CN101475619B

CN101475619B - 一种柳穿鱼黄酮及其总黄酮的制备方法和用途

Info

Publication number: CN101475619B
Application number: CN 200910010324
Authority: CN
Inventors: 刘晓秋; 华会明; 关宏峰; 兰洲
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2009-02-09
Filing date: 2009-02-09
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2029-02-09
Also published as: CN101475619A

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种柳穿鱼中黄酮及其总黄酮的制备方法和用途，来源于柳穿鱼中的黄酮类化合物，包括柳穿鱼苷、柳穿鱼苷元、乙酰柳穿鱼苷、乙酰蒙花苷、蒙花苷、橙皮苷、刺槐素、粗毛豚草素、木犀草素、香草木素、白杨素等黄酮类化合物。其将柳穿鱼的干燥全草用水或醇回流提取，然后使用大孔树脂进行上柱，使用不同浓度的醇进行洗脱，收集洗脱液，再将不同洗脱流分经硅胶色谱柱、聚酰胺色谱柱、凝胶色谱柱等，得到各组合物，得到的总黄酮物质的含量在60％以上，该黄酮类组合物可以用于制备治疗心血管疾病、咳嗽及哮喘药物。本发明的提取方法简单实用且造价低廉，适合于工业化生产。

Description

一种柳穿鱼黄酮及其总黄酮的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，涉及一种柳穿鱼黄酮及其总黄酮的制备方法和用途，具体地说是涉及一种来源于柳穿鱼药材的总黄酮和多种黄酮制备方法及其在制备治疗心血管疾病、咳嗽及哮喘药物中的用途。

背景技术

柳穿鱼为玄参科(Scrophulariaceae)柳穿鱼属(Linaria)植物柳穿鱼Linaria vulgaris ssp.sinensis(Bebeaux)Hong的干燥全草。其原产欧亚大陆北部温带，生沙地、山坡草地及路边。喜光，较耐寒，不耐酷热，宜中等肥沃、适当湿润而又排水良好的土壤。

国外民间用柳穿鱼属植物作利尿剂、轻泻剂、解痉、利胆和抗炎药，用于治疗膀胱炎、出血、皮疹等[Handjieva NV，et al.Iridoid glycosides fromLinaria species.Tetrahedron，1993，49(41)：9261-9266]。柳穿鱼药材主要含有黄酮类成分，未见有关柳穿鱼黄酮及总黄酮制备方法及其用于制备治疗心血管疾病，缓解咳嗽及哮喘药物的报道。本发明提供了简便快速、造价低廉且适合工业化大生产的制备柳穿鱼总黄酮和高纯度单体黄酮的方法及总黄酮在心血管疾病方面的用途。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种来源于柳穿鱼的黄酮及总黄酮。

本发明的目的之二在于提供所述柳穿鱼黄酮及总黄酮的制备方法。

本发明的目的之三在于提供所述柳穿鱼黄酮及总黄酮的用途。

本发明提供的柳穿鱼的总黄酮类，是从柳穿鱼药材中提取的，其总黄酮的含量在60％以上。其中主要以柳穿鱼苷为主，含量在20％以上，还包括柳穿鱼苷、柳穿鱼苷元、橙皮苷和刺槐素等。

其柳穿鱼黄酮和总黄酮的制备方法如下：

1)预处理：将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药备用；

2)提取：加入5～12倍生药量的50～90％的提取溶剂进行回流提取1～4次，每次提取时间为0.5～3h，滤过，合并滤液；或加入5～10倍生药量的50～90％的提取溶剂冷浸12h～48h，滤过，合并滤液；或加入5～10倍量的50～90％的提取溶剂浸润4～24小时，使药材粗粉充分膨胀，分次均匀地装入底部垫有脱脂棉的渗漉器中，每次装好后用木棒压紧，上面盖上纱布，并压上一层洗净的小石子，以免加入提取溶剂后使药粉浮起。然后打开渗滤器下口的开关，再慢慢地从渗漉器上部加进提取溶剂，当液体自下口流出时关闭上口开关，加盖，打开下口开关，使渗漉液缓缓流出，渗漉速度为2～5ml/min，收集渗漉液，过滤，合并滤液。所述的提取溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

