CN102091104B - 从刺山柑中获得精制提取物的方法及该提取物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：a)使浓缩的刺山柑粗提物上大孔吸附树脂层析，依次用水和20-30％的乙醇溶液洗脱；b)再用50-100％的乙醇溶液洗脱，即得刺山柑精制提取物。本发明还提供由所述方法制得的刺山柑精制提取物。本发明所述刺山柑精制提取物经过药效试验证明具有明显的抗类风湿关节炎活性。本发明方法工艺简单、适合工业化生产。

Description

从刺山柑中获得精制提取物的方法及该提取物的应用

技术领域

本发明涉及天然药物化学领域，具体说，涉及从刺山柑中获得精制提取物的方法及该提取物的应用。

背景技术

刺山柑为白花菜科植物刺山柑Capparis spinoa L，又名槌果藤、老鼠瓜、野西瓜、菠里克果等。刺山柑是一种生长在炎热干旱气候条件下的半灌木，我国主要分布于新疆天山南北石质低山、丘陵坡地、山麓冲沟或戈壁滩。此外，在甘肃、西藏等地也有生长。刺山柑在国外主要分布在地中海湾地区，生长期为五月到十月。刺山柑的药用部位为叶、果和根皮，味辛苦、性温，民间用刺山柑治疗关节炎、通风等症，效果显著。

中国专利CN101185663A公开的方法是从刺山柑药用部位开始，通过提取、浓缩、萃取等步骤，得到提取物。该方法工艺较为繁琐，且使用的溶剂不利于工业化生产。而中国专利200310113957.9公开了一种从植物槌果藤实中提取抗关节炎有效部位的方法，该方法包括将刺山柑果粉碎，加热回流，冷浸或渗漉提取，减压浓缩，得到粗提物，将粗提物先用石油醚脱脂，残余物依次用乙酸乙酯和正丁醇体系洗脱，分别得到乙酸乙酯有效部位和正丁醇有效部位。该方法工艺较为繁琐，不利于工业化生产，且未明确活性部位的化学成分等物质基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提取刺山柑药材中的抗类风湿关节炎活性部位(以下称为刺山柑精制提取物)的方法。本发明人在药效追踪筛选的指导下，通过不同的药效筛选模型，对刺山柑果实进行了系统的提取研究。分别对刺山柑的水提取物、水提醇沉、醇提取物进行了筛选，确定刺山柑抗类风湿关节炎活性部位。本发明明确了刺山柑抗类风湿关节炎活性部位主要由吲哚和黄酮苷组成，并分别富集有效部位的总黄酮、总吲哚部位，分别进行了药效试验，结果显示这些活性部位都具有明显的活性。本发明方法工艺简单、适合工业化生产。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)使浓缩的刺山柑粗提物上大孔吸附树脂层析，依次用水和20-30％的乙醇溶液洗脱；

b)再用50-100％的乙醇溶液洗脱，即得刺山柑精制提取物。

对于刺山柑粗提物，本领域技术人员可按照任何公开的现有技术获得，例如，可以按照以下步骤获得：用水提取刺山柑药材、过滤、加入乙醇溶液使最终乙醇浓度为65-75％、静置后过滤；或用＜75％乙醇溶液提取刺山柑药材、过滤。

优选地，本发明所述从刺山柑中获得精制提取物的方法的特征在于，该方法包括以下步骤：

a)使浓缩的刺山柑粗提物上大孔吸附树脂层析，依次用水和20-30％的乙醇溶液洗脱；

b)再用50-70％的乙醇溶液洗脱，即得刺山柑精制提取物。

更优选地，b)步骤中使用浓度为70％的乙醇溶液洗脱。

本发明中所述的乙醇溶液为含乙醇的水溶液，所述百分比均为体积百分比。

本发明a)步骤中所述的大孔吸附树脂可以使用非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂；优选使用非极性大孔吸附树脂或中等极性大孔吸附树脂。

