CN113456621B - 姜黄素代谢物在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供姜黄素代谢物在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用。本发明通过对大鼠MIRI模型的干预作用研究，发现CUR及OHC均可改善受损心功能及血清心肌酶表现，减轻心室扩大程度，降低心肌细胞凋亡及组织纤维化样改变，减轻MIRI的病理表现，且OHC的改善作用略优。因此，本发明将有助于了解MIRI疾病进程的分子机制，为解释CUR及其活性代谢产物OHC的药效作用机制，提供有价值的科学依据。

Description

姜黄素代谢物在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及姜黄素代谢物在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用。

背景技术

缺血性心肌病的发病率呈逐年上升趋势，严重危害人类健康。在临床治疗指南中，尽早恢复缺血区的血液灌注是抢救的关键，但灌注的同时亦带来更严重的损伤，这在短时内还会进一步加重缺血损伤，继而引发心室重构、心律失常等症状，最终甚至发展为心力衰竭。这种恢复血液灌注而进一步加重心肌损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury，MIRI)。MIRI是一个多因素参与的复杂的病理生理过程，在临床上十分常见，如心梗后溶栓及支架植入术、体外循环下心内直视手术及冠状动脉(冠脉)搭桥术等。其发生机制涉及炎性反应、细胞凋亡、氧化应激等多种因素。

姜黄素(Curcumin,CUR)是姜科植物姜黄(Curcuma longa L.)根中提取的主要活性成份，对于心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用已经有了广泛的研究基础，但其应用一直受限于稳定性差、生物利用率低等因素。因此，姜黄素的体内活性代谢产物如四氢姜黄素(THC)和八氢姜黄素(OHC)，成为近几年国内外的生物医学研究热点。但对于代谢物是否同样具有干预MIRI的作用未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了姜黄素代谢物在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用。

CUR及OHC干预MIRI大鼠心功能的实验研究

取SPF级雄性SD大鼠，体重约200g，连接

数据采集分析系统记录术间心电图，采用结扎大鼠冠状动脉左前降支1小时后恢复血流灌注的方法建立心肌缺血再灌注损伤模型，假手术组行同样的开胸手术，左前降支只穿线不结扎。术后24小时，成活大鼠再次连接针形电极记录心电图，选取造模合格大鼠随机分为模型组(MIRI)、姜黄素组(CUR)、八氢姜黄素组(OHC)、八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)，腹腔注射(i.p.)给药，假手术组(Sham)和模型组(MIRI)i.p.给予0.2％吐温的生理盐水溶液，连续4周。

实验周期内，持续动态观察大鼠血清心肌酶：肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)水平变化；超声心电图检测大鼠术前、术后7d、28d的左室结构及功能变化；病理组织检测：术后7d、28d H&E染色观察心肌组织病理改变，TUNEL染色检测干预7d后各组大鼠心肌细胞凋亡指数。Masson染色检测干预28d后各组大鼠心肌纤维化程度。

结果：

(1)M型超声检查心脏左室结果及功能水平发现，CUR及OHC干预7d即可显著降低左室收缩末期内径(LVESD)和收缩末期容积(LVESV)，减轻MIRI后心室扩张程度；并能显著增加射血份数(EF)、短轴收缩率(FS)及每搏输出量(CO)，改善心肌收缩功能及顺应性；

(2)与假手术组比较，MIRI大鼠术后各时间点心肌酶三项均显著升高，在再灌注24h后MIRI大鼠心肌酶水平明显回落，后续又持续升高。CUR及OHC干预后部分抑制了MIRI引起的血清心肌酶升高，7d后可显著降低血清CK、LDH、α-HBDH水平，且OHC对LDH的抑制作用与CUR比有显著性差异；

(3)组织HE染色结果显示，假手术组心肌组织结构完整；MIRI组大鼠7d表现较严重的部分心肌细胞坏死，可见大量中性粒细胞聚集，炎症细胞浸润明显，28d样本发现明显的室壁变薄，同时伴有组织纤维化样改变；CUR及OHC可明显干预7d MIRI大鼠炎性病变，减少心脏组织炎症细胞浸润；并能减轻28d MIRI大鼠心肌纤维化程度，有改善病变的趋势，其中以高剂量OHC效果更为显著；

(4)通过TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡的情况，发现7d MIRI组大鼠心肌组织凋亡数目教假手术组显著增加，而相应CUR和OHC干预大鼠心肌中凋亡的细胞要少于MIRI组大鼠。

(5)Masson染色结果显示，CUR及OHC干预有改善心脏切片心肌纤维化的趋势，其中OHC组有显著性差异。

本发明通过对大鼠MIRI模型的干预作用研究，发现CUR及OHC均可改善受损心功能及血清心肌酶表现，减轻心室扩大程度，降低心肌细胞凋亡及组织纤维化样改变，减轻MIRI的病理表现，且OHC的改善作用略优。

