CN106822165A - 刺槐素‑7‑o‑葡萄糖醛酸苷的用途 - Google Patents

刺槐素‑7‑o‑葡萄糖醛酸苷的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了刺槐素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷的用途。该化合物有心肌保护作用活性，因此刺槐素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷能作为心肌保护作用先导化合物。

Description

刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的新用途。
背景技术
心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指在短期心肌血供间断一定时间内恢复血供，原缺血心肌在代谢、结构、功能等方面发生较血供恢复前更严重甚至不可逆的。目前，在缺血性心脏病的治疗过程中，MIRI是阻碍疾病获得最佳疗效的主要难题，在很大程度上削弱了治疗的初衷，使很多病人遭受更严重的身体伤害和经济损失。因此，寻找有效的方法实现血液再灌注的同时，减轻再灌注损伤势在必行，而阐明MIRI的发生机制是从根本防治此类疾病的基本前提。
经过学者们多年的探索和研究，对MIRI也有了一定程度的认识，其基本原理及发病机制已有所突破。研究显示，活性氧自由基的损伤，细胞内Ca2+超载、炎症级联反应、血管收缩以及细胞凋亡等因素均参与了MIRI的发生和发展。虽然目前关于MIRI的报道已有很多，但其发病机制过于复杂，具有多层面、多靶点的特点。人们对MIRI的现有了解相对有限，仍然缺乏相对系统的发病机制网络和新颖有效的治疗方法。
缺血预处理(Ischemia Preconditioning，IPC)是指心脏在几回短暂的心肌缺血后能耐受随后较长期间的缺血损伤，从而达到减小心梗面积，提高心脏功能恢复程度以及降低心律失常发生率的目的。IPC作为一种内源性的保护机制，尽管具有一定的临床价值，但因道德伦理和使用不便等诸多原因使其临床运用受到限制。因此，常采用药物预处理的方法，达到心肌保护的作用。由此看来，寻找切实有效的治疗药物成为防治MIRI的首要任务。目前，西药还是治疗冠心病的主要药物，但我国传统中药兼备疗效确切及副反应少等众多长处优势，因此，开发具有一定治疗效果、作用机理明确且副反应少的治疗心血管疾病的中药，具有重要的研究意义和应用价值。另外，中药单体成分结构明确、研究结果更易于现代医学接受，近来愈来愈引起学者们的广泛重视，一些中药单体抗心肌缺血的作用及机理已被证实。
植物资源中有许多活性物质可以保护心肌缺血，缺氧，而且一些已开发用于预防和治疗心血管疾病。黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物，大量存在于水果、蔬菜等植物中，有些游离存在于植物中，但有些则以成苷的方式存在，因其结构类型复杂多样的特点而具有抗氧化，抗炎，抗肿瘤，抗癌，以及增强免疫能力等多种药理作用。且已有研究表明黄酮类化合物对MIRI有一定的防治作用。大量文献资料表明，口服黄酮类化合物对MIRI有一定的治疗作用。由于中药单体化学结构明确，更具药效靶向性，为了更加深入的研究黄酮类成分对MIRI的药理作用，课题组对香青兰中黄酮成分刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷进行制备工艺的研究，又首次通过结扎大鼠左冠状动脉前降支的方式复制MIRI模型，对刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷进行抗MIRI的作用及机制的研究。
发明内容
本发明的目的是提供刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷在制备保护心肌的药物中的应用。
本发明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保护作用活性，该化合物能作为心肌保护作用先导化合物。从动物整体及细胞因子水平阐明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对抗心肌缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。
A、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可抑制大鼠心肌梗死程度以及血清心肌酶的释放；
B、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷通过纠正急性心肌缺血再灌注损伤过程中能量代谢障碍、抑制氧化损伤、炎症因子活化及中性粒细胞浸润的抗炎作用、缓解急性心肌缺血再灌注损伤时内皮功能障碍、调控凋亡活性基因的表达，抑制细胞凋亡等机制发挥抗急性心肌缺血再灌注损伤的作用；
从动物整体及细胞因子水平，研究刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对抗心肌缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。通过组织病理形态学观察发现，模型组心肌纤维断裂明显，细胞肿胀，有大量炎症细胞浸润；与模型组比较，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷组心肌纤维较为完整，并呈束状分布，炎症细胞浸润不明显。采用TTC染色法测定心肌梗死范围，比色法测定血清心肌酶的活性，结果表明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能够明显减轻大鼠心肌梗死程度，与模型组比较具有显著性差异；此外，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能够有效降低血清心肌酶的活性，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。分别采用不同的试剂盒测定大鼠心肌组织中能量代谢酶Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性，血清中SOD、GSH-Px、XOD的酶活性、脂质代谢产物MDA的水平、炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的含量及中性粒细胞特异性酶MPO的活性。