CN102652741A

CN102652741A - 姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN102652741A
Application number: CN2012101491622A
Authority: CN
Inventors: 颜光涛; 廖杰; 邓子辉; 薛辉
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-09-05

Abstract

本发明公开了属于药物制备技术领域的一种姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明制备脑缺血再灌注损伤模型，将姜黄素-PVP固体分散体用注射用生理盐水溶解后用于治疗该疾病模型。结果发现姜黄素能显著改善脑组织损伤和脑缺血再灌注损伤导致的远端肝肾等重要器官的损伤，能够调控与凋亡、炎症、氧化相关的一些因子的表达水平，控制损伤进一步恶化，保护脑组织和肝肾等重要器官。

Description

姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

脑缺血是严重危害人类生命健康的三大疾病之一，是中老年人的常见病，多发病，以其高发病率、高病死率、高致残率和高复发率严重危害人类的健康。近年来，其发病有年轻化趋势，发病率逐渐增高，是首位致残原因，存活者中3/4患者不同程度地丧失劳动能力，中度致残者占40％以上。脑梗死可出现神经元的变性、坏死、迟发性神经元死亡或凋亡，目前尚无有效治疗方法。

脑缺血后梗死的主要病理变化为能量缺乏、脑水肿、炎症、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性作用和凋亡级联的启动等，机制非常复杂、涉及许多相关因子和基因的改变。改善恢复脑血供及神经保护是治疗缺血性脑中风的两种重要策略，目前公认的有效方法是溶栓治疗，但受溶栓治疗时间窗和治疗条件所限，仅3％左右的患者能进行该项治疗，而且溶栓治疗虽可以建立缺血区血流再灌注，但不能解决缺血引起的脑组织再灌注损伤。因此，寻找有效的神经保护因子，对脑梗死损伤过程的主要环节进行干预，减轻缺血区的神经损伤、恢复受损神经功能一直是人们研究的热点。因此目前急需一种有效预防和治疗脑缺血疾病的药物。

姜黄素是中药姜黄中的主要成分，能够抑制肿瘤细胞的生长，能够对亚硝胺等有良好的保护作用，还具有降血脂、调节免疫功能，抗炎、抗氧化、利胆，可以抑制自由基的形成等。过去临床上用姜黄素治疗的疾病如艾滋病、肿瘤、慢性溃疡、肝炎，以及降血脂、抑郁症等。

发明内容

本发明的目的在于发现一种传统药物的新作用，即姜黄素能够在早期预防和治疗脑缺血再灌注损伤导致的急危重病象。

姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

所述脑缺血再灌注损伤为脑梗死，脑充血和脑水肿。

治疗脑缺血再灌注损伤的药物为姜黄素注射剂；所述姜黄素注射剂的制备方法如下：取姜黄素3g，3ml无水乙醇溶解，滴加入聚维酮溶液中，用10ml无水乙醇洗瓶，手动搅拌，倒入250ml烧杯中搅拌充分，搅拌后冻干3-5h，得到姜黄素固体分散体，取900mg姜黄素固体分散体，加注射用生理盐水5ml，得到20mg/ml的姜黄素注射剂，置于于棕色瓶中保存。

所述姜黄素能降低脑缺血再灌注患者中谷丙转氨酶的活力和尿酸含量，改善脑缺血再灌注肝肾功能损伤。

所述姜黄素能降低脑缺血再灌注患者中Caspase-3的表达，上调Bcl-2的表达，从而抑制神经细胞凋亡。

所述姜黄素能抑制脑缺血再灌注患者中损伤相关因子Cox-II、p-ERK、p-cPLA2的表达水平。

本发明的有益效果：本发明发现姜黄素在预防和治疗脑缺血再灌注损伤中能显著改善脑组织病理损伤，神经功能学状态得到改善，并且改善脑缺血再灌注损伤导致的肝肾功能损伤，通过调节凋亡相关基因的表达，达到抗脑梗死区神经细胞凋亡的作用，并且同时能够改善自由基损伤，减小脑梗死体积。姜黄素来源广，易于取得，且成本低，制作工艺简单，注射剂剂型便于临床给药。

