CN111494631B - 一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用 - Google Patents

一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用。本发明还公开了抑制miR‑98‑5p活性的物质或降低miR‑98‑5p含量的物质在如下1)‑6)中任一种中的应用：1)制备预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症的产品；2)制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品；3)制备提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平的产品；4)制备促进骨髓间充质干细胞产生IGF‑2的产品；5)制备增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性的产品；6)制备提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平的产品。本发明对揭示ITP发生机理研究提供了新思路，同时为临床治疗ITP提供了新靶点。

Description

一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用。
背景技术
原发性免疫性血小板减少症(ITP)是一种以单一血小板减少为特征的自身免疫性出血性疾病。免疫耐受异常介导的血小板破坏增加和血小板生成减少是ITP的经典发病机制。ITP临床常表现为皮肤黏膜出血、月经过多，甚至内脏或颅内出血等危及生命。间充质干细胞(MSCs)是骨髓造血微环境的重要成分，具有调控巨核细胞分化发育、促进巨核细胞形成血小板的作用。此外，MSCs还具有强大的免疫调控功能，在维持机体自身免疫耐受方面起重要作用。近年来以ITP骨髓微环境为切入点的相关研究取得了一定进展。研究发现，ITP骨髓MSCs凋亡增加，MSCs免疫抑制功能及促进巨核细胞发育形成血小板的功能受损，而具体ITP骨髓MSCs凋亡的分子机制尚不完全清楚。
微小RNA(miRNA)是一类内源性非编码RNA，miRNA通过与下游靶基因的3'非翻译区(3'UTR)互相作用而调节基因表达。由于miRNA具有分子小、检测途径多样、检测灵敏度高、易于体外合成及给药等特点，在疾病诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。
发明内容
第一方面，本发明保护抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质或沉默或敲低或突变miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质的新用途。
本发明保护抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质在如下1)-6)中任一种中的应用：
1)制备预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症的产品；
2)制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品；
3)制备提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平的产品；
4)制备促进骨髓间充质干细胞产生IGF-2的产品；
5)制备增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性的产品；
6)制备提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平的产品。
本发明还保护沉默或敲低或突变miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质在如下1)-6)中任一种中的应用：
1)制备预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症的产品；
2)制备抑制骨髓间充质干细胞凋亡的产品；
3)制备提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平的产品；
4)制备促进骨髓间充质干细胞产生IGF-2的产品；
5)制备增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性的产品；
6)制备提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平的产品。
第二方面，本发明保护一种产品；所述产品的活性成分为抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质或沉默或敲低或突变miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质；
所述产品的功能为如下A1)-A6)中任一种：
A1)预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症；
A2)抑制骨髓间充质干细胞凋亡；
A3)提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平；
A4)促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2；
A5)增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性；
A6)提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平。