综上所述，药物的活性代谢产物是未来中药现代化研究的一个可期方向，本发明将有助于了解MIRI疾病进程的分子机制，为解释CUR及其活性代谢产物OHC的药效作用机制，提供有价值的科学依据。

附图说明

图1为大鼠假手术组和MIRI组在不同时间点缺血再灌注的II导联心电图。假手术组(A)；假手术组24h(B)；心肌缺血60分钟(C)；心肌缺血再灌注损伤后10分钟(D)；心肌缺血再灌注损伤后60分钟(E)；心肌缺血再灌注损伤后24小时(F)；

图2为对假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)的左心室的超声检测图。B模式(B-mode)为胸骨旁长轴视图；M模式(M-mode)为短轴视图；

图3为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)分别在0天、7天和28天的左室收缩末期内径(LVESD)、收缩末期容积(LVESV)、射血分数(LVEF)、短轴收缩率(FS)及每搏输出量(CO)等方面的变化对比图；

图4为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)于大鼠术前、以及再灌注后1h、1d、3d、7d、28d多个时间点检测大鼠心肌酶三项变化图；

图5为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)在7天、28天的大鼠心肌组织样本(HE染色)图；

图6为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)的大鼠心肌细胞凋亡情况(A)和凋亡定量分析(B)；

图7为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、姜黄素组、八氢姜黄素、以及八氢姜黄素低剂量组(OHC/2)的大鼠28天心肌组织切片电镜图(A-E)和左心室纤维化的定量分析图(F)。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

本发明首先对比姜黄素及其代谢物对细菌脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞模型的作用效果，选取活性较高的代谢物研究其对于MIRI是否具有治疗作用，并进一步利用转录组学技术探讨MIRI疾病预后及姜黄素代谢物对MIRI进程的影响变化，为姜黄素代谢物可用于治疗MIRI提供理论依据。

英文缩写	英文全称	中文全称
			α-HBDH	Alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase	α-羟丁酸脱氢酶
AI	Apoptotic Index	凋亡指数
			ɑ-SMA	alpha-smooth muscle actin	ɑ-平滑肌肌动蛋白
CK	Creatine kinase	肌酸激酶
			CO	Cardiac Output	每搏输出量
CUR	Curcumin	姜黄素
			CVD	Cardiovascular disease	心血管疾病
d	Day	天
			ECG	Electrocardiogram	心电图
ECM	Extracellular Matrix	细胞外基质
			sec	Second	秒
DEGs	Differentially expressed genes	显著差异表达基因
			EF	Ejection fraction	射血分数
FS	Fractional shortening	短轴收缩率
			iNOS	induced nitric oxide synthase	诱导型一氧化氮合酶
i.p.	intraperitoneal injection	腹腔注射
			LAD	Left anterior descending	冠状动脉左前降支
LDH	Lactate dehydrogenase	乳酸脱氢酶
			LPS	Lipopolysaccharide	脂多糖
LVESd	Left ventricular end systolic diameter	左室收缩末期内径
			LVESV	Left ventricular end systolic volume	左室收缩末容积
MCP-1	Monocyte Chemoattractant Protein-1	单核细胞趋化蛋白
			mg	Milligram	毫克
MI	Myocardial infarction	心肌梗死
			min	Minute	分钟
MIRI	Myocardial ischemia reperfusion injury	心肌缺血再灌注损伤
			NO	Nitric Oxide	一氧化氮
OD	Optical Density	光密度
			OHC	Octahydrocurcumin	八氢姜黄素
PBS	Phosphate Buffered Saline	磷酸盐缓冲液
			PCI	Percutaneous Coronary Intervention	经皮冠状动脉介入
STEMI	ST-segment elevation myocardial infarction	ST段抬高型心肌梗死
			THC	Tetrahydrocurcumin	四氢姜黄素
TGF-β	Transfroming Growth Factor-β	转化生长因子
			WB	Western Blot	免疫蛋白印迹
ZnPP	Zinc Protoporphyrin-9	锌原卟啉

姜黄素及八氢姜黄素干预心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能的实验研究

通过姜黄素及其代谢物对巨噬细胞炎症-氧化应激作用的比较研究，本部分重点探讨OHC及原型药物CUR，对MIRI的干预作用。拟通过结扎大鼠冠状动脉左前降支，阻断供血1小时后恢复血流灌注，建立大鼠心肌缺血/再灌注模型(MIRI)，观察CUR、OHC对MIRI可能存在的治疗作用。首先观察受试动物的常规生活状态、心功能变化情况、血清心肌酶谱变化，评价姜黄素及其代谢物对受试动物的整体疗效；继而通过苏木精-伊红(H&E)染色法观察心肌组织病理状况，TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡情况，Masson染色法观察受试动物心肌胶原纤维沉积情况，初步评估姜黄素及其代谢产物对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用。

