CN103764843A - 用于确定心力衰竭或心力衰竭的风险的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明部分基于miR组的发现，所述miR的水平在慢性心脏收缩HF患者的循环中增加或降低。因此，在稳定的慢性心脏收缩HF患者的血清中，对大范围的miR组进行筛选，并将结果与年龄、性别和种族相匹配的对照组相比较。

Description

用于确定心力衰竭或心力衰竭的风险的方法和组合物

发明领域

本发明通常涉及与心力衰竭有关的微RNA分子，以及与其相关或其衍生的多种核酸分子。

发明背景

心力衰竭是一种病理生理状态，其中心脏不能泵送足量的血液以满足代谢中的组织或细胞的营养和氧气需求。其为许多心脏病中主要的并发症。超过40岁的成人具有估计的21%发展心力衰竭的终身风险(Lloyd-Jones等, 2002, Circulation 106, 3068-72)，其为比组合的所有形式癌症导致更多住院治疗的病况(美国心脏病协会(American Heart Association). 心脏病和中风统计(Heart Disease and Stroke Statistics)2003年更新)。

在过去几年中进行的研究表明，转录控制和心脏病基因表达似乎在心力衰竭(HF)的发病机理和临床表现中起到重要的作用(Li等, 2011, Cardiovasc Res. (6):498-512)。

特别是，先前研究表明，HF患者中信使RNA (mRNA)的下调提示抑制mRNA稳态水平的分子机制的重要性(Kaab等, 2004, J Mol Med. 82: 308–316)。

在近年来，微RNA(miRNA、miR)已显现成为一种重要的新类型的调控RNA，其对各种各样的生物学过程具有重大影响。

这些小的(通常17-24个核苷酸长度)非编码RNA分子可通过促进RNA降解、抑制mRNA翻译以及还影响基因转录来调节蛋白质表达模式。miR在不同的过程中起到关键的作用，所述过程例如发育和分化、细胞增殖的控制、应激反应和新陈代谢。在许多类型的人类癌肿中发现许多miR的表达是变化的，在一些病例中，已提出有力的证据来支持以下推测：所述变化在肿瘤进展中可能起到成因的作用。目前有约1223个已知的人miR。

新近的数据显示，miR还与心脏病(包括HF)有关，并且甚至比mRNA对末期心力衰竭的急性功能状态更灵敏(Thum等, 2007, Circulation. 116: 258–267; Matkovich等, 2009, Circulation. 119(9):1263-1271)。

目前对于心力衰竭的治疗包括药理学方法、装置例如心室辅助装置(VAD)、心脏再同步疗法(CRT)、可植入的电复律器-除颤器(ICD) (其为小型电池供电的和心脏移植)。药理学方法包括但不限于变力剂(即，增加心脏收缩性的化合物)、神经元介质阻滞剂(例如，β-阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂)、醛甾酮拮抗剂、利尿剂和血管舒张剂。然而，这些药剂没有一种是完全单独或组合有效的。移植物的可用性受到高度限制，并且因为许多遭受心力衰竭的个体健康很差，他们经常不是良好的手术候选者。因为这些原因，心力衰竭仍是发病率和死亡率的主要原因，尤其在发达地区。此外，确定心力衰竭的准确病因可能是困难的，这是阻止开发更特异疗法的一个因素。总体上缺乏分子水平的诊断技术。因此，本领域存在发现循环的诊断标记物的需要，所述标记物更准确地反映受试者发展HF的遗传倾向。

发明简述

本发明部分基于miR组的发现，所述miR的水平在慢性心脏收缩HF患者的循环中增加或降低。因此，在稳定的慢性心脏收缩HF患者的血清中，对大范围的miR组进行筛选，并将结果与年龄、性别和种族相匹配的对照组相比较。得到基于血清中所检测的miR水平的评分，其为HF患者的提示，并且与HF组中其他已知的预后临床标记物相关。

在体液中循环的核酸为HF风险的早期诊断提供独特的机会。本发明提供特异的核酸序列，用于HF的鉴定、早期检测和诊断。根据核酸序列在生物样品中的表达模式，其还可用作用于受试者的预后评估的预后标记物。本发明还提供最少入侵的早期检测HF倾向(early detection or predisposition of HF)的方法。

本发明还提供在受试者中诊断或预测心力衰竭的方法，所述方法包括：从受试者获得生物样品；测定所述样品中核酸序列的表达谱(expression profile)，所述核酸序列选自SEQ ID NO：1-48、94-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列；和比较所述表达谱与参照表达谱，其中与所述参照表达谱相比较，在所述生物样品中至少一个或多个核酸序列的表达谱水平差异是心力衰竭的诊断或预后。

根据一些实施方案，选自SEQ ID NO：1-39、94-97、119-122、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对高的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。

根据其他实施方案，选自以下SEQ ID NO：40-48、98-118、123-146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对低的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。

根据一些实施方案，所述方法还包括根据心脏病状况管控(managing)受试者的治疗。

根据一些实施方案，所述生物样品选自体液、细胞系和组织样品。根据一个实施方案，体液样品为血清样品。根据另一个实施方案，所述体液为血液样品。

根据一些实施方案，所述方法包括测定至少两个核酸序列的表达。根据一些实施方案，所述方法还包括组合一个或多个表达比。根据一些实施方案，通过选自核酸杂交、核酸扩增和其组合的方法测定所述表达水平。根据一些实施方案，所述核酸扩增方法为实时PCR (RT-PCR)。根据一个实施方案，所述实时PCR为定量实时PCR (qRT-PCR)。

根据一些实施方案，RT-PCR方法包括正向和反向引物。根据其他实施方案，正向引物包含选自SEQ ID NO：49-66, 86-89, 147-171、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。根据一些实施方案，实时PCR方法还包括与探针杂交。

根据一些实施方案，所述探针包含与选自SEQ ID NO：1-48、94-146中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。

根据其他实施方案，所述探针包含选自SEQ ID NO：67-84、90-93、172-196中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。

本发明还提供用于在受试者中评估心脏病的试剂盒；所述试剂盒包含探针，所述探针含有与选自SEQ ID NO：1-48、94-146中的任何一个、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。根据一些实施方案，所述探针包含选自SEQ ID NO：67-84、90-93、172-196、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的核酸序列。根据其他实施方案，试剂盒还包含正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：49-66、86-89、147-171、其片段和与其具有至少80%同一性的序列的序列。根据其他实施方案，试剂盒还包含反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。

本发明的这些和其他实施方案连同下文的附图、描述和权利要求书一起时将显而易见。

附图简述

图1A-1D为盒形图(boxplot presentation)，其比较在获得自HF组(I)或健康受试者(II)的血清样品中所例示的统计学显著上调的微RNA的存在分布：hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 13) (1A)、hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 1) (1B)、hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14) (1C)和hsa-miR-92b (SEQ ID NO: 15) (1D)。结果基于实时PCR，并且较高的标准化信号表示在样品中存在较大数量的微RNA。