上述第一方面和第二方面任一所述应用或产品中，所述促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2体现在提高骨髓间充质干细胞中IGF-2mRNA表达水平和/或提高骨髓间充质干细胞中IGF-2含量。
所述p53泛素化水平为β-TrCP依赖的p53泛素化水平。
上述第一方面和第二方面任一所述应用或产品中，所述A2)中，所述抑制骨髓间充质干细胞凋亡为通过调控IGF2BP1表达水平抑制骨髓间充质干细胞凋亡。进一步的，所述抑制骨髓间充质干细胞凋亡为通过提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平进而实现抑制骨髓间充质干细胞凋亡。
所述A4)中，所述促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2为通过调控IGF2BP1表达水平促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2。进一步的，所述促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2为通过提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平进而实现促进骨髓间充质干细胞中产生IGF-2。
所述A5)中，所述增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性为通过调控IGF2BP1表达水平增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性。进一步的，所述增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性为通过提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平进而实现增强骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性。
所述A6)中，所述提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平为通过调控IGF2BP1表达水平提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平。进一步的，所述提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平为通过提高骨髓间充质干细胞中IGF2BP1蛋白表达水平进而实现提高骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平。
上述第一方面和第二方面任一所述应用或产品中，所述抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质可为抑制miR-98-5p合成或促进miR-98-5p降解或抑制miR-98-5p功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。
所述抑制miR-98-5p基因表达的物质为抑制miR-98-5p基因表达的核酸分子或含有所述核酸分子的载体；所述核酸分子为将序列表中序列2所示的单链核酸分子和序列表中序列3所示的单链核酸分子退火后形成的核酸分子。
含有所述核酸分子的载体具体为含有所述核酸分子的pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体，即实施例2中的miR-98-5p下调表达载体(miR-98-5p-I)。
第三方面，本发明保护抑制IGF2BP1活性的物质或降低IGF2BP1含量的物质或沉默或敲低或突变IGF2BP1基因的物质或抑制IGF2BP1基因表达的物质的新用途。
本发明保护抑制IGF2BP1活性的物质或降低IGF2BP1含量的物质在如下(1)-(4)中任一种中的应用：
(1)制备促进骨髓间充质干细胞凋亡的产品；
(2)制备抑制骨髓间充质干细胞产生IGF-2的产品；
(3)制备抑制骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性的产品；
(4)制备抑制骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平的产品。
本发明还保护沉默或敲低或突变IGF2BP1基因的物质或抑制IGF2BP1基因表达的物质在如下(1)-(4)中任一种中的应用：
(1)制备促进骨髓间充质干细胞凋亡的产品；
(2)制备抑制骨髓间充质干细胞产生IGF-2的产品；
(3)制备抑制骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性的产品；
(4)制备抑制骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平的产品。
第四方面，本发明保护一种产品；所述产品的活性成分为抑制IGF2BP1活性的物质或降低IGF2BP1含量的物质或沉默或敲低或突变IGF2BP1基因的物质或抑制IGF2BP1基因表达的物质；
所述产品的功能为如下B1)-B4)中任一种：
B1)促进骨髓间充质干细胞凋亡；
B2)抑制骨髓间充质干细胞产生IGF-2；
B3)抑制骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路活性；
B4)抑制骨髓间充质干细胞中p53泛素化水平。
上述第三方面和第四方面任一所述应用或产品中，所述抑制骨髓间充质干细胞中产生IGF-2体现在降低骨髓间充质干细胞中IGF-2mRNA表达水平和/或降低骨髓间充质干细胞中IGF-2含量。
所述p53泛素化水平为β-TrCP依赖的p53泛素化水平。