实验材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体重约200g，周龄相同，毛色光泽，由南方医科大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(粤)2018-0002，运抵至广东省中医院实验动物中心适应性饲养7天后开展实验，动物实验设施使用许可证号：SCXK(粤)2013-0094。饲养期间，保持大鼠饲养房环境干净清洁，温湿度恒定(温度23±1℃、湿度40±5％)，且具有12小时明暗周期。所有的实验都是遵循实验动物伦理的指导方针并经广东省中医院动物伦理委员会审查通过。

1.2主要仪器及设备

1.3主要实验药物及试剂

1.4药液配制

戊巴比妥钠溶液：称取1.5g戊巴比妥钠粉末，充分溶解于100ml生理盐水中，4℃避光保存。

0.2％吐温溶液：取2ml吐温80，充分溶解于1L生理盐水中，4℃避光保存。

姜黄素注射液：称取500mg姜黄素粉末，溶于100ml 0.2％吐温溶液，超声制备成混悬液。

八氢姜黄素注射液：分别称取250mg、500mg八氢姜黄素粉末，各溶于100ml 0.2％吐温溶液，超声制备成混悬液。

2.实验方法

2.1大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立

按照Dr.Charles E Murry实验室老师指导方法^[101]建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。

术前准备：SD大鼠，术前大鼠禁食12h，不禁水。大鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥纳溶液(60mg/kg)进行麻醉后，实施眼眶静脉丛采血，后将大鼠仰卧位固定于37℃保温板上，经气管无创插管，连小动物呼吸机辅助呼吸(Harvard Inspira，设置潮气量约2.5ml/100g，频率75次/min)。并于四肢皮下刺入针形电极以连接

数据采集分析系统记录心电图(注意针形电极不要插入四肢肌肉组织，以免形成肌电信号干扰)。

通过冠脉结扎法给予心脏缺血及再灌注处理：大鼠胸前进行脱毛预处理，后经酒精、碘伏3次皮肤消毒，于左胸骨旁切口，定位于腋下于剑突连线的中点处，钝性分离肋前及肋间肌肉组织，在3-4肋间开胸，小心撕开心包膜，暴露心脏，于左心耳肺动脉圆锥下1-2mm处进针，6-0丝线通过套管结扎冠状动脉左前降支。结扎后心电图显示II导联S-T段明显弓背抬高(≥0.1mV)，或T波高耸、QRS波增高增宽等心梗后超急期表现，肉眼可见心脏组织左室前壁呈暗红色或灰白色，收缩力度减弱，即为结扎位置正确。维持大鼠麻醉状态下心肌缺血60min后松开结节恢复血流再灌，观察心电图ST段降低或出现再灌室性心电图样表示再灌注成功，心脏无出血后关胸，缝合肋间肌肉及皮肤，肌注青霉素预防感染，待大鼠出现吞咽动物后拔除气管插管，转移至温箱中待自然苏醒。再灌注1小时后再次于大鼠眼底取血，分离血清。

假手术组行同样的开胸手术，左前降支只穿线不结扎，取血时间点与手术组一致。

实验动物排除标准：

(1)模型制作过程中因为麻醉意外或手术意外而死亡的。

(2)术中及术后心电图检测不合格的。

2.2分组及给药

手术后24h，成活大鼠再次腹腔注射戊巴比妥纳溶液(50mg/kg)进行麻醉后，实施心电图导联检测。缺血60min后ST段升高大于等于0.1mV，再灌注后间或出现室速等心律失常症状，再灌注24h后出现t波更低或倒置等表现,依据此标准筛选造模成功大鼠^[102-104]，假手术组大鼠无明显心电图异常，如图7所示，随机分为5组，分组及给药如下。

(1)假手术组(Sham组)：0.2％吐温溶液腹腔注射1ml/100g。

(2)模型组(Model组)：0.2％吐温溶液腹腔注射1ml/100g。

(3)姜黄素组(CUR组)：腹腔注射姜黄素混悬液，50mg/kg/d。

(4)八氢姜黄素组(OHC组)：腹腔注射八氢姜黄素混悬液，50mg/kg/d。

(5)八氢姜黄素低剂量组(OHC/2组)：腹腔注射八氢姜黄素混悬液，25mg/kg/d。

上述各组按相应剂量腹腔注射给药，每天1次，连续给药观察28d，记录周期内大鼠体重变化。

2.3超声检测大鼠心功能

分别于术前及术后7d、28d，经超高分辨率小动物超声成像系统检测大鼠心功能。即：大鼠胸前提前脱毛备皮，经异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定于操作台上。并通过调节心率在350-450BPM区间，以控制麻醉深度。左胸前涂少量耦合剂，通过小动物超声成像系统，将探头定位于大鼠左侧胸骨旁长轴切面(如图1)，并由该长轴切面转换至左心室乳头肌水平短轴切面，频率设定为15MHz，进行M型超声检查。测量指标包括：左室收缩末期内径(leftventricular end systolic diameter,LVESd)、左室收缩末容积(left ventricular endsystolic volume,LVESV)、射血分数(ejection fraction,EF)、短轴收缩率(fractionalshortening,FS)等值并计算每搏输出量(Cardiac Output,CO)等。上述指标均取3个连续心动周期的数据，测量3次，取平均值。

