CN101955507A - 柳穿鱼苷对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种柳穿鱼苷对照品的制备方法，取柳穿鱼药材、粉碎，用极性溶剂冷浸及微波处理后再经超声提取，硅胶-氧化镁混合柱吸附、解析，收集的洗脱液浓缩至原体积的1/10-1/15作为下次柱层析的上样液，柱层析2-5次，洗脱液减压浓缩至干，反复重结晶，即得柳穿鱼苷对照品。最终产品用HPLC对其进行含量测定，产品纯度达98％以上，可作为柳穿鱼中柳穿鱼苷定性、定量标准对照品。该制备方法操作简单、适于大批量生产。

Description

柳穿鱼苷对照品的制备方法

技术领域：

本发明属于天然药物化学领域，涉及天然产物提取、分离、纯化方法，尤其涉及一种柳穿鱼苷对照品的制备方法。

背景技术：

柳穿鱼苷(Pectolinarin)，又名果胶里哪苷。

分子式及分子量：C29H34O15；622.56；

分子结构式：

物理性状：无色针状结晶(甲醇)，熔点254-255℃。

柳穿鱼为玄参科柳穿鱼属植物柳穿鱼(Linaria vulgaris Mill.subsp.sinensis(Bebeaux)Hong的干燥全草。具有清热解毒，散瘀消肿的功用，主治感冒，头痛头晕，黄疸，痔疮便秘，皮肤病，烫火伤。全草含乙酰柳穿鱼苷，地上部分含鸭嘴花碱，叶含龙头花苷，花含蒙花苷，柳穿鱼苷，新蒙花苷。

现代药理研究证明，柳穿鱼可用于治疗风湿性心脏病、咳嗽、哮喘，其主要成分柳穿鱼苷还具有潜在的抗肿瘤活性。

目前国内提取柳穿鱼苷的方法主要是通过乙醇回流提取，经大孔树脂或硅胶、聚酰胺柱层析吸附。例如在专利申请号为200910010324，发明名称为“一种柳穿鱼黄酮及其总黄酮的制备方法和用途”中公开的工艺流程是水或醇回流提取，HPD-600、AB-8或D101大孔树脂吸附，不同浓度的醇洗脱，再经硅胶色谱柱、聚酰胺色谱柱或凝胶色谱柱等。该方法用了大量的二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇等有毒溶剂，且提取率低，成本较高。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是：采用先进的工艺方法从柳穿鱼中提取、分离纯化柳穿鱼苷，其工艺提取率高，产品纯度高，适于批量生产。

本发明的技术方案：柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)柳穿鱼的预处理：将柳穿鱼药材洗净，干燥，制成粗粉，过2040目筛备用；

(2)柳穿鱼稠膏的获取：将干燥的柳穿鱼粉末用极性溶剂冷浸，微波照射5-10分钟后超声萃取10-60min，萃取1-5次，冷却，过滤，合并滤液，减压回收得稠膏；

(3)制备及纯化：将所得稠膏用甲醇或乙醇溶解，层析硅胶拌样，上柱层析，4-8BV氯仿-甲醇(1∶1)混合溶液洗脱，HPLC检测，收集柳穿鱼苷相对含量≥40％的部分，其余低含量柳穿鱼部分合并，积累到一定量后浓缩与下批次上样液混合再重复进行柱层析纯化步骤；柳穿鱼苷含量≥40％的部分浓缩至原体积的1/10-1/15，再次过柱层析纯化，氯仿-丙酮(3∶1-10∶1)洗脱，反复柱层析，收集洗脱液，减压浓缩至干，得柳穿鱼苷粗品；

(4)重结晶：将所得粗品用乙酰丙酮-乙醇回流饱和溶解，重结晶1-4次，得纯品。

所述步骤(2)中极性溶剂为水或甲醇、丙酮，液料比为8∶1-20∶1(kg/L)。

所述步骤(2)中微波功率为75-750W，超声功率为40-400W。

所述步骤(3)中硅胶拌样用量与样品量的质量比为1∶1-1∶3；柱层析填料为硅胶和氧化镁，硅胶和氧化镁的填料比例为5∶1-10∶1。

所述步骤(3)中氯仿-甲醇混合液洗脱流速为0.5-2BV/h。

所述步骤(3)中洗脱剂氯仿-丙酮混合洗脱液洗脱用量为5-7BV，反复柱层析2-5次。

所述步骤(4)中重结晶溶剂乙酰丙酮、乙醇体积比为1∶1-3∶1。

与现有技术相比，本发明利用现代提取技术，将微波辅助和超声有机结合，充分利用微波的高能作用及超声波的空化作用，为柳穿鱼苷的提取分离提供了一种新的有效方法；此外通过混合柱层析和重结晶来提高柳穿鱼苷的纯度，使得提取物中柳穿鱼苷的含量达98％以上；该方法安全性高，生产周期短，生产成本低，适于大批量生产。

具体实施方式：

实施例1：

将柳穿鱼粉碎过40目筛，取500g，加入7.5L蒸馏水冷浸，在200W微波下照射5分钟再在50W超声波作用下处理20分钟，过滤，重复操作2次，合并滤液，减压回收得稠膏；将稠膏用甲醇溶解，与等质量的硅胶拌样，上硅胶-氧化镁(5∶1)层析柱，用4BV氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱速度0.5BV/h，收集洗脱液，HPLC检测，收集柳穿鱼苷含量≥40％洗脱部分，浓缩至原体积的1/10，再次上硅胶-氧化镁(7∶1)层析柱，氯仿-丙酮(3∶1)洗脱至无柳穿鱼苷流分，收集洗脱液，减压浓缩至干，乙酰丙酮-乙醇(2∶1)重结晶2次，得柳穿鱼苷，纯度为98.8％。

