 600 ggcccggagc ccagggactg cgtctcttgc cggaatgtca gccgaggcag ggaatgcgtg 660 gacaagtgca accttctgga gggtgagcca agggagtttg tggagaactc tgagtgcata 720 cagtgccacc cagagtgcct gcctcaggcc atgaacatca cctgcacagg acggggacca 780 gacaactgta tccagtgtgc ccactacatt gacggccccc actgcgtcaa gacctgcccg 840 gcaggagtca tgggagaaaa caacaccctg gtctggaagt acgcagacgc cggccatgtg 900 tgccacctgt gccatccaaa ctgcacctac ggatgcactg ggccaggtct tgaaggctgt 960 ccaacgaatg ggcctaagat cccgtccatc gccactggga tggtgggggc cctcctcttg 1020 ctgctggtgg tggccctggg gatcggcctc ttcatg 1056 <210> 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aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaaggtg gaggtggcag cggaggaggt 360 gggtccggcg gtggaggaag cgaggtgaag ttggtggagt caggacctgg cctggtggcg 420 ccctcacaga gcctgaccat cacatgcacc gtctcagggt tctcattaac cggctatggt 480 gtaaactggg ttcgccagcc tccaggaaag ggtctggagt ggctgggaat gatctggcat 540 aatggaagca cagactataa ttcagctctc agatccagac tgagcatcaa caaggacaag 600 tccaagaacc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccaggtac 660 tactgtgcca gagggggaag gtccccctgg tttccttact ggggccaagg gactctggtc 720 actgtctctg caagatct 738 <210> 43 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 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Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp His Asn Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Lys Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Gly Arg Ser Pro Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 45 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 46 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Asn Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 48 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (59)

  1. G 단백질 결합된 수용체-관련 분류 단백질 1(GASP-1) 또는 이의 단편을 발현하는 과립을 갖는 세포를 검출하기 위한 방법으로서,
    (a) 세포를 유효량의 결합 단백질과 접촉시키는 단계로서, 결합 단백질은 GASP-1에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편을 포함하는 단계; 및
    (b) 결합 단백질에 결합된 과립을 갖는 세포를 식별하는 단계로서, 식별된 세포는 GASP-1 과립을 갖는 세포인 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포 중 GASP-1 과립의 직경이 0.1 내지 5.0 μm 범위인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포 중 GASP-1 과립의 평균 수가 세포 당 20 내지 150개 범위인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, GASP-1 과립이 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 세포가 종양에 존재하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 종양이 고형 종양 또는 혈액 종양인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 세포가 암 세포인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 세포가 암을 갖는 대상체에 존재하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 유방암이 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암인, 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐암(NSCLC)인, 방법.
  13. 제8항에 있어서, 대상체가 암 치료를 받았던 대상체인, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 세포에서 암 바이오마커를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 암 바이오마커가 CA125, CA19-9, CA15-3, CA27.29, AFP, BRCA1/BRCA2, EGFR, HER-2, KIT, VEGF, KRAS, ALK, PSA, HE4, CYFRA 21-1, NSE, PD-L1, TIMP-1, TIMP-2, HGF, OPN, MSLN, MMP2 및 CEA로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 결합 단백질이 인간화된 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  17. 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함하는 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 항-GASP-1 scFv가 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 포함하는, 결합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, VH 사슬이 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  20. 제17항에 있어서, VH 사슬이 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된 제1 상보성-결정 영역 1(VHCDR1), SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 구성된 제2 상보성-결정 영역 2(VHCDR2), SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 구성된 제3 상보성-결정 영역 3(VCCDR3) 또는 이의 조합물을 포함하는, 결합 단백질.
  21. 제17항에 있어서, VL 사슬이 SEQ ID NO: 9 또는 17을 포함하는, 결합 단백질.
  22. 제17항에 있어서, VL 사슬이 SEQ ID NO: 10 또는 18의 아미노산 서열로 구성된 제1 상보성-결정 영역(VL1CDR1), SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열로 구성된 제2 상보성-결정 영역(VL1CDR2) 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열로 구성된 제3 상보성-결정 영역(VL1CDR3)을 포함하는, 결합 단백질.
  23. 제17항에 있어서, VH 사슬이 링커에 의해 VL 사슬에 연결되는, 결합 단백질.
  24. 제17항에 있어서, 링커가 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  25. 제17항에 있어서, 항-GASP-1 scFv가 GASP-1의 면역우성 에피토프에 특이적으로 결합하고, 면역우성 에피토프가 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  26. 제17항에 있어서, 결합 단백질이 재조합 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간화된 항체 및 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체인, 결합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 결합 단백질이 인간화된 항체인, 결합 단백질.
  28. 제17항에 있어서, 결합 단백질이 항-GASP-1 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 항-GASP-1 scFv가 SEQ ID NO: 36 및 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  30. 제17항에 있어서, SEQ ID NO: 1-4, 9-12 및 17-18로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  31. 제17항에 있어서, 결합 단백질이 화학요법제와 컨쥬게이션되는, 결합 단백질.