2.4血清心肌酶谱检测

血清采集：各组大鼠分别于术前、心肌缺血恢复灌注后1h、1d、3d、7d、28d，取血后分离血清，EP管分装后于-80摄氏度冰箱冻存，待各时间点取材结束后一同用于血清心肌酶三项：肌酸磷酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDE)的检测。

2.4.1 CK检测原理及具体操作步骤：

2.4.1.1测定原理：

肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉(骨骼肌和心肌)以及脑等组织的细胞浆和线粒体中,是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶对研究心肌缺血有较高的科研价值。

肌酸激酶CK催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸，此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定，加入钼酸铵可生成磷钼酸，可进一步还原成钼蓝，根据生成无机磷的量可算出酶的活力。

2.4.1.2操作步骤：

根据说明书方法设定测定管及对照管。按照下表所示依次加入相应的样本或试剂：

注：1、配置好的试剂，需37℃预温5min，再进行测定。

2、试剂新配新用，测定的管子不得含磷。

2.4.1.3计算公式：

CK活力(U/ml)＝根据标准曲线计算所得的CK酶活力(U/ml)x样本稀释倍数＝[7.4491x(测定OD值-对照OD值)-0.0716]x样本稀释倍数。

2.4.2 LDH检测原理及具体操作步骤：

2.4.2.1测定原理(参考试剂说明书)：

乳酸脱氢酶(LDH)存在于人体各组织器官中。LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢，当机体各组织器官病变时，其组织器官本身的LDH要发生改变，并且可引起血液中LDH改变。LDH增高主要见于心肌缺血、病毒性肝炎、肝硬化、肺梗塞、某些恶性肿瘤、骨骼肌病、有核红细胞骨髓内破坏(无效性造血)、白血病、恶性贫血。

根据比尔定律，可测乳酸脱氢酶(LDH)活性。

2.4.2.2制备丙酮酸标准曲线：

取2μmol/ml的丙酮酸标准品，用双蒸水分别200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍稀释后，按下表制备标准曲线。

以测得的吸光度为纵坐标，丙酮酸标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.4.2.3微板法测定LDH

根据说明书方法设定空白孔、标准孔、测定孔及对照孔。按照下表所示依次加入相应的样本或试剂：

注：加样时要尽量避免产生气泡及液体溅出。

2.4.3 α-HBDE检测原理及具体操作步骤：

2.4.3.1测定原理：

血清α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)能催化α-羟丁酸氧化为α-酮丁酸，它存在于人体各组织中，以心肌组织含量最多，约为肝脏的2倍，其活性达总酶活力的一半以上。当心肌受损时，α-羟丁酸脱氢酶就会释放到血中，所以α-HBDH在发生心肌疾病时明显增高。α-HBDH增高常见于心肌梗死患者、活动性风湿性心肌炎和溶血性贫血等疾病，可用比色法和连续监测法检测。

2.4.3.2操作步骤：

根据说明书方法设定空白管及测定管。按照下表所示依次加入相应的样本或试剂：

2.4.3.3计算公式

HBDH活力(U/L)＝△A/min x 6.22

2.5心肌组织病理学检查

取材：分别于给药后7d、28d，各组随机选取4-5只大鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉致死后，迅速打开胸腔，将心脏迅速剪下，在预冷生理盐水中洗净残余血液，后用4％多聚甲醛灌注心脏使腔室充盈，置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，固定后在结扎线位置横向切取心脏组织样本，放入Thermo组织脱水机、组织包埋机内，制成石蜡包块。

2.5.1 HE染色观察心肌组织病理学变化

用Leica病理切片机对7d、28d样本石蜡包块连续切片，厚度为3.5μm。按Leica多能能染色机说明设定染色程序，如下表所示：

2.5.2 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡

取给药后7d大鼠心脏组织石蜡包块，连续切片，厚度为3.5μm。每只大鼠随机取5张切片，利用DAPI和TUNEL双染法测定心肌细胞凋亡水平。依据说明书进行如下操作：

