CN102697769A - 源自香青兰的化合物用于抗心肌缺血再灌注损伤的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物技术领域，具体涉及源自香青兰的黄酮类化合物具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，药理实验证明木犀草素、山奈酚、木犀草苷的抗心肌缺血再灌注损伤作用强于其他黄酮类化合物，也强于香青兰总黄酮。

Description

源自香青兰的化合物用于抗心肌缺血再灌注损伤的用途

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，具体涉及源自香青兰的黄酮类化合物特别是木犀草素、山奈酚、木犀草苷的抗心肌缺血再灌注损伤作用。 

背景技术

心血管疾病是一类严重危害人类健康的常见疾病，位居世界最致命的十大疾病之首。据WHO统计，全球每年心血管疾病死亡人数约为1670万（占总死亡人数的30％），其中约700万死于缺血性心脏病（占心血管疾病死亡人数的42％）。据流行病学资料预测，全球缺血性心脏病死亡数2020将比1990年增加74.6％。而在中国，每年约有150万人死于缺血性心脏病（约占世界的21％），且正呈上升趋势，所以防治工作任务艰巨。 

缺血性心脏病（主要是冠心病）因冠状动脉血供急剧减少或中断，使心肌严重、持久的急性缺血而导致心肌梗死或心力衰竭，导致死亡率甚高。因此，防治心肌缺血性损伤是防治缺血性心脏病的关键，目前临床主要通过应用各种动、静脉溶栓疗法、冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉介入技术及心脏外科体外循环等再灌注措施使缺血心肌组织重新恢复血供，以减轻细胞损伤，从而提高临床疗效。 

但是，在临床观察和动物实验中发现，缺血组织细胞恢复血液灌注一定时间后，部分患者或者动物的心肌细胞功能及结构破坏反而加重，即心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。再灌注损伤会对心脏的功能及代谢产生明显的影响，且时间短、损害性大，主要表现为舒缩功能降低、能量生成减少和细胞凋亡，甚至出现血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情恶化的现象，从而成为血管再通治疗获得最佳和长期疗效的主要临床难题。临床研究表明，心肌缺血再灌注损伤是心血管外科手术中一种非常常见的组织器官损伤，常导致患者严重的心肌功能缺失、预后不良，冠状动脉搭桥术后早期死亡的病因中再灌注损伤几乎占到了25％；动物模型研究提示，致死性再灌注损伤最多可占心肌梗死最终体积的50％；在心脏移植中提高供心的保存实效，减轻缺血再灌注损伤，是移植成功的先决条件。据WHO统计，到2020年急性冠状动脉阻塞性疾病将是世界上的主要致死原因。 

因此，心肌缺血再灌注损伤已成为重大的临床问题，防治再灌注损伤一直是近年来心脏 病学应用基础研究中的一个热点，受到国内外学者的广泛关注。 

香青兰为新疆维吾尔族和蒙古族习用药材，维吾尔医和民间应用于治疗心悸心痛、头晕脑胀、反应迟钝、感觉低下、思维不敏、胃虚肝弱、机体自然力下降、冠心病及血液质旺盛（高血压）已有几百年的历史，疗效确切、显著。目前有文献报道，从香青兰中已分离得到一些黄酮类化合物，如木犀草素、山奈酚、木犀草苷、香叶木素、芹菜苷、藿香苷等。目前报道这些化合物主要用于抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗纤维化、抗生育、抗细菌和病毒、降血脂等作用。在心肌缺血再灌注损伤疾病治疗方面未见报道。 

发明内容

本发明公开了来源于香青兰的黄酮化合物抗心肌缺血再灌注损伤作用，特别是木犀草素、山奈酚、木犀草苷的抗心肌缺血再灌注损伤作用，与来源于香青兰中其他黄酮类化合物和总黄酮进行了活性比较，结果显示木犀草素、山奈酚、木犀草苷三个化合物活性最强，从而有望将其开发成具有抗心肌缺血再灌注损伤作用的药物。 

这些来源于香青兰的化合物结构式如下： 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷来源于任何天然药物或合成品。可添加药学上可接受的载体制成各种制剂。成人用药的单体成分每日有效剂量为10～5000mg/70kg。也可视具体病情偏离此范围。 

下面结合实施例作进一步的阐述。 

附图说明

图1是药物对H9c2心肌细胞氧化损伤后细胞活力的影响（与Control组比较^###P﹤0.001；与Model组比较^***P﹤0.001；n=6， 

图2是药物对H9c2心肌细胞氧化损伤后活性氧生成量的影响（与Control组比较^##P＜0.01；与Model组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；n=6， ） 