上述第三方面和第四方面任一所述应用或产品中，所述抑制IGF2BP1活性的物质或降低IGF2BP1含量的物质可为抑制IGF2BP1合成或促进IGF2BP1降解或抑制IGF2BP1功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。
所述抑制IGF2BP1基因表达的物质包括但不限于序列表中序列4所示的核酸分子(5’-CAGTATGTGGGTGCCATTATT-3’)。
第五方面，本发明保护组合物甲或组合物乙；
所述组合物甲由上述抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质或沉默或敲低或突变miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质与间充质干细胞组成；
所述组合物乙由增强IGF2BP1活性的物质或提高IGF2BP1含量的物质或过表达IGF2BP1的物质与间充质干细胞组成。
上述组合物甲或组合物乙在制备预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
miR-98-5p或IGF2BP1作为标志物或靶点在开发诊断和/或预防和/或治疗原发性免疫性血小板减少症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述应用或产品中，所述miR-98-5p为如下至少一种：miR-98-5p初始miRNA、miR-98-5p前体miRNA、成熟miR-98-5p。所述miR-98-5p初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达为成熟miR-98-5p，所述miR-98-5p前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达为成熟miR-98-5p。虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miR-98-5p，但是本领域技术人员可以预期，初始miRNA(pri-miR-98-5p)、前体miRNA(pre-miR-98-5p)将可以获得与成熟miR-98-5p同样的技术效果，因为细胞有进一步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA的能力。
所述成熟miR-98-5p的核苷酸序列为序列表中序列1所示。
所述IGF2BP1的基因序列的GeneID为10642。
本发明采用原发性免疫性血小板减少症(ITP)骨髓间充质干细胞(MSCs)mRNA和miRNA芯片表达谱分析，筛选差异表达miRNAs。经验证分析，首次发现miR-98-5p在ITP骨髓MSCs中高表达，其表达量与MSCs凋亡呈正相关。进一步研究表明，上调的miR-98-5p靶向抑制IGF2BP1蛋白表达水平，进一步抑制IGF-2的产生和PI3K/Akt信号通路活性、抑制β-TrCP依赖的p53泛素化水平导致p53增高，从而介导ITP骨髓MSCs凋亡，是ITP重要的发病机制。体内实验进一步证实miR-98-5p过表达的MSCs对ITP的治疗作用减弱。本发明对揭示ITP发生机理研究提供了新思路，同时为临床治疗ITP提供了新靶点。
附图说明
图1为芯片分析差异miRNAs。图A为与异常mRNAs表达相关的32种差异miRNAs在ITP骨髓MSCs中异常表达；图B为32种差异miRNAs的差异倍数。
图2为验证miR-98-5p在ITP骨髓MSCs中高表达。图A为荧光定量PCR验证ITP骨髓MSCs中miR-98-5p表达水平；图B为miR-98-5p表达量与ITP骨髓MSCs凋亡水平呈显著正相关。
图3为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达对MSCs凋亡水平的影响。图A为载体结构示意图；图B为正向序列和反向序列的结构示意图；图C为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达的MSCs的转染率；图D为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达的MSCs的miR-98-5p表达水平；图E为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达的MSCs的细胞凋亡水平。
图4为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达对IGF2BP1表达水平的影响及IGF2BP1表达水平对骨髓MSCs凋亡水平的影响。图A为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达不影响IGF2BP1 mRNA表达水平；图B为过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达可抑制或提高IGF2BP1蛋白表达水平；图C为抑制IGF2BP1表达可促进骨髓MSCs凋亡。
图5为过表达miR-98-5p可抑制IGF-2的产生及PI3K/Akt通路活性。图A为过表达miR-98-5p可抑制MSCs中IGF-2mRNA表达水平及IGF-2产生；图B为过表达miR-98-5p可抑制MSCs中PI3K/Akt通路活性。
图6为miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制IGF-2的产生及PI3K/Akt通路活性。图A为miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制MSCs中IGF-2mRNA表达水平及IGF-2产生；图B为miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制MSCs中PI3K/Akt通路活性。