注：1、破膜液工作液：Triton X-100：PBS＝1:1000；

2、TDT酶：Tunel试剂盒TDT酶:dUTP:buffer按1:5:50比例混合；

3、DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555nm，发绿光；

4、在实验过程中注意将样本置于湿盒中保存。

2.5.3 Masson染色检测心肌胶原纤维沉积

取给药后28d大鼠心脏组织石蜡包块，连续切片，厚度为3.5μm。每只大鼠随机取5张切片，利用DAPI和TUNEL双染法测定心肌细胞凋亡水平。依据说明书进行如下操作：

2.6数据统计分析

本实验结果数据均采用SPSS 23.0专业软件进行统计分析，所有数值以均数±标准差

来表示，用Graphpad prism8软件制图。本实验中各组数据先进行正态分布及方差齐性检验，符合正态分布且方差齐的多组间计量资料比较符合条件者采用单因素方差分析，并以LSD法进行组间两两比较；多组间计量资料比较不符合应用条件者采用Welch'sANOVA，组间两两比较采用Games-Howell法；多组间重复测量计量资料比较符合条件者采用单因素重复测量方差分析，并以LSD或Bonferroni法进行组间或组内两两比较。以P≤0.05为差异有统计学意义。

3.实验结果

3.1大鼠心肌缺血再灌注损伤前后大鼠心脏表现及心电图形态变化情况

本研究利用

数据采集分析系统，记录大鼠术前、术间及术后24h心电图形态，筛选合格受试动物分组进行后续实验。大鼠给予腹腔注射戊巴比妥那溶液适度麻醉后，静息状态下正常大鼠心率维持在约400BPM。如图1所示，假手术组大鼠ECG II导联表现与人类近似，可见P波、QRS波群、T波、U波等典型表现，QRS波群恒定波幅较小，无明显S-T段；结扎LAD形成心肌缺血后，肉眼可见大鼠左室前壁颜色先变暗，后转为苍白；心电图表现为ST段显著弓背向上抬高，增幅>0.2mV，T波高耸，证明结扎位置准确，形成缺血区；LAD结扎60min后剪开套环，恢复大鼠左室前壁心肌供血，造成心肌缺血再灌注损伤。肉眼可见缺血区由苍白渐渐转红，再灌30min可见QRS间期延长、波群变宽，或出现室性心电图表现；表明再灌成功。

术后24h心电图可见T波倒置，表明大鼠心肌缺血再灌注损伤模型构建成功。

假手术组大鼠心电图II导联仅在进针时候有短时不规则波动，后恢复正常。无心肌缺血的ST段抬高或心律失常表现。

3.2超声检测大鼠心功能

图2为超声检测左心室功能结构图，其中，B模式(B-mode)为胸骨旁长轴视图；M模式(M-mode)为短轴视图。分别于大鼠术前，给药后7d、28d，取大鼠经异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定于操作台上，超声检测大鼠心功能。B-model下可见假手术组大鼠室壁活动均匀，心房心室比例正常；给药后7d大鼠，模型组及给药组大鼠，室间隔活动度降低，可见左室轻度扩张，大鼠给予姜黄素、八氢姜黄素后，扩张程度较轻；给药后28d大鼠，模型组大鼠室间隔活动明显降低，左室扩张明显，呈病理性肥大，姜黄素及其代谢物组可见左室扩张明显减轻，M-mode下测量各组大鼠左室收缩末期内径(LVESD)、收缩末期容积(LVESV)、射血分数(LVEF)、短轴收缩率(FS)及每搏输出量(CO)。如图3显示，与假手术组相比，给药7d后MIRI大鼠均出现心功能降低(EF：23％-30％,P<0.05；FS：30％-37％,P<0.05；CO：10％-18％,P<0.05)及左室扩张(LVESD增加31％-53％，P<0.01；LVESV增加93％-149％，P<0.01)，出现心脏收缩功能异常及每搏输出量降低，提示大鼠造模成功；给药组可延缓MIRI后心脏扩张和心功能受损趋势，以八氢姜黄素作用较优，但各手术组间无统计学差异。28d大鼠超声结果显示，MIRI组大鼠心功能持续降低，心室扩张严重；姜黄素、八氢姜黄素均能明显抑制心室扩张，改善心功能，增加每搏输出量，提示CUR及OHC均能显著减轻左室扩张程度，改善心肌收缩功能及顺应性，保护受损心肌。

3.3 CUR、OHC对MIRI大鼠血清心肌酶三项CK、LDH、α-HBDE含量的影响

分别于大鼠术前，再灌注后1h、1d、3d、7d、28d多个时间点检测大鼠心肌酶三项变化。如图4所示：

(1)血清CK水平：与假手术组比较，模型组血清CK水平含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，给药3d后OHC组CK水平显著降低(P＜0.05)；给药7d后各给药组CK水平显著降低(P＜0.01)；