附图说明

图1脑组织肉眼观察图；

图中，A-假手术组，B-对照组，C-姜黄素治疗组。

图2各组小鼠脑缺血再灌注组织病理学HE染色(×600)图；

图中，A-假手术组，B-对照组，C-姜黄素治疗组。

图3各组小鼠脑缺血再灌注脑组织切片免疫组化图；

图中，A-C：NSE；D-F：Cox-II；G-I：Bcl-2；A/D/G-假手术组；B/E/H-对照组；C/F/I-姜黄素给药组。

图4各组小鼠脑缺血再灌注后脑组织中谷丙转氨酶的活力和血清中尿酸的含量；

图中，Sham-假手术组，K30-对照组，Cur-姜黄素治疗组。

图5姜黄素调节脑缺血再灌注损伤脑组织相关蛋白的表达水平图；

图中，Sham-假手术组，K30-对照组，Cur-姜黄素治疗组。

图6姜黄素调节脑缺血再灌注损伤脑组织凋亡相关基因的表达水平图；

图中，Sham-假手术组，K30-对照组，Cur-姜黄素治疗组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1姜黄素注射剂及小鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型制备

(1)姜黄素注射剂的制备

①聚维酮(PVP)姜黄素固体分散体：

质量比(姜黄素∶PVP＝1∶8)PVP 24g，40ml无水乙醇溶解，磁力搅拌

姜黄素3g，3ml无水乙醇溶解，滴加入PVP溶液中，用10ml无水乙醇洗瓶，手动搅拌，倒入250ml烧杯中大转子搅拌充分，搅拌后冻干4h。

②姜黄素固体分散体溶液：

称取900mg姜黄素固体分散体，加注射用生理盐水5ml，即为姜黄素20mg/ml，于棕色瓶中，呈透明橘红色，粘稠，取20mg/ml 1ml+生理盐水7ml即为2.5mg/ml的应用液。

(2)制作小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型：雄性昆明小鼠60只，称重约25g，其中分为假手术组A 20只，对照组B 20只，姜黄素治疗组C 20只，1％戊巴比妥钠(6mg/100g)麻醉小鼠，暴露并分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外(ECA)和颈内(ICA)动脉，结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，颈总动脉远心端穿线备用。颈总动脉近分叉处剪一小口，将栓线(直径0.14)由此插入颈总动脉，用镊子轻轻将栓线送至大脑中动脉分叉处，栓线插入深度约(15±0.5)mm(ECA与ICA分叉处为起点)，假手术组仅将栓线插到5mm处，结扎颈总动脉与栓线，顺序缝合好肌肉皮肤，栓线末端留于皮肤外以备抽线。栓塞2h后将栓线拉出ICA实现再灌注，再灌注24h。麻醉清醒后让小鼠自由摄取水和食物，伤口做好消毒预防感染。

(3)模型成功评判标准采用Longa“5分法”对小鼠脑缺血再灌注模型的神经功能缺损进行评分。0分为无神经缺损症状；1分为对侧前肢不能完全伸直；2分为向对侧旋转；3分为行走向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。1-4分为有效模型。

(4)脑梗死体积计算测定再灌注24h后麻醉小鼠，立即断头取脑，于-20℃速冻30min，从额极向枕极作厚度为2mm的冠状切片，共5-6片，迅速置于2％TTC磷酸盐缓冲液中，37℃避光染色40min，期间翻动脑片3-4次使染色均匀。染色后正常脑组织呈红色，而梗死灶呈白色。10％甲醛固定24h后数码拍照输入计算机，利用真彩色病理图像分析系统4.0(北京航空航天大学)进行计算，以梗死区占缺血侧大脑半球总体积的百分比作为统计参数。

(5)姜黄素对小鼠脑梗死体积及神经功能的影响

TTC染色结果如图1，假手术组脑片全部染色成红色，对照组可见明显的白色梗死灶，姜黄素治疗组与对照组比较，梗死灶显著缩小(P＜0.05)；再灌注24h，对照组小鼠表现出明显的神经运动功能障碍，而姜黄素给药组神经功能缺损症状较模型组有所改善，且有统计学差异(P＜0.05)，见表1.

