ES2703133T3 - Métodos y composiciones para determinar insuficiencia cardiaca o un riesgo de insuficiencia cardiaca - Google Patents

Abstract

Un metodo in vitro de diagnostico de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca cronica en un sujeto, comprendiendo el metodo: determinar el perfil de expresion de las secuencias de micro-ARN en una muestra de suero previamente obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dichas secuencias de micro-ARN la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma; y comparar dicho perfil de expresion con un perfil de expresion de referencia, en el que un nivel de expresion relativamente alto de la secuencia de micro-ARN que comprende la SEQ ID NO: 13 o que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma en el perfil de expresion determinado en la muestra de suero, en comparacion con dicho perfil de expresion de referencia, es diagnostico de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca cronica.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para determinar insuficiencia cardiaca o un riesgo de insuficiencia cardiaca

Campo de la invención

La invención se refiere en general a moléculas de microARN asociadas con insuficiencia cardiaca, así como a métodos de diagnóstico de insuficiencia cardiaca crónica.

Antecedentes de la invención

La insuficiencia cardiaca es un estado fisiopatológico en que el corazón no puede bombear suficiente sangre para cumplir las necesidades de nutrición y oxígeno de los tejidos o de las células metabolizantes. Es una complicación principal en muchas cardiopatías. Los adultos de más de 40 de edad tienen un riesgo durante su vida de desarrollar insuficiencia cardiaca estimado en un 21 % (Lloyd-Jones et al., 2002, Circulation 106, 3068- 72), una afección que es responsable de más hospitalizaciones que todas las formas de cáncer combinadas (American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics 2003 Update).

La investigación realizada en el transcurso de los últimos años demostró que el control transcripcional y la expresión génica cardiaca parece desempeñar una función importante en la patogenia y las manifestaciones clínicas de la insuficiencia cardiaca (HF) (Li et al., 2011, Cardiovasc Res. (6):498-512).

Específicamente, los estudios precios demostraron la regulación por disminución del ARN mensajero (ARNm) en pacientes con HF, lo que sugiere la importancia de los mecanismos moleculares que suprimen los niveles en estado constante de ARNm (Kaab et al., 2004, J Mol Med. 82: 308-316).

En los últimos años, los microARN (miARN, miR) han surgido como una clase novedosa importante de ARN regulador, que tiene un profundo impacto sobre una amplia serie de procesos biológicos.

Estas moléculas de ARN no codificantes pequeñas (normalmente de 17-24 nucleótidos de longitud) pueden modular los patrones de expresión de proteínas promoviendo la degradación del ARN, inhibiendo la traducción del ARNm y también afectando la transcripción génica. Los miR desempeñan funciones centrales en diversos procesos tales como el desarrollo y la diferenciación, el control de la proliferación celular, la respuesta a sobrecarga y el metabolismo. Se encontró que la expresión de muchos miR estaba alterada en numerosos tipos de cáncer humano, y en algunos casos se han aducido fuertes evidencias de la conjetura de que dichas alteraciones pueden desempeñar una función causante en la progresión del tumor. Actualmente hay aproximadamente 1223 miR humanos conocidos.

Los datos recientes indican que los miR también están asociados a cardiopatía, incluida HF, y eran incluso más sensibles que los ARNm al estado funcional agudo de insuficiencia cardiaca en fase final (Thum et al., 2007, Circulation. 116: 258-267; Matkovich et al., 2009, Circulation. 119(9): 1263-1271).

Los tratamientos actuales para insuficiencia cardiaca incluyen métodos farmacológicos, dispositivos tales como el dispositivo de asistencia ventricular (VAD), tratamiento de resincronización cardiaca (CRT), desfibrilador cardioversor implantable (ICD) que es una pequeña batería y trasplante de corazón. Las estrategias farmacológicas incluyen, aunque sin limitación, el uso de agentes inotrópicos (es decir, compuestos que aumentan la capacidad de contractilidad cardiaca), bloqueante neurohumorales (por ejemplo, beta bloqueantes, inhibidores de la enzima conversora de angiotensina), antagonistas de aldosterona, diuréticos y vasodilatadores. Sin embargo, ninguno de estos agentes es completamente eficaz en solitario o en combinación. La disponibilidad de trasplantes es muy limitada, y como muchos individuos que padecen insuficiencia cardiaca están en mal estado de salud, frecuentemente no son buenos candidatos quirúrgicos. Por estas razones, la insuficiencia cardiaca sigue siendo una causa principal de morbilidad y mortalidad, particularmente en el mundo desarrollado. Además, puede ser difícil determinar la etiología precisa de la insuficiencia cardiaca, un factor que impide el desarrollo de tratamientos más específicos. Hay una ausencia general de técnicas de diagnóstico a nivel molecular. Por tanto, hay una necesidad en la técnica del descubrimiento de marcadores de diagnóstico en circulación que reflejen de forma más precisa la predisposición genética de un sujeto a desarrollar HF.

Sumario de la invención

La presente solicitud divulga el descubrimiento de un panel de miR cuyos niveles están aumentados o disminuidos en la circulación de pacientes con HF sistólica crónica. Por consiguiente, se cribó un amplio panel de miR en el suero de pacientes con h F sistólica crónica estables y los resultados se compararon con un grupo de control con coincidencia en edad, género y etnia. Se encontró que una puntuación basada en los niveles de los miR detectados en suero sugiere pacientes con HF y se correlaciona con otros marcadores clínicos de pronóstico conocidos en el grupo de HF.

Los ácidos nucleicos en circulación de líquidos corporales ofrecen oportunidades únicas para el diagnóstico prematuro del riesgo de HF. La presente solicitud divulga secuencias de ácido nucleico específicas para su uso en la identificación, detección prematura y diagnóstico de HF. Las secuencias de ácido nucleico también pueden usarse como marcadores de pronóstico para la evaluación pronóstica de un sujeto basándose en su patrón de expresión en una muestra biológica. La solicitud divulga además un método de detección o predisposición prematura mínimamente invasiva de HF.

La presente invención proporciona un método de diagnóstico del riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica en un sujeto, comprendiendo el método: determinar el perfil de expresión de secuencias de microARN en una muestra de suero previamente obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dichas secuencias de microARN la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma; y comparar dicho perfil de expresión con un perfil de expresión de referencia en el que un nivel relativamente alto de expresión de la secuencia de microARN que comprende la SEQ ID NO: 13 o que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma en el perfil de expresión determinado en la muestra de suero, en comparación con dicho perfil de expresión de referencia, es diagnóstico de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica.

De acuerdo con una realización, el perfil de expresión determinado comprende además el nivel de expresión de al menos una secuencia de microARN seleccionada de las SEQ ID NO: 1-12, 14-48 y 94-146, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas.

En una realización adicional, los niveles de expresión relativamente altos de secuencias de microARN seleccionadas de las SEQ ID NO: 1-12, 14-39, 94-97 y 119-122, o secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas, en comparación con el perfil de expresión de referencia, son diagnósticos de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca.

En otra realización, los niveles de expresión relativamente bajos de secuencias de microARN seleccionadas de las SEQ ID NO: 40-48, 98-118, 123-146, o secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas, en comparación con el perfil de expresión de referencia, son diagnósticos de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica.

De acuerdo con algunas realizaciones, dicha muestra biológica se selecciona de líquido corporal, una línea celular y una muestra tisular. De acuerdo con una realización, la muestra de líquido corporal es una muestra de suero. De acuerdo con otra realización, dicha muestra de líquido corporal es una muestra de sangre.

De acuerdo con algunas realizaciones, el método comprende determinar la expresión de al menos dos secuencias de ácido nucleico. De acuerdo con algunas realizaciones, el método comprende además combinar una o más relaciones de expresión.

De acuerdo con algunas realizaciones, los niveles de expresión se determinan por hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos o una combinación de las mismas. De acuerdo con algunas realizaciones, el método de amplificación de ácidos nucleicos es PCR en tiempo real (RT-PCR). De acuerdo con una realización, dicha PCR en tiempo real es PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR).

De acuerdo con algunas realizaciones, el método de RT-PCR comprende cebadores directos e inversos, en el que el cebador directo comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 49-66, 86-89, 147­ 171, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas. De acuerdo con algunas realizaciones, el método de PCR en tiempo real comprende además hibridación con una sonda.

De acuerdo con algunas realizaciones, la sonda puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 1-48, 94-146; un fragmento de las mismas y secuencias al menos aproximadamente un 80 % idénticas a las mismas.

De acuerdo con otras realizaciones, la sonda puede comprender una secuencia seleccionada de una cualquiera de las SEQ ID NO: 67-84, 90-93, 172-196; un fragmento de las mismas y una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas.

La solicitud divulga además un kit para evaluar la insuficiencia cardiaca en un sujeto; dicho kit comprende una sonda que comprende una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-48, 94-146; un fragmento de las mismas y secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas. De acuerdo con algunas realizaciones, dicha sonda comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 67-84, 90-93, 172-196; un fragmento de las mismas y secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas. De acuerdo con otras realizaciones, el kit comprende además un cebador directo que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las 49-66, 86-89, 147-171; un fragmento de las mismas y secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas. De acuerdo con otras realizaciones, el kit comprende además un cebador inverso que comprende la SEQ ID NO: 85, un fragmento de la misma y secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma.