盒形图显示中值(水平线)、25-75百分位数(盒)、最多1.5倍于四分位距的数据范围(“虚线”)和离群值(十字型)。

图2A-2D为盒形图，其比较获得自HF组(I)或健康受试者(II)的血清样品中例示的统计学显著下调的微RNA的表达分布(Y轴)：hsa-miR-26a (SEQ ID NO: 40) (2A)、hsa-miR-199b-5p (SEQ ID NO: 42) (2B)、hsa-miR-33a (SEQ ID NO: 41) (2C)和hsa-miR-27b (SEQ ID NO: 43) (2D)。结果基于实时PCR，并且较高的标准化信号表示在样本中存在较大数量的微RNA。

盒形图显示中值(水平线)、25-75百分位数(盒)、最多1.5倍于四分位距的数据范围(“虚线”)和离群值(十字型)。

图3为显示miR分数(Y轴)在HF组(I)和对照组(II)之间显著分离的点图。对每个样品计算miR分数作为以下序列的平均标准化反向信号：hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 13)、hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 1)、hsa-miR-22 (SEQ ID NO: 14)和hsa-miR-92b (SEQ ID NO: 15)，并且通过减去常数(最小分数)进行调整使得分数的范围自0开始。

水平线表示中值，其在HF组中为2.9而在对照组中为1.3。双侧不成对t检验的P-值为0.0000001。

图4为HF组和对照组之间的miR分数区分的接受者操作特性(ROC, Receiver Operating Characteristic)曲线。ROC曲线描绘了对于诊断测量的不同截止值，针对假阳性比率(1减去特异性) (X轴)的灵敏度(Y轴)，并且为分类性能的量度。ROC曲线下面积(AUC)可用于评估测量的诊断性能。随机分类器具有AUC=0.5，并且具有理想灵敏度和100%特异性的最佳分类器具有AUC=1。相应的ROC曲线具有AUC=0.90。

图5为证明HF组内的miR分数(Y轴)和提高的血清脑钠素(BNP)水平(X轴)之间显著相关的图示。HF组内患者的BNP水平以对数标度显示。BNP水平与miRNA分数的Spearman相关性为0.63 (p=0.003)。

图6为证明miR分数(Y轴)和血清脑钠素(BNP)水平(X轴)之间显著相关的点图。在来自HF患者的对于该参数其值在上半部的样品和其值在下半部的样品之间，比较miR分数。高BNP水平与高miRNA分数相关，p值=0.002。

图7为证明miR分数(Y轴)和宽QRS (X轴)之间显著相关的点图。

图8为证明miR分数(Y轴)和左心室舒张末期容积(EDD) (X轴)之间显著相关的点图。高舒张末期容积(EDD)与高miRNA分数相关(p=0.03)。

图9为证明miR分数(Y轴)和左房内径(left atrial dimension, LAD) (X轴)显著相关的点图。高LAD与高miRNA分数相关(p=0.01)。

发明详述

本发明部分基于以下发现：特定的生物标记物序列(SEQ ID NO:1-48、94-146)可用于心力衰竭的鉴定、早期检测、诊断和预后。

生物标记物具有改革各种医学病况的诊断和治疗的潜能。理想的是，生物标记物以最小入侵的方式取样。因此，各种生物医学研究领域的挑战为鉴定体液(例如血清或血液)中的生物标记物。在近年来已清楚，无细胞的DNA和mRNA存在于血清以及其他体液中，并且为潜在的生物标记物。然而，监测在体液中通常小量的这些核酸需要灵敏的检测方法，所述方法不是通常在临床上可适用的。

本发明提供灵敏、特异和准确的方法，其可用于进行心力衰竭的最小入侵的早期检测、诊断和预后。本发明的方法具有高灵敏性和特异性。

令人惊讶地发现，上述方法允许简单的最小入侵测试，以在非常早期的阶段以较高可靠性和有效性容易地检测心脏病，节省时间、材料和操作步骤，以及节省成本和难以获得的精细化学品。

此外，本发明的方法组合了以下优势：容易进行样品采集和早期阶段诊断心力衰竭的选择。作为最小入侵的方法(其中例如递送血清样品)，所述方法具有在受试者中获得高接受度的良好潜能，所述受试者可例如为人或动物。因此，所述方法不但可用于常规检测，还可用于预防医学检查。

另外，本发明提供用于确定治疗计划的方法。一旦健康护理提供者知道样品和由此个体所属的疾病种类，健康护理提供者可确定用于所述个体的适当治疗计划。例如，不同的心脏病种类往往需要不同的治疗。如本文所述，与具有不同的类型或种类的心脏病的个体相比，具有特定类型或种类的心脏病的个体可从不同的治疗过程中获益。恰当诊断和理解个体的心脏病种类允许更好、更成功的治疗和诊断。

定义

在公开和描述本发明的组合物和方法之前，要理解本文所用术语只用于描述具体实施方案的目的，并无意限制。必须注意，本说明书和随附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。

对于本文数字范围的列举，明确包括每一个介于其间的具有相同精确度的数字。例如对于6-9的范围，除6和9以外还包括数字7和8，对于6.0-7.0的范围，还明确包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

约

本文所用的术语“约”是指+/-10%。

反义

本文所用的术语“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。术语“反义链”用于指与“有义”链互补的核酸链。反义分子可通过任何方法产生，包括以相反方向连接目的基因到允许互补链合成的病毒启动子上的合成方法。该转录的链一旦引入到细胞中，就与细胞所产生的天然序列组合形成双链体(duplex)。然后这些双链体阻断进一步转录或翻译。以这种方式，可产生突变的表型。

连接的

本文所用的“连接的”或“固定化的”是指探针和固体支持物，并且可指探针和固体支持物之间的结合在结合、洗涤、分析和去除的条件下足够地稳定。结合可以是共价或非共价的。共价键可直接在探针和固体支持物之间形成，或者可通过交联剂或通过在固体支持物或探针或两者上包含特定的反应基团形成。非共价结合可以是静电、亲水和疏水相互作用中的一种或多种。非共价结合中包括分子(例如链霉抗生物素)共价连接到支持物上以及生物素化的探针非共价结合到链霉抗生物素上。固定化还可包括共价和非共价相互作用的组合。

生物样品

本文所用的“生物样品”是指含有核酸的生物学组织或流体的样品。这样的样品包括但不限于分离自受试者的组织或流体。生物样品还可包括组织切片，例如活检样品和尸检样品、FFPE样品、为组织学目的获得的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰(sputum)、粪便、泪液、粘液、毛发和皮肤。生物样品还包括源自动物或患者组织的外植块和原代的和/或转化的细胞培养物。

生物样品还可以是血液、血液级分、尿液、渗出液、腹水、唾液、脑脊液、宫颈分泌物、阴道分泌物、子宫内膜分泌物、胃肠分泌物、支气管分泌物、痰、细胞系、组织样品或乳腺分泌物。生物样品可通过从动物中移除细胞样品来提供，但还可通过使用先前分离的细胞(例如，通过其他人、在其他时间和/或为其他目的分离的)或通过在体内进行本文所述的方法来实现。还可使用归档组织(archival tissues)，例如具有治疗或结果记载的那些组织。