3)浓缩：将步骤2)得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏。

4)上柱：将步骤3)得到的浸膏以0.3～0.5g/ml上样于AB-8或HPD-600或D101型大孔树脂，上样流速为1～3BV/h，分别采用柱径高比为1∶3～1∶7的大孔吸附树脂，上样浓度为0.3～0.5g/ml，用30％～90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。

5)制备：将收集到的乙醇浓度为90％洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼的总黄酮提取物。

6)将步骤4)得到的不同乙醇洗脱部分经硅胶色谱柱、聚酰胺色谱柱或凝胶色谱柱，用三氯甲烷或二氯甲烷或甲醇或乙醇或水或它们之间的不同比例的组合洗脱，分别得到橙皮苷、柳穿鱼苷、柳穿鱼苷元和刺槐素等不同的黄酮单体化合物。

其中所述步骤2)的提取溶剂为乙醇；提取方式为回流。回流提取方法是以90％乙醇提取3次。每次提取时间为1.5h。所述步骤4)的大孔树脂柱为HPD-600型树脂，上样浓度为0.5g/ml，流速为3BV/h，柱径高比为1∶5，乙醇浓度为30％、50％和90％。

将步骤4)中得到的30％乙醇洗脱部分流经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷∶甲醇(30∶1)进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到橙皮苷，纯度在95％以上。

将步骤4)中得到的50％乙醇洗脱部分流经反复硅胶柱色谱，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼苷，纯度在95％以上。

将步骤4)中得到的90％乙醇洗脱部分经过反复硅胶柱色谱、用二氯甲烷∶甲醇(70∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过聚酰胺柱色谱、用二氯甲烷∶甲醇(100∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再流经Sephadex LH-20柱色谱，用二氯甲烷进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼苷元和刺槐素，纯度在95％以上。

柳穿鱼苷 R＝OCH₃ R₁＝-glc(6→1)rha

柳穿鱼苷元 R＝OCH₃R R₁＝H

刺槐素 R＝H R₁＝H

柳穿鱼总黄酮及柳穿鱼中多种高含量黄酮在制备治疗心血管疾病及缓解咳嗽、哮喘药物中的应用。

本发明提供的提取方法简单、易行，以HPLC为检测手段，以柳穿鱼苷的含量为检测指标，可以有效地对整个工艺流程进行质量控制，有效地提高了黄酮类成分的含量，得到的原料药纯度高，色泽好；另外，该提取方法使用常规提取设备，造价低廉，工艺中没有使用到有毒的有机溶剂，无污染，有利于保护环境，适于工业化生产。

附图说明

图1为异丙肾上腺素所致急性心肌缺血小鼠的常压耐缺氧实验(X±SD，n＝10)

具体实施方式

实施例1、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的90％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为1.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.5g/ml上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶5，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为66.8％。

实施例2、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入8倍生药量的80％的乙醇回流提取2次，每次提取时间为1h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为63.2％。

实施例3、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入12倍生药量的70％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为0.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为60.8％。

实施例4、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的70％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为0.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上样于AB-8型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用80％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为62.6％。

实施例5、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入8倍生药量的80％的乙醇回流提取2次，每次提取时间为1h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于AB-8型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为60.6％。

实施例6、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入12倍生药量的70％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为0.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于AB-8型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为63.6％。

实施例7、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的70％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为0.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.3g/ml上样于D-101型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用80％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为61.6％。

实施例8、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入8倍生药量的80％的乙醇回流提取2次，每次提取时间为1h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于D-101型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为65.3％。