Estas y otras realizaciones de la presente invención llegarán a ser evidentes junto con las figuras, descripción y reivindicaciones siguientes.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1D son presentaciones de gráficas de caja que comparan las distribuciones de la presencia de microARN estadísticamente significativos regulados por aumento ejemplificados: hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 13) (lA), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 1) (IB), hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14) (1C) y hsa- miR-92b (SEQ ID NO: 15) (ID), en muestras de suero obtenidas del grupo de HF (I) o sujetos sanos (II). Los resultados se basan en PCR en tiempo real, y una señal normalizada mayor indica cantidades mayores de microARN presentes en las muestras. Las gráficas de caja muestran el promedio (línea horizontal), el percentil 25 a 35 (recuadro), alcance de los datos hasta 1,5 veces el intervalo intercuartílico ("bigotes") y valores atípicos (cruces).

Las figuras 2A-2D son presentaciones de gráficas de caja que comparan las distribuciones de la expresión (eje de ordenadas) de microARN estadísticamente significativos regulados por disminución ejemplificada: hsa-miR-26a (SEQ ID NO: 40) (2A), hsa-miR-199b-5p (SEQ ID NO: 42) (2B), hsa-miR-33a (SEQ ID NO: 41) (2C) y hsa-miR-27b (SEQ ID NO: 43) (2D), en muestras de suero obtenidas del grupo de HF (I) o sujetos sanos (II). Los resultados se basan en PCR en tiempo real, y una señal normalizada mayor indica cantidades mayores de microARN presentes en las muestras.

Las gráficas de caja muestran el promedio (línea horizontal), el percentil 25 a 75 (recuadro), alcance de los datos hasta 1,5 veces el intervalo intercuartílico ("bigotes") y valores atípicos (cruces).

La figura 3 es un diagrama de puntos que muestra que la puntuación de miR (eje de ordenadas) se separa significativamente entre el grupo de HF (I) y el grupo de control (II). La puntuación de miR se calculó para cada muestra como la señal media normalizada-invertida de hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 13), hsa- miR-320a (SEQ ID NO: 1), hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14) y hsa-miR-92b (SEQ ID NO: 15) y ajustada restando una constante (la puntuación mínima) de modo que el intervalo de puntuaciones empieza en 0.

Las líneas horizontales indican los valores promedio que son 2,9 en el grupo de HF y 1,3 en el grupo de control. El valor p para el ensayo de la t de muestras no emparejadas bilateral es 0,0000001.

La figura 4 es una curva de rendimiento diagnóstico (ROC) para la discriminación de la puntuación de miR entre los grupos de HF y de control. La curva ROC representa la sensibilidad (eje de ordenadas) frente a la tasa de positivos falsos (uno menos la especificidad (eje de abscisas) para diferentes valores de corte de una métrica de diagnóstico, y es una medida del rendimiento de clasificación. El área bajo la curva ROC (AUC) puede usarse para evaluar el rendimiento diagnóstico de la métrica. Un clasificador aleatorio tiene AUC = 0,5, y un clasificador óptimo con sensibilidad y especificidad perfectas de un 100 % tiene AUC = 1. La curva ROC correspondiente tiene AUC = 0,90.

La figura 5 es un diagrama que demuestra la correlación significativa entre las puntuaciones de miR dentro del grupo de HF (eje de ordenadas) y los niveles elevados de péptido natriurético cerebral (BNP) en suero (eje de abscisas). Los niveles de BNP para pacientes en el grupo de HF se presentan en escala logarítmica. La correlación de Spearman de los niveles de BNP respecto a la puntuación de miARN es 0,63 (p = 0,003).

La figura 6 es un diagrama de puntos que demuestra la asociación significativa entre las puntuaciones de miR (eje de ordenadas) y los niveles de péptido natriurético cerebral (BNP) en suero (eje de abscisas). Las puntuaciones de miR se compararon entre muestras de pacientes con HF cuyos valores para el parámetro estaban en la mitad superior respecto a las muestras cuyos valores estaban en la mitad inferior. Niveles de BNP elevados se asocian con una puntuación de miARN alta, valor p = 0,002.

La figura 7 es un diagrama de puntos que demuestra la asociación significativa entre las puntuaciones de miR (eje de ordenadas) y QRS ancho (eje de abscisas). Valor p = 0,009.

La figura 8 es un diagrama de puntos que demuestra la asociación significativa entre las puntuaciones de miR (eje de ordenadas) y la dimensión diastólica final del ventrículo izquierdo (EDD) (eje de abscisas). Un diámetro diastólico final elevado (EDD) está asociado con una puntuación de miARN alta (p = 0,03).

La figura 9 es un diagrama de puntos que demuestra la asociación significativa entre las puntuaciones de miR (eje de ordenadas) y la dimensión de la aurícula izquierda (LAD) (eje de abscisas). Un LAD elevada está asociada con una elevada puntuación de miARN (p = 0,01).

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en parte en el descubrimiento de que secuencias biomarcadoras específicas (SEQ ID NO: 1-48, 94-146) pueden usarse para la identificación, detección prematura, diagnóstico y pronóstico de insuficiencia cardiaca crónica.

Los biomarcadores tienen el potencial de revolucionar el diagnóstico y el tratamiento de diversas afecciones médicas. De forma ideal, los biomarcadores deben muestrearse de una manera mínimamente invasiva. Por lo tanto, el reto de diversos campos de investigación biomédica ha sido identificar biomarcadores en líquidos corporales, tal como suero o sangre. En los últimos años, a quedado claro que hay tanto ADN como ARNm son células presentes en el suero, así como en otros líquidos corporales, y representan biomarcadores potenciales. Sin embargo, el control de las cantidades normalmente pequeñas de estos ácidos nucleicos en los líquidos corporales requiere métodos de detección sensibles, que no son actualmente aplicables clínicamente.

La presente invención proporciona un método sensible, específico y preciso que puede usarse para realizar en una detección prematura mínimamente invasiva, el diagnóstico y el pronóstico de insuficiencia cardiaca crónica. Los métodos de la presente invención tienen alta sensibilidad y especificidad.

Sorprendentemente, el método anterior permite un ensayo mínimamente invasivo simple, para una fácil detección de cardiopatía crónica en una fase muy temprana con mayor fiabilidad y eficacia, ahorro de tiempo, material y etapas de funcionamiento, así como ahorro de costes y agentes químicos refinados difíciles de obtener.

Además, el método de acuerdo con la invención combina las ventajas de una fácil recogida de muestra y la opción de diagnosticar insuficiencia cardiaca crónica en una fase temprana. Siendo un método mínimamente invasivo, en que, por ejemplo, se suministra una muestra de suero, el método tiene un buen potencial de conseguir una alta aceptación entre los sujetos, pudiendo ser dichos sujetos seres humanos o animales, por ejemplo. Por lo tanto, el método puede usarse en ensayos rutinarios, pero también en exámenes médicos profilácticos.

Además, la presente solicitud divulga métodos para determinar un plan de tratamiento. Una vez que el profesional sanitario conoce clase de enfermedad a la que pertenece la muestra y, por lo tanto, el individuo, el profesional sanitario puede determinar un plan de tratamiento adecuado para el individuo. Por ejemplo, diferentes clases de cardiopatías a menudo requieren diferentes tratamientos. Como se describe en este documento, los individuos que tienen un tipo particular o clase de cardiopatía pueden beneficiarse de un ciclo diferente de tratamiento, que un individuo que tiene un tipo diferente o clase de cardiopatía. El diagnóstico y comprensión apropiados de la clase de cardiopatía de un individuo permite un mejor tratamiento y pronóstico más satisfactorio.

Definiciones

Antes de divulgar y describir las presentes composiciones y métodos, debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante. Debe apreciarse que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "uno", "una" y "el", "la" incluyen referencias en plural salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

Para recitar intervalos numéricos en este documento, cada número intermedio entre medias con el mismo grado de precisión se contempla explícitamente. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, los números 7 y 8 se contemplan además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, el número 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0 se contemplan explícitamente.

Aproximadamente

Como se usa en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a ±10 %.

Antisentido

El término "antisentido", como se usa en este documento, se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. La expresión "hebra de antisentido" se usa en referencia a una hebra de ácido nucleico que es complementaria a la hebra "codificante". Las moléculas de antisentido pueden producirse por cualquier método, incluyendo síntesis por ligamiento del gen o genes de interés en una orientación inversa a un promotor vírico que permite la síntesis de una hebra complementaria. Una vez introducida en una célula, esta hebra transcrita combina con secuencias naturales producidas por la célula para formar dúplex. Estos dúplex entonces bloquean la transcripción o la traducción adicional. De esta manera, pueden generarse fenotipos mutantes.