图3是药物对H9c2心肌细胞氧化损伤后线粒体膜电位的影响（与Control组比较^###P＜0.001；与Model组比较^**P﹤0.01，^***P﹤0.001；n=6， 

具体实施方式

实施例1 

保护大鼠离体心肌缺血再灌注损伤 

1．Langendoff装置组装组装Langendoff装置，设定压力高度为80cm；启动超级恒温水浴，接通保温循环水，使恒温于37℃；装入洛-林二氏溶液，打开氧气阀，充入氧气适量，通过药液泵将洛-林二氏溶液泵入Langendoff装置，检查连接情况，调节并保持流速稳定，并排尽灌流气泡。连接三通，一端接好球囊，另一端接好接换能器，通过转换器连接电脑，打 开BL-420F生物机能实验系统，点击输入信号→1通道→左室内压，并点击Excel标记记录数据。 

2.离体心脏缺血/再灌注模型复制大鼠称重，用乌拉坦腹腔注射麻醉（1g/kg）；快速开胸取出心脏，置于Locke-Ringer’s冰水液中洗净血液，理出主动脉，迅速转移、固定于Langendorff灌流装置，以充O₂的Locke-Ringer’s液逆行恒流灌流（温度控制在37±0.2℃），主动脉进，右心房出；剪开左心耳，插入球囊，调节体积以灵敏感应为度；灌流15～30min，用BL-420F生物机能实验系统监测心率、左室发展压等指标，待心脏搏动达稳定状态后，停止灌流20min，使心脏缺氧，然后恢复灌流20min，使心肌产生再灌注损伤（以LVDP降低到正常20％为合格）。 

3．实验动物分组SD大鼠80只，随机分为10组，每组8只。模型组：稳定灌流15min后，全心停灌30min，再灌流30min；给药组：同模型组，含药物100μM的灌流液液通过恒流灌流10min，停灌30min，再含药灌流30min；Ramipril组：同模型组，含Ramipril 100μM灌流液通过恒流灌流10min，停灌30min，再含药灌流30min。 

4．心率（HR）、LVDP（左室发展压）、LVEDP（左室舒张末压）测定根据实时记录表读取，（-dp/dt）/（+dp/dt）由最大下降速度（mmHg/ms）与最大上升速度（mmHg/ms）之比得。 

5．冠脉流量测定缺血前5min和复灌后10min分别收集1min灌流液，量取体积。 

6．相关酶测定再灌注30min末取1mL灌流液冻存备用，测定LDH。 

7．心肌梗死面积测定离体心脏再灌注30min后，冻存，然后与心脏纵轴垂直切成2mm均匀薄片5片，1％TTC于37℃恒温染色15min，弃去染色液，生理盐水冲洗，取出稍晾干拍照。根据颜色不同区分各区域（红色为危险区，苍白色为梗死区），称总重后分离梗死区称重，计算梗死区占总心脏的比值。 

8．结果 

（1）木犀草素、山奈酚、木犀草苷具有保护心率、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的作用，特别是，它们的保护作用明显强于其它黄酮类化合物如香叶木素和芹菜苷等，见表1。 

表1对大鼠离体心脏心率、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响（n=7～8， 

注：与模型组比较^*P﹤0.05，^**P﹤0.01，^***P﹤0.001 

（2）木犀草素、山奈酚、木犀草苷具有保护冠脉流量，抑制LDH释放和梗死区比重的作用，其作用效果好于其它源自香青兰的黄酮类化合物，见表2。 

表2对冠脉流量、LDH释放和梗死区比重的影响（n=7～8， 

注：与模型组比较：^*P﹤0.05，^**P﹤0.01，^***P﹤0.001 

实施例2 

保护大鼠心肌缺血再灌注损伤 

1．缺血再灌注损伤模型制备280～320g雄性SD大鼠，20％乌拉坦腹腔浅麻醉，经口腔气管插管，呼吸机正压通气（呼吸频率80次/min，潮气量20mL，呼吸比1︰2，气压0）。将针形电极插入三肢皮下，连接BL-420s生物机能实验系统通道1或2，打开系统软件及相应通道，测定心电。剃去左胸中部毛，消毒，在心脏跳动处纵行切开皮肤1cm，在第4，5肋间钝性分离肌层，撑开肋间肌和胸膜进入胸腔。拉开胸腔，撕破心包，挤出心脏。在主动脉根部动脉圆锥与左心耳之间冠状动脉处，用6/0带针细缝合线环绕冠脉前降支进行结扎（里包一根硅胶管）。将心脏送回胸腔内，挤压胸腔排出空气，迅速缝合胸壁，恢复自主呼吸，停止人工呼吸，测定心电图（在恢复自主呼吸前），结扎30min，再灌注60min。 