分类

本文所用的“分类”是指程序和/或算法，其中根据项目(称为性状、变量、性质、特征等)中一个或多个内在特性的定量信息并根据统计模型和/或在先标记项目的训练集，将各个项目分到各组或各类。根据一个实施方案，分类指心脏病类型的确定。

互补

本文所用的“互补”或“互补的”是指在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick (例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。完全互补或完全互补的可指在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间100%互补的碱基配对。

C_T

C_T信号表示PCR的第一个循环，其中扩增穿过荧光阈值(循环阈值)。因此低C_T值表示微RNA的高丰度或表达水平。在一些实施方案中，将PCR C_T信号标准化，使得标准化的C_T保持为表达水平的倒数。在其他实施方案中，PCR C_T信号可被标准化并成倒数，使得低的标准化倒数的C_T表示低的微RNA丰度或表达水平。

检测

“检测”指检测样品中组分的存在。检测还指检测组分的不存在。检测还指定量或定性地测定组分的水平。

差异表达

“差异表达”指细胞和组织之内和之间在时序基因和/或细胞基因表达模式上定性或定量的差异。因此，差异性表达的基因可在性质上改变其表达，包括例如正常组织相对于疾病组织的活化或失活。可使基因在特定状态下相对于另一状态打开或关闭，因此允许比较两个或更多个状态。定性调节的基因可在某一状态或细胞类型中显示可通过标准技术检测的表达模式。一些基因可在一种状态或细胞类型中表达，但不能在两种状态或细胞类型中表达。或者，表达的差异可以是定量的，例如其中表达受到调节，或上调(导致转录物的量增加)，或下调(导致转录物的量降低)。表达的差异程度只需大到足以通过诸如表达阵列、定量逆转录酶PCR、RNA印迹分析(northern analysis)、实时PCR、原位杂交和RNA酶保护等标准表征技术进行量化即可。

表达谱

术语“表达谱”广泛用于包括基因组表达谱，例如微RNA的表达谱。谱可通过用于测定核酸序列水平的任何合适的方法例如微RNA、标记的微RNA、扩增的微RNA、cDNA等的定量杂交、定量PCR、用于定量的ELISA等来产生，并且可供分析两个样品间的差异基因表达。对受试者或患者肿瘤样品(例如其细胞或收集物(例如组织))进行测定。通过本领域已知的任何合宜的方法收集样品。目的核酸序列是发现具有预测性的核酸序列，包括上文提供的核酸序列，其中表达谱可包括5、10、20、25、50、100个或更多个(包括所有)所列核酸序列的表达数据。根据一些实施方案，术语“表达谱”意指在所测样品中测量核酸序列的丰度。

表达比

本文所用“表达比”是指通过检测生物样品中相应核酸的相对表达水平而确定的两种或更多种核酸的相对表达水平。

FDR

当进行多重统计检验时，例如在比较多个数据特征的两组间的信号时，由于可达到在另外情况下可视为统计显著性的水平的组间随机差，获得假阳性结果的概率越来越高。为了限制这类错误发现的比例，统计显著性定义为仅用于其中差异达到阈值以下p值(通过双侧t检验)的数据特征，其依赖于所进行的检验数目和这些检验中所获得的p值的分布。

片段

“片段”在本文中用来表示核酸或多肽的非全长部分。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。

基因

本文所用“基因”可以是天然基因(例如基因组)或合成基因，其包含转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(例如内含子、5'和3'非翻译序列)。基因的编码区可以是编码氨基酸序列或功能性RNA例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA或反义RNA的核苷酸序列。基因还可以是相当于编码区(例如外显子和miRNA)的mRNA或cDNA，任选包含与之连接的5'或3'非翻译序列。基因还可以是包含全部或部分编码区和/或与之连接的5'或3'非翻译序列的体外产生的扩增核酸分子。

沟结合物/小沟结合物(MGB)

“沟结合物”和/或“小沟结合物”可互换使用，是指通常以序列特异性方式适应双链DNA的小沟的小分子。小沟结合物可以是长的扁平分子，可呈新月形，因此紧贴地适应双螺旋的小沟中，常常置换水。小沟结合分子通常可包含几个通过具有扭转自由度的键连接的芳族环例如呋喃、苯或吡咯环。小沟结合物可以是抗生素，例如纺锤菌素、偏端霉素、berenil、喷他脒和其它芳族二脒、Hoechst 33258、SN 6999、金霉酸抗肿瘤药物例如色霉素和光神霉素、CC-1065、二氢环吡咯并吲哚(dihydrocyclopyrroloindole)三肽(DPI₃)、1,2-二氢-(3H)-吡咯并[3,2-e]吲哚-7-羧化物(carboxylate) (CDPI₃)和相关化合物和类似物，包括Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 第2版，Blackburn和Gait主编，Oxford University Press，1996和PCT公布申请号WO 03/078450中描述的那些，所述文献的内容通过引用结合到本文中。小沟结合物可以是引物、探针、杂交标签互补序列的组分或其组合。小沟结合物可提高它们与之连接的引物或探针的T_m，允许这类引物或探针在较高温度下有效地杂交。

心脏病

本文所用的心脏病涉及下列非限制性实例：心力衰竭(充血性)；心肌疾病，例如缺血性心肌病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、酒精中毒性心肌病、病毒性心肌病、心动过速介导的心肌病、应激诱发的(takotsubo)心肌病、淀粉样心肌病、心律失常性右心室发育不良或无类别的心肌疾病，例如左心室致密化不全(Left ventricular noncompaction)或心内膜弹力纤维增生症；或者瓣膜性心脏病，例如主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣狭窄、二尖瓣反流、二尖瓣脱垂、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣反流、三尖瓣狭窄或三尖瓣反流。

心力衰竭

本文所用的术语“心力衰竭”广泛指降低心脏泵送血液或以提高的充盈压泵送血液的能力的任何病况。结果，在组织中出现充血和浮肿。最经常地是，心力衰竭由心肌的收缩性降低引起，其由冠状动脉血流量减少而产生；然而，许多其他的因素可导致心力衰竭，包括对心脏瓣膜的损伤、维生素缺乏和原发性心肌疾病。

根据一些实施方案，所述心力衰竭指具有保持心脏收缩功能的心力衰竭(HFPSF)。

同一性

本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下所用“同一性的”或“同一性”意指在特定区域内具有特定百分比的相同残基的序列。百分比可如下计算：对两个序列进行最佳比对，比较特定区域内的两个序列，确定在两个序列中出现相同残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以该特定区域中的位置总数，将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及比较的特定区域只包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中，但不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可视为等同物。同一性可手工进行或通过应用计算机序列算法例如BLAST或BLAST 2.0进行。