  32. 제31항에 있어서, 화학요법제가 아나스트로졸(Anastrozole), 엑세메스탄(Exemestane), 레트로졸(Letrozole), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(Ribociclib), 네라티닙(Neratinib), 아베마시클립(Abemaciclib), 올라파립(Olaparib), 레고라페닙(Regorafenib), 트레티노인(TretiNOin), 악시캅타젠 실로류셀(axicabtagene ciloleucel), 다사티닙(Dasatinib), 닐로티닙(Nilotinib), 보수티닙(Bosutinib), 이브루티닙(Ibrutinib), 이델라리십(Idelalisib), 베네토클락스(Venetoclax), 포나티닙(Ponatinib), 미도스타우린(Midostaurin), 에나시데닙(Enasidenib), 티사젠렉류셀(Tisagenlecleucel), 이보시데니(Ivosideni), 두벨리십(Duvelisib), 이마티닙(Imatinib), 제피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 소라페닙(Sorafenib), 아비라테론(Abiraterone), 크리토지닙(Critozinib), 베무라페닙(Vemurafenib), 방사성 동위원소 예컨대, 111In 및 90Y, 독소, 예컨대 오리스타틴(auristatin), 마이탄시노이드(maytansiNOid), 독소루비신(doxorubicin), 탁솔(taxol), 시스플라틴(cisplatin), 빈블라스틴(vinblastine), 칼리체아미신(calicheamicin), 및 슈도모나스 엑소톡신 A(Pseudomonas exotoxin A)로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 단백질.
  33. 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포(CAR-T 세포)를 생성하기 위한 방법으로서,
    (a) 항-GASP-1 단일-사슬 가변 단편(항-GASP-1 scFv)을 포함하는 CAR을 인코딩하는 유전자를 T 세포에 도입시키는 단계,
    (b) T 세포에 의해 항-GASP-1 scFv를 발현하는 단계, 및
    (c) 항-GASP-1 scFv를 발현하는 T 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-GASP-1 scFv가 SEQ ID NO: 36 및 43으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  35. 면역원으로서의 GASP-1 펩티드로 숙주를 면역화시키는 것을 포함하는, 항-GASP-1 항체를 생성하기 위한 방법.
  36. 제35항에 있어서, GASP-1 펩티드가 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  37. 이중-특이적 결합 단백질을 생성하기 위한 방법으로서, 제16항의 결합 단백질을 추가의 인간화된 항체와 조합하여 인간화된 항체보다 우수한 면역요법 특이성 및/또는 효능을 갖는 이중-특이적 결합 단백질을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 결합 단백질이 인간화된 GASP-1 항체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 추가의 인간화된 항체가 리툭시맙(Rituximab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 에팔리주맙(Efalizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 벨리무맙(Belimumab), 오비누투주맙(Obinutuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 베돌리주맙(Vedolizumab), 라무시루맙(Ramucirumab), 에볼로쿠맙(Evolocumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 레슬리주맙(Reslizumab), 네시투무맙(Necitumumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 두르발루맙(Durvalumab), 보르테조밉(Bortezomib), 엘로투주맙(Elotuzumab), 아벨루맙(Avelumab), 세미플리맙(Cemiplimab) 및 올라라투맙(Olaratumab)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 이중-특이적 결합 단백질.
  41. 제17항 내지 제32항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제40항의 이중-특이적 결합 단백질, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  42. GASP-1-매개된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 GASP-1-매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법으로서, 유효량의 제41항의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, GASP-1 매개된 질환 또는 장애가 종양인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 종양이 고형 종양인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 종양이 혈액 종양인, 방법.
  46. 제42항에 있어서, GASP-1 매개된 질환 또는 장애가 암인, 방법.
  47. 제42항에 있어서, 대상체가 암 치료를 받았던 대상체인, 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, GASP-1이 대상체의 세포의 과립에서 발현되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 과립이 세포의 표면 상에 또는 세포질에 존재하는, 방법.
  50. GASP-1을 발현하는 세포의 성장을 억제하기 위한 방법으로서, 유효량의 제41항의 약학적 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 세포가 암 세포인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 세포가 암을 갖는 환자에 존재하는, 방법.
  53. GASP-1을 발현하는 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀을 비활성화시키기 위한 방법으로서, 유효량의 제41항의 약학적 조성물을 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀이 암을 갖는 대상체에 존재하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 엑소좀, 미세소포 또는 온코좀이 대상체의 순환 혈액(blood circulation)에 존재하는, 방법.
  56. 제46항, 제52항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 결장암, 자궁내막 암종, 식도 편평 세포 암종, 신경아교종, 두부암, 간세포 암종, 침윤성 유관 유방 암종, 후두암, 폐암, 흑색종, 난소의 점액성 낭샘암종, 경부암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 소장 악성 간질 종양 및 위 선암종으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  57. 제46항, 제52항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 결장암, 아교모세포종, 간암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암 및 전립선암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 유방암이 고등급 유관 제자리 암종(DCIS) 유방암 또는 삼중 음성 유방암인, 방법.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 폐암이 비소세포 폐암(NSCLC)인, 방법.
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