CN110835362B

CN110835362B - 一种柳穿鱼叶苷对照品的制备方法

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Publication number: CN110835362B
Application number: CN201810940019.2A
Authority: CN
Inventors: 舒亚平; 杨士杰; 贺湘; 钱勇; 谢天培
Original assignee: SHANGHAI BAINIAN SHIDANDE INSPECTION TECHNOLOGY CO LTD; Shanghai Nature Standard R&d And Biotech Co ltd; Shanghai Standard Technology Co ltd
Current assignee: SHANGHAI BAINIAN SHIDANDE INSPECTION TECHNOLOGY CO LTD; Shanghai Nature Standard R&d And Biotech Co ltd; Shanghai Standard Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: CN110835362A

Abstract

本发明公开了一种柳穿鱼叶苷对照品的制备方法。具体地，本发明的方法包括以下步骤：(i)提供柳穿鱼叶苷的醇提物；(ii)用NaOH水溶液溶解所述的醇提物，通过洗脱剂，利用聚酰胺柱分离所述的醇提物后进行浓缩，获得柳穿鱼叶苷半成品；(iii)溶解所述的柳穿鱼叶苷半成品，并利用中压制备柱分离所述的半成品，从而获得柳穿鱼叶苷粗品；(iv)碱溶酸沉所述的柳穿鱼叶苷粗品，过滤，得固体，固体用甲醇热溶冷析后，抽滤，得柳穿鱼叶苷纯品；和(v)浓缩并冷冻干燥所述的纯品，获得所述的柳穿鱼叶苷对照品。本发明工艺稳定、操作方便、分离效率高，成本低廉经济环保，具有较高的经济价值和学术价值。

Description

一种柳穿鱼叶苷对照品的制备方法

技术领域

本发明属于中药现代化技术领域，涉及一种中药化学对照品的制备方法，具体来说，本发明提供一种柳穿鱼叶苷对照品的制备方法。

背景技术

大蓟为菊科植物蓟Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，夏、秋二季花开时采割地上部分，除去杂质，晒干。大蓟化学成分主要有三萜及甾体类、挥发油类、黄酮和黄酮苷类、长链烯炔醇类、有机酸类等化合物。在临床上,大蓟味甘、微苦、性凉,具有“消淤血、生新血、止吐血、止鼻血和消疮毒”的作用。还可用于治疗肺结核、高血压、尿路结石、尿血、痈疖初起、肺经风热所引起的鼻炎等多种临床上的应用。现代药理研究发现大蓟具有止血、抗菌、抗肿瘤等作用。

柳穿鱼叶苷是大蓟中含量较高的黄酮苷类成分，是在2015年版《中国药典》一部中收载的指标成分，柳穿鱼叶苷(Pectolinarin)，分子式为C₂₉H₃₄O₁₅，结构式如下：

目前国内关于柳穿鱼叶苷分离纯化文献报道很少，加之，柳穿鱼叶苷已在2015版药典中被列为标准，对其需求量越来越大，而柳穿鱼叶苷溶解性很差，从药材中分离出单体非常困难，市面上供应量严重不足，因此从大蓟中分离纯化柳穿鱼叶苷对照品显得非常必要，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的第一方面提供一种柳穿鱼叶苷对照品的分离纯化方法，所述的方法包括以下步骤：

(i)提供柳穿鱼叶苷的醇提物；

(ii)用NaOH水溶液溶解所述的醇提物，通过洗脱剂，利用聚酰胺柱分离所述的醇提物后进行浓缩，获得柳穿鱼叶苷半成品；

(iii)溶解所述的柳穿鱼叶苷半成品，并利用中压制备柱分离所述的半成品，从而获得柳穿鱼叶苷粗品；

(iv)碱溶酸沉所述的柳穿鱼叶苷粗品，过滤，得固体，固体用甲醇热溶冷析后，抽滤，得柳穿鱼叶苷纯品；和

(v)浓缩并冷冻干燥所述的纯品，获得所述的柳穿鱼叶苷对照品。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中聚酰胺柱为常压玻璃柱，使用的填料为聚已内酰胺，其中，所述的聚已内酰胺粒径为100-200目。

在另一优选例中，所述步骤(ii)包括步骤：使用质量分数为3-5％NaOH水溶液溶解所述的柳穿鱼叶苷的醇提物，与聚酰胺拌样后，加1-3％盐酸调节pH，pH为6-8后烘干。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中使用的洗脱剂包括：