结果表明，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对心肌组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性提高具有显著的作用；能够显著升高血清中抗氧化酶活性，降低XOD活性及MDA含量，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；降低血清中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α水平(P＜0.05)和MPO的活性(P＜0.05或P＜0.01)。通过ELISA试剂盒检测血清中内皮舒缩因子ET-1、CGRP、TXA2、PGI2的水平实验证明，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能够降低血清中内皮收缩因子ET-1和TXA2的含量，提高内皮舒张因子CGRP和PGI2的含量；通过比色法测定血清中NO含量及心肌组织中NOS的活性，结果表明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对NO水平和NOS活力具有显著的抑制作用，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。通过检测心肌细胞凋亡率、组织中Bcl-2和Bax蛋白及Caspase-3mRNA的表达，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各剂量组均明显降低心肌细胞凋亡率，同时提高抑制凋亡基因Bcl-2表达，而降低促凋亡基因Bax表达，Bcl-2/Bax比值升高明显，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，此外，还能够显著抑制Caspase-3mRNA的表达，且高、中剂量组具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
附图说明：
具体实施方式
图1 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠心肌梗死程度的影响(n＝10)
图1-1中A：假手术组；B：模型组；C：普奈洛尔组；D：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高剂量组；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷中剂量组；F：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低剂量组。
图2 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠血清心肌酶活性的影响(n＝10)。
图3 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠血清氧化应激的影响(n＝10)。
图4 MIRI大鼠心肌组织病理学观察(HE×200)。A：假手术组；B：模型组；C：普萘洛尔组；D：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高剂量组；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷中剂量组；E：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低剂量组；F：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低剂量组。
图5 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠心肌组织中ATPase活性的影响(n＝10)。
图6 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠心肌细胞凋亡率的影响(n＝10)。
图7 IRI大鼠心肌组织中Bcl-2基因表达(DAB显色，×200)。
图8 IRI大鼠心肌组织中Bax基因表达(DAB显色，×200)。
图9 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠心肌Bcl-2(左)和Bax(右)的影响(n＝10)。
图10 IRI大鼠心肌组织中caspase-3mRNA表达(n＝10)。
图11 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对缺血再灌注损伤大鼠血清促炎因子的影响(n＝10)。
图12 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠机体NO水平及NOS活性的影响(n＝10)。
图13 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对IRI大鼠血清内皮功能因子的影响(n＝10)。
一、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤对抗作用及分子机制研究
前期试验通过从一种植物中分离纯化得到刺槐素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷单体；现以刺槐素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷为研究药物，研究其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用以及其作用机制。选用经典的在体模型-结扎大鼠左冠状动脉前降支，对刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的保护作用及其作用机制进行研究，该模型更接近于临床发病的情况，对于药物的实际应用更具有指导意义和借鉴价值。选用HE染色观察心肌组织病理形态学变化，TTC染色检测心肌梗死程度，并对血清心肌酶的含量进行了检测，采用宏观和微观的方法对刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷抗MIRI的作用机制进行研究。
1动物分组及药物处理