图7为miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制β-TrCP介导的p53泛素化水平。图A为ITP骨髓MSCs中β-TrCP介导的p53泛素化水平降低；图B为过表达miR-98-5p抑制正常骨髓MSCs中的p53泛素化水平；图C为抑制miR-98-5p表达可提高ITP骨髓MSCs中的p53泛素化水平；图D为抑制IGF2BP1表达可抑制正常骨髓MSCs中的p53泛素化水平；图E为IGF2BP1参与miR-98-5p介导的ITP骨髓MSCs中p53泛素化水平下调。
图8为体内实验表明miR-98-5p过表达减弱MSCs对ITP小鼠的治疗效应。图A为MSCs治疗组的ITP小鼠血小板计数；图B为miR-98-5p过表达MSCs治疗组的ITP小鼠血小板计数；图C为MSCs治疗组的ITP小鼠血清炎性细胞因子部分恢复，miR-98-5p过表达MSCs治疗组的ITP小鼠血清炎性细胞因子未明显恢复。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的C57BL/6J CD61 KO纯合子小鼠(B6.129S2-Itgb3tm1Hyn/JSemJ；Stock No:008819)记载于文献“Hou Y,Feng Q,Xu M,et al.High-dose dexamethasonecorrects impaired myeloid-derived suppressor cell function via Ets1 in immunethrombocytopenia[J].Blood,2016,127(12):1587.”中，公众可从北京大学人民医院处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、验证miR-98-5p在ITP骨髓MSCs中高表达
一、miR-98-5p的发现
使用TargetScan和Miranda algorithms预测miRNA靶向调控的mRNA，分析芯片数据，筛查与ITP骨髓MSCs异常mRNA相关的差异miRNA(图1A)。在筛查到的32种差异miRNAs中，miR-98-5p的差异倍数最高(图1B)。用miRbase(http://www.mirbase.org)数据库获得成熟miR-98-5p的核苷酸序列。miR-98-5p核苷酸序列具体如下：5’-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3’(序列1)。
二、验证miR-98-5p在ITP骨髓MSCs中高表达
受试者样本：2018年11月至2019年3月期间来源于北京大学人民医院血液科的12例初诊ITP患者(患者均知情同意)，并选取同期12例健康志愿者做对照。采集受试者骨髓标本，按照文献“Zhang JM,Feng FE,Wang QM,Zhu XL,Fu HX,Xu LP,Liu KY,Huang XJ,ZhangXH.(2016).Platelet-Derived Growth Factor-BB Protects Mesenchymal Stem Cells(MSCs)Derived From Immune Thrombocytopenia Patients Against Apoptosis andSenescence and Maintains MSCMediated Immunosuppression.Stem Cells TranslMed.5,1631-1643”中的方法从骨髓标本中分离培养骨髓MSCs。
1、荧光定量PCR检测miR-98-5p表达水平
荧光定量PCR验证miR-98-5p在ITP骨髓MSCs中的表达水平。依据成熟miR-98-5p核苷酸序列设计合成引物，以U6为内参对照。miR-98-5p基因的引物及内参基因的引物的设计与合成均委托锐博生物完成。具体实施方法如下：用Trizol裂解法提取细胞总RNA；用RNase-Free DNase对RNA进行处理，去除残留DNA；使用M-MLV反转录试剂盒对RNA进行反转录获得cDNA；以cDNA为模板用ABI StepOne Plus型荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
12例ITP患者和12例健康志愿者骨髓MSCs中miR-98-5p相对表达量的检测结果如表1和图2A所示。结果表明：miR-98-5p在ITP骨髓MSCs异常高表达。
表1.12例ITP患者和12例健康志愿者骨髓MSCs中miR-98-5p相对表达量
Figure BDA0002469006500000071
2、流式细胞术Annexin V/PI检测ITP骨髓MSCs细胞凋亡水平
采用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD 556547，USA)试剂盒通过流式细胞术检测12例ITP患者骨髓MSCs细胞凋亡水平，分析miR-98-5p表达量与ITP骨髓MSCs凋亡的相关性。
结果如图2B所示。结果表明：miR-98-5p相对表达量与ITP骨髓MSCs凋亡水平呈显著正相关。
实施例2、抑制miR-98-5p表达的物质在抑制骨髓MSCs凋亡中的应用
一、表达载体的构建
1、正向序列和反向序列的设计与合成
根据miRbase数据库中人源miR-98-5p序列信息和质粒载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Life Technologies，USA)结构(图3A)设计并合成如下序列(上下游加上载体互补序列位点，正反向序列设计见图3B)：
miR-98-5p-M forward：5’-TGCTGAACAAUACAACUUACUACCUCAGTTTTGGCCACTGACUGAGGUAGAGUUGUAUUGUU-3’；