表1神经功能学评分及梗死灶体积

注：^*P＜0.05vs对照组

由以上结果提示，姜黄素注射剂能够通过改善小鼠脑缺血再灌注损伤神经功能学状态和降低小鼠脑梗死体积，改善脑缺血再灌注损伤。

实施例2小鼠脑缺血再灌注各组脑组织病理学改变

(1)HE染色缺血2h再灌注24h后用1％戊巴比妥钠(6mg/100g)麻醉小鼠，开胸剪破右心耳，经左心室依次灌注(含肝素0.4％)0.9％生理盐水30ml，4％多聚甲醛30ml，立即取脑，在10％多聚甲醛溶液中后固定48h。常规方法进行石蜡包埋，在额极厚5mm处取2mm厚冠状切片进行HE切片染色工作。光镜观察缺血侧皮层脑组织的病理学改变。

(2)HE染色结果，如图2所示，光镜下可见，假手术组神经细胞的数量、形态分布正常；对照组细胞排列紊乱，梗死灶中心区可见明显组织疏松，神经细胞脱失，细胞空泡样变，梗死灶周围神经细胞缺血样变明显；姜黄素治疗组缺血范围及程度较模型组明显缩小，梗死灶中心区神经元脂肪变性和空泡样变程度减轻，充血和脑水肿程度减轻。以上结果提示，姜黄素能够减轻脑缺血再灌注损伤坏死。

实施例3小鼠脑缺血再灌注后脑组织NSE、Cox-II、Bcl-2免疫组化

(1)免疫组化检测NSE、Cox-II、Bcl-2表达根据HE染色结果判定缺血梗死灶部位进行切片，将石蜡组织切片脱蜡，按免疫组织化学SABC法进行染色，应用3％H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性30min，PBS洗5min×2次，蒸馏水洗5min×2次。枸橼酸缓冲液(pH6.0)92℃热修复5min，静置5min，再次热修复5min，PBS洗5min×2次，蒸馏水洗5min×2次。1.5％羊血清封闭置湿盒孵育1h(37℃)，弃去不洗，滴加一抗(兔抗鼠Cox-II (1∶50)和Bcl-2(1∶200)多克隆抗体)37℃孵育1h，PBS洗5min×2次。滴加二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔)37℃孵育1h，PBS洗5min×2次。滴加试剂SABC，37℃孵育1h，PBS洗5min×2次。加DAB显色，蒸馏水洗涤，0.2％苏木素轻度复染10min，常规脱水，透明，树脂封片，显微镜观察。

(2)如图3(A-C)所示，神经元NSE染色棕黄色，正常形态呈蝌蚪形，可见明显的轴突。姜黄素给药组神经元排列整齐、胞浆染色均一；对照组缺血区NSE阳性细胞数量明显减少，胞体固缩、浓染，NSE表达较假手术组明显减弱；姜黄素组缺血区NSE阳性细胞较模型组明显增多，细胞形态接近正常。如图3(D-F)假手术组Cox-II阳性神经元散在于大脑皮层，数量极少，表达量低；对照组Cox-II阳性神经元分布多位于脑梗死边缘区，表达量明显高于假手术组，在梗死边缘区某些Cox-II免疫阳性神经元有正常神经细胞的形态特征，免疫活性主要位于核周围神经元的胞体和突起，Cox-II表达也见于缺血边缘呈皱缩、扭曲的损伤神经元；姜黄素治疗组Cox-II表达较模型组明显降低，较假手术组无显著差别。如图3(G-I)所示，假手术组可见有少量Bcl-2蛋白表达；对照组Bcl-2蛋白表达较假手术组有所增加；姜黄素给药组Bcl-2蛋白表达进一步增加，明显高于对照组。以上结果提示，姜黄素通过上调脑组织中NSE、Bcl-2，下调脑组织中Cox-II的表达，保护脑缺血再灌注损伤。

实施例4姜黄素对脑缺血再灌注小鼠血清中谷丙转氨酶活力和尿酸含量的影响

(1)小鼠缺血2h再灌注24h后，立即摘眼球取血，冻于-20℃备用。使用南京建成生物技术公司试剂盒检测血清谷丙转氨酶活力和尿酸含量。各组数据进行方差齐性检验和正态分布检验，比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。

(2)如图4所示，对照组较假手术组谷丙转氨酶活力显著升高(P＜0.01)，姜黄素治疗组较对照组有所降低(P＜0.05)，但高于假手术组(P＜0.01)；对照组较模型组和姜黄素治疗组血清尿酸含量明显升高(P＜0.01)，姜黄素治疗组较对照组尿酸含量有所降低(P＜0.01)。