原位检测

本文所用“原位检测”意指在原始位置处因此意指在组织样品(例如活组织检查)中检测表达或表达水平。

标记

本文所用“标记”意指通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。例如有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如常用于ELISA的酶)、生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)或半抗原和可使其可检测的其它实体。可将标记在任何位置处掺入核酸和蛋白质中。

核酸

本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描述亦限定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可为单链或双链，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA (基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合及包括以下碱基的组合：尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。

核酸一般含有磷酸二酯键，但可包括可具有至少一个不同键(例如氨基磷酸酯、磷硫酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(methylphosphoroamidite)键)和肽核酸骨架和键的核酸类似物。其它类似的核酸包括具有正性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的核酸，所述专利通过引用予以结合。含有一个或多个非天然存在的或修饰的核苷酸的核酸也包括在核酸的一种定义中。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5'端和/或3'端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖或骨架修饰的核糖核苷酸。然而，应当注意，核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸也是适宜的，所述非天然存在的核碱基例如在5位修饰的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。2'-OH基团可被选自以下的基团置换：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN，其中R为C₁-C₆烷基、烯基或炔基，卤素为F、Cl、Br或I。修饰核苷酸还包括通过例如以下文献中描述的羟脯氨醇键(hydroxyprolinol linkage)与胆固醇缀合的核苷酸：Krutzfeldt等，Nature 438:685-689 (2005)和Soutschek等，Nature 432:173-178 (2004)，其通过引用结合到本文中。可出于多种原因对核糖-磷酸骨架进行修饰，例如提高这类分子在生理环境的稳定性和半衰期、促进跨细胞膜的扩散或作为生物芯片上的探针。骨架修饰还可提高对降解的抗性，例如在细胞的严酷胞吞环境中。骨架修饰还可降低经由例如肝中的肝细胞的核酸清除。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸和类似物的混合物。

探针

本文所用“探针”意指能够通过一种或多种化学键类型、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成而与互补序列的靶核酸结合的寡核苷酸。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。可能存在任何数目的碱基对错配，所述错配将干扰本文所述靶序列和单链核酸间的杂交。然而，如果突变数如此大以致于甚至在最小严格杂交条件下都不能发生杂交，则该序列不是互补靶序列。探针可为单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链性(strandedness)受靶序列的结构、组成和性质支配。探针可被直接标记或间接标记，例如用生物素标记，链霉抗生物素复合物可随后与之结合。

参考表达谱

本文所用短语“参考表达谱”指标准表达值，所测定的值与其比较以确定具有心脏病的受试者的检测。所述参考可基于组合测量分数。

灵敏度

本文所用“灵敏度”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将心脏病正确归类为正确类型的频繁程度。A类的灵敏度是通过检验确定属于“A”类的病例占为“A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。

特异性

本文所用“特异性”可意指二元分类检验正确鉴定病况的良好程度的统计学度量，例如将心脏病正确归类为正确类型的频繁程度。A类的特异性是通过检验确定属于“非A”类的病例占为“非A”类的病例(如通过某一绝对标准或金标准确定的)的比例。

标准样品

“标准样品”是指代表无疾病状态的样品，特别是其中没有心力衰竭或任何其他相关病况的状态(即，健康状态)。举例而言，标准样品可以是生物样品，所述生物样品得自与为其提供诊断或预后的受试者年龄类似的健康受试者。标准样品可以是混合样品，其中将获自几个健康受试者(即，没有心力衰竭症状的对照受试者)的生物样品的数据平均化，由此建立混合样品。

严格杂交条件

本文所用“严格杂交条件”意指例如在核酸的复杂混合物中，第一核酸序列(例如探针)与第二核酸序列(例如靶)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同环境下将不同。在确定的离子强度、pH下，可选择严格条件为低于特定序列的热解链温度(Tm)约5-10℃。Tm可为在平衡时50%与靶互补的探针与靶序列杂交的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下) (因为靶序列过量存在，所以在Tm处，在平衡时50%的探针被占用)。

严格条件可为这样的条件，其中盐浓度小于约1.0 M钠离子，例如在pH 7.0-8.3下约0.01-1.0 M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如约10-50个核苷酸)，温度为至少约30℃，对于长探针(例如大于约50个核苷酸)，温度为至少约60℃。还可加入去稳定剂(例如甲酰胺)来达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可为背景杂交的至少2-10倍。示例性的严格杂交条件包括下列条件：50%甲酰胺、5x SSC和1% SDS，在42℃下温育，或者，5x SSC、1% SDS，在65℃下温育，同时在0.2x SSC和0.1% SDS中于65℃洗涤。

基本互补的

本文所用“基本互补的”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域内，第一序列与第二序列的互补序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或所述两个序列在严格杂交条件下杂交。

基本相同的

本文所用“基本相同的”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸或氨基酸内，第一和第二序列有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的同一性，或对于核酸，如果第一序列与第二序列的互补序列基本互补。

受试者

本文所用的术语“受试者”指哺乳动物，包括人和其他哺乳动物两者。本发明的方法优选应用于人受试者。

靶核酸

本文所用“靶核酸”意指可被另一核酸结合的核酸或其变体。靶核酸可以是DNA序列。靶核酸可以是RNA。靶核酸可包含mRNA、tRNA、shRNA、siRNA或Piwi-相互作用RNA、或pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA或反-miRNA (anti-miRNA)。

靶核酸可包含靶miRNA结合部位或其变体。一个或多个探针可结合靶核酸。靶结合部位可包含5-100或10-60个核苷酸。靶结合部位可包含总共5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30-40、40-50、50-60、61、62或63个核苷酸。靶位点序列可包含美国专利申请号11/384,049、11/418,870或11/429,720中公开的靶miRNA结合部位序列的至少5个核苷酸，所述专利的内容结合到本文中。

组织样品

本文所用的组织样品是采用相关医学领域普通技术人员熟知的方法获自组织活检的组织。用于从活组织检查获得样品的方法包括团块(mass)的大致分配(gross apportioning)、显微切割、基于激光的显微切割或其它本领域已知的细胞分离方法。

变体

本文所用的涉及核酸的“变体”意指(i)所参考的核苷酸序列的一部分；(ii)所参考的核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与所参考的核酸或其互补序列基本相同的核酸；或(iv)与所参考的核酸、其互补序列或与之基本相同的序列在严格条件下杂交的核酸。

野生型

本文所用术语“野生型”序列是指编码序列、非编码序列或界面序列(interface sequence)，所述界面序列是执行该序列的天然或正常功能的序列的等位基因形式。野生型序列包括同族序列(cognate sequence)的复等位基因形式，例如野生型序列的复等位基因可编码编码序列编码的蛋白质序列的沉默变化或保守变化。

本发明采用miRNA来鉴定、分类和诊断心脏病。

微RNA加工

编码微RNA (miRNA)的基因可转录，导致miRNA前体(称为pri-miRNA)的产生。pri-miRNA可以是包含多个pri-miRNA的多顺反子RNA的部分。pri-miRNA可形成带有茎和环的发夹结构。茎可包含错配的碱基。