SD大鼠，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型对照组、生理盐水组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组，其中3组大鼠于手术前1周分别灌胃不同剂量的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷(2mg/kg/d、4mg/kg/d、8mg/kg/d)，连用7d；其余各组大鼠术前分别给予相应容积的溶剂，时间同药物组。
2大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型的建立
将Wistar大鼠用乌来糖以(1g/Kg)剂量麻醉后，立即仰位固定于手术台上，将心电图机针型电极插入大鼠四肢皮下，记录正常II导联心电图。调节小动物呼吸机，潮气量7mL/100g，吸呼比：2∶1，呼吸频率70次，然后沿胸骨左缘3-4肋间开胸，连接小动物呼吸机，再次记录II导联心电图。暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支(距左心耳下降2mm水平处)，结扎后心脏回位，分别于结扎0min、10min、20min、30min记录II导联心电图，并于结扎30min时松开结扎线，记录再灌0min、15min、30min、60min、90min、120min II导联心电图，模型复制成功的标准：结扎后II导联心电图以ST段明显抬高表现为心肌缺血成功复制，放松结扎线后，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功复制。符合该标准者入选实验。整个实验过程中用图像分析软件记录分析大鼠肢体II导联心电图S-T段变化，计算各组大鼠ECG在缺血和再灌注时S-T段变化绝对值。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI心电图S-T段影响见表1。
表1 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI心电图S-T段的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
由表1可以看出，各试验组缺血及再灌注时均有S-T段的显著抬高及下降，提示模型建立成功。与假手术组相比，模型组缺血前和再灌注后S-T段均明显升高(P＜0.01)与模型组相比，普萘洛尔组在缺血期和再灌注期的ST段显著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组在缺血期和再灌注期ST段的抬高幅度显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，低剂量组的ST段降低幅度相对于模型组无显著性差异。此结果说明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷预处理能缓解MIRI过程中心电传导的异常。
3心肌梗死程度的测定
将心脏冰冻后，从心尖到心基底部平行切成2mm的薄片，置于含有1％TTC的50mMTris-HCl(pH＝7.4)中37℃避光染色20min，染色过程中不时摇动染液，使之与心肌充分的接触，保证染色完全。用超纯水将心肌切片冲洗3次，然后置于10％甲醛溶液中固定12h，以增强颜色对比。由于非梗死区心肌细胞中的脱氢酶可以将TTC还原成红色，因此，该区域心肌组织呈现砖红色；而梗死区，由于心肌细胞膜损伤，脱氢酶漏出，不能将TTC还原，故该区域心肌组织呈现灰白色。使用数码照相机采集图像，并在图像分析软件(Image J)下计算出梗死区的面积(IS)，用IS×2mm即为梗死区的体积，心肌梗死程度以IS/AAR(梗死心肌体积/全心体积)来表示。结果见图1。
试验结果表明，假手术组大鼠心肌染色正常，没有呈现白色的区域，可见其心肌无梗死现象；模型组大鼠心肌梗死严重，特别是结扎线以下极为明显。而刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组能够显著的降低心肌梗死程度(P＜0.01，P＜0.05)，达到保护心肌的作用，效果呈现剂量依赖性。普萘洛尔组也可显著降低心肌梗死范围(P＜0.01)。
4心肌缺血再灌注后心肌酶及氧化酶含量测定
再灌2h结束后，腹主动脉取血8-10ml，在4℃下，3000rpm离心10min分离血清备用。动脉血血清标本-20℃保存。采用试剂盒测定血清心肌酶LDH、CK、CK-MB及AST活性；并测定抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，及氧化产物XOD、MDA的含量。
4.1刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠心肌酶影响见表2，图2。
表2 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠血清心肌酶的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
与假手术组相比，模型组心肌酶释放量显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，普萘洛尔组心肌酶均显著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组心肌酶含量降低显著(P＜0.01，P＜0.05)，低剂量组对LDH，CK-MB的含量有抑制作用(P＜0.05)，而对AST，CK活力无显著性影响。从表2-2中可以看出，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组对CK-MB释放的抑制作用强于普萘洛尔组。另外，此数据同样提示了刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对心肌酶的抑制作用有一定的剂量-效应关系。
4.2刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠氧化酶影响见表3，图3。
表3 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠血清氧化应激的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与假手术组比较，模型组血清SOD，GSH-Px活性下降显著(P＜0.01)，而XOD活性及MDA含量显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，普萘洛尔组SOD，GSH-Px活性显著升高(P＜0.01)，XOD活性及MDA含量显著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各剂量组SOD，GSH-Px活性显著高于模型组，MDA含量显著低于模型组(P＜0.01，P＜0.05)，低剂量组能够明显提高SOD活性、降低XOD活性(P＜0.05)，而对GSH-Px活性和MDA含量影响不显著。