实施例9、柳穿鱼总黄酮的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入12倍生药量的70％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为0.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏，得到的浸膏以0.4g/ml上样于D-101型大孔树脂，上样流速为3BV/h，采用柱径高比为1∶3，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。洗脱液滤过，合并滤液，浓缩干燥、粉碎，得到柳穿鱼总黄酮物。本发明的柳穿鱼总黄酮，其为黄棕色粉末，以柳穿鱼苷为对照品，采用分光光度法，在280nm测定吸收度，计算总黄酮的含量为60.4％。

实施例10、柳穿鱼中橙皮苷的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的90％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为1.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液过滤，合并滤液，得到的滤液浓缩干燥得到柳穿鱼提取浸膏。将得到的浸膏上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，分别采用柱径高比为1∶5，上样浓度为0.5g/ml，用30％的浓度乙醇溶液进行洗脱。将得到的30％乙醇洗脱部分流经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷∶甲醇(30∶1)进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到橙皮苷，纯度在95％以上。

实施例11、橙皮苷的结构鉴定

白色粉末，UVλ_max ^MeOH 280nm。HCl-Mg反应阳性，聚酰胺薄层色谱，喷1％三氯化铝-乙醇溶液，紫外灯下显绿色荧光，Molish反应阳性，酸水解反应检出葡萄糖和鼠李糖。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz，TMS内标)，12.0(1H，s，OH-5)，9.09(1H，s，OH-3′)，6.92(3H，m，H-2′，H-5′，H-6′)，6.14(1H，brs，H-8)，6.12(1H，brs，H-6)，5.50(1H，dd，J＝3，12.6Hz，H-2)，4.97(1H，d，Glc-1)，4.52(1H，s，Rha-1)，3.77(3H，s，4′-OCH₃)，3.27(1H，dd，J＝12.6，17Hz，3-H)，2.77(1H，dd，J＝3，17Hz，3-H)，1.07(3H，d，J＝6.0Hz，Rha-6)。¹³C-NMR(DMSO-d6，75MHZ，TMS内标)，197.1(C-4)，165.2(C-7)，162.6(C-9)，148.0(C-4′)，146.5(C-3′)，131.0(C-1′)，118.0(C-6′)，114.2(C-2′)，112.1(C-5′)，103.4(Rha-1)，100.7(C-10)，99.5(Glc-1)，96.4(C-6)，95.6(C-8)，78.4(C-2)，76.3(Glc-3)，75.6(Glc-5)，73.0(Glc-2)，72.1(Rha-3)，70.8(Rha-2)，70.3(Rha-4)，69.7(Glc-4)，68.4(Rha-5)，66.1(Glc-6)，55.8(OCH₃-4′)，42.2(C-3)，17.9(Rha-6)。综合以上数据及查阅相关文献，鉴定其为橙皮苷。

实施例12、柳穿鱼中柳穿鱼苷的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的90％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为1.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液过滤，合并滤液，得到的滤液浓缩干燥得到柳穿鱼提取浸膏。将得到的浸膏上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，分别采用柱径高比为1∶5的大孔吸附树脂，上样浓度为0.5g/ml，用50％的浓度乙醇溶液进行洗脱。将得到的50％乙醇洗脱部分流经反复硅胶柱色谱，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过Sephadex LH-20柱色谱，用甲醇进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼苷，纯度在95％以上。