Adherido

"Adherido" o "inmovilizado", como se usa en este documento, se refiere a una sonda y un soporte sólido y puede indicar que la unión entre la sonda y el soporte solido es suficiente para que sea estable en condiciones de unión, lavado, análisis y eliminación. La unión puede ser covalente o no covalente. Pueden formarse enlaces covalentes directamente entre la sonda y el soporte sólido o pueden formarse por un reticulante o mediante la inclusión de un grupo reactivo específico en el soporte sólido o la sonda, o ambos. La unión no covalente puede ser una o más de interacciones electrostáticas, hidrófilas e hidrófobas. Se incluye en la unión no covalente la adhesión covalente de una molécula, tal como estreptavidina, al soporte y la unión no covalente de una sonda biotinilada a la estreptavidina. La inmovilización también puede implicar una combinación de interacciones covalentes y no covalentes.

Muestra biológica

"Muestra biológica", como se usa en este documento, significa una muestra de tejido o líquido biológico que comprende ácidos nucleicos. Dichas muestras incluyen, aunque sin limitación, tejido o líquido aislado de sujetos. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como muestras de biopsia y autopsia, muestras FFPE, secciones congeladas recogidas con fines histológicos, sangre, plasma, suero, esputo, heces, lágrimas, moco, cabello y piel. Las muestras biológicas también incluyen explantes y cultivos celulares primarios y/o transformados derivados de tejidos animales o del paciente.

Las muestras biológicas también pueden ser sangre, una fracción sanguínea, orina, fusiones, líquido ascítico, saliva, líquido cefalorraquídeo, secreciones cervicales, secreciones vaginales, secreciones endometriales, secreciones gastrointestinales, secreciones bronquiales, esputo, línea celular, muestra tisular o secreciones de mama. Una muestra biológica puede proporcionarse retirando una muestra de células de un animal, pero también puede conseguirse usando células aisladas previamente (por ejemplo, aisladas por otra persona, en otro momento y/o con otro fin), o realizando los métodos descritos en este documento in vivo. También pueden usarse tejidos de archivo, tales como los que tienen un historial de tratamiento o de resultados.

Clasificación

"Clasificación", como se usa en este documento, se refiere a un procedimiento y/o algoritmo en que artículos individuales se colocan en grupos o clases basándose en la información cuantitativa sobre una o más características inherentes en los artículos (mencionados como rasgos, variables, caracteres, características, etc.) y basándose en un modelo estadístico y/o un conjunto capacitado de artículos marcados previamente. De acuerdo con una realización, clasificación significa la determinación del tipo de cardiopatía.

Complemento

"Complemento" o "complementario", como se usa en este documento, significa emparejamiento de bases de Watson-Crick (por ejemplo, A-T/U y C-G) o de Hoogsteen entre nucleótidos o análogos nucleotídicos de moléculas de ácido nucleico. Un complemento completo o complementariedad completa puede indicar un emparejamiento de bases 100 % complementario entre nucleótidos o análogos nucleotídicos de moléculas de ácido nucleico.

C ^T

Las señales C^t representan el primer ciclo de PCR donde la amplificación cruza un umbral (umbral de ciclo) de fluorescencia. Por consiguiente, valores bajos de C^t representan alta abundancia o niveles de expresión del microARN.

En algunas realizaciones, la señal C^t de PCR se normaliza de modo que la C^t normalizada permanece invertida a partir del nivel de expresión. En otras realizaciones, la señal C^t de PCR puede normalizarse y después invertirse de modo que un C^t invertido normalizado bajo representa baja abundancia o niveles de expresión del microARN.

Detección

"Detección" significa detectar la presencia de un componente en una muestra. Detección también significa detectar la ausencia de un componente. Detección también significa medir el nivel de un componente, cuantitativa o cualitativamente.

Expresión diferencial

"Expresión diferencial" significa diferencias cualitativas o cuantitativas en los patrones temporales y/o celulares de expresión génica dentro y entre células y el tejido. Por tanto, un gen expresado de forma diferencial puede tener cualitativamente su expresión alterada, incluyendo una activación o inactivación en, por ejemplo, tejido normal frente a enfermo. Los genes pueden activarse o desactivarse en un estado particular, respecto a otro estado, permitiendo de este modo la comparación de dos o más estados. Un gen regulado cualitativamente puede mostrar un patrón de expresión dentro de un estado o tipo celular que puede ser detectable por técnicas convencionales. Algunos genes pueden expresarse en un estado tipo celular, pero no en ambos. Como alternativa, la diferencia en la expresión puede ser cuantitativa, por ejemplo, en que la expresión está modulada, regulada por aumento, que provoca una cantidad aumentada de transcrito, o regulada por disminución, que provoca una cantidad disminuida de transcrito. El grado al que difiere la expresión únicamente tiene que ser suficientemente grande para cuantificarse mediante técnicas convencionales de caracterización tales como matrices de expresión, PCR con transcriptasa inversa cuantitativa, análisis de Northern, PCR en tiempo real, hibridación in situ y protección de RNasa.

Perfil de expresión

La expresión "perfil de expresión" se usa ampliamente para incluir un perfil de expresión genómica, por ejemplo, un perfil de expresión de microARN. Los perfiles pueden generarse por cualquier medio conveniente para determinar un nivel de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, hibridación cuantitativa de microARN, microARN marcado, microARN amplificado, ADNc, etc., PCR cuantitativa, ELISA para cuantificación y similares, y permite el análisis de la expresión génica diferencial entre dos muestras. Se ensaya una muestra de tumor de un sujeto o paciente, por ejemplo, células o colecciones de las mismas, por ejemplo, tejidos. Las muestras se recogen por cualquier método conveniente, conocido en la técnica. Las secuencias de ácido nucleico de interés son secuencias de ácido nucleico que se encuentra que son predictivas, incluyendo las secuencias de ácido nucleico proporcionadas anteriormente, donde el perfil de expresión puede incluir datos de expresión de 5, 10, 20, 25, 50, 100 o más, incluyendo todas las secuencias de ácido nucleico enumeradas. De acuerdo con algunas realizaciones, la expresión "perfil de expresión" significa medir la abundancia de las secuencias de ácido nucleico en las muestras medidas.

Relación de expresión

"Relación de expresión", como se usa en este documento, se refiere a niveles de expresión relativa de dos o más ácidos nucleicos determinados detectando los niveles de expresión relativa de los ácidos nucleicos correspondientes en una muestra biológica.

FDR

Cuando se realizan múltiples ensayos estadísticos, por ejemplo, en la comparación de la señal entre dos grupos en múltiples características de datos, hay una probabilidad cada más alta de obtener resultados positivos falsos, por diferencias aleatorias entre los grupos que pueden alcanzar niveles que de lo contrario se considerarían estadísticamente significativos. Para limitar la proporción de dichos descubrimientos falsos, se define la significación estadística únicamente para características de datos en que las diferencias alcanzaban un valor p (por ensayo de la t bilateral) por debajo de un umbral, que depende de la cantidad de ensayos realizados y la distribución de los valoresp obtenidos en estos ensayos.

Fragmento

"Fragmento" se usa en este documento para indicar una parte que no es de longitud completa de un ácido nucleico o polipéptido. Por tanto, un fragmento es sí mismo también un ácido nucleico o polipéptido, respectivamente.

Gen

"Gen", como se usa en este documento, puede ser un gen natural (por ejemplo, genómico) o sintético que comprende secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3'). La región codificante de un gen puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos o un ARN funcional, tal como ARNt, ARNr, ARN catalítico, ARNip, miARN o ARN de antisentido. Un gen también puede ser un ARNm o ADNc correspondiente a las regiones codificantes (por ejemplo, exones y miARN) que comprenden opcionalmente secuencias no traducidas 5' o 3' unidas a las mismas. Un gen también puede ser una molécula de ácido nucleico amplificada producida in vitro que comprende todo o una parte de la región codificante y/o secuencias no traducidas 5' o 3' unidas a la misma.

Agente de unión al surco/agente de unión al surco menor (MGB)

"Agente de unión al surco" y/o "agente de unión al surco menor" pueden usarse indistintamente y se refieren a moléculas pequeñas que se ajustan en el surco menor del ADN bicatenario, normalmente de una manera específica de secuencia. Los agentes de unión al surco menor pueden ser moléculas planas y largas que pueden adoptar una forma de tipo media luna y, por tanto, se ajustan exactamente en el surco menor de una doble hélice, a menudo desplazando el agua. Las moléculas de unión al surco menor normalmente pueden comprender varios anillos aromáticos conectados por enlaces con libertad de torsión tales como anillos de furano, benceno o pirrol. Los agentes de unión al surco menor pueden ser antibióticos tales como netropsina, distamicina, Berenil, pentamidina y otras diamidinas aromáticas, Hoechst 33258, SN 6999, fármacos antitumorales aureólicos tales como cromomicina y mitranmicina, CC-1065, tripéptido de dihidrociclopirroloindol (DPI3), 1,2-dihidro-(3H)-pirrolo[3,2-e]indol-7-carboxilato (CDPI3) y compuestos relacionados y análogos, incluyendo los descritos en Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2.a ed., Blackburn and Gait, eds., Oxford University Press, 1996, y la solicitud publicada PCT n.° WO 03/078450. El agente de unión al surco menor puede ser un componente de un cebador, una sonda, un complemento de marca de hibridación o combinaciones de los mismos. Los agentes de unión al surco menor pueden aumentar la T^m del cebador o de una sonda a la que están unidos, permitiendo que dichos cebadores o sondas hibriden de forma eficaz a temperaturas mayores.