(2)血清LDH水平：与假手术组比较，模型组血清LDH水平含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，给药7d后LDH水平显著降低(P＜0.01)；并以28d OHC组的疗效更优(P＜0.05)。

(3)血清α-HBDH水平：与假手术组比较，模型组血清CK水平含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，给药7d后给给药组α-HBDH水平显著降低(P＜0.05)。

综合血清三项结果显示：正常状态下，血清心肌酶三项维持在较低水平。与Sham相比，MIRI后大鼠血清心肌酶三项含量迅速增加，但在恢复供血后24h降至略高于正常水平，而后表现为持续性缓慢上升(P＜0.01)，这一变化趋势与临床MIRI变化趋势相似，表明该模型大鼠差异性及稳定性较好。与模型组比较，药物干预后3天，各给药组心肌酶三项指标开始出现好转，术后7d、28d给药组可明显降低血清心肌酶三项水平(P＜0.05～0.01)，逆转结果与模型组相比有显著性差异；各给药组间比较结果显示，OHC给药28d作用效果较为显著(P＜0.01)。

3.5心肌组织病理学检查

3.5.1 HE染色观察心肌组织病理学变化

结果显示：假手术组大鼠可见心肌细胞规则且排列整齐且，各结构完整，细胞核均匀分布，间隙均匀一致，有完整的心肌纤维排列，染色均一，未见细胞水肿坏死、肌束溶解等症状，仅见极少假手术操作的炎症细胞浸润及纤维化增生(图5)；MIRI组大鼠7d样本即表现出较严重的缺血区心肌细胞坏死，可见大量中性粒细胞聚集，炎症细胞浸润明显，28d样本发现明显的室壁变薄，左室受损心肌包膜结构损坏，细胞排列紊乱同时伴有组织纤维化样改变、瘢痕形成；给予姜黄素及八氢姜黄素干预后，可降低炎症细胞浸润及纤维化增生程度，有改善病变的趋势，其中以OHC给药28d的改善作用较为明显。

3.5.2 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡

结果如图6所示，假手术组大鼠心肌组织多见正常排列的蓝色心肌细胞细胞核，仅见极少数散在的绿色荧光标记的凋亡细胞，为假手术组实验操作过程所致，心肌细胞凋亡程度轻微(Sham：AI＝5.47％)。MIRI模型组大鼠，缺血再灌注区心肌细胞凋亡的阳性细胞率显著升高(34.83％，P<0.01)，而CUR和OHC给药组大鼠的细胞凋亡阳性率则有显著降低，分别为CUR组27.7％、OHC组21.4％、OHC/2组27.8％。与模型组相比，CUR及OHC均可降低心肌细胞凋亡率，差异有统计学意义(P＜0.05)；各给药组间比较显示，OHC 50mg/kg剂量组作用效果较为显著(P<0.05)。上述结果表明，CUR及OHC可降低心肌缺血再灌注损伤后引起心肌细胞凋亡，有助于减轻心肌缺血再灌注损伤程度。

3.5.3 Masson染色检测心肌胶原纤维沉积

心肌缺血再灌注损伤后，心脏会逐渐形成纤维化修复、代偿性增生肥厚以及心肌重构等病理表现，Masson染色能够直观显示心肌组织和血管周围胶原纤维分布情况。我们取干预处理28d大鼠心肌组织，制备石蜡切片，进行Masson染色以检测其纤维化程度及瘢痕组织。石蜡切片masson染色结果判读：胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色，并用Image-Pro Plus 6.0分析软件分别测量切片中2个视野的胶原面积(A)，以及对应的2个视野的组织面积(B)，并计算出胶原纤维的面积分数(％)＝＝A/B*100％。

结果显示(图7)，镜下可见大鼠MIRI4周后，假手术组视野内心肌纤维排列整齐有序，主要为红色的心肌细胞，胞质染色均匀，边界清晰，在细胞间隙可见少量蓝色胶原纤维散在分布，为假手术操作所致，左室未见明显纤维化；与假手术组相比，模型组大鼠心肌纤维化程度增高(44.6％，P<0.01)，左室心肌组织大部被蓝色胶原纤维取代(心肌组织和血管周围有大量蓝色胶原纤维显色)，心肌束纤维排列疏松紊乱，可见纤维化瘢痕形成，表明模型制作成功；与模型组相比，CUR及OHC给药组均可减轻心肌纤维化程度(28.3％～32.5％)，蓝色胶原纤维面积明显减少，心肌束排列较为整齐；其中OHC 50mg/kg剂量组作用效果较为显著(P<0.05)。