所述非极性大孔吸附树脂的型号例如可以包括：AB-8、ADS-4、ADS-8(南开树脂)，SPD-100、SPD-300、SPD-400、SPD-450、SPD-500、SPD-600、SPD-700、SPD-850(宝恩公司)，D101、LSA-20、XAD-5、HP-10(蓝晓公司)和D 101(天津市海光化工有限公司)。

所述中等极性大孔吸附树脂的型号例如可以包括：DM-130、DM-11(山东鲁抗)，LSA-40、LSA-10(蓝晓公司)，SPD-800(宝恩公司)，HZ-806(华震树脂)，ADS-17(南开树脂)和860021(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂)。

优选地，本发明使用中等极性大孔吸附树脂860021(山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂)。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种由上述方法制得的刺山柑提取物，其特征在于，所述提取物含有74-91％的总吲哚和5-8％的总黄酮。

所述总吲哚的主要化学成分为6-methoxybrassicanal A、6-methoxyspirobrassinin、3-醛基吲哚、3-醛基-4-羟基吲哚和Arvelexin。

所述总黄酮的主要化学成分为槲皮素-3-芸香糖苷、山奈酚-3-芸香糖苷、黄花夹竹桃黄酮、金圣草素、樱花素、银杏黄素和异银杏黄素。

本发明方法所制得的刺山柑提取物经过药效试验证明具有明显的抗类风湿关节炎活性。

相对于现有技术，本发明从刺山柑中获得提取物的方法的优势在于：

1、工艺简单，适合工业化生产，不采用有毒和价格高的有机溶剂。

2、生产时间短，可节约生产成本。

3、根据本发明方法获得的提取物中的物质基础明确，化学成分清楚。

4、环保，本工艺使用果实不破坏植被，利于生态平衡。

附图说明

图1为在210nm波长下对比例2和实施例2所得提取物的HPLC分析比较；

图2为在229nm波长下对比例2和实施例2所得提取物的HPLC分析比较；

图3为在254nm波长下对比例2和实施例2所得提取物的HPLC分析比较；

在不同的检测波长下，两个有效部位的HPLC图谱对比可以看出，氯仿部位(对比例2方法)和水提醇沉大孔树脂精制部分(实施例2方法)在HPLC图谱上显示有相同的吸收峰，尤其在保留时间20min和30min左右，两个有效部分的重合的吸收峰最多，通过化合物确认，均是黄酮和吲哚类化合物。

图4为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物山奈酚-3-芸香糖苷的HPLC图谱(保留时间为15.14分钟)；

图5为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物槲皮素-3-芸香糖苷的HPLC图谱(保留时间为14.40分钟)；

图6为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物黄花夹竹桃黄酮的HPLC图谱(保留时间为37.283分钟)；

图7为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物金圣草素的HPLC图谱(保留时间为29.833分钟)；

图8为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物樱花素的HPLC图谱(保留时间为36.65分钟)；

图9为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物异银杏黄素的HPLC图谱(保留时间为40.36分钟)；

图10为从本发明刺山柑提取物中分离得到的黄酮类化合物银杏黄素的HPLC图谱(保留时间为39.834分钟)；

图11为从本发明刺山柑提取物中分离得到的吲哚类化合物6-methoxybrassicanal A的HPLC图谱(保留时间为28.88分钟)；

图12为从本发明刺山柑提取物中分离得到的吲哚类化合物6-methoxyspirobrassinin的HPLC图谱(保留时间为31.20分钟)；

图13为从本发明刺山柑提取物中分离得到的吲哚类化合物3-醛基吲哚的HPLC图谱(保留时间为20.02分钟)；

图14为从本发明刺山柑提取物中分离得到的吲哚类化合物3-醛基-4-羟基吲哚的HPLC图谱(保留时间为21.18分钟)。

化合物确认：

6-methoxybrassicanal A：无色结晶粉末，ESI-MS显示220.07[M-H]^-和256.04[M+Cl]⁺，高分辨ESI-MS 220.0431[M-H]^-，(Calc：220.0432，C₁₁H₁₀NO₂S)表明分子量为221，结合¹HNMR，¹³CNMR数据确定化合物的分子式为C₁₁H₁₁NO₂S。不饱和度为7。