miR-98-5p-M reverse：5’-CCTGAACAAUACCUUACUACCUCAGTCAGTGGCCAAAACUGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUUC-3’；
miR-98-5p-I forward：5’-TGCTGGGGAAAGUAGUAAGUUGUAUAGGTTTTGGCCACTGACCUAUACAAUACUACUUUCCC-3’(序列2)；
miR-98-5p-I reverse：5’-CCTGGGGAAAGUUAAGUUGUAUAGGTCAGTGGCCAAAACCUAUACAACUUACUACUUUCCCC-3’(序列3)；
miR-98-5p-NC forward：5’-TGCTGAAACGUGACACGUUCGGAGAAGTTTTGGCCACTGACUUCUCCGAGUGUCACGUTT-3’；
miR-98-5p-NC reverse：5’-CCTGAAACGUGACGUUCGGAGAAGTCAGTGGCCAAAACUUCUCCGAACGUGUCACGUTTC-3’。
2、重组载体的合成
将miR-98-5p-M forward和miR-98-5p-M reverse退火后得到的核酸分子与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Life Technologies，USA)进行连接(核酸分子的插入位置具体见图3A)，得到重组载体，将该重组载体转入TOP10感受态细胞中，挑取阳性克隆经菌液PCR鉴定获得阳性重组载体，并将其记作miR-98-5p过表达载体(miR-98-5p-M)。miR-98-5p过表达载体(miR-98-5p-M)导入细胞后使细胞中过表达成熟miR-98-5p。
将miR-98-5p-I forward和miR-98-5p-I reverse退火后得到的核酸分子与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Life Technologies，USA)进行连接(核酸分子的插入位置具体见图3A)，得到重组载体，将该重组载体转入TOP10感受态细胞中，挑取阳性克隆经菌液PCR鉴定获得阳性重组载体，并将其记作miR-98-5p下调表达载体(miR-98-5p-I)。miR-98-5p下调表达载体(miR-98-5p-I)导入细胞后抑制细胞中miR-98-5p表达。
将miR-98-5p-NC forward和miR-98-5p-NC reverse退火后得到的核酸分子与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(Life Technologies，USA)进行连接(核酸分子的插入位置具体见图3A)，得到重组载体，将该重组载体转入TOP10感受态细胞中，挑取阳性克隆经菌液PCR鉴定获得阳性重组载体，并将其记作miR-98-5p无义表达载体(miR-98-5p-NC)。miR-98-5p无义表达载体(miR-98-5p-NC)导入细胞后对细胞中miR-98-5p表达无特定影响。
上述退火的反应体系具体如下(总体积20μL)：正向序列(200μM)5μL、反向序列(200μM)5μL、10X Oligo Annealing Buffer 2μL、DNase/RNase-Free Water 8μL。
上述退火的反应条件具体如下：
95℃10min
95℃to 85℃(-2.0℃/s)
85℃1min
85℃to 75℃(-0.3℃/s)
75℃1min
75℃to 65℃(-0.3℃/s)
65℃1min
65℃to 55℃(-0.3℃/s)
55℃1min
55℃to 45℃(-0.3℃/s)
45℃1min
45℃to 35℃(-0.3℃/s)
35℃1min
35℃to 25℃(-0.3℃/s)
25℃1min后终止退火程序，再放置10min后取出产物。
上述连接的反应体系如下(总体积20μL)：5X Ligation Buffer 4μL、pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR(linearized)2μL、核酸分子(退火后得到的核酸分子)4μL、T4 DNA Ligase(1U/μl)1μL、DNase/RNase-Free Water 9μL。
上述连接的反应条件如下：室温孵育15min。
二、miR-98-5p对MSCs凋亡水平的影响
1、实验方法
将步骤一中构建的载体转染正常骨髓MSCs(简称HC-MSCs)或ITP骨髓MSCs(简称ITP-MSCs)。具体步骤如下：将待转染的MSCs弃掉培养基后加少量OPTI MEM培养基润洗，再加入6mL OPTI MEM培养基后放置培养箱中备用。将步骤一中构建的载体加入500μL OPTIMEM培养基中；再将30μL脂质体LTX加入另一管500μL OPTI MEM中混匀，室温放置5min后将两管混匀，体积为1mL。脂质体LTX与步骤一中构建的载体于室温包被30min，包被好后加入到MSCs细胞培养皿中，6-7h后更换为细胞所需的含10％FBS的完全培养基。根据转染载体和MSCs细胞的不同，实验分成如下六组，每组处理方法如下：
HC(HC-MSCs):正常骨髓MSCs(简称HC-MSCs)。
miR-98-5p-M(HC-MSCs):将miR-98-5p-M载体转染正常骨髓MSCs，转染后继续培养细胞，得到过表达miR-98-5p的HC-MSCs。
miR-98-5p-NC(HC-MSCs):将miR-98-5p-NC载体转染正常骨髓MSCs，转染后继续培养细胞，得到对照的HC-MSCs。
ITP(ITP-MSCs):ITP骨髓MSCs(简称ITP-MSCs)。
miR-98-5p-I(ITP-MSCs):将miR-98-5p-I载体转染ITP骨髓MSCs，转染后继续培养细胞，得到抑制miR-98-5p表达的ITP-MSCs。