综上所述，本发明中，我们通过对实验周期内不同时间点(术前、再灌注后1h、1d、4d、8d、28d)，大鼠血清心肌酶三项的检测发现，假手术组大鼠血清心肌酶三项始终较稳定的维持在一个较低水平，仅在假手术后1h这个时间点略有上升，后续即回落至正常水平。对于MIRI手术组大鼠，在结扎LAD使得心肌缺血60min后松开结扎位点，恢复灌流1h后，可测得大鼠血清心肌酶三项均显著升高，证明血清心肌酶三项对于心肌缺血再灌注损伤有及时的诊断功效，可以在损伤极早期就有显著表现。术后1d检测发现，心肌酶三项均有所回落，这与临床多时间点的观察趋势一致，解释了临床上血清心肌酶谱假阴性研判率出现的原因。而后在再灌注4d、8d、28d三个时间点检测发现，模型组大鼠血清心肌酶在短暂的回落后，仍旧持续升高，不同酶之间上升趋势和持续时间略有差异；同时，给药干预后各时间点模型组大鼠血清心肌酶三项指标较假手术组具有显著性差异，表明在实验周期内模型稳定有效。

三种血清心肌酶的药物术后处理结果显示，CUR(50mg/kg.d)、OHC(50mg/kg.d、25mg/kg.d)腹腔注射给药条件下，可减缓或逆转血清心肌酶的持续上升表现。其中，在早期(给药3d)干预处理后，药物组血清心肌酶三项水平就较模型组呈下降趋势，OHC50mg/kg.d给药组降低LDH的作用具有显著性差异；给药7d后，三组药物对血清LDH、CK的降低作用均具有显著性差异，OHC 25mg/kg.d给药组对α-HBDH的作用具有显著性差异；给药28d后，三组药物对血清LDH、α-HBDH的降低作用均具有显著性表现，OHC 50mg/kg.d、25mg/kg.d给药组可显著降低血清CK值。表明姜黄素及八氢姜黄素均可以有效改善MIRI大鼠的心肌酶表达紊乱，对心肌缺血再灌注损伤具有一定的治疗作用。并以OHC 50mg/kg.d的改善效果为优。

结合我们的研究结果，在对心肌缺血损伤进行研究或诊断时，可采用血清心肌酶谱水平参考评估，并联几种酶指标、串联多时间点的血清心肌酶检测，能为患者的病情进行有效评估，让治疗效果研究及临床诊断准确率有效提高，降低误判率，进而为进一步制定和调整临床治疗方案提供科学依据，具有较好的临床价值。

姜黄素及其代谢物对MIRI心肌细胞凋亡以及心脏结构和功能的影响

本研究观察了CUR和OHC给药7d后对MIRI所致大鼠心肌细胞凋亡的影响。实验结果显示，与假手术组比较，MIRI组大鼠心肌细胞TUNEL荧光显色密集，凋亡指数显著增加，说明MIRI大鼠模型造模成功，心脏中存在细胞凋亡。与MIRI组相比，各给药组干预均能降低大鼠心肌细胞凋亡指数，减少细胞凋亡，且CUR和OHC组间比较结果显示有显著性差异，表明说明八氢姜黄素抗心肌细胞凋亡的作用效果更显著。实验结果提示姜黄素及其代谢物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用与减少心肌MIRI后心肌细胞凋亡有关。

心肌细胞凋亡也与心脏手术后的心室功能障碍有关，心肌短暂性缺血后再灌注导致心肌细胞凋亡和心功能障碍，心肌MIRI后发生的细胞凋亡进一步导致了大鼠左心结构改变和心功能降低，通过激活抗凋亡级联作用可实现对心脏的保护作用。基于CUR和OHC的抗凋亡作用，我们通过检测大鼠术前、MIRI术后7d、28d三个时间点的超声心动图，评估其左室结构和功能相关的LVESD、LVESV、EF、FS、CO等指标，以了解实验周期内药物干预MIRI大鼠心肌结构和功能的动态变化。结果显示，姜黄素及八氢姜黄素能显著改善心肌收缩功能及顺应性，保护受损心肌，可有效改善心肌凋亡所致心功能下降。提示，抑制缺血心肌细胞凋亡可能是改善缺血后收缩功能的有效治疗方法。

同时，MIRI后常伴有炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等典型反应，这些损伤的早期表现多为心肌细胞变性坏死、组织炎性细胞浸润等，远期表现为心室重构和纤维化修复。基于早期的凋亡表现和实验周期内超声心动图的变化，本研究进一步检测了各组大鼠心肌组织的病理表现以及纤维化增生情况。其中HE染色结果显示，药物干预7d后，可减轻心肌细胞水肿及炎症细胞浸润，干预28d后可明显减低纤维化增生程度，且药物可减缓MIRI后的结构变化和纤维化修复，有持续改善病变的趋势。Masson染色结果进一步验证了CUR和OHC可以减少MIRI后纤维化增生的面积。