以上结果提示，姜黄素能够改善脑缺血再灌注损伤后小鼠肝肾功能。

实施例5脑缺血再灌注损伤后脑组织相关蛋白表达情况

(1)Western blot检测相关蛋白的表达脑缺血2h再灌注24h后，断头取脑，放置于液氮中保存，待样本量足够，提取总蛋白，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按照常规方法转膜、10％脱脂奶粉室温封闭1h，一抗37℃缓慢摇动1h，TBST缓冲液洗膜3次，10min/次，二抗37℃避光缓慢摇动40min，TBST缓冲液洗膜3次，10min/次，曝光及洗片，扫描，软件分析光密度值。

(2)如图5所示，缺血再灌注24h对照组脑组织p-ERK、p-cPLA2表达量显著高于假手术组(P＜0.01)，姜黄素治疗组能够显著降低p-ERK、p-cPLA2的表达(P＜0.01)，但要高于假手术组(P＜0.01)；缺血再灌注24h对照组Cox-II表达量较假手术组显著升高(P＜0.01)，姜黄素治疗组明显降低Cox-II表达量，与假手术组无显著性差异(P＞0.05)；假手术组抗凋亡蛋白Bcl-2有少量表达，对照组表达量较假手术组显著增加(P＜0.01)，姜黄素治疗组显著高于对照组(P＜0.01)；模型组促凋亡蛋白Caspase-3显著高于假手术组(P＜0.01)，姜黄素治疗组显著降低Caspase-3蛋白表达量(P＜0.01)。以上结果提示，姜黄素通过降低Cox-II、Caspase-3、p-ERK、p-cPLA2的表达，增加Bcl-2的表达，保护缺血再灌注损伤，控制损伤进一步恶化。

实施例6RT-PCR检测姜黄素对凋亡相关基因bcl-2、caspase-3表达的影响

(1)缺血2h再灌注24h断头取脑，放入液氮冻存。提取RNA并进行RNA定性及定量。RT-PCR步骤按试剂盒说明。取5ulPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，参照Marker DL2000为标准分子量参照，紫外灯下用Gel-ProImager Kit成像系统拍照，半定量分析产物的累积光密度值(IOD)，与内参照β-actin比较的相对光密度值(Relative OD)来评定表达水平。

表2引物序列及扩增片段长度

(2)如图6所示，对照组bcl-2表达量较假手术组有所降低(P＜0.05)，姜黄素治疗组bcl-2表达量高于对照组(P＜0.05)，但低于假手术组，差异无显著性(P＞0.05)。对照组、姜黄素治疗组caspase-3表达量显著高于假手术组(P＜0.01，P＜0.05)，姜黄素治疗组caspase-3表达量低于对照组，但差异无显著性(P＞0.05)。以上结果提示，姜黄素通过调节凋亡相关基因的表达，达到抗凋亡，保护神经细胞的作用。

上述实施例发现姜黄素注射剂对脑缺血再灌注损伤有显著的治疗效果，并且姜黄素制剂毒性低、易取得、成本低，适于临床给药等特点。可以显著改善脑组织损伤和脑缺血再灌注损伤导致的远端肝肾等重要器官的损伤，能够调控与凋亡、炎症、氧化相关的一些因子的表达水平，控制损伤进一步恶化，保护脑组织和肝肾等重要器官。从而为患者进行临床治疗赢得时间，降低致残率，提高生存率和患者的生活质量。

Claims

1.姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述脑缺血再灌注损伤为脑梗死，脑充血和脑水肿。

3.根据权利要求1所述姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，治疗脑缺血再灌注损伤的药物为姜黄素注射剂；所述姜黄素注射剂的制备方法如下：取姜黄素3g，3ml无水乙醇溶解，滴加入聚维酮溶液中，用10ml无水乙醇洗瓶，手动搅拌，倒入250ml烧杯中搅拌充分，搅拌后冻干3-5h，得到姜黄素固体分散体，取900mg姜黄素固体分散体，加注射用生理盐水5ml，得到20mg/ml的姜黄素注射剂，置于于棕色瓶中保存。

4.根据权利要求1所述姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能降低脑缺血再灌注患者中谷丙转氨酶的活力和尿酸含量，改善脑缺血再灌注肝肾功能损伤。

5.根据权利要求1所述姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能降低脑缺血再灌注患者中Caspase-3的表达，上调Bcl-2的表达，从而抑制神经细胞凋亡。

6.根据权利要求1所述姜黄素在制备治疗脑缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，所述姜黄素能抑制脑缺血再灌注患者中损伤相关因子Cox-II、p-ERK和p-cPLA2的表达水平。