Pri-miRNA的发夹结构可被Drosha (其是一种RNase III内切核酸酶)识别。Drosha可识别pri-miRNA中的末端环，并切割约2个螺旋转角到茎中以产生60-70个核苷酸前体，称为pre-miRNA。Drosha可切割pri-miRNA，带有RNase III内切核酸酶特有的交错切口，产生具有5'磷酸和约2个核苷酸3'突出端的pre-miRNA茎环。延伸至Drosha切割位点以外的茎的约1个螺旋转角(约10个核苷酸)对有效加工可能是必需的。然后可通过Ran-GTP和输出受体Ex-portin-5主动地将pre-miRNA从核转运至胞质。

pre-miRNA可被Dicer (其也是一种RNase III内切核酸酶)识别。Dicer可识别pre-miRNA的双链茎。Dicer还可识别茎环基部的5'磷酸和3'突出端。Dicer可从茎环基部切下末端环2个螺旋转角，留下另外的5'磷酸和约2个核苷酸3'突出端。所得的可包含错配的siRNA样双链体包含成熟的miRNA和相似大小的称为miRNA*的片段。miRNA和miRNA*可来源于pri-miRNA和pre-miRNA的相对臂。MiRNA*序列可存在于克隆miRNA文库，但通常频率比miRNA低。

虽然最初作为具有miRNA*的双链种类存在，但miRNA最终可作为单链RNA掺入到称为RNA诱导沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体中。各种蛋白质都可形成RISC，这可导致以下方面的变化性：对miRNA/miRNA*双链体的特异性、靶基因的结合部位、miRNA的活性(阻抑或活化)、miRNA/miRNA*双链体的哪条链加载入RISC中。

当miRNA:miRNA*双链体的miRNA链加载入RISC时，miRNA*可被除去并降解。加载至RISC的miRNA:miRNA*双链体的链可以是其5'端较不紧密配对的链。在miRNA:miRNA*的两端具有大致相当的5'配对的情况下，miRNA和miRNA*两者可具有基因沉默活性。

RISC可根据miRNA和mRNA之间高水平的互补性，尤其通过miRNA的核苷酸2-7来鉴定靶核酸。在动物中只报告了一例，其中miRNA及其靶之间的相互作用沿着miRNA的全长。对于mir-196和Hox B8表明如此，并且进一步表明mir-196介导Hox B8 mRNA的切割(Yekta等，2004，Science 304-594)。另外，仅在植物中已知这种相互作用(Bartel和Bartel 2003，Plant Physiol 132-709)。

已对miRNA及其mRNA靶之间的碱基配对要求进行了许多研究以实现翻译的有效抑制(Bartel 2004，Cell 116-281的综述)。在哺乳动物细胞中，miRNA的前8个核苷酸可能是重要的(Doench和Sharp 2004 GenesDev 2004-504)。然而，微RNA的其它部分也可参与mRNA结合。此外，在3’处的充分碱基配对可补偿在5’处的不充分配对(Brennecke等，2005 PLoS 3-e85)。

在整个基因组上分析miRNA结合的计算研究表明了miRNA 5’处的碱基2-7在靶结合中的特定作用，但也认识到第一个核苷酸(发现通常为“A”)的作用(Lewis等，2005 Cell 120-15)。同样地，Krek等人(2005，Nat Genet 37-495)使用核苷酸1-7或2-8来鉴定和证实靶。

mRNA中的靶位点可在5' UTR、3' UTR或在编码区中。引人关注的是，多个miRNA可通过识别相同位点或多个位点来调节相同的mRNA靶。大多数经遗传鉴定的靶中多个miRNA结合部位的存在可表明，多个RISC的协同作用提供最有效的翻译抑制。

miRNA可通过以下两种机制中的任一种指导RISC下调基因表达：mRNA切割或翻译阻抑。如果mRNA与miRNA具有某种程度的互补性，则miRNA可指定mRNA的切割。当miRNA引导切割时，切割可介于与miRNA的残基10和11配对的核苷酸之间。或者，如果miRNA与miRNA不具有必要程度的互补性，则miRNA可阻抑翻译。翻译阻抑在动物中可能更普遍，因为动物在miRNA和结合部位之间可具有较低程度的互补性。

应当注意，任何一对miRNA和miRNA*的5’端和3’端中可存在变化性。该变化性可能由于有关切割部位的Drosha和Dicer的酶促加工的变化性所致。miRNA和miRNA*的5’端和3’端处的变化性还可能由于pri-miRNA和pre-miRNA的茎结构的错配所致。茎链的错配可导致一群不同的发夹结构。茎结构的变化性还可导致由Drosha和Dicer切割的产物的变化性。

核酸

本文提供核酸。所述核酸包含SEQ ID NO: 1-196或其变体的序列。变体可以是所参考的核苷酸序列的互补序列。变体还可以是与所参考的核苷酸序列或其互补序列基本相同的核苷酸序列。变体还可以是在严格条件下与所参考的核苷酸序列、其互补序列或与之基本相同的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

核酸的长度可为10-250个核苷酸。核酸的长度可为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个核苷酸。可使用本文所述的合成基因在细胞(体外或体内)中合成或表达核酸。核酸可作为单链分子合成，并与基本互补的核酸杂交形成双链体。可采用本领域技术人员熟知的方法，包括美国专利号6,506,559 (其通过引用予以结合)中描述的方法，核酸可以单链或双链形式导入细胞、组织或器官或者能够通过合成基因来表达。

表1：本发明的核酸序列

核酸复合体

核酸还可包含以下的一种或多种：肽、蛋白质、RNA-DNA杂合体、抗体、抗体片段、Fab片段和适体。

Pri-miRNA

核酸可包含pri-miRNA或其变体的序列。pri-miRNA序列可包含45-30,000、50-25,000、100-20,000、1,000-1,500或80-100个核苷酸。Pri-miRNA的序列可包含本文所示pre-miRNA、miRNA和miRNA*及其变体。pri-miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1- 48、94-146或其变体的序列。

pri-miRNA可形成发夹结构。发夹可包含基本互补的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可为37-50个核苷酸。第一和第二核酸序列可被8-12个核苷酸的第三序列分隔开。发夹结构可具有小于-25 Kcal/摩尔的自由能，其用Vienna算法计算，默认参数描述于Hofacker等，Monatshefte f. Chemie 125：167-188 (1994)，其内容结合到本文中。发夹可包含4-20、8-12或10个核苷酸的末端环。pri-miRNA可包含至少19%腺苷核苷酸、至少16%胞嘧啶核苷酸、至少23%胸腺嘧啶核苷酸和至少19%鸟嘌呤核苷酸。