通过观察姜黄素及其代谢物八氢姜黄素对MIRI的治疗作用，我们发现CUR及OHC能有效改善大鼠MIRI后心肌细胞凋亡，进而抑制心室扩张，提高受损心功能，并能持续降低血清心肌酶三项水平，缩小因MIRI导致的心肌组织坏死及纤维化修复面积，且代谢物OHC作用效力略优于原型药物CUR，具有较好的临床开发潜力。

基于转录组学探讨MIRI疾病预后及药物对MIRI进程的影响变化

建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，术后1d分组给药同上，分别于药物干预心肌缺血再灌注损伤大鼠模型7d、28d后取材，提取左室受损心肌组织总RNA，Agilent2100Bioanalyzer检测RNA浓度与完整性。采用Illumina公司的novaseq6000测序平台，利用转录组高通量测序(RNA-seq)技术，通过Hisat2、Feature-counts、DEseq2分析比对并找出差异基因，利用DAVID、GSEA等软件和工具对姜黄素及其代谢物干预心肌缺血再灌注损伤的差异基因进行生物信息学分析和数据挖掘，对差异表达的基因进行GSEA/KEGG通路富集分析，通过假设检验计算得到P-value，筛选出显著差异表达的基因富集信号通路，为阐明MIRI疾病进程与愈后、CUR和OHC对MIRI进程的影响变化提供基础数据，为进一步揭示CUR和OHC的调控机制、作用的关键靶点基因及蛋白水平研究奠定基础。

为验证转录组水平数据挖掘发现的MIRI疾病进程变化规律，以及CUR和OHC干预MIRI大鼠的差异性基因数据准确性，我们针对疾病显著上调的趋化因子相关信号通路，显著下调的代谢及氧化磷酸化通路选取部分差异基因进行验证；免疫组化法检测各组大鼠心肌损伤区域CD68、CD74、α-SMA蛋白表达情况，观察炎症细胞浸润情况、分型变化及组织修复情况。

(1)在MIRI模型7d样本共筛选出3169条差异表达基因，28d样本共筛选出802条差异表达基因，其中上调基因占绝大多数。2个时间点差异表达基因在KEGG中富集的通路主要包括：趋化因子信号通路、细胞外基质受体交互作用、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、TGF-β信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节、MAPK信号通路等，且7d时机体趋化因子相关通路的调控显著活跃。此外，相较于28d样本，7d样本显著富集于代谢途径及氧化磷酸化。

(2)与7d MIRI组相比，CUR组及OHC组分别筛选出353条、342条差异表达基因，差异基因共同富集于趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体的相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、白细胞跨内皮迁移、细胞粘附分子等炎症调控及纤维化修复通路中。同时CUR较OHC可显著下调造血细胞谱系及VEGF信号通路，而OHC在JAK-STAT信号通路、粘着斑、细胞外基质受体相互作用及补体和凝血级联等炎症通路效果更为显著。

(3)与28d MIRI组相比，CUR组及OHC组分别筛选出15条、23条差异表达基因，这些差异基因主要调控心室重构、纤维化通路及补体系统。28d样本表现为表现为基因调控水平降低，提示耐药性的发生；

(4)PCR验证结果显示，与Sham组相比，MIRI 7d后，趋化因子表达相关基因CCL2、CCL3、CCL9、CCR5显著升高，相关纤维化信号通路TGF-β1、TGF-β2表达亦显著升高；代谢及氧化因子IDH3A、PKM、GCLc、GCLm水平显著降低；与MIRI组相比，CUR及OHC可显著降低趋化因子及TGF-β表达，对代谢及氧化因子作用无显著性差异；同时，对于MIRI28d样本，CUR及OHC亦可显著降低MIRI引起心室重构及纤维化修复相关基因：MMP8、CollagenI、CollagenIII、ACTA2表达量。

(5)免疫组化结果：与Sham组相比，MIRI 7d后，巨噬细胞表面抗原CD68和CD74均显著升高，MIRI 28d时，α-SMA表达量显著增加；与模型组相比，CUR和OHC均可显著降低CD68、CD74和α-SMA蛋白表达，且OHC组对比CUR组差异显著。

转录组分析发现，MIRI病程早期以趋化因子及相关的炎症纤维化修复、代谢氧化水平调控为主，晚期变化减缓，主要以心室重构及纤维化修复为主。CUR和OHC可显著调控趋化因子及其相关细胞因子通路，抑制炎性巨噬细胞水平及纤维化增生，进而影响MIRI愈后的纤维化样改变。

综上所述，药物的活性代谢产物是未来中药现代化研究的一个可期方向，本研究将有助于了解MIRI疾病进程的分子机制，为解释CUR及其活性代谢产物OHC的药效作用机制，提供有价值的科学依据。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.姜黄素代谢物-八氢姜黄素在制备治疗心肌缺血相关损伤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心肌缺血相关损伤为心肌缺血再灌注损伤。

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