miR-98-5p-NC(ITP-MSCs):将miR-98-5p-NC载体转染ITP骨髓MSCs，转染后继续培养细胞，得到对照的ITP-MSCs。
2、转染率检测
转染后于5％CO2和37℃条件下继续培养，培养48h后在荧光显微镜下下观察各组细胞。并统计转染率。转染率的计算公式如下：转染率＝(带GFP荧光的细胞数目/总细胞数目)×100％。
结果如图3C所示(第1行细胞为质粒转染前在荧光显微镜下观察到图片，第2列为质粒转染后在荧光显微镜下观察到图片)。结果表明：各组细胞的转染率均在75％以上。
3、miR-98-5p表达水平检测
转染后于5％CO2和37℃条件下继续培养，分别于培养24h、48h和72h后采用荧光定量PCR检测各组细胞中miR-98-5p表达水平，具体检测方法同实施例1步骤二中的1。
结果如图3D所示。结果表明：miR-98-5p-M和miR-98-5p-I在转染后培养24h后对各组细胞中miR-98-5p表达的抑制作用和促进作用最强。
4、细胞凋亡水平检测
转染后于5％CO2和37℃条件下继续培养，培养48h后采用FITC Annexin VApoptosis Detection Kit I(BD 556547，USA)试剂盒通过流式细胞术检测各组细胞凋亡水平。
结果如图3E所示。结果表明：过表达miR-98-5p后正常骨髓MSCs凋亡增加，抑制miR-98-5p表达后ITP骨髓MSCs凋亡减少。说明过表达miR-98-5p可促进骨髓MSCs凋亡，抑制miR-98-5p表达可抑制骨髓MSCs凋亡。
实施例3、miR-98-5p转录后抑制IGF2BP1介导ITP骨髓MSCs凋亡
一、miR-98-5p对IGF2BP1的抑制作用
使用miRbase数据库预测miR-98-5p结合IGF2BP1 mRNA 3’UTR的位点。通过荧光素酶报告基因实验进一步验证了miR-98-5p结合IGF2BP1 mRNA 3’UTR的位点。为了确定miR-98-5p对IGF2BP1是否有抑制作用，采用荧光定量PCR和蛋白印迹法检测骨髓MSCs中IGF2BP1mRNA表达水平和蛋白表达水平。
1、荧光定量PCR检测骨髓MSCs中IGF2BP1 mRNA表达水平
荧光定量PCR检测骨髓MSCs(实施例2步骤二中六个分组分别获得的骨髓MSCs)中IGF2BP1 mRNA表达水平，检测步骤同实施例1步骤二中的1中的方法。引物序列如下：
IGF2BP1-forward：CTCCGATAGATCTGCCCTCTTG；
IGF2BP1-reverse：AGCTGTTGCAGCCTAGTCCACT。
2、蛋白印迹法检测骨髓MSCs中IGF2BP1蛋白表达水平
蛋白印迹法检测骨髓MSCs(实施例2步骤二中六个分组分别获得的骨髓MSCs)中IGF2BP1蛋白表达水平，蛋白印迹法中所使用的抗体为抗IGF2BP1抗体(Abcam，ab82968，UK)。
结果如图4A和图4B所示。结果表明：IGF2BP1是miR-98-5p下游的靶基因。过表达miR-98-5p或抑制miR-98-5p表达不影响IGF2BP1 mRNA表达水平，但可抑制或上调IGF2BP1蛋白表达水平。说明过表达miR-98-5p可抑制IGF2BP1蛋白表达水平，抑制miR-98-5p表达可提高IGF2BP1蛋白表达水平。
二、IGF2BP1在ITP骨髓MSCs凋亡中的作用
1、IGF2BP1干扰RNA的构建
根据IGF2BP1基因序列(NCBI GeneID：10642)设计干扰IGF2BP1基因表达的siRNA。
siR-IGF2BP1(干扰IGF2BP1基因表达的siRNA)：5’-CAGTATGTGGGTGCCATTATT-3’(序列4)。
siR-scramble(对照siRNA)：5’-CGGGAAAGTAGAATTACAAGG-3’。
2、抑制IGF2BP1表达的MSCs的构建
将步骤1构建的siRNA转染MSCs。siRNA具体转染步骤如下：将待转染MSCs弃掉培养液后加少量OPTI MEM培养基，再加入6mL OPTI MEM培养基后放置培养箱备用。将5μLsiRNA-IGF2BP1和对照siRNA分别加250μL OPTI MEM培养基中。再将6μL LipofectamineRNAiMAX加入另一管250μL OPTI MEM中混匀，室温放置5min后将两管混匀，体积为500μL。脂质体与siRNA于室温包被30min，包被好后加入到MSCs细胞培养皿，6-7h后更换为细胞所需的含10％FBS的完全培养基，在5％CO2和37℃条件继续培养72h后流式细胞术检测MSCs凋亡。确定IGF2BP1在ITP骨髓MSCs凋亡中的作用。根据转染的载体和/或siRNA不同(载体转染方法同实施例2中的方法)，实验分成如下五组，每组处理方法如下：
siR-IGF2BP1(HC-MSCs)：将siR-IGF2BP1转染正常骨髓MSCs，得到含有siR-IGF2BP1的HC-MSCs。
siR-scramble(HC-MSCs)：将siR-scramble转染正常骨髓MSCs，得到含有siR-scramble的HC-MSCs。
MiR-98-5p-I(ITP-MSCs)：将miR-98-5p-I载体转染ITP骨髓MSCs，得到含有MiR-98-5p-I的ITP-MSCs。
MiR-98-5p-I+siR-IGF2BP1(ITP-MSCs)：将miR-98-5p-I载体和siR-IGF2BP1转染ITP骨髓MSCs，得到含有MiR-98-5p-I和siR-IGF2BP1的ITP-MSCs。
MiR-98-5p-I+siR-scramble(ITP-MSCs)：将miR-98-5p-I载体和siR-scramble转染ITP骨髓MSCs，得到含有MiR-98-5p-I和siR-scramble的ITP-MSCs。
结果如图4C所示。结果表明：抑制IGF2BP1表达可促进MSCs凋亡。说明miR-98-5p转录后抑制IGF2BP1介导ITP骨髓MSCs凋亡。