实施例13、柳穿鱼苷的结构鉴定

淡黄色粉末，UVλ_max ^MeOH，273、330nm。HCl-Mg反应阳性，聚酰胺薄层色谱，喷1％三氯化铝-乙醇溶液，紫外灯下显暗斑，Molish反应阳性。酸水解反应检出葡萄糖和鼠李糖。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz，TMS内标)，12.97(1H，s，OH-5)，8.05(2H，d，J＝8.1Hz，H-2′，H-6′)，7.17(2H，d，J＝8.1Hz，H-3′，H-5′)，6.95(2H，s，H-3，H-8)，5.13(1H，d，J＝6.0Hz，Glc-1)，4.57(1H，brs，Rha-1)，3.87(3H，s，OCH₃-4′)，3.78(3H，s，OCH₃-6)，1.00(3H，d，J＝6.0Hz，Rha-6)，3.27(1H，dd，J＝12.6，17Hz，3-H)，2.77(1H，dd，J＝3，17Hz，3-H)，1.07(3H，d，J＝6.0Hz，Rha-6)。¹³C-NMR(DMSO-d6，75MHZ，TMS内标)，182.5(C-4)，164.3(C-2)，162.5(C-4′)，156.6(C-9)，152.6(C-5)，152.3(C-7)，132.8(C-6)，128.6(C-2′)，122.8(C-1′)，114.9(C-3′，C-5′)，106(C-10)，103.4(C-3)，100.5(Glc-1)，94.5(C-8)，76.6(Glc-3)，75.9(Glc-5)，73.3(Glc-2)，72.1(Rha-3)，70.9(Rha-4)，70.6(Rha-2)，69.6(Glc-4)，68.4(Rha-5)，66.1(Glc-6)，59.6(OCH₃-6)，55.2(OCH₃-4′)，17.9(Rha-6)。综合以上数据及查阅相关文献，鉴定其为柳穿鱼苷。

实施例14、柳穿鱼中柳穿鱼苷元和刺槐素的制备

将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药加入10倍生药量的90％的乙醇回流提取3次，每次提取时间为1.5h，收集提取液，过滤，得到的滤液过滤，合并滤液，得到的滤液浓缩干燥得到柳穿鱼提取浸膏。将得到的浸膏上样于HPD-600型大孔树脂，上样流速为3BV/h，分别采用柱径高比为1∶5的大孔吸附树脂，上样浓度为0.5g/ml，用90％的浓度乙醇溶液进行洗脱。将得到的90％乙醇洗脱部分经过反复硅胶柱色谱、用二氯甲烷∶甲醇(70∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过聚酰胺柱色谱、用二氯甲烷∶甲醇(100∶1)进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再流经Sephadex LH-20柱色谱，用二氯甲烷进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼苷元和刺槐素，纯度在95％以上。

实施例15、柳穿鱼苷元的结构鉴定

淡黄色针晶(甲醇)。UVλ_max ^MeOH 273、330nm。HCl-Mg反应呈阳性。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz，TMS内标)，13.03(1H，s，OH-5)，10.73(1H，s，OH-7)，8.02(2H，d，J＝8.1Hz，H-2′，H-6′)，7.09(2H，d，J＝8.1Hz，H-3′，H-5′)，6.87(1H，s，H-3)，6.66(1H，s，H-8)，3.84(3H，s，OCH₃-4′)，3.74(3H，s，OCH₃-6)。¹³C-NMR(DMSO-d6，75MHZ，TMS内标)，182.3(C-4)，163.5(C-2)，162.4(C-4′)，157.4(C-9)，152.9(C-5)，152.5(C-7)，131.5(C-6)，128.4(C-2′，C-6′)，123(C-1′)，114.7(C-3′，C-5′)，104.2(C-10)，103.2(C-3)，94.4(C-8)60.1(OCH₃-6)，55.6(OCH₃-4′)。综合以上数据及查阅相关文献，鉴定其为柳穿鱼苷元。

实施例16、刺槐素的结构鉴定

淡黄色针晶(甲醇)。UVλ_max ^MeOH，267、330nm。HCl-Mg反应呈阳性。¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz，TMS内标)，12.95(1H，s，OH-5)，10.85(1H，s，OH-7)，8.03(2H，d，J＝8.1Hz，H-2′，H-6′)，7.10(2H，d，J＝8.1Hz，H-3′，H-5′)，6.86(1H，s，H-3)，6.47(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.19(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，3.84(3H，s，OCH₃-4′)。¹³C-NMR(DMSO-d6，75MHZ，TMS内标)，181.8(C-4)，163(C-2)，162(C-4′)，157(C-9)，152.4(C-5)，152.1(C-7)，131.1(C-6)，128.0(C-2′，C-6′)，122.5(C-1′)，114.3(C-3′，C-5′)，103.8(C-10)，102.7(C-3)，94(C-8)，55.8(OCH₃-4′)。综合以上数据及查阅相关文献，鉴定其为刺槐素。