乙酸乙酯 8-11重量份；

甲醇 0.8-2重量份；

质量分数为0.05％的NaOH水溶液 0.5-1重量份。

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷半成品纯度≥50.0％。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中的中压制备柱设有柱压0-2MPa,此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中的中压制备柱设有柱压0.5-2MPa，此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中的中压制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

在另一优选例中，所述的填料粒径为40-60μm。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中,中压制备柱的流动相为质量分数为20％-50％四氢呋喃水溶液。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中，中压制备柱洗脱剂流速为50-70mL/min。

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷粗品纯度≥98％。

在另一优选例中，所述步骤(iv)包括步骤：使用质量分数为3-5％NaOH水溶液溶解所述的柳穿鱼叶苷粗品，再用质量分数为3-5％盐酸水溶液调节pH，pH为6-8后烘干。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中甲醇的纯度≥99.7％。

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷的醇提物由包括以下步骤的方法制备得到：

(I)混合大蓟药材和乙醇溶液，在50-70℃下进行提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；

(II)使用大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用2-8倍柱体积的水和2-5倍柱体积的15-30％乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍柱体积的50-65％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩以获得步骤(i)中所述柳穿鱼叶苷的醇提物。

在另一优选例中，所述的乙醇溶液与大蓟药材以体积质量比(L/kg)为5-20倍量混合。

在另一优选例中，所述步骤(I)中的乙醇溶液的体积百分比浓度为60-75％。

在另一优选例中，所述的大孔树脂为苯乙烯型弱极性共聚体。

在另一优选例中，所述的大孔树脂为AB-8型苯乙烯型弱极性共聚体。

在另一优选例中，所述的大孔树脂粒径为0.3-1.25mm。

本发明的第二方面提供了一种柳穿鱼叶苷对照品，所述的柳穿鱼叶苷对照品用如本发明第一方面所述的方法制备所得。

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷对照品纯度≥99.0％。

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷对照品纯度≥99.4％，

在另一优选例中，所述的柳穿鱼叶苷对照品纯度≥99.8％。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为本发明实施例1所得柳穿鱼叶苷对照品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种高纯度柳穿鱼叶苷对照品的制备方法。本制备方法采用聚酰胺柱分离纯化柳穿鱼叶苷醇提物，有效的富集到了目标物，除去了浸膏。然后采用中压柱纯化，在一定的压强下，分离效率大大提高。最后将样品进行碱溶酸沉，以及甲醇热溶冷析处理，进一步提高柳穿鱼叶苷的纯度。在此基础上，完成了本发明。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一种优选的技术方案如下：

A.原料提取：将大蓟药材按照体积质量比L/Kg加入5～8倍量的乙醇溶液，所使用的乙醇溶液的体积百分比浓度为60-75％；将大蓟药材和乙醇溶液在60℃下热提取至少2次，每次大约2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；

B.大孔树脂富集：将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜，然后然后分别用2-8倍量柱体积的水和2-5倍量柱体积的15-30％乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的50-65％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩以获得步骤(i)中所述的柳穿鱼叶苷醇提物；

C.聚酰胺纯化：将步骤B的柳穿鱼叶苷醇提物用质量分数为3％NaOH水溶液溶液溶解，与聚酰胺1:1拌样，加3％盐酸调节至pH为6-8，烘干，进行聚酰胺柱层析，再用洗脱剂进行洗脱，收集目标流份，其中，所述的洗脱剂包括：8-11重量份乙酸乙酯；0.8-2重量份甲醇；0.5-1重量份质量分数为0.05％的NaOH水溶液，收集目标流份，浓缩以获得柳穿鱼叶苷半成品；

D.中压制备:将步骤C所得的柳穿鱼叶苷半成品用质量分数为3％NaOH水溶液溶解，加质量分数为1％盐酸调节PH＝10，上中压制备柱，用20％四氢呋喃水洗脱，浓缩得到纯度为98％左右的柳穿鱼叶苷粗品；

E.碱溶酸沉：将步骤D所得到的纯度为98％左右的柳穿鱼叶苷粗品用质量分数为3％NaOH水溶液溶解过滤，在滤液中加入3％盐酸水溶液，调节pH为6-8，抽滤，得固体；