Pre-miRNA

核酸还可包含pre-miRNA或其变体的序列。pre-miRNA序列可包含45-90、60-80或60-70个核苷酸。Pre-miRNA的序列可包含本文所示的miRNA和miRNA*。Pre-miRNA的序列还可以是不包括pri-miRNA的5’和3’端的0-160个核苷酸的pri-miRNA的序列。Pre-miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1-48、94-146或其变体的序列。

miRNA

核酸还可包含miRNA (包括miRNA*)或其变体的序列。miRNA序列可包含13-33、18-24或21-23个核苷酸。miRNA还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的起始13-33个核苷酸。miRNA的序列还可以是pre-miRNA的最后13-33个核苷酸。miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1-18、40-43、94-115或其变体的序列。

反-miRNA

核酸还可包含例如通过与pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA或miRNA*结合(例如反义或RNA沉默)，或通过与靶结合部位结合，能够阻断miRNA或miRNA*活性的反-miRNA(anti-miRNA)的序列。反-miRNA可包含总共5-100或10-60个核苷酸。反-miRNA还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。反-miRNA的序列可包含(a)与miRNA的5’基本相同或互补的至少5个核苷酸和与miRNA的5’端靶位点的侧翼区基本互补的至少5-12个核苷酸，或(b)与miRNA的3’基本相同或互补的至少5-12个核苷酸和与miRNA的3’端靶位点的侧翼区基本互补的至少5个核苷酸。反-miRNA的序列可包含SEQ ID NO: 1-48、94-146或其变体的互补序列(complement)。

靶的结合部位

核酸还可包含靶微RNA结合部位或其变体的序列。靶位点序列可包含总共5-100或10-60个核苷酸。靶位点序列还可包含总共至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62或63个核苷酸。靶位点序列可包含SEQ ID NO: 1-18、40-43、94-115的序列的至少5个核苷酸。

探针

本文提供探针。探针可包含核酸。探针的长度可为8-500、10-100或20-60个核苷酸。探针的长度还可为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280或300个核苷酸。探针可包含18-25个核苷酸的核酸。

探针可能够通过一个或多个化学键类型、通常通过互补碱基配对、通常通过氢键形成，而与互补序列的靶核酸结合。根据杂交条件的严格性，探针可结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。探针可以是单链的或部分单链的和部分双链的。探针的链性受靶序列的结构、组成和性质支配。探针可被直接标记或间接标记。

试验探针

探针可以是试验探针。试验探针可包含与miRNA、miRNA*、pre-miRNA或pri-miRNA互补的核酸序列。试验探针的序列可选自SEQ ID NO: 67-84、90-93、172-196或其变体。

接头序列

探针还可包含接头。接头的长度可为10-60个核苷酸。

接头的长度可为20-27个核苷酸。接头可具有足够的长度，以允许探针的总长度为45-60个核苷酸。接头可能不能够形成稳定的二级结构，或者可能不能够自身折叠，或者可能不能够在探针所含核酸的非接头部分上折叠。接头的序列可能不出现在探针非接头核酸从其中衍生的动物基因组中。

反转录

可通过靶RNA的反转录来产生cDNA的靶序列。用于产生cDNA的方法可以是反转录的多腺苷酸化RNA，或备选具有连接的衔接序列的RNA。

使用与RNA连接的衔接序列反转录

RNA可在反转录前与衔接序列连接。连接反应可通过T4 RNA连接酶进行以在RNA的3’端与衔接序列连接。然后反转录(RT)反应可使用包含与衔接序列的3’端互补的序列的引物进行。

使用与RNA连接的多腺苷酸化序列反转录

可使用包含5’衔接序列的聚(T)引物，将多腺苷酸化RNA用于反转录(RT)反应。聚(T)序列可包含8、9、10、11、12、13或14个连续的胸腺嘧啶。

RNA的RT-PCR

可使用包含至少15个与靶核酸互补的核酸和5’尾序列的特异性正向引物、与衔接序列的3’端互补的反向引物和包含至少8个与靶核酸互补的核酸的探针，通过实时PCR使RNA的反转录物扩增。探针可与衔接序列的5’端部分互补。

靶核酸的PCR

本文描述了扩增靶核酸的方法。扩增可以是通过包括PCR在内的方法。PCR反应的第一循环的退火温度可为56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。第一循环可包含1-10个循环。PCR反应的其余循环可为60℃。其余循环可包含2-40个循环。退火温度可使PCR更灵敏。PCR可产生可用作较高严格性PCR模板的较长产物。

正向引物

PCR反应可包含正向引物。正向引物可包含15、16、17、18、19、20或21个与靶核酸相同的核苷酸。

正向引物的3’端可能对靶核酸和亲缘核酸(sibling nucleic acid)之间序列的差异敏感。

正向引物还可包含5’突出尾。5’尾可提高正向引物的解链温度。5’尾的序列可包含与靶核酸从其中分离的动物的基因组不同的序列。5’尾的序列还可以是合成的。5’尾可包含8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸。正向引物可包含SEQ ID NO: 49-66、86-89、147-171或其变体。

反向引物

PCR反应可包含反向引物。反向引物可与靶核酸互补。反向引物还可包含与衔接序列互补的序列。与衔接序列互补的序列可包含SEQ ID NO: 85或其变体。

生物芯片

还提供生物芯片。生物芯片可包含固体基质，其包含本文所述的连接的一种或多种探针。探针可能够在严格杂交条件下与靶序列杂交。探针可在基质上空间确定的位置上连接。每个靶序列可使用多于一种探针，或为重叠探针，或为针对特定靶序列的不同部分的探针。探针可能够与本领域技术人员了解的单一病症相关的靶序列杂交。探针或可先合成，随后与生物芯片连接，或可在生物芯片上直接合成。

固体基质可以是经改良以含有适于探针连接或缔合的离散的各个位置并适于至少一种检测方法的材料。基质材料的代表性实例包括玻璃和经改良的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯类、TeflonJ等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、树脂、二氧化硅或二氧化硅型材料包括硅(silicon)和改性硅、碳、金属、无机玻璃和塑料。在没有明显荧光的情况下，基质可允许光学检测。

基质可以是平面的，但是也可使用其它形状的基质。例如，可将探针置于管的内表面用于穿流样品分析(flow-through sample analysis)以使样品体积减至最小。同样地，基质可以是柔性的，例如软泡沫塑料，包括由特定塑料制成的闭孔泡沫塑料(closed cell foam)。

生物芯片的基质和探针可用化学官能团衍生化用于两者随后的连接。例如，生物芯片可用化学官能团衍生化，化学官能团包括但不限于氨基、羧基、桥氧基或硫醇基。利用这些官能团，探针可用探针上的官能团直接连接或使用接头间接连接。

探针可通过5'端、3'端或通过内部核苷酸与固体支持物连接。

探针还可与固体支持物非共价连接。例如，可制备生物素化寡核苷酸，其可与链霉抗生物素共价包被的表面结合，导致连接。或者，可采用诸如光聚合和光刻术等技术，在表面上合成探针。