2．给药方法大鼠随机分为假手术组、缺血组（模型组）、药物组、倍他乐克组，每组12只。给药组术前3天灌胃给药，每天1次，假手术组及模型组予以等量生理盐水。 

3．观察指标 

（1）血清心肌酶再灌注60min后，眼眶取血，分离血清，分别用试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH）、谷草转氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）。 

（2）心肌缺血和梗死范围测定再灌注60min后，打开胸腔，摘取心脏冻存，然后与心脏纵轴垂直切成2mm均匀薄片5片，1％TTC于37℃恒温染色15min，弃去染色液，生理盐水冲洗，取出稍晾干拍照。根据颜色不同区分各区域（红色为危险区，苍白色为梗死区），称总重后分离梗死区称重，计算梗死区占总心脏的比值。 

4．结果 

（1）木犀草素、山奈酚、木犀草苷显著抑制心肌缺血再灌注大鼠LDH分泌、AST和CK活力，效果明显优于其它黄酮类化合物，见表3。 

表3对心肌缺血再灌注大鼠血清中LDH分泌、AST和CK活力的影响（n=12， 

注：与假手术组比较^##P﹤0.01；与模型组比较^*P﹤0.05，^**P﹤0.01 

（2）木犀草素、山奈酚、木犀草苷显著抑制心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死区比重，见表4。 

表4对心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死区比重的影响（n=12， 

注：与模型组比较^*P﹤0.05，^**P﹤0.01 

5．结论 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷具有较强的保护心肌缺血再灌注大鼠心肌梗死的作用。 

实施例3 

保护心肌细胞缺氧/复氧损伤 

1．原代心肌细胞培养取乳鼠，无菌条件下分离心脏，冷PBS洗净，剪碎成1mm³左右的小块，用0.0625g/L胰酶于37℃恒温低速搅拌条件下分次消化，每次8min，共4次。每次收集上清液后即用等体积含15％FBS的DMEM培养基终止消化，然后离心（1000rpm×10min），收集心肌细胞后用培养基洗涤1次，再进行差速贴壁正常培养90min。然后将细胞悬液以密度5×10⁵cells/mL接种于96孔培养板中，于37℃、5％CO₂条件下培养，每2d更换一次培养液。 

2．原代心肌细胞分组进行药物预处理及缺氧/复氧损伤模型制备将培养至第5d的乳鼠心肌细胞进行分组并加药预处理。正常组：用含12％FBS的无酚红DMEM培养液正常培养；模型组：用含12％FBS的无酚红DMEM培养液正常培养，加入4mmol/L Na₂S₂O₄缺氧2h，再弃去培养液，加入含12％FBS的无酚红DMEM培养液复氧培养24h；VitE组（100μg/mL），供试药物组。在含12％FBS的无酚红DMEM培养液中加入供试药正常培养24h后，加入4mmol/L Na₂S₂O₄缺氧2h，再弃去培养液，加入含12％FBS的无酚红DMEM培养液并加入供试药保持浓度复氧培养24h。复氧24h后观察细胞形态，于复氧24h后观察细胞形态，收集各组培养液上清，按试剂盒检测LDH和T-SOD活力及MDA含量。 

3．结果 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷显著抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤后LDH释放，降低MDA含量，升高T-SOD活力，其效果优于其它黄酮类化合物，见表5。 

表5对原代心肌细胞缺氧/复氧损伤后LDH、T-SOD、MDA的影响（n=3， 

注：与正常组比较#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01 

4．结论 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷具有较强的保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。 