Cardiopatía

Como se usa en este documento, cardiopatía se refiere a los siguientes ejemplos no limitantes: insuficiencia cardiaca (congestiva); cardiomiopatías, tales como cardiomiopatía isquémica, cardiomiopatía dilatada, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía restrictiva, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía vírica, cardiomiopatía mediada por taquicardia, cardiomiopatía inducida por estrés (takotsubo), cardiomiopatía amiloide, displasia de ventrículo derecho arritmogénica o cardiomiopatías no clasificadas, por ejemplo, falta de compactación del ventrículo izquierdo o fibroelastosis de endocardio; o cardiopatía valvular, tal como estenosis aortica, regurgitación aortica, estenosis mitral, regurgitación mitral, prolapso mitral, estenosis pulmonar, regurgitación pulmonar, estenosis tricúspide o regurgitación tricúspide.

Insuficiencia cardiaca

Como se usa en este documento, la expresión "insuficiencia cardiaca" se refiere ampliamente a cualquier afección que reduzca la capacidad del corazón de bombear sangre o bombear sangre con presiones de llenado elevadas. Como resultado, se desarrolla congestión y edema en los tejidos. Muy frecuentemente, la insuficiencia cardiaca está causada por capacidad disminuida de contracción del miocardio, como resultado de un flujo de sangre coronaria reducido; sin embargo, muchos otros factores pueden provocar insuficiencia cardiaca, incluyendo daño a las válvulas cardiaca, deficiencia de vitaminas y enfermedad primaria del músculo cardiaco.

De acuerdo con algunas realizaciones, dicha insuficiencia cardiaca se refiere a insuficiencia cardiaca con función sistólica conservada (HFPSF).

Identidad

"Idéntico" o "identidad", como se usan en este documento en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, significa que las secuencias tienen un porcentaje especificado de restos que son iguales sobre una región especificada. El porcentaje puede calcularse alineando de forma óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias sobre la región especificada, determinando la cantidad de posiciones en que existe un resto idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. En casos donde las dos secuencias son de longitudes diferentes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región especificada de comparación incluye únicamente una sola secuencia, los restos de la secuencia única se incluyen en el denominador, pero no el numerador del cálculo. Cuando se compara ADN y ARN, la timina (T) y el uracilo (U) pueden considerarse equivalentes. La identidad puede realizarse de forma manual o usando un algoritmo informático de secuencias tales como BLAST o BLAST 2.0.

Detección in situ

"Detección in situ", como se usa en este documento, significa la detección de la expresión o los niveles de expresión en el sitio original que en la presente significa en una muestra tisular tal como biopsia.

Marcador

"Marcador", como se usa en este documento, significa una composición detectable por medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, químico u otro medio físico. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen 32P, tintes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo, como se usa habitualmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y otras entidades que pueden hacerse detectables. Un marcador puede incorporarse en ácidos nucleicos y proteínas en cualquier posición.

Ácido nucleico

"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido", como su usan en este documento, significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente juntos. La representación de una única hebra también define la secuencia de la hebra complementaria. Por tanto, un ácido nucleico también abarca la hebra complementaria de una hebra individual representada. Muchas variantes de un ácido nucleico pueden usarse para el mismo fin como un ácido nucleico dado. Por tanto, un ácido nucleico también abarca ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y complementos de los mismos. Una hebra individual proporciona una sonda que puede hibridar con una secuencia diana en condiciones de hibridación rigurosas. Por tanto, un ácido nucleico también abarca una sonda que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas.

Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o pueden contener partes de secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribo- y ribonucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse por métodos de síntesis química o por métodos recombinantes.

Un ácido nucleico generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque pueden incluirse análogos de ácido nucleico que pueden tener al menos un enlace diferente, por ejemplo, fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato o enlaces O-metilfosforoamidita y cadenas principales y enlaces de ácido péptido nucleico. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las descritas en las patentes de Estados Unidos n.° 5235033 y 5034506. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más nucleótidos que no son de origen natural o están modificados también se incluyen dentro de la definición de ácidos nucleicos. El análogo nucleotídico modificado puede estar ubicado, por ejemplo, en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico. Los ejemplos representativos de análogos nucleotídicos pueden seleccionarse de ribonucleótidos con azúcar o cadena principal modificada. Debe apreciarse, sin embargo, que también los ribonucleótidos con núcleo base modificada, es decir, ribonucleótidos, que contienen una nucleobase que no es de origen natural en lugar de una nucleobase de origen natural tal como uridinas o citidinas modificadas en la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino) propil uridina, 5-bromo uridina; adenosinas y guanosinas modificadas en la posición 8, por ejemplo, 8-bromo guanosina; desazanucleótidos, por ejemplo, 7- desaza-adenosina; nucleótidos O- y N-alquilados, por ejemplo, N6-metil adenosina son adecuados. El grupo 2'-OH- puede remplazarse por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR, NH2, NHR, NR2 o CN, en el que R es alquilo, alquenilo o alquinilo C¹-C⁶, y halo es F, Cl, Br o I. Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos conjugados con colesterol mediante, por ejemplo, un enlace hidroxiprolinol como se describe en Krutzfeldt et al., Nature 438:685-689 (2005) y Soutschek et al., Nature 432:173-178 (2004). Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden hacerse por diversas razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y la semivida de dichas moléculas en entornos fisiológicos, para potenciar la difusión a través de membranas celulares o como sondas en un biochip. La modificación de la cadena principal también puede potenciar la resistencia a la degradación, tal como en el entorno endocítico riguroso de las células. La modificación de la cadena principal también puede reducir la eliminación del ácido nucleico por los hepatocitos, tal como en el hígado. Pueden prepararse mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos; como alternativa, pueden prepararse mezclas de diferentes análogos de ácido nucleico y mezclas de ácidos nucleicos de origen natural y análogos.

Sonda

"Sonda", como se usa en este documento, significa un oligonucleótido que puede unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente mediante emparejamiento de bases complementarias, habitualmente mediante formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Puede haber muchísimos emparejamientos incorrectos de pares de bases que impedirá la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos monocatenarios descritos en este documento. Sin embargo, si la cantidad de mutaciones es tan grande que no se puede producir hibridación incluso en las condiciones de hibridación menor rigurosas, la secuencia no es una secuencia diana complementaria. Una sonda puede ser monocatenaria o parcialmente monocatenaria y parcialmente bicatenaria. El tipo de hebra de la sonda viene dictaminada por la estructura, composición y propiedades de la secuencia diana. Las sondas pueden marcarse directamente o marcarse indirectamente tal como con biotina a la que posteriormente se puede unir un complejo de estreptavidina.

Perfil de expresión de referencia

Como se usa en este documento, la expresión "perfil de expresión de referencia" se refiere a un valor de expresión estándar con el que se comparan los valores medidos para determinar la detección de un sujeto con una cardiopatía. La referencia puede basarse en una puntuación métrica combinada.

Sensibilidad

"Sensibilidad", usada en este documento puede significar una medida estadística de lo bien que un ensayo de clasificación binario identifica correctamente una afección, por ejemplo, la frecuencia con que clasifica correctamente una cardiopatía en el tipo correcto. La sensibilidad para la clase A es la proporción de casos que se determinan perteneciente a la clase "A" por el ensayo de los casos que están en la clase "A", como se determina por algún valor absoluto o de referencia.

Especificidad

"Especificidad" usada en este documento puede significar una medida estadística de lo bien que un ensayo de clasificación binario identifica correctamente una afección, por ejemplo, la frecuencia con que clasifica correctamente una cardiopatía en el tipo correcto. La especificidad para la clase A es la proporción de casos que se determinan pertenecientes a la clase "que no es A" por el ensayo de los casos que están en la clase "que no es A", como se determina por algún valor absoluto o de referencia.

Muestra patrón

Una "muestra patrón" se refiere a una muestra que es representativa de un estado sin enfermedad, particularmente un estado en que está ausente cardiopatía o cualquier otra afección asociada (es decir, un estado saludable). A modo de ejemplo, la muestra patrón puede ser una muestra biológica, obtenida de un sujeto sano de edad similar que el sujeto del que se proporciona diagnóstico o pronóstico. Una muestra patrón puede ser una muestra compuesta, en la los datos obtenidos de las muestras biológicas de varios sujetos sanos (es decir, sujetos de control que tienen síntomas de insuficiencia cardiaca) están promediados, creando de ese modo la muestra compuesta.

Condiciones de hibridación rigurosas

"Condiciones de hibridación rigurosas", como se usa en este documento, significa condiciones en las que una primera secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, sonda) hibridará con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, diana), tal como en una mezcla compleja de ácidos nucleicos. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las condiciones rigurosas pueden seleccionarse para que sean aproximadamente 5-10 °C inferiores a los puntos de fusión térmico (T^m) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definida. La T^m puede ser la temperatura (a fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos) a la que un 50 % de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (como las secuencias dianas están presentes en exceso, a T^m, un 50 % de las sondas están ocupadas en equilibrio).