5心肌组织HE染色
取心脏下1/3心肌组织中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，从各组取5张石蜡切片，二甲苯脱蜡，HE染色，梯度乙醇脱水，封片，于光学显微镜下观察。采用评分制评价组织细胞损伤程度：0分(无损伤)；1分(轻度损伤)：心肌纤维无明显断裂，细胞轮廓清晰，间质水肿和局灶性坏死；2分(中度损伤)：心肌纤维出现一定程度的断裂，弥散性心肌细胞溶胀和坏死，有少量红细胞破裂；3分(严重损伤)：心肌纤维较大面积断裂，细胞轮廓模糊，融合性坏死并伴随中性粒细胞浸润，破裂的红细胞分布于细胞间隙；4分(极严重损伤)：心肌纤维大量断裂，细胞融合性病变坏死，中性粒细胞大量浸润及出血严重。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI心肌组织病理学影响见图4。
常规HE染色后在光镜下可见假手术组心肌细胞排列整齐，界限清晰，呈束状分布，心肌细胞核形态正常，无细胞肿胀和坏死区，胞浆染色均匀；模型组可见心肌广泛融合性病变，心肌细胞肿胀，肌纤维排列紊乱，大片状出血坏死，细胞间中性粒细胞浸润明显；普萘洛尔组大鼠轻度水肿，少量炎症因子的浸润；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各药物组与模型组比较损伤较轻，高剂量组与普萘洛尔组作用相当。
6对心肌组织中Ca2+的影响
6.1心肌中Ca2+含量检测
在强碱性条件下，邻甲酚酞络合酮法可与钙离子络合酮从而形成稳定的有色复合物，在波长575nm处，其吸光度与样本中钙含量成正比，试剂中8-羟基喹啉可消除镁的干扰，其他金属由氰化物掩蔽，二甲基亚砜为邻甲酚酞络合酮的稳定剂，亦可使轻度脂血标本反应液澄清，并可消除蛋白影响。按Elizabeth等的方法略作改动。胞浆悬浮于1％HCl中，150W×10s超声3次，30000×g离心60min，取上清邻甲酚酞络合酮显色，575nm波长比色。结果见表4。
表4 对MIRI大鼠Ca2+含量的影响(n＝6)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与假手术组相比，模型组线粒体Ca2+浓度显著升高。与模型组相比，药物组、以及阳性药物组均能有效抑制线粒体Ca2+浓度升高，药物低、中剂量也能相应的减低Ca2+浓度。
6.2大鼠心肌组织中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的测定
通过测定无机磷的量即可以判定ATP酶的活力。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对心肌Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性影响见表5，图5。
表5 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠心肌组织中ATPase活性的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与假手术组比较，模型组Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性均显著下降；与模型组比较，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组能够显著提高组织中ATPase活性(P＜0.01或P＜0.05)′，低剂量对ATPase活性的影响不具有显著性差异；阳性药对ATPase活性的影响也具有统计学意义(P＜0.05)。
7对心肌细胞凋亡的影响
用200目尼龙网研磨心肌组织块，生理盐水冲洗，将冲洗液收集后离心，弃去上清，向沉淀物中加入0.5％胃蛋白酶2mL，37℃消化30min后，加入生理盐水稀释至5mL，用100目尼龙网过滤，将滤液离心，弃去上清。取沉淀物按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书，采用流式细胞术检测平滑肌细胞凋亡情况。
7.1刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对心肌细胞凋亡影响见表6，图6。
表6 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠心肌细胞凋亡率的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，+P＜0.05，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与假手术比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显增加(P＜0.01)，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷组呈剂量依赖性的减少心肌细胞凋亡率，高、中剂量组具有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)，此外，普萘洛尔组也能够明显降低心肌细胞的凋亡，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。
7.2对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响
采用免疫组化法测定Bcl-2和Bax。步骤如下：石蜡切片脱蜡入水，PBS水化10min；含3％H2O2的甲醇溶液室温孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加正常血清封闭液，室温孵育30min，甩去多余液体；滴加Bcl-2/Bax单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗5min×3次；滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(S-A/HRP)工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；二氨基联苯胺(DAB)显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下Bcl-2和Bax免疫阳性细胞胞浆中有呈棕褐色、棕黄色或淡黄色的颗粒物，根据着色强度及阳性细胞百分率进行评分。在200倍视野下，观察凋亡阳性细胞分布情况，每张切片于阳性表达区随机选择6个无重叠视野，计算免疫阳性细胞率并评分，免疫阳性细胞率＝免疫阳性细胞数/(免疫阳性细胞数+免疫阴性细胞数)×100％，蛋白阳性表达结果采用着色强度积分与阳性细胞百分率积分相加的方法进行统计。评分标准见表7。