实施例4、miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制IGF-2产生和PI3K/Akt通路活性
一、基于miR-98-5p的IGF-2及PI3K/Akt通路活性检测
1、荧光定量PCR和ELISA检测IGF-2表达水平
(1)采用荧光定量PCR检测实施例2步骤二中六个分组获得的骨髓MSCs中的胰岛素样生长因子(IGF-2)mRNA表达水平，检测步骤同实施例1步骤二中的1中的方法。引物序列如下：
IGF-2-forward：CTCCTGGAGACGTACTGTGCTACC；
IGF-2-reverse：GTGGACTGCTTCCAGGTGTCATATT。
(2)采用ELISA检测实施例2步骤二中六个分组获得的骨髓MSCs中的IGF-2含量。具体检测方法如下：按说明书稀释对应的标准品，加入酶标板内，双孔重复；将收集的骨髓上及细胞培养上清加入至酶标板内，室温反应2h；用洗涤液洗涤4次，加入对应酶标抗体，200ul/孔，室温反应2h；加入50ul终止液，450nm下读取OD值，以标准品浓度为横坐标，以OD值为纵坐标绘制标准曲线，再将样品测得的OD值带入标准曲线获得样品中目的细胞因子的含量。
2、蛋白印迹法检测PI3K/Akt通路活性
蛋白印迹法检测实施例2步骤二中六个分组获得的骨髓MSCs中p-IGF1R、IGF1R、p-AKT、Akt、p-PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH蛋白表达水平，蛋白印迹法中所使用的抗体为抗p-IGF1R(Tyr1135)(CST，3918)、抗IGF1R(CST，9750)、抗p-Akt(Ser473)(CST，4060)、抗Akt(CST，4691)、抗p-PI3K p85(Tyr607)(Abcam，ab182651)、抗Bcl-2(CST，15071)、抗Bax(CST，2772)、抗Caspase 3(Proteintech，66470-2-Ig)和抗GAPDH(CST，2118)抗体。
结果如图5所示。结果表明：过表达miR-98-5p可抑制正常骨髓MSCs IGF-2产生和PI3K/Akt通路活性；抑制miR-98-5p表达可促进ITP骨髓MSCs IGF-2产生并增强PI3K/Akt通路活性。
二、基于IGF2BP1的IGF-2及PI3K/Akt通路活性检测
1、荧光定量PCR和ELISA检测IGF-2表达水平
(1)采用荧光定量PCR检测实施例3步骤二中五个分组获得的骨髓MSCs中的IGF-2mRNA表达水平，检测步骤同实施例1步骤二中的1中的方法。
(2)采用ELISA检测实施例3步骤二中五个分组获得的骨髓MSCs中的IGF-2含量。
2、蛋白印迹法检测PI3K/Akt通路活性
蛋白印迹法检测实施例3步骤二中五个分组获得的骨髓MSCs中p-IGF1R、IGF1R、p-AKT、Akt、p-PI3K、Bcl-2、Bax、Caspase-3和GAPDH蛋白表达水平，蛋白印迹法中所使用的抗体为抗p-IGF1R(Tyr1135)(CST，3918)、抗IGF1R(CST，9750)、抗p-Akt(Ser473)(CST，4060)、抗Akt(CST，4691)、抗p-PI3K p85(Tyr607)(Abcam，ab182651)、抗Bcl-2(CST，15071)、抗Bax(CST，2772)、抗Caspase 3(Proteintech，66470-2-Ig)和抗GAPDH(CST，2118)抗体。
结果如图6所示。结果表明：抑制IGF2BP1表达后，骨髓MSCs IGF-2产生减少以及PI3K/Akt通路活性下降。说明miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制IGF-2产生和PI3K/Akt通路活性。
实施例5、miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制β-TrCP介导的p53泛素化水平
一、基于miR-98-5p的免疫共沉淀检测β-TrCP介导的p53泛素化水平
采用免疫共沉淀检测实施例2步骤二中六个分组获得的骨髓MSCs中的β-TrCP介导的p53泛素化水平。具体步骤如下：待检测细胞先用20uM蛋白酶体抑制剂MG132处理8h，收集细胞用PBS洗涤，再用1ml裂解缓冲液重悬细胞，置于冰上20min，离心取上清；取部分上清加上样缓冲液，沸水煮10min用于蛋白印迹法检测；剩余上清加抗p53抗体进行免疫沉淀反应，4℃孵育过夜，再加入蛋白G琼脂糖珠60μl于4℃下摇晃孵育3h；4℃、12000rpm离心3min，将上清小心吸去，琼脂糖珠用免疫沉淀缓冲液洗涤2次，用裂解缓冲液清洗3遍后加入上样缓冲液，沸水煮10min，用蛋白印迹法分析p53泛素化水平。蛋白印迹法中所使用的抗体为抗p53(Abcam，ab26)、抗Ubiquitin(Abcam，ab7780)和抗GAPDH(CST，2118)抗体。
二、基于IGF2BP1的免疫共沉淀检测β-TrCP介导的p53泛素化水平
采用免疫共沉淀检测实施例3步骤二中五个分组获得的骨髓MSCs中的β-TrCP介导的p53泛素化水平。
结果如图7所示。结果表明：过表达miR-98-5p可抑制正常骨髓MSCs中的p53泛素化水平；抑制miR-98-5p表达可上调ITP骨髓MSCs的p53泛素化水平。抑制IGF2BP1表达可下调正常骨髓MSCs中的p53泛素化水平；IGF2BP1参与miR-98-5p介导的ITP骨髓MSCs中的p53泛素化水平下调。说明miR-98-5p靶向调控IGF2BP1抑制β-TrCP介导的p53泛素化水平，从而导致ITP骨髓MSCs中p53水平升高，介导MSCs凋亡。
实施例6、miR-98-5p过表达减弱MSCs对ITP小鼠的治疗效应
一、构建ITP小鼠模型