Las condiciones rigurosas pueden ser aquellas en que la concentración salina es de menos de aproximadamente 1,0 M de iones sodio, tal como aproximadamente 0,01-1,0 M de concentración de iones sodio (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10-50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, de más de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo incluyen las siguientes: formamida al 50 %, SSC 5x y SDS al 1 %, incubación a 42 °C o SSC 5x, SDS al 1 %, incubación a 65 °C, con lavado en SSC 0,2x y SDS al 0,1 % a 65 °C.

Sustancialmente complementario

"Sustancialmente complementario", como se usa en este documento, significa que una primera secuencia es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica al complemento de una segunda secuencia sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos, o que las dos secuencias hibridan en condiciones de hibridación rigurosas.

Sustancialmente idéntico

"Sustancialmente idéntico", como se usa en este documento, significa que una primera y una segunda secuencia son al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complemento de la segunda secuencia.

Sujeto

Como se usa en este documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero, incluyendo tanto seres humanos como otros mamíferos. Los métodos de la presente invención se aplican preferiblemente a sujetos humanos.

Ácido nucleico diana

"Ácido nucleico diana", como se usa en este documento, significa un ácido nucleico o variante del mismo que puede unirse por otro ácido nucleico. Un ácido nucleico diana puede ser una secuencia de ADN. El ácido nucleico diana puede ser ARN. El ácido nucleico diana puede comprender un ARNm, ARNt, ARNhc, ARNip o ARN que interactúa con Piwi, o un pri-miARN, pre-miARN, miARN o anti-miARN.

El ácido nucleico diana puede comprender un sitio de unión a miARN diana o una variante del mismo. Una o más sondas pueden unirse al ácido nucleico diana. El sitio de unión diana puede comprender 5- 100 o 10-60 nucleótidos. El sitio de unión diana puede comprender un total de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30-40, 40-50, 50-60, 61,62 o 63 nucleótidos. La secuencia del sitio diana puede comprender al menos 5 nucleótidos de la secuencia de un sitio de unión a miARN diana divulgado en las patentes de Estados Unidos US 7825229 o US 7642348.

Muestra tisular

Como se usa en este documento, una muestra tisular es tejido obtenido de una biopsia de tejido usando métodos bien conocidos para los expertos en las materias médicas relacionadas. Los métodos para obtener la muestra de la biopsia incluyen reparto burdo de una masa, microdisección, microdisección basada en láser u otros métodos de separación celular conocidos en la técnica.

Variante

"Variante", como se usa en este documento, que se refiere a un ácido nucleico significa (i) una parte de una secuencia de nucleótidos mencionada; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos mencionada o parte de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico mencionado o el complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico mencionado, complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica al mismo.

Tipo silvestre

Como se usa en este documento, la expresión secuencia "de tipo silvestre" se refiere a una secuencia codificante, una no codificante o una de conexión que es una forma alélica de secuencia que realiza la función natural o normal para esa secuencia. Las secuencias de tipo silvestre incluyen múltiples formas alélicas de una secuencia afín, por ejemplo, múltiples alelos de una secuencia de tipo silvestre pueden codifican cambios silenciosos o conservativos para la proteína que codifica una secuencia codificante.

La presente invención emplea miARN para la identificación, clasificación y diagnóstico de cardiopatía.

Procesamiento de microARN

Un gen que codifica un microARN (miARN) puede transcribirse dando lugar a la producción de un miARN precursor conocido como pri-miARN. El pri-miARN puede ser parte de un ARN policistrónico que comprende múltiples primiARN. El pri-miARN puede formar una estructura de horquilla con un tallo y un bucle. El tallo puede comprender bases emparejadas incorrectamente.

La estructura de horquilla del pri-miARN puede reconocerse por Drosha, que es una endonucleasa RNasa III. Drosha puede reconocer bucles terminales en el pri-miARN y escindir aproximadamente dos giros helicoidales en el tallo para producir un precursor de 60-70 nucleótidos conocido como pre-miARN. Drosha puede escindir el pri-miARN con un corte escalonado típico de las endonucleasas RNasa III que produce un pre-miARN de tallo y bucle con un fosfato 5' y un saliente de ~2 nucleótidos 3'. Aproximadamente un giro helicoidal del tallo (~10 nucleótidos) que se extiende más allá del sitio de escisión de Drosha puede ser esencial para el procesamiento eficaz. El pre-miARN después puede transportarse activamente desde el núcleo hasta el citoplasma mediante Ran-GTP y el receptor de exportación Exportina-5.

El pre-miARN puede reconocerse por Dicer, que es también una endonucleasa RNasa III. Dicer puede reconocer el tallo bicatenario del pre-miARN. Dicer también puede reconocer el fosfato 5' y el saliente 3' en la base del tallo y bucle. Dicer puede escindir el bucle terminal a dos giros helicoidales de la base del tallo y bucle dejando un fosfato 5' adicional y un saliente de ~2 nucleótidos 3'. La doble hélice de tipo ARNip resultante, que puede comprender emparejamientos incorrectos, comprende el miARN maduro y un fragmento de tamaño similar conocido como miARN*. El miARN y miARN* pueden obtenerse de brazos opuestos del pri-miARN y pre-miARN. Pueden encontrarse secuencias de miARN* en colecciones de miARN clonados, pero normalmente a menor frecuencia que los miARN.

Aunque está inicialmente presente como una especie bicatenaria con miARN*, el miARN finalmente puede llegar a incorporarse como un ARN monocatenario en un complejo ribonucleoproteínico conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Diversas proteínas pueden formar el RISC, lo que puede dar lugar a variabilidad en la especificidad por dúplex de miARN/miARN*, el sitio de unión del gen diana, la actividad del miARN (represión o activación), y la hebra del dúplex de miARN/miARN* que se carga en el RISC.

Cuando la hebra de miARN del dúplex de miARN:miARN* se carga en el RISC, el miARN* puede retirarse y degradarse. La hebra del dúplex de miARN:miARN* que se carga en el RISC puede ser la hebra cuyo extremo 5' es empareja menos fuertemente. En casos donde ambos extremos del miARN:miARN* tienen emparejamiento 5' casi equivalente, tanto el miARN como el miARN* pueden tener actividad de silenciamiento.

El RISC puede identificar ácidos nucleicos diana basándose en los altos niveles de complementariedad entre el miARN y el ARNm, especialmente en los nucleótidos 2-7 del miARN. Se ha informado únicamente de un caso en animales donde la interacción entre el miARN y su diana era a lo largo de la longitud completa del miARN. Esto se mostró para mir-196 y Hox B8 y se mostró además que mir-196 media la escisión del ARNm de Hox B8 (Yekta et al. 2004, Science 304-594). Por lo demás, dichas interacciones se conocen únicamente en plantas (Bartel y Bartel 2003, Plant Physiol 132-709).

Varios estudios han estudiado el requisito de emparejamiento de bases entre el miARN y su ARNm diana para conseguir la inhibición eficaz de la traducción (revisado por Bartel 2004, Cell 116-281). En células de mamífero, los 8 primeros nucleótidos del miARN pueden ser importantes (Doench y Sharp 2004 GenesDev 2004-504). Sin embargo, otras partes del microARN también pueden participar en la unión del ARNm. Además, un suficiente emparejamiento de bases en el extremo 3' puede compensar el insuficientemente emparejamiento en el extremo 5' (Brennecke et al., 2005 PLoS 3-e85).

Los estudios en ordenador, que analizan la unión del miARN en genomas completos han sugerido una función específica para las bases 2-7 en el extremo 5' del miARN en la unión a la diana, pero también se reconoció la función del primer nucleótido, que habitualmente resulta ser "A" (Lewis et at. 2005 Cell 120-15). Asimismo, los nucleótidos 1­ 7 o 2-8 se usaron para identificar y validar dianas por parte de Krek et al. (2005, Nat Genet 37-495).

Los sitios diana en el ARNm pueden estar en la 5' UTR, la 3' UTR o en la región codificante. De forma interesante, múltiples miARN pueden regular el mismo ARNm diana reconociendo el mismo o múltiples sitios. La presencia de múltiples sitios de unión de miARN en la mayoría de dianas identificadas genéticamente puede indicar que la acción cooperativa de múltiples RISC proporciona la inhibición traduccional más eficaz.

Los miARN pueden dirigir el RISC a regular por disminución la expresión génica mediante cualquiera de dos mecanismos: escisión de ARNm o represión traduccional. El miARN puede escindir específicamente el ARNm si el ARNm tiene un determinado grado de complementariedad con el miARN. Cuando un miARN guía la escisión, el corte puede ser entre los nucleótidos que emparejan los restos 10 y 11 del miARN. Como alternativa, el miARN puede reprimir la traducción si el miARN no tiene el grado necesario de complementariedad con el miARN. La represión traduccional puede ser más predominante en animales, ya que los animales pueden tener un menor grado de complementariedad entre el miARN y el sitio de unión.