表16-methoxybrassicanal A的¹H、¹³C-NMR数据

综上所述，通过¹HNMR，¹³CNMR，HSQC，HMBC对碳氢信号进行归属。结合相关文献，鉴定该化合物为6-methoxybrassicanal A。

6-methoxyspirobrassinin：黄色粉末，ESI-MS显示302.98[M+Na]⁺，279.02[M-H]^-，EI-MS  显示为280[M]⁺，高分辨ESI-MS303.0413[M+Na]⁺(Calc：303.0415，C₁₂H₁₂N₂O₄SNa)，表明分子量为280，结合¹HNMR，¹³CNMR确定化合物的分子式为C₁₂H₁₂N₂O₂S₂。不饱和度8。

表26-methoxyspirobrassinin的¹H、¹³C-NMR数据

综上所述，通过¹HNMR，¹³CNMR，HSQC，HMBC对碳氢信号进行归属。结合相关文献，鉴定该化合物为6-methoxyspirobrassinin。

3-醛基吲哚：淡黄色固体，ESI-MS显示168.04[M+Na]⁺，144.08[M-H]^-，结合¹HNMR，¹³CNMR数据推定分子式为C₉H₇NO。不饱和度7。

在¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)中，δ：9.90(1H，s)为醛基的质子信号。δ：12.462(1H，s)为-NH上的质子信号。δ：8.0(1H，d，J＝6Hz)，δ：7.2(2H，m)，δ：7.5(1H，d，J＝6.4Hz)为苯环上的四个质子信号，根据偶合常数以及质子数，推断苯环上的四个质子为相邻的四个质子。

在¹³CNMR(400MHz，DMSO-d₆)中，δ：185.0推断为醛基上碳的信号。δ：112.6，137.1，124.1，123.4，122.1，120.8，为苯环上的碳信号。由dept谱可推断有三个季碳，结合前面的不饱和度7，推断可能存在两个环。

综上所述，¹HNMR，¹³CNMR的波谱数据与文献对照一致，确定该化合物为3-醛基吲哚(3-Indolcarboxaldehyde)。

3-醛基-4-羟基吲哚：ESI-MS显示184.04[M+Na]⁺，和160.12[M-H]^-，EI-MS显示为161[M]⁺。结合¹HNMR，¹³CNMR数据推定分子式为C₉H₇NO₂。不饱和度7。

在¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ：12.2(1H，s)为-NH上的质子信号。δ：10.50(1H.s)为-OH  上活泼氢信号，δ：6.54(1H，d，J＝7.6Hz)，δ：7.12(1H，dd，J＝8Hz，7.6Hz)，δ：6.92(1H，d，J＝8Hz)为苯环上的三个质子的信号，根据偶合常数以及质子数，判断苯环上的质子为相邻的三个质子。与化合物csg7质谱和氢谱图谱相比较，相差一个羟基，其波谱数据与文献对照一致，确定为3-醛基-4-羟基吲哚(4-hydroxy-1H-indole-3-carboxaldehyde)。