实施例17、柳穿鱼苷的纯度检查

以HPLC法进行柳穿鱼苷的纯度检查。采用面积归一化法计算柳穿鱼苷的含量。色谱条件：色谱柱：diamonsil^TM C₁₈(200×4.6mm，5μm)流动相：甲醇-水(45∶55)流速：0.8mL/min

检测波长：280nm，进样量20μl。用面积归一化法测定纯度，柳穿鱼苷的纯度为99.2％，可作为对照品使用。

实施例18、柳穿鱼苷元的纯度检查

以HPLC法进行柳穿鱼苷元的纯度检查。采用面积归一化法计算柳穿鱼苷元的含量。色谱条件：色谱柱：diamonsil^TMC₁₈(200×4.6mm，5μm)流动相：甲醇-水(55∶45)流速：0.8mL/min检测波长：280nm，进样量20μl。用面积归一化法测定纯度，柳穿鱼苷元的纯度为99.0％，可作为对照品使用。

实施例19对离体豚鼠气管平滑肌的作用实验

体重200～400g豚鼠10只，击昏后，迅速取出气管，按气管螺旋条法制成气管螺旋条标本，悬挂于盛有37℃恒温水Krebs营养液中，于NF-DC-100型离体器官测定仪记录平滑肌张力曲线。然后给药，观察总黄酮提取物对正常气管平滑肌及对组织胺、乙酰胆碱和氯化钡引起收缩的气管平滑肌的作用。实验结果表明，当营养液中药物浓度为0.026g/ml时，对正常的平滑肌有显著的松弛作用，并能完全地拮抗组织胺、乙酰胆碱和氯化钡引起的离体平滑肌的收缩。

实施例20柳穿鱼总黄酮的祛痰作用研究

体重18～22g小鼠，雌雄各半分为三组，按酚红法进行试验，腹腔注射31％的柳穿鱼总黄酮提取物0.05g/kg，口服给予62％柳穿鱼总黄酮提取物0.15g/kg及分别腹腔注射和口服等量的生理盐水，分别于30min和1h后，腹腔注射0.25％酚红20mg/kg。15min后处死，分离气管，将6号枕头插入气管内约0.5mm。结扎固定后，用注射器吸取5％碳酸氢钠溶液0.5ml，通过针头反复冲洗三遍，收集碳酸氢钠冲洗液0.3～0.5ml于试管中。精置18～24小时与标准管进行目测比色，结果见表1。

表1柳穿鱼总黄酮提取物对小鼠祛痰作用

注：与生理盐水组对照比较：***P＜0.001

表1结果表明，与生理盐水组比较：腹腔注射柳穿鱼总黄酮提取物和口服柳穿鱼总黄酮提取物均能极显著地提高小鼠气管的酚红排泄量(P＜0.001)。提示柳穿鱼总黄酮提取物有较好的提高小鼠气管酚红排泄量的功能，有祛痰作用。

实施例21柳穿鱼苷和柳穿鱼苷元及的柳穿鱼总黄酮提取物的小鼠氨水引咳法实验

小鼠雌雄各半，随机分6组，每组10只，阳性药物对照组灌服咳必清(枸橼酸喷托维林糖衣片，丹东制药厂生产)50mg/kg，空白对照组给同体积的0.5％CMCNa，给药组分别灌服柳穿鱼苷元(0.5％CMCNa混悬液)100、200mg/kg和柳穿鱼苷(0.5％CMCNa混悬液)100、200mg/kg和柳穿鱼总黄酮提取物(0.5％CMCNa混悬液)100、200mg/kg。给药1小时后(阳性对照组给药2小时后)，将小鼠置于倒置的500mL烧杯中，内放一棉球，用1ml注射器吸取氨水0.4ml注入棉球，迅速倒置烧杯，记录小鼠的咳嗽潜伏期(秒)和3分钟内咳嗽次数。实验结果见表3。