Debe apreciarse que puede haber variabilidad en los extremos 5' y 3' de cualquier par de miARN y miARN*. Esta variabilidad se puede deber a variabilidad en el procesamiento enzimático de Drosha y Dicer con respecto al sitio de escisión. La variabilidad en los extremos 5' y 3' de miARN y miARN* también se puede deber a emparejamientos incorrectos en las estructuras de tallo del pri-miARN y el pre-miARN. Los emparejamientos incorrectos de las hebras del tallo pueden dar lugar a una población de diferentes estructuras de horquilla. La variabilidad en las estructuras del tallo también puede dar lugar a variabilidad en los productos de escisión por Drosha y Dicer.

Ácidos nucleicos

En este documento se proporcionan ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos comprenden la secuencia de las SEQ ID NO: 1-196 o variantes de las mismas. La variante puede ser un complemento de la secuencia de nucleótidos mencionada. La variante también puede ser una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos mencionada o el complemento de la misma. La variante también puede ser una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos mencionada, complementos de la misma, o secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a la misma.

El ácido nucleico puede tener una longitud de 10 a 250 nucleótidos. El ácido nucleico puede tener una longitud de al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 o 250 nucleótidos. El ácido nucleico puede sintetizarse o expresarse en una célula (in vitro o in vivo) usando un gen sintético descrito en este documento. El ácido nucleico puede sintetizarse como una molécula monocatenaria e hibridarse con un ácido nucleico sustancialmente complementario para formar un dúplex. El ácido nucleico puede introducirse en una célula, tejido u órgano en una forma mono- o bicatenaria o puede expresarse mediante un gen sintético usando métodos bien conocidos para los expertos en la materia, incluyendo como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6506559.

Tabla 1: L n i i n l i l r n inv n i n

Complejos de ácido nucleico

El ácido nucleico puede comprender además uno o más de los siguientes: un péptido, una proteína, un híbrido de ARN-ADN, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un fragmento Fab y un aptámero.

Pri-miARN

El ácido nucleico puede comprender una secuencia de un pri-miARN o una variante del mismo. La secuencia de primiARN puede comprender de 45-30000, 50-25000, 100-20000, 1000-1500 u 80-100 nucleótidos. La secuencia del pri-miARN puede comprender un pre-miARN, miARN y miARN*, como se expone en este documento, y variantes de los mismos. La secuencia del pri-miARN puede comprender la secuencia de las SEQ ID NO: 1-48, 94-146; o variantes de las mismas.

El pri-miARN puede formar una estructura de horquilla. La horquilla puede comprender una primera y una segunda secuencia de ácido nucleico que son sustancialmente complementarias. La primera y segunda secuencia de ácido nucleico pueden ser de 37-50 nucleótidos. La primera y segunda secuencia de ácido nucleico pueden estar separadas por una tercera secuencia de 8-12 nucleótidos. La estructura de horquilla puede tener una energía libre de menos de -25 kcal/mol, calculada mediante el algoritmo de Vienna, con parámetros por defecto como se describe en Hofacker et al., Monatshefte f Chemie 125: 167-188 (1994). La horquilla puede comprender un bucle terminal de 4-20, 8-12 o 10 nucleótidos. El pri-miARN puede comprender al menos un 19 % de nucleótidos adenosina, al menos un 16 % de nucleótidos citosina, al menos un 23 % de nucleótidos timina y al menos un 19 % de nucleótidos guanina.

Pre-miARN

El ácido nucleico también puede comprender una secuencia de un pre-miARN o una variante de la misma. La secuencia de pre-miARN puede comprender de 45-90, 60-80 o 60-70 nucleótidos. La secuencia del pre-miARN puede comprender un miARN y un miARN* como se expone en este documento. La secuencia del pre-miARN también puede ser la de un pri-miARN excluyendo 0-160 nucleótidos de los extremos 5' y 3' del pri-miARN. La secuencia del premiARN puede comprender la secuencia de las SEQ ID NO: 1-48, 94-146; o variantes de las mismas.

miARN

El ácido nucleico también puede comprender una secuencia de un miARN (incluyendo miARN*) o una variante de la misma. La secuencia de miARN puede comprender de 13-33, 18-24 o 21-23 nucleótidos. El miARN también puede comprender un total de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia del miARN puede ser los primeros 13-33 nucleótidos del pre-miARN. La secuencia del miARN también puede ser los últimos 13-33 nucleótidos del pre-miARN. La secuencia del miARN puede comprender la secuencia de las SEQ ID NO: 1-18, 40-43, 94-115; o variantes de las mismas.

Anti-miARN

El ácido nucleico también puede comprender una secuencia de un anti-miARN que puede bloquear la actividad de un miARN o miARN*, tal como mediante la unión al pri-miARN, pre-miARN, miARN o miARN* (por ejemplo, antisentido o silenciamiento de ARN), o mediante la unión al sitio de unión diana. El anti-miARN puede comprender un total de 5­ 100 o 10-60 nucleótidos. El anti-miARN también puede comprender un total de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia del anti-miARN puede comprender (a) al menos 5 nucleótidos que son sustancialmente idénticos o complementarios al extremo 5' de un miARN y al menos 5-12 nucleótidos que son sustancialmente complementarios a las regiones flanqueantes del sitio diana desde el extremo 5' del miARN, o (b) al menos 5-12 nucleótidos que son sustancialmente idénticos o complementarios al extremo 3' de un miARN y al menos 5 nucleótidos que son sustancialmente complementarios a la región flanqueante del sitio diana desde el extremo 3' del miARN. La secuencia del anti-miARN puede comprender el complemento de las SEQ ID NO: 1-48, 94-146; o variantes de las mismas.

Sitio de unión de diana

El ácido nucleico también puede comprender una secuencia de un sitio de unión de microARN diana o una variante del mismos. La secuencia del sitio diana puede comprender un total de 5-100 o 10-60 nucleótidos. La secuencia del sitio diana también puede comprender un total de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62 o 63 nucleótidos. La secuencia del sitio diana puede comprender al menos 5 nucleótidos de la secuencia de las SEQ ID NO: 1-18, 40-43, 94-115.

Sondas

Se proporciona una sonda en este documento. Una sonda puede comprender un ácido nucleico. La sonda puede tener una longitud de 8 a 500, de 10 a 100 o de 20 a 60 nucleótidos. La sonda también puede tener una longitud de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280 o 300 nucleótidos. La sonda puede comprender un ácido nucleico de 18-25 nucleótidos.

Una sonda puede tener capacidad de unión a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces químicos, habitualmente mediante emparejamiento de bases complementarias, habitualmente mediante formación de enlaces de hidrógeno. Las sondas pueden unirse a secuencias diana que carecen de complementariedad completa con la secuencia de la sonda, dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Una sonda puede ser monocatenaria o parcialmente monocatenaria y parcialmente bicatenaria. El tipo de hebra de la sonda está dictaminado por la estructura, composición y propiedades de la secuencia diana. Las sondas pueden marcarse directamente o marcarse indirectamente.

Sonda de ensayo

La sonda puede ser una sonda de ensayo. La sonda de ensayo puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a un miARN, un miARN*, un pre-miARN o un pri-miARN. La secuencia de la sonda de ensayo puede seleccionarse de las SEQ ID NO: 67-84, 90-93, 172-196; o variantes de las mismas.

Secuencias conectoras

La sonda puede comprender además un conector. El conector puede ser de 10-60 nucleótidos de longitud.

El conector puede ser de be 20-27 nucleótidos de longitud. El conector puede ser de longitud suficiente para permitir que la sonda sea de una longitud total de 45-60 nucleótidos. El conector puede no tener capacidad para formar una estructura secundaria estable, o puede no tener capacidad de plegarse sobre sí mismo, o puede no tener capacidad de plegarse sobre una parte no conectora de un ácido nucleico contenido en la sonda. La secuencia del conector no aparece en el genoma del animal del que se obtiene el ácido nucleico no conector de la sonda.

Transcripción inversa

Pueden generarse secuencias diana de un ADNc por transcripción inversa de un ADN diana. Los métodos para generar ADNc pueden ser la transcripción inversa de un ARN poliadenilado o, como alternativa, ARN con una secuencia adaptadora ligada.

Transcripción inversa usando secuencia adaptadora ligada a ARN

El ARN puede ligarse a una secuencia adaptadora antes de la transcripción inversa. Una reacción de ligamiento puede realizarse mediante la ARN ligasa T4 para ligar una secuencia adaptadora en el extremo 3' del ARN. La reacción de transcripción inversa (RT) puede realizarse después usando un cebador que comprende una secuencia que es complementaria al extremo 3' de la secuencia adaptadora.

Transcripción inversa usando secuencia poliadenilada ligada a ARN

Puede usarse ARN poliadenilado en una reacción de transcripción inversa (RT) usando un cebador de poli(T) que comprende una secuencia adaptadora 5'. La secuencia de poli(T) puede comprender 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 timinas consecutivas.