黄色针晶，ESI-MS显示为593[M-H]^-，结合¹HNMR，¹³CNMR数据推定分子式为C₂₇H₃₀O₁₅。在¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ：6.40(1H，d，J＝2.4Hz)，6.19(1H，d，J＝2.4Hz)，为A环上的两个质子信号，偶合常数为2.0Hz，表明A环上的两个质子处于间位偶合关系，分别为8，6位的质子信号。δ：7.98(2H，d，J＝9.2Hz)，δ：6.86(2H，d，9.2Hz)为B环上的两组对称质子信号，因此可以推断B环4’位被羟基取代。又因在氢谱中未见C环3位质子信号，而δ：5.30为糖的端基氢信号，δ：3.0-4.4处为糖上的质子信号。推断该化合物可能为3位被取代的5，7，4’-三羟基黄酮苷。在δ：1.0(3H，d，J＝6.4Hz)有质子信号，为鼠李糖上的特征甲基质子信号。推断所连的糖中含有鼠李糖。

经文献检索，其¹HNMR谱与文献对照一致，故鉴定为山奈酚-3-芸香糖苷。

槲皮素-3-芸香糖苷：黄色晶体，易溶于甲醇，ESI-MS显示609[M-H]^-结合¹HNMR，¹³CNMR数据推断分子式为C₂₇H₃₀O₁₆。

在¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ：6.38(1H，d，J＝2Hz)，δ：6.19(1H，d，J＝2Hz)为A环上的两个质子信号，偶合常数为2Hz，表明A环两个质子处于间位偶合关系，分别为8，6位质子信号。δ：7.54(2H，m)，δ：6.84(1H，d，J＝7Hz)为B环上的三个质子信号，由于其中两个质子由于化学位移值比较接近，所以在δ：7.54处出现多重峰，初步推断为B环上的三个质子为邻位和间位偶合关系。又因在氢谱中未见C环3位质子信号，而δ：5.34为糖的端基氢信号，δ：3.0-4.4为糖上的质子信号。因此可以初步判断该化合物可能为3位被取代的5.7.3’，4’四羟基黄酮苷。同时在δ：1.02(3H，d，J＝6.8Hz)为质子信号，为鼠李糖的甲基特征质子信号。推断该化合物可能为芦丁。与芦丁标准品对照，TLC中Rf值一致。经文献检索，鉴定该化合物为槲皮素-3-芸香糖苷。

Arvelexin.；无色结晶状固体，ESI-MS m/z：185.03[M-H]^-，结合¹HNMR数据推定分子式为C₁₁H₁₀N₂O。不饱和度8。

在¹HNMR(400MHz，DMSO-d₆)，δ：3.84(3H.s)为-O-CH₃上三个质子信号，δ：7.59(1H，d，J＝8.0Hz)，δ：7.18(1H，dd，J＝8.0Hz，8.4Hz)，δ：7.39(1H，d，J＝8.4Hz)为苯环上的三个质子的信号，根据偶合常数以及质子数，判断苯环上的质子为相邻的三个质子。δ：7.24(1H，s)为2位的氢的信号。δ：8.13(1H，brs)推断为-NH-上的质子信号。经文献检索，其¹HNMR谱与文献对照一致，鉴定该化合物的结构为Arvelexin。

异银杏黄素：黄色粉末，易溶于甲醇，ESI-MS m/z565[M-H]^-，结合¹HNMR，¹³CNMR数据推断分子式为C₃₂H₂₂O₁₀，分子量为566.依据¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)、¹³C-NMR(DMSO-d₆，500Hz)、HMQC、HMBC、NOESY，并通过这些数据分析确定该化合物为3’-8”为关联的双黄酮类化合物，经文献检索，与异银杏黄素文献数据一致，鉴定该化合物为异银杏黄素。

表3异银杏黄素的¹H、¹³C-NMR数据

银杏黄素：黄色粉末，易溶于甲醇，ESI-MS m/z565[M-H]^-，结合¹HNMR，¹³CNMR数据推断分子式为C₃₂H₂₂O₁₀，分子量为566.依据¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)、¹³C-NMR(DMSO-d₆，500Hz)、HMQC、HMBC、NOESY，并通过这些数据分析确定该化合物为3’-8”为关联的双黄酮类化合物，与异银杏黄素为一对同分异构体，经文献检索，与银杏黄素文献数据一致，鉴定该化合物为银杏黄素。