实施例2：

将柳穿鱼粉碎过20目筛，取500g，加入5L蒸馏水冷浸，在220W微波下照射7分钟再在70W超声波作用下处理10分钟，过滤，重复操作3次，合并滤液，减压回收得稠膏；将稠膏用甲醇溶解，与1.2倍样品质量的硅胶拌样，上硅胶-氧化镁(7∶1)层析柱，用5BV氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱速度1BV/h，收集洗脱液，HPLC检测，收集柳穿鱼苷含量≥40％洗脱部分，浓缩至原体积的1/10，再次上硅胶-氧化镁(9∶1)层析柱，氯仿-丙酮(7∶1)洗脱至无柳穿鱼苷流分，反复柱层析5次，收集洗脱液，减压浓缩至干，乙酰丙酮-乙醇(1∶1)，重结晶3次，得柳穿鱼苷，纯度为99％。

实施例3：

将柳穿鱼粉碎过30目筛，取1kg，加入12L蒸馏水冷浸，在340W微波下照射10分钟再在150W超声波作用下处理30分钟，过滤，重复操作4次，合并滤液，减压回收得稠膏；将稠膏用甲醇溶解，与2倍样品质量的硅胶拌样，上硅胶-氧化镁(8∶1)层析柱，用7BV氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱速度0.8BV/h，收集洗脱液，HPLC检测，收集柳穿鱼苷含量≥40％洗脱部分，浓缩至原体积的1/10，再次上硅胶-氧化镁(10∶1)层析柱，氯仿-丙酮(10∶1)洗脱至无柳穿鱼苷流分，反复柱层析3次，收集洗脱液，减压浓缩至干，乙酰丙酮-乙醇(2∶1)重结晶2次，得柳穿鱼苷，纯度为98.7％。

实施例4：

将柳穿鱼粉碎过20目筛，取2kg，加入30L蒸馏水冷浸，在440W微波下照射12分钟再在270W超声波作用下处理25分钟，过滤，重复操作2次，合并滤液，减压回收得稠膏；将稠膏用甲醇溶解，与1.5倍样品质量的硅胶拌样，上硅胶-氧化镁(5∶1)层析柱，用5BV氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱速度1.5BV/h，收集洗脱液，HPLC检测，收集柳穿鱼苷含量≥40％洗脱部分，浓缩至原体积的1/15，再次上硅胶-氧化镁(8∶1)层析柱，氯仿-丙酮(8∶1)洗脱至无柳穿鱼苷流分，反复柱层析2次，收集洗脱液，减压浓缩至干，乙酰丙酮-乙醇(3∶1)重结晶2次，得柳穿鱼苷，纯度为98.5％。

实施例5：

将柳穿鱼粉碎过40目筛，取5kg，加入100L蒸馏水冷浸，在380W微波下照射7分钟再在200W超声波作用下处理35分钟，过滤，重复操作5次，合并滤液，减压回收得稠膏；将稠膏用甲醇溶解，与2.5倍样品质量的硅胶拌样，上硅胶-氧化镁(6∶1)层析柱，用4BV氯仿-甲醇(1∶1)洗脱，洗脱速度1.2BV/h，收集洗脱液，HPLC检测，收集柳穿鱼苷含量≥40％洗脱部分，浓缩至原体积的1/13，再次上硅胶-氧化镁(10∶1)层析柱，氯仿-丙酮(6∶1)洗脱至无柳穿鱼苷流分，反复柱层析4次，收集洗脱液，减压浓缩至干，乙酰丙酮-乙醇(1∶1)重结晶3次，得柳穿鱼苷，纯度为99.2％。

Claims (6)

1.柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)柳穿鱼的预处理：将柳穿鱼药材洗净，干燥，制成粗粉，过20-40目筛备用；

(2)柳穿鱼稠膏的获取：将干燥的柳穿鱼粉末用极性溶剂冷浸，微波照射5-10分钟后超声萃取10-60min，萃取1-5次，冷却，过滤，合并滤液，减压回收得稠膏；

(3)制备及纯化：将所得稠膏用甲醇或乙醇溶解，层析硅胶拌样，上柱层析，4-8BV氯仿-甲醇(1∶1)混合溶液洗脱，HPLC检测，收集柳穿鱼苷相对含量≥40％的部分，其余低含量柳穿鱼部分合并，积累到一定量后浓缩与下批次上样液混合再重复进行柱层析纯化步骤；柳穿鱼苷含量≥40％的部分浓缩至原体积的1/10-1/15，再次过柱层析纯化，氯仿-丙酮(3∶1-10∶1)洗脱，反复柱层析，收集洗脱液，减压浓缩至干，得柳穿鱼苷粗品；

(4)重结晶：将所得粗品用乙酰丙酮-乙醇重结晶1-4次，得纯品。

2.如权利要求1所述的柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中极性溶剂为水或甲醇、丙酮，液料比为8∶1-20∶1(kg/L)。

3.如权利要求1所述的柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中微波功率为75-750W，超声功率为40-400W。

4.如权利要求1所述的柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中硅胶拌样用量与样品量的质量比为1∶1-1∶3；柱层析填料为硅胶和氧化镁，硅胶和氧化镁的填料比例为5∶1-10∶1。

5.如权利要求1所述的柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中洗脱剂氯仿-丙酮混合洗脱液洗脱用量为5-7BV，反复柱层析2-5次。

6.如权利要求1所述的柳穿鱼苷对照品的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中重结晶溶剂乙酰丙酮、乙醇体积比为1∶1-3∶1。