RT-PCR de ARN

El transcrito inverso del ARN puede amplificarse por PCR en tiempo real, usando un cebador directo específico que comprende al menos 15 ácidos nucleicos complementarios al ácido nucleico diana y una secuencia de cola 5'; un cebador inverso que es complementarios al extremo 3' de la secuencia adaptadora; y una sonda que comprende al menos 8 ácidos nucleicos complementarios al ácido nucleico diana. La sonda puede ser parcialmente complementaria al extremo 5' de la secuencia adaptadora.

PCR de ácidos nucleicos diana

En este documento se describen métodos de amplificación de ácidos nucleicos diana. La amplificación puede ser mediante un método que comprende PCR. Los primeros ciclos de la reacción de PCR pueden tener una temp. de hibridación de 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C o 60 °C. Los primeros ciclos pueden comprender 1-10 ciclos. Los ciclos restantes de la reacción de PCR pueden ser a 60 °C. Los ciclos restantes pueden comprender 2-40 ciclos. La temperatura de hibridación puede causar que la PCR sea más sensible. La PCR puede generar productos más grandes que pueden servir como moldes de PCR de mayor rigurosidad.

Cebador directo

La reacción de PCR puede comprender un cebador directo. El cebador directo puede comprender 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos idénticos al ácido nucleico diana.

El extremo 3' del cebador directo puede ser sensible a diferencias en la secuencia entre un ácido nucleico diana y un ácido nucleico del mismo nivel.

El cebador directo también puede comprender una cola saliente 5'. La cola 5' puede aumentar la temperatura de fusión del cebador directo. La secuencia de la cola 5' puede comprender una secuencia que no es idéntica al genoma del animal del que se aísla el ácido nucleico diana. La secuencia de la cola 5' también puede ser sintética. La cola 5' puede comprender 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos. El cebador directo puede comprender las SEQ ID NO: 49-66, 86-89, 147-171; o variantes de las mismas.

Cebador inverso

La reacción de PCR puede comprender un cebador inverso. El cebador inverso puede ser complementario a un ácido nucleico diana. El cebador inverso también puede comprender una secuencia complementaria a una secuencia adaptadora. La secuencia complementaria a una secuencia adaptadora puede comprender la SEQ ID NO: 85 o variantes de la misma.

Biochip

También se proporciona un biochip. El biochip puede comprender un sustrato sólido que comprende una sonda o pluralidad de sondas adherida descrita en este documento. Las sondas pueden tener la capacidad de hibridar con una secuencia diana en condiciones de hibridación rigurosas. Las sondas pueden adherirse en ubicaciones espacialmente definidas en el sustrato. Puede usarse más de una sonda por secuencia diana, con sondas solapantes o sondas para diferentes secciones de una secuencia diana particular. Las sondas pueden tener la capacidad de hibridar con secuencias diana asociadas con un único trastorno apreciado por los expertos en la materia. Las sondas pueden sintetizarse en primer lugar, con posterior adhesión al biochip, o pueden sintetizarse directamente sobre el biochip.

El sustrato sólido puede ser un material que puede modificarse para que contenga sitios individuales diferenciados apropiados para la adhesión o asociación de las sondas y es susceptible a al menos un método de detección. Los ejemplos representativos de materiales de sustrato incluyen vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plástico (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TeflonJ, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales basados en sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y plástico. Los sustratos pueden permitir la detección óptica sin emitir fluorescencia apreciable.

El sustrato puede ser plano, aunque pueden usarse también otras configuraciones de sustratos. Por ejemplo, las sondas pueden colocarse sobre la superficie interior de un tubo, para el análisis de muestras que fluyen para minimizar el volumen de la muestra. Asimismo, el sustrato puede ser flexible, tal como espuma flexible, incluyendo espumas de celda cerrada hechas de plásticos particulares.

El sustrato del biochip y la sonda pueden derivatizarse con grupos funcionales químicos para la posterior adhesión de los dos. Por ejemplo, el biochip puede derivatizarse con un grupo funcional químico incluyendo, aunque sin limitación, grupos amino, grupos carboxilo, grupos oxo o grupos tiol. Usando estos grupos funcionales, las sondas pueden adherirse usando grupos funcionales en las sondas directa o indirectamente usando un conector.

Las sondas pueden adherirse al soporte sólido mediante el extremo 5', el extremo 3' o mediante un nucleótido interno.

La sonda también puede adherirse al soporte sólido de forma no covalente. Por ejemplo, pueden generarse oligonucleótidos biotinilados, que pueden unirse a superficies recubiertas covalentemente con estreptavidina, provocando la adhesión. Como alternativa, las sondas pueden sintetizarse sobre la superficie usando técnicas tales como fotopolimerización y fotolitografía.

Diagnóstico

También se proporciona un método de diagnóstico. El método comprende detectar un nivel de expresión diferencial de ácidos nucleicos asociados a cardiopatía en una muestra biológica. La muestra puede obtenerse de un paciente. El diagnóstico de la cardiopatía, y su tipo histológico, en un paciente puede permitir el pronóstico y selección de la estrategia terapéutica.

Kits

También se proporciona un kit y puede comprender un ácido nucleico descrito en este documento junto con cualquiera o todos los siguientes: reactivos de ensayo, tampones, sondas y/o cebadores, y solución salina estéril u otra base de emulsión o suspensión farmacéuticamente aceptable. Además, los kits pueden incluir materiales instructivos que contienen directrices (por ejemplo, protocolos) para la práctica de los métodos descritos en este documento.

Por ejemplo, el kit puede usarse para la amplificación, detección, identificación o cuantificación de un ácido nucleico diana. El kit puede comprender un cebador de poli(T), un cebador directo, un cebador inverso y una sonda.

Cualquiera de las composiciones descritas en este documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitante, se incluyen en un kit reactivos para el aislamiento de miARN, marcaje de miARN y/o evaluación de una población de miARN usando una matriz. El kit puede incluir además reactivos para crear o sintetizar sondas de miARN. Los kits, por tanto, comprenderán, en recipientes adecuados, una enzima para marcar el miARN incorporando nucleótidos marcados o nucleótidos no marcados que se marcan posteriormente. También puede incluir uno o más tampones, tal como tampón de reacción, tampón de marcaje, tampón de lavado o un tampón de hibridación, compuestos para preparar las sondas de miARN, componentes para la hibridación in situ y componentes para aislar miARN. Otros kits de la invención pueden incluir componentes para generar una matriz de ácidos nucleicos que comprende miARN y, por tanto, pueden incluir, por ejemplo, un soporte sólido.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente algunas realizaciones de la invención. No deben interpretarse de ninguna manera, sin embargo, como limitantes del amplio alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Métodos

Cohorte de pacientes y de control

Se reclutaron treinta pacientes con HF sistólica, de clase C crónica estable en el la clínica de HF en Lin Medical Center, Haifa Israel. Además, se reclutó otro grupo de control que consistía en 30 voluntarios que eran de edad, género y etnia coincidentes con el grupo de HF. El estudio se aprobó por el Comité de Revisión Institucional (comité de Helsinki) del Lady Davis Carmel Medical Center, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de su inclusión en el estudio y el inicio de cualquier procedimiento relacionado con el estudio. Los criterios de inclusión para el grupo de HF fueron: pacientes de HF sistólica crónica, tratados durante al menos 3 meses de acuerdo con las directrices ACC/AHA, fase C, clínicamente estable a juicio del cardiólogo especializado en HF a cargo en el día del reclutamiento. Los criterios de inclusión para el grupo de control fueron: cualquier enfermedad coronaria, valvular o de miocardio desconocida o sin tratar. Las comorbilidades para arteriopatía coronaria, tales como diabetes mellitus, hipertensión, hiperlipidemia y tabaquismo no impiden el reclutamiento. Los criterios de exclusión para todos los participantes fueron: embarazo, diálisis, neoplasias conocidas o tratadas. Todos los datos clínicamente pertinentes se recogieron en el grupo de HF: pruebas clínicas, ecocardiográficas, electrocardiográficas, analíticas iniciales, así como los datos demográficos pertinentes en el grupo de control.

Las características del grupo de HF y la demográfica de los grupos de HF y de control se muestran en la tabla 2.

T l 2: r rí i l r HF nr l

Según se elaboran; los dos grupos (HF y control) fueron similares respecto a su edad, género, etnia, índice de masa corporal y hábitos de tabaquismo). Los cambios significativos predichos y triviales, que reflejan la naturaleza del grupo de HF frente al de control estaban en los regímenes médicos, los dispositivos antiarrítmicos y la prevalencia de las comorbilidades; incluyendo arteriopatía coronaria, diabetes mellitus e insuficiencia renal crónica.

Aislamiento y almacenamiento de suero

Se recogieron 8 ml de sangre de cada individuo directamente en tubos de recogida de suero (Greiner Bio-one, tubos de suero VACUETTE® 455071). Se permitió que la sangre completa reposara durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente (TA) antes de centrifugarse a 1800 g durante 10 minutos a TA. El suero resultante se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf y se almacenó a -80 °C. Se determinaron los niveles de péptido natriurético cerebral (BNP) para los niveles de BNP en suero simultáneos (Triage MetrPro; BIOSITE, San Diego, CA).