诊断

还提供诊断方法。所述方法包括检测生物样品中的心脏病相关核酸的差异表达水平。样品可来源于患者。患者中的心脏病状态及其组织学类型的诊断可供预后和治疗策略的选择。

试剂盒

还提供试剂盒，试剂盒可包括本文所述核酸连同以下的任一种或全部：测定试剂、缓冲液、探针和/或引物和无菌盐水或其它药学上可接受的乳剂和混悬剂基质(suspension base)。另外，试剂盒可包括含有用法说明(例如方案)的指导材料，用于实施本文所述方法。

例如，试剂盒可用于靶核酸序列的扩增、检测、鉴定或定量测定。试剂盒可包含聚(T)引物、正向引物、反向引物和探针。

本文所述组合物的任一种都可包括在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒中包括用于分离miRNA、标记miRNA和/或使用阵列评价miRNA群的试剂。试剂盒还可包括用于产生或合成miRNA探针的试剂。因此，试剂盒可在合适的容器装置中包括用于通过掺入标记的核苷酸或随后标记但尚未标记的核苷酸以标记miRNA的酶。其还可包括一种或多种缓冲液，例如反应缓冲液、标记缓冲液、洗涤缓冲液或杂交缓冲液，用于制备miRNA探针的化合物，用于原位杂交的组分和用于分离miRNA的组分。本发明的其它试剂盒可包括用于制备包含miRNA的核酸阵列的组分，因此，可包括例如固体支持物。

提供下面的实施例，以便更全面地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应解释为对本发明宽范围的限制。

实施例

实施例1

方法

患者和对照组

在Haifa Israel的Lin Medical Center的HF诊所，招募30名具有慢性稳定的C类心脏收缩HF患者。此外，招募由30名志愿者组成的另一对照组，其年龄、性别和种族与HF组相匹配。研究由Lady Davis Carmel Medical Center的Institution Review Board (Helsinki委员会)批准，并且所有患者在包括到研究中以及开始任何研究相关的程序之前给出书面通知的同意。对于HF组的包括标准是：在招募日由治疗HF专科心脏病学判断为慢性心脏收缩HF患者，根据ACC/AHA指导方针治疗至少3个月，C阶段，临床稳定。对于对照组的包括标准是：未知或经治疗的任何冠心病、心瓣膜病或心肌病。对于冠状动脉疾病例如糖尿病、高血压、高脂血症和吸烟的并存病没有排除在招募外。对于所有参与者的排除标准是：怀孕、透析、已知或已治疗的恶性肿瘤。在HF组收集所有的临床相关数据：临床数据、超声心动图数据、心电图数据、基线实验室数据，以及对照组中的相关人口数据。

HF组的特征以及HF和对照组的人口统计学显示于表2。

表2：HF和对照组的特征

如详述的，两个组(HF和对照)在其年龄、性别、种族性、体重指数和吸烟习惯方面类似。预测的和轻微显著的变化(反映HF组相对于对照组的不同性质)在于医疗方案、抗心律失常装置和并存病的流行率，所述并存病包括冠心病、糖尿病和慢性肾衰竭。

血清分离和储存

从每个个体直接采集8 ml血液到血清采集管(Greiner Bio-one, VACUETTE? Serum Tubes 455071)中。让全血置于室温(RT)约1小时，然后在室温下于1800 g 离心10分钟。将得到的血清等份装入eppendorf管并储存在-80℃。

测定脑钠素(BNP)水平，得到同时存在的血清BNP水平(Triage MetrPro; BIOSITE, San-Diego, CA)。

RNA提取

将血清(100μl)与300μl如表3中所详述的预热蛋白酶K提取液于57℃过夜孵育：

表3：蛋白酶K提取液

然后通过酸性苯酚：氯仿萃取，加入线性丙烯酰胺(8μl)。RNA在-20℃经ETOH沉淀，用DDW (43μl)重悬浮。接着进行DNA酶(Ambion)处理以消除残留的DNA片段。最后，在第二次酸性苯酚：氯仿萃取后，将沉淀物重悬于DDW中。

外来体(exosome)分离

根据厂商说明书，使用Exoquick试剂盒(ExoQuick? Exosome Precipitation Solution 目录号EXOQ20A-1, SBI)从血清中进行外来体分离。

qRT-PCR

按先前所述(Shi, R.和Chiang, V.L. 2005, Biotechniques. 39(4):519-25)，对RNA进行多腺苷酸化反应。简单地说，RNA在存在聚(A)聚合酶(PAP; NEB-M0276L)、MnCl2和ATP的情况下于37℃孵育1h。然后，使用带有共有序列(与反向引物互补)的寡聚dT引物，使用SuperScript II RT (Invitrogen)对总RNA进行反转录。接着，通过实时PCR进行cDNA扩增；该反应包含微RNA特异性正向引物、与特异性微RNA序列的3'和聚A衔接序列的一部分互补的TaqMan探针、以及与寡聚dT尾的共有3'序列互补的通用反向引物。

与RNA样品一起研究的阴性对照用于检测潜在的污染和/或非特异性扩增。对每个样品中的每个miRNA，测定荧光通过阈值(循环阈值-Ct)的循环数量。

血清miRNA分析

在由6个HF患者和6个健康个体的血清建立的4个库(pool)和1个阴性对照中测定在健康个体的心脏组织或血清中的370个miRNA (在由本发明人进行的先前实验中所检出)。这些miRNA中的186个在所述库的至少一个中被可靠检测出，与阴性对照相比具有至少3个CT的差异。使用RT-PCR，在所有60个参与者和2个阴性对照的血清中测定这些186个miRNA。从分析和标准化中忽略了7个miR，在血清样品中这些miR的中值Ct比阴性对照的中值Ct低3个Ct以内。

数据分析和统计

通过从每个miR的Ct中减去样品的所有miR的平均Ct，并加回度量常数(scaling constant) (整个样品集内的平均Ct)，使每个样品标准化。在组间比较标准化信号以找到可用于在组间进行区分的miR。通过双侧不成对t检验评估差异的显著性。使用Benjamini-Hochberg假发现率(FDR)方法(Benjamini等, 1995, J. Roy. Statist. Soc. Ser. B 57 no.1, 289-300)控制多假定测试，使用FDR=0.1。计算倍数变化作为两组中标准化Ct的中值的绝对差。

对于每个miRNA以及每个miRNA分数，区别HF组和对照组的能力被表征为接受者操作特性(ROC)曲线，并且计算ROC曲线下面积(AUC)。

对于盒形图和分数计算，使用倒数-标准化的信号，以使得高值表示高表达。通过从50中减去标准化CT，计算每个miR的倒数-标准化信号。

使用带有对数回归模型的留一交叉验证法(Leave-one-out cross validation)来模拟分类算法对未见样品的性能。重复再训练(retrain)逻辑斯谛回归模型，每一轮除去一个样品，并在分类器上测试每个样品，所述分类器在没有所述样品时经过训练。分数和临床/预后变量之间的关联：对于两分法变量，使用双侧不成对t检验比较两组内患者的分数。对于连续变量，使用双侧不成对t检验比较其值在上半部的样品的分数和其值在下半部的样品的分数。使用Spearman轶系数测定BNP和分数之间的相关性，因为关系是非线性的。