表4银杏黄素的¹H、¹³C-NMR数据

黄花夹竹桃黄酮：黄色粉末，ESI-MS m/z283[M-H]^-，分子量为284，分子式为C₁₆H₁₂O₅。¹H-NMR(DMSO-d₆，400Hz)：δ6.32(1H，s，H-6)，δ6.72(2H，s，H-8、3)，δ6.87(2H，d，J＝8.4Hz  ，H-3’、5’)，δ7.87(2H，d，J＝8.8Hz，H-2’、6’)，δ3.85(3H，s，OCH₃)。经文献检索，与黄花夹竹桃黄酮文献数据一致，鉴定该化合物为黄花夹竹桃黄酮。

金圣草素：黄色粉末，ESI-MS m/z299[M-H]^-，分子量为300，分子式为C₁₆H₁₂O₆。¹H-NMR(DMSO-d₆，400Hz)：δ12.93(1H，s，5-OH)，δ6.20(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，δ6.50(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，黄酮6、8位特征质子峰，δ6.85(1H，s，H-3)，δ6.91(1H，d，J＝8.8Hz，H-5’)，δ7.52(1H，d，J＝2.0HzH-2’)，δ7.54(1H，dd，J＝8.8Hz，2.0Hz，H-6’)，δ3.89(3H，s，OCH₃)，由NOESY谱确定为B环3’-OCH₃。经文献检索，与金圣草素文献数据一致，鉴定该化合物为金圣草素。

黄色粉末，ESI-MS m/z285[M-H]^-，C₁₆H₁₄O₅相对分子量为286.¹H-NMR(DMSO-d₆，400Hz)：δ2.73(1H，dd，J＝17.2，2.8Hz；H-3e)，δ3.30(1H，dd，J＝17.2，12.8Hz；H-3α)，δ5.48(1H，dd，J＝12.8，2.8Hz；H-2)，二氢黄酮特征峰；δ6.06(1H，d，J＝2.4Hz；H-6)，δ6.09(1H，d，J＝2.4Hz；H-8)，δ6.79(2H，d，J＝8.4Hz；H-3’，5’)，δ7.32(2H，d，J＝8.4Hz；H-2’，6’)，δ3.87(3H，s OCH₃)，经NOESY确定7-OCH₃，δ12.08(1H，s，5-OH)，δ9.45(1H，s，4’-OH)。经文献检索，与樱花素文献数据一致，鉴定该化合物为樱花素。

HPLC色谱条件：

仪器HP1100色谱系统：G1322A脱气机，G1316A柱温箱，G1311A四元泵，G1314AVWD紫外检测器。

色谱柱Diamonsil^TM，C₁₈，5μm，250×4.6mm；检测波长210nm、229nm、254nm；柱温25℃；流速：1ml/min；样品：甲醇溶解，浓度10mg/ml。

表5：流动相梯度条件：

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明。但所述实施例不构成对本发明的限制。

本发明所述刺山柑干燥果实为新疆产的刺山柑果实。

实施例1

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的水提取，提取两次，每次2小时，过滤，合并两次滤液。减压浓缩，至浓度1.2g/ml左右。加入95％乙醇，使最终醇浓度为70％，醇沉静置过夜。过滤得到滤液，减压浓缩至无醇味，将此溶液通过860021型大孔吸附树脂，依次用水，30％，50％，70％，95％的乙醇(均为体积比)洗脱，得到水部位131.5g，30％乙醇部位14.70g，50％乙醇部位3.328g，70％乙醇部位1.304g，95％乙醇部位0.66g。

实施例2

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的水提取，提取两次，每次2小时，过滤，合并两次滤液。减压浓缩，至浓度1.2g/ml左右。加入95％乙醇，使最终醇浓度为70％，醇沉静置过夜。过滤得到滤液，减压浓缩至无醇味，将此溶液通过860021型大孔吸附树脂，依次用水，30％，70％，95％的乙醇(均为体积比)洗脱，得到水部位129.8g，30％乙醇部位13.6g，70％乙醇部位4.2g，95％乙醇部位0.59g。