F.热溶冷析：将步骤E所得固体加甲醇加热溶解，置于冰箱中，0-4℃下冷却析出，抽滤，得固体；

G.产品回收：将步骤F得到的固体加水分散、冷冻干燥，得纯度为99.8％柳穿鱼叶苷对照品。

本发明的主要优点

1、工艺步骤少，耗时短，得率高，操作简便，易于工业化生产；

2、溶剂消耗少，工艺过程中的溶剂都可回收再利用；

2、溶剂毒性小，所用的溶剂为乙醇、甲醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、纯水，环境污染小；

4、具有较高的学术价值。目前国内关于柳穿鱼叶苷分离纯化的文献报道较少，结合聚酰胺、中压色谱用于柳穿鱼叶苷的分离纯化属首次；

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

柳穿鱼叶苷对照品的制备方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

A.原料提取；将大蓟药材30Kg，加入180L体积分数为70％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共10L；

B.大孔树脂富集：称取6KgAB-8大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜15个小时，然后分别用25L的水和20L柱体积的30％乙醇溶液洗脱杂质，再用10L的60％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩至400ml；

C.聚酰胺纯化：向步骤B的浓缩液中加3％NaOH溶液溶解，与聚酰胺1:1拌样，加3％盐酸调节至中性，烘干，进行聚酰胺柱层析，再用洗脱剂进行洗脱，收集目标流份，其中，所述的洗脱剂包括：8-11重量份乙酸乙酯；0.8-2重量份甲醇；0.5-1重量份质量分数为0.05％的NaOH水溶液；浓缩得到柳穿鱼叶苷半成品30g；

D.中压制备：将步骤C的柳穿鱼叶苷半成品用3％NaOH溶解，加1％盐酸调节PH＝10，上中压制备柱，用20％四氢呋喃水洗脱，浓缩得到纯度为98％左右的柳穿鱼叶苷粗品20g；

E.碱溶酸沉：将步骤D所得到的98％左右的柳穿鱼叶苷粗品20g，3％NaOH水溶液溶解过滤，在滤液中加入3％盐酸水溶液，调节pH为6-8后烘干，抽滤，得固体；

F.热溶冷析：将步骤E所得到的固体加甲醇加热溶解，置于冰箱中，0-4℃下冷却析出，抽滤，得固体；

G.产品回收：将步骤F得到的固体加水分散、冷冻干燥，得纯度为99.8％柳穿鱼叶苷对照品15g。

所得柳穿鱼叶苷对照品的HPLC检测图谱如图1所示，其中，检测条件Plus-C18 2.1×50mm 1.8um波长330nm柱温30℃流速0.4ml/min进样1ul；流动相：乙腈(B)-0.1％甲酸水(A)0-10min 20％-20％B 10.1-13min95％-95％B，检测柳穿鱼叶苷对照品纯度为99.8％。

实施例2

A.原料提取；将大蓟药材100Kg，加入600L体积分数为70％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共30L；

B.大孔树脂富集：称取20KgAB-8大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜15个小时，然后分别用80L的水和50L柱体积的30％乙醇溶液洗脱杂质，再用30L的60％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩至1000ml；

C.聚酰胺纯化：向步骤B的浓缩液中加3％NaOH溶液溶解，与聚酰胺1:1拌样，加3％盐酸调节至中性，烘干，进行聚酰胺柱层析，再用洗脱剂进行洗脱，收集目标流份，所述的洗脱剂包括：乙酸乙酯8-11重量份；甲醇0.8-2重量份；质量分数为0.05％的NaOH水溶液0.5-1重量份，浓缩得到柳穿鱼叶苷半成品90g；

D.中压制备：将步骤C的柳穿鱼叶苷半成品用3％NaOH水溶液溶解，加1％盐酸调节PH＝10，上中压制备柱，用20％四氢呋喃水洗脱，浓缩得到纯度为98％左右的柳穿鱼叶苷粗品60g；

E.碱溶酸沉：将步骤D所得到的98％左右的柳穿鱼叶苷粗品60g，3％NaOH水溶液溶解过滤，在滤液中加入3％盐酸水溶液，调节PH至6-8，抽滤，得固体；

G.产品回收：将步骤F得到的固体加水分散、冷冻干燥，得纯度为99.8％柳穿鱼叶苷对照品50g。

所得柳穿鱼叶苷对照品经HPLC分析纯度为99.8％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种柳穿鱼叶苷对照品的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(i) 提供柳穿鱼叶苷的醇提物；