使用χ²检验比较分类变量。在小样品量的情况下，使用Fisher'精确检验。

实施例2

特异性微RNA用于血清样品中HF的检测

在所有血清样品中测定186个微RNA的水平，并按方法部分中所述使之标准化。比较在心力衰竭组中30个样品的信号与对照组中30个样品的信号。总共47个miR通过0.1的FDR阈值(截止p值为0.027)。在这些中，心力衰竭组的血清中18个miR的中值水平高于(超过1.2倍)对照组血清中所检出的miR。

图4A：在心力衰竭组vs.对照组中上调的miR

表4B：在心力衰竭组vs.对照组中下调的miR

图5：用于检测差异miR的引物和探针序列

最近研究表明，通过蛋白质复合物或者通过封装到囊泡例如外来体中，循环中的微RNA受到保护而免于富含RNA酶的环境。为探究在外来体级分(fraction)中是否存在miRNA水平上观察到的差异，在来自10个HF患者和10个对照的血清中测定miRNA的水平，所述血清经Exoquick试剂盒处理，所述试剂盒使具有外来体miRNA的样品富集。外来体级分中HF和对照之间在微RNA水平上的差异与在未分级血清中所见的差异类似。特别是，在HF患者的未分级血清中具有提高水平的前四个miRNA在HF患者的外来体级分中亦相对于对照提高。然而，在差异的强度上没有增加(数据未显示)。

当与对照血清比较时，HF患者血清中具有最显著(p<0.0005)提高水平的四个miRNA为：hsa-miR-423-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-320a和hsa-miR-92b。这些miR的盒形图显示于图1A-1D。

对每个样品计算分数(miR分数)作为这4个miR的平均标准化倒数信号，并通过常数(最小分数)调整分数使得分数的范围从0开始。在HF组和对照组之间比较miR分数。miR分数使得HF组和对照组之间显著区分，其中HF组的中值分数为2.9，而对照组的中值分数为1.3 (图3)。miR分数将HF组和对照组区分开的能力由具有0.90的ROC曲线下面积(AUC)的接受者操作特性(ROC)曲线来表征(图4)。通过将任何大于1.98的分数分类为“可能的”HF患者，对于HF患者的鉴定，我们得到90%的灵敏度和90%的特异性。使用miRNA分数区分HF和对照，具有逻辑斯谛回归分类器的留一交叉验证法得到类似的结果(90%的特异性和87%的灵敏度)。

实施例3

miR分数和临床相关性

测试miR分数与以下数种临床和预后参数的可能相关性：年龄、性别、体重指数(BMI)、缺血性病因、左心室射血分数(LVEF)、纽约心脏病协会(NYHA)功能性分类(NYHA)、左心室舒张末期内径(EDD)、左房内径(LAD)、BNP血清水平和心电图上的宽QRS宽度(>120ms)。分析按实施例1所述进行。在miR分数和年龄(p=0.58)、性别(p=0.9)、BMI (p=0.25)、缺血性病因(p=0.93)、LVEF (p=0.37)或NYHA (p=0.35)之间没有显著相关。然而，高miR分数与提高的血清BNP水平(p=0.002)、宽QRS (p=0.009)、EDD (p=0.03)和LAD (p=0.01)具有显著相关(分别为图6、7、8、9)。对于血清BNP水平，观察到与miR分数强相关(r=0.63; p=0.0003) (图5)。

上文具体实施方案的描述将如此充分地揭示本发明的总体性质，使得在无过多实验且不偏离一般构思的情况下，其他人可通过应用现有知识，容易地改变和/或修改所述具体实施方案用于各种应用，因此，所述改变和修改应在并且意旨在所公开实施方案的等同物的含义和范围内理解。虽然结合其具体实施方案对本发明进行了描述，但是显然许多备选方案、改变和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，意旨包括落入所附权利要求书的精神和宽泛范围内的所有这些备选方案、改变和变化。

应理解的是，详细说明和具体实施例(虽然其表示本发明的优选实施方案)仅通过举例说明给出，因为从该详细说明来看，本发明精神和范围内的各种变化和改变对本领域的技术人员而言将变得显而易见。

Claims (22)

1. 一种在受试者中诊断或预测心力衰竭的方法，所述方法包括：从受试者获得生物样品；在所述样品中测定核酸序列的表达谱，所述核酸序列选自SEQ ID NO：1-48、94-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列；和将所述表达谱与参考表达谱进行比较，其中与所述参考表达谱相比较，所述生物样品中的至少一个或多个核酸序列的表达谱水平上的差异是心力衰竭的诊断或预后。

2. 权利要求1的方法，其中选自SEQ ID NO：1-39、94-97、119-122、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对高的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。

3. 权利要求1的方法，其中选自SEQ ID NO：40-48、98-118、123-146、其片段或与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列的相对低的表达水平是心力衰竭的诊断或预后。

4. 权利要求1的方法，其中所述生物样品选自体液、细胞系和组织样品。

5. 权利要求4的方法，其中所述体液样品是血清样品。

6. 权利要求4的方法，其中所述体液样品是血液样品。

7. 权利要求1的方法，其中所述方法包括测定至少两个核酸序列的表达水平。

8. 权利要求7的方法，其中所述方法还包括组合所述核酸序列的一个或多个表达比。

9. 权利要求1的方法，其中通过选自以下的方法测定所述表达水平：核酸杂交、核酸扩增及其组合。

10. 权利要求9的方法，其中所述核酸扩增方法是实时PCR。

11. 权利要求10的方法，其中所述实时PCR方法包括正向和反向引物。

12. 权利要求11的方法，其中所述正向引物包含选自以下的序列：SEQ ID NO：49-66、86-89、147-171、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。

13. 权利要求12的方法，其中所述实时PCR方法还包括探针。

14. 权利要求13的方法，其中所述探针包含与选自SEQ ID NO：1-48、94-146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。

15. 权利要求14的方法，其中所述探针包含选自SEQ ID NO：67-84、90-93、172-196、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列。

16. 权利要求11的方法，其中所述反向引物包含SEQ ID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。

17. 一种用于在受试者中评价心脏病的试剂盒，所述试剂盒包括探针，所述探针包含与选自SEQ ID NO：1-48、94-146、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列互补的核酸序列。

18. 权利要求17的试剂盒，其中所述探针包含选自SEQ ID NO：67-84、90-93、172-196、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的核酸序列。

19. 权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒还包括正向引物，所述正向引物包含选自SEQ ID NO：49-66、86-89、147-171中的任何一个、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列的序列。

20. 权利要求17的试剂盒，其中所述试剂盒还包括反向引物，所述反向引物包含SEQ ID NO: 85、其片段和与其具有至少约80%同一性的序列。

21. 权利要求1的方法，还包括根据心脏病状况管控受试者的治疗。

22. 权利要求21的方法，其中管控受试者的治疗选自安排进一步的诊断测试、给予至少一种治疗剂、手术和不采取进一步的行动。

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