Extracción de ARN

Se incubó suero (100 |jl) durante una noche a 57 °C con 300 |jl de solución de extracción de proteinasa K precalentada como se detalla en la tabla 3:

T l : l i n xr i n r in K

Seguido de la extracción con fenol:cloroformo, se añadió acrilamida lineal (8 |jl). El ARN se precipitó con ETOH a -20 °C y se resuspendió con DDW (43 jl) . A continuación, se realizó tratamiento con DNasa (Ambion) para eliminar los fragmentos de ADN residuales. Finalmente, después de una segunda extracción ácida con fenol:cloroformo, el sedimento se resuspendió en DDW.

Separación del exosoma

La separación del exosoma del suero se realizó usando el kit Exoquick (ExoQuick™ solución de precipitación de exosoma n.° de Cat. EXOQ20A-1, SBI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

qRT-PCR

El ARN se sometió a una reacción de poliadenilación como se describe previamente (Shi, R. y Chiang, V.L. 2005, Biotechniques. 39(4):519-25). En resumen, el ARN se incubó en presencia de poli (A) polimerasa (PAP; NEB-M0276L), MnC12, y ATP durante 1 h a 37 °C. Después, usando un cebador oligo-dT que alberga una secuencia consenso (complementaria al cebador inverso) se realizó transcripción inversa sobre el ARN total usando SuperScript II RT (Invitrogen). A continuación, el ADNc se amplificó por PCR en tiempo real; esta reacción contenía un cebador directo específico de micro-ARN, una sonda TaqMan complementaria al extremo 3' de la secuencia de micro-ARN específica, así como a parte de la secuencia adaptadora de poli-A y un cebador inverso universal complementario a la secuencia 3' consenso de la cola de oligo-dT.

Los controles negativos estudiados junto con las muestras de ARN sirven para detectar contaminaciones potenciales y/o amplificaciones no específicas. El número de ciclos al que la fluorescencia pasa el umbral (umbral de ciclo-Ct) se midió para cada miARN en cada muestra.

Análisis de miARN en suero

Se midieron 380 miARN que se detectaron en experimentos previos realizados por los autores de la presente invención en tejido cardiaco o suero de individuos sanos, en 4 combinaciones creadas a partir de sueros de 6 pacientes con HF y 6 individuos sanos y en un control negativo. De estos miARN, 186 se detectaron de forma fiable en al menos una de las combinaciones, con una diferencia de al menos 3 CT en comparación con el control negativo. Estos 186 miARN se midieron en los sueros de los 60 participantes y 2 controles negativos usando RT-PCR. Los 7 miR para los que el promedio de Ct en las muestras de suero era de menos de 3 Ct inferior al promedio de Ct en los controles negativos se omitieron del análisis y la normalización.

Análisis de datos y estadística

Cada muestra se normalizó restando el promedio de Ct de todos de los miR de la muestra del Ct de cada miR, y añadiendo de nuevo una constante de gradación (el promedio de Ct sobre el conjunto de muestra completo). Las señales normalizadas se compararon entre los grupos para encontrar los miR que pueden usarse para diferenciar entre los grupos. La significación de las diferencias se evaluó por un ensayo de la t para muestras no emparejadas bilateral. Se usó el método de tasa de descubrimiento de falsos de Benjamini-Hochberg (FDR) (Benjamini et al., 1995, J. Roy. Statist. Soc. Ser. B 57 n.° 1,289-300) para controlar el ensayo de múltiples hipótesis, usando un FDR de 0,1. El cambio factorial se calculó como la diferencia absoluta en los valores de promedio del Ct normalizado en los dos grupos.

Para cada miARN, así como para la puntuación de miARN, se caracterizó la capacidad de discriminar entre los grupos de HF y de control por la curva de rendimiento diagnóstico (ROC) y se calculó el área bajo la curva ROC (AUC).

Para las gráficas de caja y el cálculo de la puntuación, se usaron señales normalizadas invertidas de modo que valores altos representan alta expresión. La señal normalizada invertida para cada miR se calcula restando el Ct normalizado de 50.

La validación cruzada dejando uno fuera con un modelo de regresión logística se usó para simular el rendimiento de un algoritmo de clasificación en muestras no observadas. El modelo de regresión logística se volvió a capacitar repetidamente dejando una muestra en cada ronda, y ensayando cada muestra en un clasificador que se capacitó sin la misma. Asociaciones entre la puntuación y las variables clínicas/de pronóstico: Para variables dicotómicas, se usó un ensayo de la t de muestras no emparejadas bilateral para comparar las puntuaciones de los pacientes en los dos grupos. Para variables continuas, se usó un ensayo de la t para muestras no emparejadas bilateral para comparar la puntuación de muestras cuyos valores estaban en la mitad superior de las muestras cuyos valores estaban en la mitad inferior. La correlación entre BNP y la puntuación se midió usando el coeficiente del orden de Spearman ya que la relación no es lineal.

Se usaron ensayos de ji al cuadrado para comparar las variables categóricas. El ensayo exacto de Fisher se usó en casos de tamaños de muestra pequeños.

Ejemplo 2

Los micro-ARN específicos se usan para la detección de HF en muestras de suero

Los niveles de 186 micro-ARN se midieron en todas las muestras de suero y se normalizaron como se describe en la sección de métodos. Las señales para las 30 muestras en el grupo de insuficiencia cardiaca se compararon con las señales de las 30 muestras en el grupo de control. Un total de 47 miR pasó el umbral de FDR de 0,1 (valor p de corte 0,027). De estos, los niveles de promedio de 18 miR en los sueros del grupo de insuficiencia cardiaca estaban por encima de 1,2 veces mayores que los detectados en sueros de controles.

T l 4A: miR r l r m n n l r in fi i n i r i fr n l r nr l

Tabla 4B: miR re ulados por disminución en el rupo de insuficiencia cardiaca frente al rupo de control

______ _____

* AUC indica el área bajo la curva ROC para la discriminación entre el grupo de HF y de control. ** Los valores de promedio también se dan como señales invertidas normalizadas.

T l : n i r n r l i n miR if r n i l

Los estudios recientes sugieren que los micro-ARN en la circulación están protegidos del entorno rico en RNasa por complejos proteínicos o por encapsulación en vesículas tales como exosomas. Para explorar si las diferencias observadas en los niveles de miARN existen en la fracción exosómica, se midieron los niveles de miARN en sueros de 10 pacientes con HF y 10 controles procesados con el kit Exoquick que enriquece la muestra con miARN exosómicos. Las diferencias en los niveles de micro-ARN entre HF y controles en la fracción exosómica fueron similares a los observados en el suero no fraccionado. Específicamente, los cuatro miARN principales con niveles elevados en suero no fraccionado de pacientes con HF también estaban elevados en la fracción exosómica de pacientes con HF respecto a los controles. Sin embargo, no hubo aumento en la fuerza de las diferencias (datos no mostrados).

Los cuatro miARN que tenían los niveles aumentados más significativos (p<0,0005) en sueros de pacientes de HF en comparación con sueros de controles eran: hsa-miR-423-5p, hsa-miR-22, hsa- miR-320a, y hsa-miR-92b. Las gráficas de caja para estos miR se muestran en las figuras 1A.1D.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro de diagnóstico de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica en un sujeto, comprendiendo el método:

determinar el perfil de expresión de las secuencias de micro-ARN en una muestra de suero previamente obtenida de dicho sujeto, comprendiendo dichas secuencias de micro-ARN la SEQ ID NO: 13, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma; y

comparar dicho perfil de expresión con un perfil de expresión de referencia,

en el que un nivel de expresión relativamente alto de la secuencia de micro-ARN que comprende la SEQ ID NO: 13 o que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma en el perfil de expresión determinado en la muestra de suero, en comparación con dicho perfil de expresión de referencia, es diagnóstico de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el perfil de expresión determinado comprende además el nivel de expresión de al menos una secuencia de micro-ARN seleccionada de las SEQ ID NO: 1-12, 14-48 y 94-146, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con la misma.

3. El método de la reivindicación 2, en el que niveles de expresión relativamente altos de secuencias de micro-ARN seleccionadas de las SEQ ID NO: 1-12, 14-39, 94-97 y 119-122, o de secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas, en comparación con el perfil de expresión de referencia, son diagnósticos de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca.

4. El método de la reivindicación 2, en el que niveles de expresión relativamente bajos de secuencias de micro-ARN seleccionadas de las SEQ ID NO: 40-48, 98-118 y 123-146, o secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas, en comparación con el perfil de expresión de referencia, son diagnósticos de riesgo aumentado de insuficiencia cardiaca crónica.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los niveles de expresión de la secuencia de micro-ARN se determinan por hibridación de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos o una combinación de los mismos.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el método de amplificación de ácidos nucleicos es PCR en tiempo real.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la PCR en tiempo real comprende el uso de cebadores directos e inversos, y en donde los cebadores directos comprenden una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 49-66, 86-89, 147­ 171, o una secuencia que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad con las mismas.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el método de PCR en tiempo real comprende además el uso de una sonda.