实施例3

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的75％的乙醇提取，加热回流提取两次，每次回流2个小时，加热回流提取两次，每次回流2小时，过滤，合并两次滤液。浓缩至无醇味，加入适量浓度的乙醇溶液，稀释成一定体积的30％乙醇溶液。将此溶液通过860021型大孔吸附树脂，依次用水，30％，70％，95％的乙醇(均为体积比)梯度洗脱，得到水部位78.8g，30％乙醇部位12.2g，70％乙醇部位8.54g，95％乙醇部位3.4g。

对比例1

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的水提取，提取两次，每次2小时，过滤，合并两次滤液。此溶液直接通过860021型大孔吸附树脂，依次用水，30％，70％，95％的乙醇(均为体积比)梯度洗脱，得到水部位，30％乙醇部位12.11g，70％乙醇部位6.36g，95％乙醇部位0.81g。

对比例2

刺山柑干燥果实2kg，粉碎，用5倍体积的75％的乙醇，加热回流提取两次，每次2小时，合并两次提取液。减压下回收乙醇至无醇味。水溶液用石油醚脱脂，然后用氯仿萃取，萃取两次，每次2升，合并氯仿部位，浓缩得到氯仿部位浸膏29g。

对比例3

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的80％乙醇，加热回流提取两次，每次回流2个小时，过滤，合并两次滤液，减压下回收乙醇至无醇味。水溶液用石油醚脱脂，浓缩得到浸膏，用无水乙醇回流溶解，得到80％乙醇提取的溶于无水乙醇的部位40g。

对比例4

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的95％乙醇，加热回流提取两次，每次回流2个小时，过滤，合并两次滤液，减压下回收乙醇至无醇味。水溶液用石油醚脱脂，浓缩得到浸膏，用无水乙醇回流溶解，得到95％乙醇提取的溶于无水乙醇的部位20g。

对比例5

刺山柑干燥果实1kg，粉碎，用8倍体积的水提取，提取两次，每次2小时，过滤，合并两次滤液。减压浓缩，至浓度1.2g/ml左右。加入95％乙醇，使最终醇浓度为70％，醇沉，静置过夜。过滤得到滤液，减压浓缩至无醇味，得到水提醇沉滤液部位153g。

试验例1

对以上实施例得到的多种刺山柑提取物分别进行了筛选。

实验动物：

昆明种小鼠18g～20g

SD大鼠130g～150g

Wistar大鼠150g～180g

实验样品：

刺山柑的水提取物(对比例1所得提取物)、水提醇沉(实施例1所得提取物)、水提醇沉大孔树脂精制部分(实施例2和3所得提取物)、醇提后醇沉(实施例4所得提取物)、不同醇浓度提取物(对比例2、3和4所得提取物)。

对照品：消炎痛，Enbrel。

药效筛选模型方法：

刺山柑对角叉莱胶诱发小鼠足跖肿胀影响的实验步骤：

将20g昆明小鼠先分成给药组：500mg/kg，口服；阳性对照消炎痛组：10mg/kg，口服；空白对照组；按上述方法给药三天，致炎前先测各组大鼠右后足跖的体积一次，末次给药一小时后在大鼠右后足跖中部皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，以后每隔一小时测足跖体积1次，计算肿胀率及抑制率，组间差异以t检验进行比较。

表6口服刺山柑不同提取部位对角叉菜胶致小鼠急性炎症的影响(0.1ml，n＝6，x±s，％)

注：给药组与致炎对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，()内为肿胀率(％)，<>内为抑制率(％)

表7口服刺山柑醇沉大孔吸附树脂纯化各部分对角叉菜胶致小鼠急性炎症的影响(0.1ml，n＝6，x±s，％)