按照文献“Chow L,Aslam R,Speck ER,Kim M,Cridland N,Webster ML,Chen PG,Sahib K,Ni HY,Lazarus AH,et al.(2010).A murine model of severe immunethrombocytopenia is induced by antibody-and CD8(+)T cell-mediated responsesthat are differentially sensitive to therapy.Blood.115,1247-1253.”中的实验方法，用洗涤的野生型C57BL/6J小鼠血小板对8-12周龄的C57BL/6J CD61 KO纯合子小鼠(B6.129S2-Itgb3tm1Hyn/JSemJ；Stock No:008819)进行尾静脉注射，连续免疫3周，每周1次，每次注射剂量100ul(含1×108个血小板)，第4周处死C57BL/6J CD61 KO小鼠，取脾脏研磨制备脾细胞悬液并冻存备用；给野生型C57BL/6J小鼠单次腹腔注射脾细胞悬液(5×106个细胞)，1周后检测C57BL/6J小鼠外周血中的血小板数目，血小板计数下降，表明ITP小鼠模型构建成功。ITP小鼠表现出明显的皮下出血。
二、实验方法及结果
按照处理方法不同，试验分成五组，每组5只小鼠。各组处理方法具体如下：
WT:野生型C57BL/6J小鼠。
MSCs:在注射脾细胞后第二天，将200ul正常骨髓MSCs溶液(溶剂为PBS溶液，Solarbio(P1020))(含6×106个细胞)单次腹腔输注给ITP小鼠。
PBS:在注射脾细胞后第二天，将200ul PBS溶液单次腹腔输注给ITP小鼠。
miR-98-5p-M MSCs:在注射脾细胞后第二天，将200ul实施例2步骤二中制备的过表达miR-98-5p的HC-MSCs溶液(溶剂为PBS溶液)(含6×106个细胞)单次腹腔输注给ITP小鼠。
miR-98-5p-NC MSCs:在注射脾细胞后第二天，将200ul实施例2步骤二中制备的正常miR-98-5p的HC-MSCs溶液(溶剂为PBS溶液)(含6×106个细胞)单次腹腔输注给ITP小鼠模型。
分别于注射后第1、4、8和12天后检测各组小鼠外周血中的血小板数目，观察血小板计数变化，于注射后第12天处死小鼠，取血清ELISA检测炎性细胞因子IFN-γ、IL-10和TGF-β的变化，所用ELISA试剂盒分别如下：Mouse Interferon gamma ELISA Kit(Abcam，ab100689)、Mouse IL-10ELISA Kit(Abcam，ab255729)和Mouse TGF beta 1ELISA Kit(Abcam，ab119557)。具体步骤同实施例4步骤一中的方法。
结果如图8所示。结果表明：正常骨髓MSCs治疗的ITP小鼠血小板计数恢复较快，ITP小鼠血清炎性细胞因子也部分恢复至正常水平；而miR-98-5p过表达MSCs治疗的ITP小鼠血小板计数恢复较慢，ITP小鼠血清炎性细胞因子也未能恢复。说明miR-98-5p过表达减弱MSCs对ITP小鼠的治疗效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大学人民医院
<120> 一种原发性免疫性血小板减少症miRNA标记物及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ugagguagua aguuguauug uu 22
<210> 2
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgctggggaa aguaguaagu uguauaggtt ttggccactg accuauacaa uacuacuuuc 60
cc 62
<210> 3
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cctggggaaa guuaaguugu auaggtcagt ggccaaaacc uauacaacuu acuacuuucc 60
cc 62
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cagtatgtgg gtgccattat t 21

Claims (3)

1.抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质在制备治疗原发性免疫性血小板减少症的产品中的应用；
所述抑制miR-98-5p活性的物质或所述降低miR-98-5p含量的物质为抑制miR-98-5p基因表达的核酸分子或含有所述核酸分子的载体；所述核酸分子为将序列表中序列2所示的单链核酸分子和序列表中序列3所示的单链核酸分子退火后形成的核酸分子。
2.沉默或敲低miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质在制备治疗原发性免疫性血小板减少症的产品中的应用；
所述沉默或敲低miR-98-5p基因的物质或所述抑制miR-98-5p基因表达的物质为抑制miR-98-5p基因表达的核酸分子或含有所述核酸分子的载体；所述核酸分子为将序列表中序列2所示的单链核酸分子和序列表中序列3所示的单链核酸分子退火后形成的核酸分子。
3.组合物甲在制备治疗原发性免疫性血小板减少症的产品中的应用；
所述组合物甲由抑制miR-98-5p活性的物质或降低miR-98-5p含量的物质或沉默或敲低miR-98-5p基因的物质或抑制miR-98-5p基因表达的物质与间充质干细胞组成；
所述抑制miR-98-5p活性的物质或所述降低miR-98-5p含量的物质或所述沉默或敲低miR-98-5p基因的物质或所述抑制miR-98-5p基因表达的物质为抑制miR-98-5p基因表达的核酸分子或含有所述核酸分子的载体；所述核酸分子为将序列表中序列2所示的单链核酸分子和序列表中序列3所示的单链核酸分子退火后形成的核酸分子。
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