表2柳穿鱼苷和柳穿鱼苷元对氨水引起小鼠咳嗽的影响

注：与空白对照比较：***P＜0.001，**P＜0.01

表2实验结果提示，与空白对照组比较：柳穿鱼苷元组、柳穿鱼苷组、柳穿鱼总黄酮提取物组、咳必清组均能显著延长氨水所致小鼠咳嗽潜伏期(P＜0.01)，且可显著抑制氨水所致小鼠咳嗽(P＜0.01)。提示柳穿鱼总黄酮提取物及柳穿鱼苷、柳穿鱼苷元的延长小鼠咳嗽潜伏期、抑制小鼠咳嗽的作用较强。

实施例22柳穿鱼苷和柳穿鱼苷元的小鼠气管段酚红法实验

雄性小鼠，体重20～24g，实验前一天饥饿过夜，只供饮水，随机分6组，每组10只。阳性药物对照组灌服氯化铵1g/kg，空白对照组灌服同体积0.5％CMCNa，给药组分别灌服柳穿鱼苷元100、200mg/kg和柳穿鱼苷100、200mg/kg。给药后30分钟腹腔注射5％酚红生理盐水500mg/kg，注射后30分钟，处死动物，取气管一段(长度应相等)放入试管中并加入1ml生理盐水，超声振荡20分钟，加入0.1ml，1mol/L NaOH，在波长546nm处比色，与酚红标准曲线比较，计算酚红量。结果见表3。

表3柳穿鱼苷和柳穿鱼苷元对小鼠气管排泌的酚红量影响

注：与空白对照比较：**P＜0.01，*P＜0.05

与氯化铵组比较：^△△P＜0.01

表3结果表明，与空白对照组比较：灌胃给柳穿鱼苷200mg/kg组和柳穿鱼苷元组均能显著地提高小鼠气管的酚红排泄量(P＜0.01)，柳穿鱼苷100mg/kg组能显著提高小鼠气管的酚红排泄量(P＜0.05)；与氯化铵组比较，柳穿鱼苷元组和柳穿鱼苷200mg/kg组的酚红排泄量有统计学差异(P＜0.01)，提示柳穿鱼苷200mg/kg组和柳穿鱼苷元有较好的提高小鼠气管酚红排泄量的功能，有较明显的祛痰作用。

实施例23柳穿鱼总黄酮对异丙肾上腺素所致急性心肌缺血小鼠的常压耐缺氧实验

取健康昆明种小鼠60只，雌雄兼用，体重20士2g，随机分为六组：正常对照组、模型对照组、柳穿鱼总黄酮5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg组和1.3mg/kg组，分别尾静脉注射药物，正常对照组尾静脉注射等容积生理盐水，各给药组容积均为0.1ml/10g。给药后5分钟后除正常对照组注射等容积生理盐水外，各组小鼠腹腔注射异丙肾上腺素(Iso)10mg/kg，各组给药容积均为0.2ml/10g，10分钟后立即将小鼠放入盛有15g钠石灰的250ml磨口广口瓶，凡士林密封。以最后一次呼吸为准，观察记录各组动物存活时间。

结果：实验数据显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠存活时间显著减少，柳穿鱼总黄酮5mg/kg组与模型对照组相比小鼠存活时间延长，10mg/kg和20mg/kg组与模型对照组相比小鼠存活时间显著延长。提示柳穿鱼总黄酮对Iso所致的心肌缺血缺氧有保护作用。结果见表4，图3。

表4急性心肌缺血小鼠常压耐缺氧实验结果

Claims

1.一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1) 预处理：将采收后的柳穿鱼药材晒干后切段，得到的柳穿鱼生药备用；