注：给药组与致炎对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，()内为肿胀率(％)，<>内为抑制率(％)

表8口服刺山苷醇提大孔吸附树脂和醇沉大孔吸附树脂纯化各部分对角叉菜胶致小鼠急性炎症影响(0.1ml，n＝6，x±s，％)

注：给药组与致炎对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，()内为肿胀率(％)，<>内为抑制率(％)

通过对角叉菜胶致小鼠急性炎症的影响的药效筛选试验的结果，发现刺山柑水提醇沉经大孔吸附树脂纯化，50％和70％洗脱部位合并后的药效结果和75％醇提氯仿萃取部位药效结果都优于其它提取方法。因此，我们进一步比较刺山柑氯仿部位和水提醇沉部位的药效。

表9口服刺山柑氯仿部位和醇沉部位对角叉菜胶致小鼠急性炎症的影响(0.1ml，n＝6，x±s，％)

注：给药组与致炎对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，()内为肿胀率(％)，<>内为抑制率(％)

以上药效结果显示醇沉和氯仿部位都有药效，醇沉药效稍好一些，同时的工艺比氯仿萃取简单，利于工业化生产。

通过HPLC分析，醇沉中黄酮类化合物较氯仿部位含量高。由此，我们分别富集有效部位的总黄酮、总吲哚和醇沉树脂纯化部位进行比较，结果如下：

表10口服刺山柑各部分对角叉菜胶致小鼠急性炎症的影响(0.1ml，n＝6，x±s，％)

注：给药组与致炎对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；()内为肿胀率(％)，<>内为抑制率(％)

通过以上结果可以看出总黄酮和总吲哚都有效，从化合物的药效和工艺成本综合考虑，醇沉大孔树脂纯化的样品为主要活性部位。

对醇沉大孔树脂纯化的部位，在进一步的研究工作中，我们明确活性部位中主要由吲哚和黄酮苷组成，我们分别富集有效部位的总黄酮、总吲哚部位，分别进行了药效试验，都具有明显的活性。

Claims (8)

1.从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)使浓缩的刺山柑粗提物上大孔吸附树脂层析，依次用水和20-30％的乙醇溶液洗脱；

b)再用50-70％的乙醇溶液洗脱，即得刺山柑精制提取物；

其中所述刺山柑粗提物按照以下步骤获得：用水提取刺山柑药材、过滤、加入乙醇溶液使最终乙醇浓度为65-75％、静置后过滤；

且所得提取物含有74-91％的总吲哚和5-8％的总黄酮。

2.根据权利要求1所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，b)步骤中再用70％的乙醇溶液洗脱。

3.根据权利要求1所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，a)步骤中所述的大孔吸附树脂选自非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

4.根据权利要求3所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，所述非极性大孔吸附树脂的型号选自AB-8、ADS-4、ADS-8、SPD-100、SPD-300、SPD-400、SPD-450、SPD-500、SPD-600、SPD-700、SPD-850、D101、LSA-20、XAD-5、HP-10或D101。

5.根据权利要求3所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，所述中等极性大孔吸附树脂的型号选自DM-130、DM-11、LSA-40、LSA-10、SPD-800、HZ-806、ADS-17、860021。

6.根据权利要求5所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，a)步骤中所述中等极性大孔吸附树脂的型号为860021。

7.根据权利要求1所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，所述总吲哚的主要化学成分为6-methoxybrassicanal A、6-methoxyspirobrassinin、3-醛基吲哚、3-醛基-4-羟基吲哚和Arvelexin。

8.根据权利要求1所述的从刺山柑中获得精制提取物的方法，其特征在于，所述总黄酮的主要化学成分为槲皮素-3-芸香糖苷、山奈酚-3-芸香糖苷、黄花夹竹桃黄酮、金圣草素、樱花素、银杏黄素和异银杏黄素。

Images