表7 免疫组化结果判断标准
刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对Bax、Bcl-2表达的影响见表8，图7，图8，图9。
表8 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠心肌组织中Bcl-2和Bax表达的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，+P＜0.05，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
免疫组化结果显示，假手术组仅见极少数散在的Bcl-2和Bax蛋白阳性表达；模型组大鼠心肌细胞胞质中Bcl-2和Bax蛋白阳性染色增加，而Bax增加幅度较Bcl-2大，导致Bcl-2/Bax比值降低；与模型组比较，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷能够增加Bcl-2的表达而降低Bax的表达，且随着剂量的增加Bcl-2的表达增加而降低Bax的表达降低，从而使Bcl-2/Bax比值升高；阳性药组也能够升高抗凋亡蛋白Bcl-2和降低促凋亡蛋白Bax的表达，从而使Bcl-2/Bax比值升高，达到抗凋亡的作用。
7.3对细胞色素C(CytC)及腺嘌呤核苷酸转运体ANT1(ANT1)的影响：
采用western-blot法检测心肌细胞胞浆Cyt C和ANT-1蛋白水平。从-80℃冰箱中取出各组心肌标本，加入组织裂解液，冰浴中充分研磨成组织匀浆；15000r·min-1离心10min，定量测定蛋白浓度；加入上样缓冲液，95℃水浴变性15min。每孔加100μg胞浆蛋白，经SDS-PAGE分离，4℃下100V恒压转膜，室温下用5％脱脂奶粉封膜2h，分别加入LC3、Beclin-1或内参GAPDH一抗，于4℃孵育过夜；洗膜后与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h；漂洗后ECL发光，常规显影。结果以目的条带灰度/内参条带灰度比值表示目的蛋白相对表达量。结果见表9。
表9 IRI大鼠心肌组织中Cyt C、ANT-1蛋白表达
由实验结果可知，模型组与假手术组比较Cyt C及ANT1表达均显著增加。与模型组比较，阳性药物组CytC及ANT1表达显著降低；药物高、中剂量组CytC及ANT1表达明显减少，此结果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷预处理能够通过抑制ANT-1的表达，来调节线粒体释放Cyt C减少，从而影响线粒体凋亡通路，最终抑制心肌缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡。
7.4心肌组织中Caspase-3mRNA的检测
提取心肌组织中RNA，取2μL RNA按逆转录试剂盒操作合成cDNA(65℃ 5min，42℃60min，70℃ 5min)，测定cDNA浓度并稀释，保存于-20℃备用。Caspase-3上游引物：5′-TTGGAGCACTGTAGCACACA-3′，下游引物：5′-ACCACTGAAGGATGGTAGCC-3′；
β-actin上游引物：5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，
下游引物：5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′。
以适量cDNA为模板进行PCR反应(94℃3min，94℃ 30sec，51℃ 30sec，72℃ 1min，72℃ 5min)。反应结束后取6μL扩增产物，用1.5％琼脂糖对每个PCR产物进行电泳，在凝胶成像仪上进行扫描及定量分析。测定Caspase-3与β-actin扩增产物电泳条带的A比值，即为目的基因caspase-3的mRNA相对表达量。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对Caspase-3mRNA表达的影响见表10，图10。
表10 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对各组心肌组织caspase-3 mRNA表达的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
与假手术组比较，模型组caspase-3mRNA表达显著增加(P＜0.01)。与模型组比较，普萘洛尔组caspase-3mRNA表达显著降低(P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组caspase-3mRNA表达明显减少(P＜0.01，P＜0.05)，此结果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷预处理能够抑制缺血再灌注损伤后caspase-3mRNA的表达。
8对前炎症因子的影响
8.1测定血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平
EILSA法检测血清中IL-1、IL-6和TNF-α的含量，严格按照试剂盒说明书操作。后以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值，采用标准曲线计算各细胞因子水平。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影响见表11，图11。
表11 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对缺血再灌注损伤大鼠血清促炎因子的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