2) 提取：加入5~12倍生药量的50～90％的提取溶剂进行回流提取1~4次，每次提取时间为0.5~3h，滤过，合并滤液；或加入5~10倍生药量的50～90％的提取溶剂冷浸12h～48h，滤过，合并滤液；或加入5~10倍量的50～90％的提取溶剂浸润4~24小时，使药材粗粉充分膨胀，分次均匀地装入底部垫有脱脂棉的渗漉器中，每次装好后用木棒压紧，上面盖上纱布，并压上一层洗净的小石子，以免加入提取溶剂后使药粉浮起，然后打开渗滤器下口的开关，再慢慢地从渗漉器上部加进提取溶剂，当液体自下口流出时关闭上口开关，加盖，打开下口开关，使渗漉液缓缓流出，渗漉速度为2~5ml/min,收集渗漉液，过滤，合并滤液，所述的提取溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；

3) 浓缩：将步骤2) 得到的滤液浓缩干燥，得到柳穿鱼提取浸膏；

4) 上柱：将步骤3) 得到的浸膏以0.3~0.5g/ml上样于AB-8或HPD-600或D101型大孔树脂，上样流速为1~3BV/h，分别采用柱径高比为1：3~1：7的大孔吸附树脂，上样浓度为0.3~0.5g/ml，用30%~90%的浓度乙醇溶液进行洗脱；

5）制备：将收集到的乙醇浓度为90%洗脱液过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到柳穿鱼的总黄酮提取物；

6）纯化：将步骤4)得到的不同乙醇洗脱部分经硅胶色谱柱、聚酰胺色谱柱或凝胶色谱柱，用三氯甲烷或二氯甲烷或甲醇或乙醇或水或它们之间的不同比例的组合洗脱，分别得到橙皮苷、柳穿鱼苷、柳穿鱼苷元和刺槐素。

2.根据权利要求1所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤2) 的提取溶剂为乙醇; 提取方式为回流，且回流提取方法是以90％乙醇提取3次，每次提取时间为1.5h。

3.根据权利要求1所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤4) 的大孔树脂柱为HPD-600型树脂，上样浓度为0.5g/ml，流速为3BV/h，柱径高比为1：5，乙醇浓度为30%、50%或90%。

4.根据权利要求1所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中将步骤4）得到的30%乙醇洗脱部分流经聚酰胺柱色谱，用二氯甲烷：甲醇=30：1进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到如式I的橙皮苷，纯度在95%以上，

。

5.根据权利要求1所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所述步骤6）中将步骤4）得到的50%乙醇洗脱部分流经反复硅胶柱色谱，用二氯甲烷：甲醇=10：1进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过Sephadex LH-20柱色谱,用甲醇进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到如式II的柳穿鱼苷，纯度在95%以上；将得到的90%乙醇洗脱部分经过硅胶柱色谱、用二氯甲烷：甲醇=70：1进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再经过聚酰胺柱色谱、用二氯甲烷：甲醇=100：1进行洗脱，合并洗脱部分，得到的洗脱部分再流经Sephadex LH-20柱色谱，用二氯甲烷进行洗脱，洗脱液进行过滤，合并滤液，浓缩干燥，得到如式II的柳穿鱼苷元和刺槐素，纯度在95%以上，

Figure 2009100103242100001DEST_PATH_IMAGE002

柳穿鱼苷 R=OCH₃ R₁= -glc(6→1)rha

柳穿鱼苷元 R= OCH₃ R₁=H

刺槐素 R= H R₁=H 。

6. 根据权利要求1所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所制备的柳穿鱼总黄酮的含量占柳穿鱼总黄酮提取物的60%以上。

7. 根据权利要求1-6中任一项所述的一种柳穿鱼中黄酮类化合物及其总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的柳穿鱼总黄酮以柳穿鱼苷为主，其中柳穿鱼苷的含量在20%以上。

8. 如权利要求1所述的制备方法得到的柳穿鱼总黄酮在制备治疗心血管疾病药物中的应用。

9. 如权利要求1所述的制备方法得到的柳穿鱼总黄酮在制备缓解咳嗽、治疗哮喘药物中的应用。