实施例4 

保护H9c2心肌细胞氧化损伤 

1．H9c2心肌细胞培养用含12％胎牛血清（FBS）的DMEM于37℃、5％CO₂培养箱中培养H9c2心肌细胞，取对数生长期细胞实验。 

2．心肌细胞药物预处理，造模及细胞活力检测取对数生长期H9c2心肌细胞，分组，药物预处理，造模。正常对照组（Normal）：整个实验过程中H9c2心肌细胞均于正常DMEM中培养；模型组（Model）：于正常DMEM培养后，加入H₂O₂（终浓度为300μmol/L）与H9c2心肌细胞共育2h；阳性药维生素E（VitE）预处理组：H9c2细胞经Vit E（终浓度为10μg/mL）孵育12h后，再加入H₂O₂（终浓度为300μmol/L）共育2h；药物预处理组：H9c2细胞分别经木犀草素、山奈酚、木犀草苷、香叶木素、金合欢素、芹菜苷、藿香苷及香青兰总黄酮提取物（终浓度分别为10μg/mL）预处理培养12h后，再加入H₂O₂（终浓度为300μmol/L）共育2h。各实验组细胞经处理后，加入MTT（终浓度为0.5mg/mL），检测细胞活性。 

3．结果 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷能够显著增强氧化损伤H9c2心肌细胞的细胞活性，作用强于其他源自香青兰的黄酮类化合物。见图1。 

实施例5 

保护H9c2心肌细胞氧化损伤生化指标分析 

1.心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量的检测取对数生长期H9c2心肌细胞，消化后用正常DMEM(含12％FBS)重悬，接种于6孔培养板。培养24h后，吸弃培养基，加入DMEM(含3％FBS)，按实例1所述方法处理细胞，各组细胞经处理后，吸取收集细胞上层培养液，离心(1200rpm×5min)，按LDH及SOD试剂盒说明书测定各组细胞培养液中LDH及SOD活性。将6孔板置于冰上，用PBS洗涤两次，加入200μL预冷细胞裂解液，短暂孵育后刮下细胞，将细胞碎片及裂解液移入EP管中，冰上孵育20min，期间漩涡振荡3次，于4℃离心(1200rpm×20min)，将上清转移至干净的EP管，根据MDA测试盒说明书方法用酶标仪测其吸光度OD值，然后按公式换算出各组细胞中MDA含量。 

2.结果 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷显著降低LDH漏出量，增强抗氧化酶SOD活性，且减少过氧化脂质降解产物中MDA的生成，见表6。 

表6对H9c2心肌细胞氧化损伤后LDH漏出量、SOD活性及MDA含量的影响(n＝6， 

注：与Control组比较^##P﹤0.01，^###P﹤0.001；与Model组比较^*P﹤0.05，^***P﹤0.001 

3．结论 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷能够保护心肌细胞免受氧化损伤，其效果好于其他源自香青兰的黄酮类化合物。 

实施例6 

保护H9c2心肌细胞氧化损伤中对活性氧含量的影响 

1．心肌细胞总氧自由基含量检测取对数生长期H9c2心肌细胞，消化后用正常DMEM（含12％FBS）重悬，接种于6孔培养板，培养24h后，吸弃培养基，加入DMEM（含3％FBS），按实例1所述方法处理细胞，各实验组细胞经处理后，对不同实验条件处理的细胞，消化，离心（1000rpm×5min），除去细胞培养液，加入适当体积的胞内活性氧荧光探针DCFH-DA（5μmol/L）重悬，避光37℃孵育30min，间隔振摇3次。再用无血清细胞培养液重悬，离心（1000rpm×5min），洗涤三次，以充分除去未进入细胞内的DCFH-DA，采用荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长为488nm，发射波长为525nm。 

2．结果 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷能够显著降低心肌细胞中活性氧的生成量，见图2。 

3．结论 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷能够保护心肌细胞免受活性氧损伤，其效果好于其他源自香青兰的黄酮类化合物。 

实施例7 

保护H9c2心肌细胞氧化损伤后对线粒体膜电位的影响 

1．心肌细胞膜电位检测取对数生长期H9c2心肌细胞，接种于6孔培养板，于37℃、5％CO₂培养24h，按实例1所述方法处理细胞，各实验组细胞经处理后，对不同实验条件处理的细胞进行消化，离心（1000rpm×5min），除去细胞培养液，加入2μM线粒体膜电位荧光探针Rhodamine 123于37℃孵育10min，用PBS重悬，离心（1000rpm×5min）。收集细胞于荧光酶标仪检测，最大激发波长为507nm，最大发射波长为529nm。在荧光显微镜下观察，呈现黄绿色荧光。 

2．结果 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷显著抑制心肌细胞损伤后线粒体膜电位下降，见图3。 

3．结论 

木犀草素、山奈酚、木犀草苷能够保护心肌细胞线粒体功能，其效果好于其他源自香青兰的黄酮类化合物。 

Claims (1)

1.木犀草素、山奈酚或木犀草苷用于制备抗心肌缺血再灌注损伤的药物的用途。

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