与假手术组比较，模型组血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量及MPO活性明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷高、中剂量组和普萘洛尔组能降低上述炎症因子水平及炎症细胞浸润程度，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)；刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷低剂量对于炎症因子虽然具有抑制能力，但不显著，而对MPO的活性则具有明显的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。
8.2检测心肌细胞核内核转录因子(NF-κB)水平
采用western-blot法检测NF-κB表达水平。从-80℃冰箱中取出各组心肌标本，加入组织裂解液，冰浴中充分研磨成组织匀浆；15000r·min-1离心10min，定量测定蛋白浓度；加入上样缓冲液，95℃水浴变性15min。每孔加100μg胞浆蛋白，经SDS-PAGE分离，4℃下100V恒压转膜，室温下用5％脱脂奶粉封膜2h，分别加入LC3、Beclin-1或内参GAPDH一抗，于4℃孵育过夜；洗膜后与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h；漂洗后ECL发光，常规显影。结果以目的条带灰度/内参条带灰度比值表示目的蛋白相对表达量。结果见表12。
表12 IRI大鼠心肌组织中NF-κB蛋白表达
与假手术组比较，模型组NF-κB活性明显升高；与模型组比较，药物高、中剂量组和阳性药组均能降低NF-κB活性，差异具有显著性；药物中剂量和低剂量组对于NF-κB活性虽然具有抑制能力，但不显著。
8.3检测心肌细胞胞浆中磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平
采用western-blot法检测磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1表达水平。从-80℃冰箱中取出各组心肌标本，加入组织裂解液，冰浴中充分研磨成组织匀浆；15000r·min-1离心10min，定量测定蛋白浓度；加入上样缓冲液，95℃水浴变性15min。每孔加100μg胞浆蛋白，经SDS-PAGE分离，4℃下100V恒压转膜，室温下用5％脱脂奶粉封膜2h，分别加入LC3、Beclin-1或内参GAPDH一抗，于4℃孵育过夜；洗膜后与辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h；漂洗后ECL发光，常规显影。结果以目的条带灰度/内参条带灰度比值表示目的蛋白相对表达量。结果见表13。
表13 IRI大鼠心肌组织中磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1蛋白表达
由实验结果可知，与假手术组比较模型组磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平均显著增加。与模型组比较，药物高、中剂量组与阳性药物组均磷酸化IκB-α、COX-2和ICAM-1水平显著降低。此结果提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷预处理能够通过激活IκB-α的磷酸化，与NF-κB结合并使其以无活性的形式存在于胞浆内，从而减少细胞黏附分子COX-2和ICAM-1的磷酸化，来对抗心肌缺血/再灌注引起的损伤。
8.4免疫组化染色分析CD40/CD40L在心肌组织中的表达水平
CD40/CD40L在心肌组织中的表达水平检测采用免疫组化染色进行图像分析。石蜡切片脱蜡入水，PBS水化10min；含3％H2O2的甲醇溶液室温孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加正常血清封闭液，室温孵育30min，甩去多余液体；滴加Bcl-2/Bax单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗5min×3次；滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加链霉亲和素-辣根过氧化物酶(S-A/HRP)工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；二氨基联苯胺(DAB)显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果见表14。
表14 IRI大鼠心肌组织中CD40/CD40L蛋白表达水平
免疫组化结果显示，假手术组仅见极少数散在的CD40、CD40L蛋白阳性表达；模型组大鼠心肌细胞胞质中CD40、CD40L蛋白阳性染色增加，而CD40L增加幅度较CD40大，导致CD40/CD40L比值降低；与模型组比较，药物组能够降低CD40L的表达，且随着剂量的增加而减少CD40L表达的程度升高，从而使CD40/CD40L比值升高；阳性药物组也能够降低CD40L的表达，使CD40/CD40L比值升高。提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可以通过提高CD40/CD40L表达，抑制无复流现象，减少细胞死亡发生。9对心肌细胞基质金属蛋白酶的影响
采用实时逆转录多聚酶链反应(Real Time RT-PCR)检测方法测定心肌MMP-2、TIMP-2mRNA转录水平。提取心肌组织中RNA，取2μL RNA按逆转录试剂盒操作合成cDNA(65℃5min，42℃ 60min，70℃ 5min)，测定cDNA浓度并稀释。以适量cDNA为模板进行PCR反应(94℃ 3min，94℃ 30sec，51℃ 30sec，72℃ 1min，72℃ 5min)。反应结束后取6μL扩增产物，用1.5％琼脂糖对每个PCR产物进行电泳，在凝胶成像仪上进行扫描及定量分析。结果见表15。
表15 IRI大鼠心肌组织中MMP-2mRNA、TIMP-2mRNA表达(n＝10)
与假手术组比较，模型组MMP-2mRNA表达显著增加。与模型组比较，阳性药物组MMP-2nRNA表达显著降低；药物高、中剂量组MMP-2mRNA表达明显减少；TIMP-2mRNA表达趋势相反。此结果提示药物预处理能够通过刺激TIMP-2mRNA表达，特异性抑制MMP-2酶活性升高造成的心肌损伤。
10对血浆NO、PGI2、ET等的影响
10.1对心肌组织及血清中NO含量、NOS活力及iNOS水平的影响