(ii)用NaOH水溶液溶解所述柳穿鱼叶苷的醇提物，通过洗脱剂，利用聚酰胺柱分离所述的醇提物后进行浓缩，获得柳穿鱼叶苷半成品；其中，聚酰胺柱为常压玻璃柱，使用的填料为聚已内酰胺，所述的聚已内酰胺粒径为100-200目，并且，所述步骤(ii)中使用的洗脱剂包括：8-11重量份的乙酸乙酯；0.8-2重量份的甲醇；0.5-1重量份的质量分数为0.05%的NaOH水溶液；

(iii)溶解所述的柳穿鱼叶苷半成品，并利用中压制备柱分离所述的半成品，从而获得柳穿鱼叶苷粗品；其中，中压制备柱设有柱压0-2MPa，此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下；中压制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；中压制备柱的流动相为质量分数为20%-50%四氢呋喃水溶液；

(v) 浓缩并冷冻干燥所述的纯品，获得所述的柳穿鱼叶苷对照品；

其中，所述的柳穿鱼叶苷的醇提物由包括以下步骤的方法制备得到：

(I) 混合大蓟药材和乙醇溶液，在50-70℃下进行提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；所述的乙醇溶液与大蓟药材以体积质量比L/kg为5-20倍量混合；

(II) 使用苯乙烯型弱极性共聚体的大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用2-8倍柱体积的水和2-5倍柱体积的15-30%乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍柱体积的50-65%乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩以获得步骤(i)中所述柳穿鱼叶苷的醇提物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)包括步骤：

使用质量分数为3-5%NaOH水溶液溶解所述的柳穿鱼叶苷的醇提物，与聚酰胺拌样后，加质量分数为1-3%盐酸调节pH，pH为6-8后烘干。

3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中的中压制备柱设有柱压0.5-2MPa，此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中,所述的填料粒径为40-60μm。

5.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，中压制备柱洗脱剂流速为50-70mL/min。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)中甲醇的纯度≥99.7％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)包括步骤：

使用质量分数为3-5%NaOH水溶液溶解所述的柳穿鱼叶苷粗品，再用质量分数为3-5%盐酸水溶液调节pH，pH为6-8后烘干。

8.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的乙醇溶液的体积百分比浓度为60-75%。

9.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的大孔树脂粒径为0.3-1.25mm。

10.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的大孔树脂为AB-8型苯乙烯型弱极性共聚体。

11.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：

A.原料提取：将大蓟药材按照体积质量比L/Kg加入5～8倍量的乙醇溶液，所使用的乙醇溶液的体积百分比浓度为60-75%；将大蓟药材和乙醇溶液在60℃下热提取至少2次，每次大约2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；

B.大孔树脂富集：将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜，然后分别用2-8倍量柱体积的水和2-5倍量柱体积的15-30%乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的50-65%乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱剂，浓缩以获得步骤(i)中所述的柳穿鱼叶苷醇提物；

C.聚酰胺纯化：将步骤B的柳穿鱼叶苷醇提物用质量分数为3%NaOH水溶液溶解，与聚酰胺1:1拌样，加3%盐酸调节至pH为6-8，烘干，进行聚酰胺柱层析，再用洗脱剂进行洗脱，收集目标流份，其中，所述的洗脱剂包括：8-11重量份乙酸乙酯；0.8-2重量份甲醇；0.5-1重量份质量分数为0.05%的NaOH水溶液，收集目标流份，浓缩以获得柳穿鱼叶苷半成品；

D.中压制备: 将步骤C所得的柳穿鱼叶苷半成品用质量分数为3%NaOH水溶液溶解，加质量分数为1%盐酸调节pH=10，上中压制备柱，用20%四氢呋喃水洗脱，浓缩得到纯度为98%左右的柳穿鱼叶苷粗品；

E.碱溶酸沉：将步骤D所得到的纯度为98%左右的柳穿鱼叶苷粗品用质量分数为3%NaOH水溶液溶解过滤，在滤液中加入3%盐酸水溶液，调节pH为6-8，抽滤，得固体；

G.产品回收：将步骤F得到的固体加水分散、冷冻干燥，得纯度为99.8%柳穿鱼叶苷对照品。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柳穿鱼叶苷半成品纯度≥50.0％；或所述的柳穿鱼叶苷粗品纯度≥98％。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法得到的柳穿鱼叶苷对照品的纯度≥99.0%。