心肌组织及血清中NO的测定采用硝酸还原酶法，NO化学生质活波，在体内代谢很快转为硝酸盐(NO3 -)和亚硝酸盐(NO2 -)，而NO2 -又进一步转化为NO3 -，本法利用硝酸还原酶特异性将NO3 -还原为NO2 -，通过在550nm处测定其吸光度可反映NO的浓度。心肌组织及血清中NOS的测定，按NOS试剂检测盒说明书所提供的方法进行。原理为：NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530nm波长下测定其吸光度，可计算出NOS的活力。iNOS表达水平采用ELISA方法测定。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对NO、NOS及iNOS水平的影响见表16，图12。
表16 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠机体NO水平及NOS活性的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，+P＜0.05，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
与假手术比较，模型组大鼠心肌组织中NO含量及NOS的活性显著升高(P＜0.01或P＜0.05)，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷组各剂量及普萘洛尔组可以明显降低心肌组织中NO的含量和NOS的活性(P＜0.01或P＜0.05)，并呈现一定的剂量依赖性；其中，各给药组对iNOS的抑制作用强于tNOS。
11.2对血浆ET、CGRP、TXB2及6-Keto-PGF1a含量的影响
血浆ET、CGRP、TXB2及6-Keto-PGF1a含量水平采用采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定。刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对ET、CGRP、TXB2及6-Keto-PGF 1a含量的影响见表17，图13。
表17 刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对MIRI大鼠血清内皮功能因子的影响(n＝10)
注：与假手术组比较，++P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
与假手术组相比，模型组血清中缩血管因子ET-1与TXB2含量明显升高，CGRP与6-Keto-PG含量明显下降(P＜0.01)。与模型组比较，刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷各个剂量组可以明显降低MIRI大鼠血清ET-1、TXB2含量(P＜0.01或P＜0.05)，显著提高MIRI大鼠血清CGRP、6-Keto-PGF1a含量(P＜0.01或P＜0.05)。普萘洛尔减少ET-1、TXB2含量及增加CGRP、6-Keto-PGF1a含量的效果均优于刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷药物组。
11.3免疫组化检测心肌组织PKCε蛋白表达
心肌组织PKCε蛋白表达采用免疫组化方法检测：取心脏下1/3心肌组织中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，从各组取5张石蜡切片，二甲苯脱蜡，98℃用修复液进行抗原修复，室温凉至30℃，滴加过氧化物酶阻断液，室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶活性，滴加动物血清室温封闭10min，一抗(1∶200稀释)湿盒内4℃过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶50稀释)湿盒内室温20min，DAB显色，苏木素复染，氨水返蓝，乙醇梯度脱水，封片，于光学显微镜下观察。Image-pro软件分析计算各组阳性表达细胞的光密度值。结果见表18。
表18 IRI大鼠心肌组织中PKCε蛋白表达水平
免疫组化结果显示，假手术组仅见较少PKCε蛋白阳性表达；模型组大鼠心肌细胞胞质中PKCε蛋白阳性染色显著增多；与模型组比较，药物组能够减少PKCε的表达，且随着剂量的增加而使抑制PKCε表达的程度增强；与阳性药物组表现相当。提示刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可以抑制PKCε表达，达到心肌保护作用。
实施例1：
本发明的目的是刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的用途：
本发明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保护作用活性，该化合物能作为心肌保护作用先导化合物。从动物整体及细胞因子水平阐明刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷对抗心肌缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。
实施例2
本发明的目的是刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的用途：
本发明的用途是：刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷具有心肌保护作用活性，该化合物能作为心肌保护作用先导化合物。
A、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷可抑制大鼠心肌梗死程度以及血清心肌酶的释放；
B、刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷通过纠正急性心肌缺血再灌注损伤过程中能量代谢障碍、抑制氧化损伤、炎症因子活化及中性粒细胞浸润的抗炎作用、缓解急性心肌缺血再灌注损伤时内皮功能障碍、调控凋亡活性基因的表达，抑制细胞凋亡等机制发挥抗急性心肌缺血再灌注损伤的作用。

Claims (2)

1.式I所示的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷在制备保护心肌的药物中的应用
2.适应症
用于冠心病、急性心肌梗死以及清热、止痛、心脏病和高血压头晕引起的心神不宁的治疗。
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