CN106214693A - 莫诺苷的医药用途 - Google Patents

Abstract

本申请提供莫诺苷的医药用途，具体地，本申请提供莫诺苷用于提高组织中SOD活性的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于提高有此需要的受试者的组织中SOD的活性。本申请首次发现莫诺苷对于缺血后心肌具有较好的保护作用，可用于预防或治疗与心肌缺血相关的疾病，例如冠心病、心肌损伤(例如心肌缺血再灌注损伤)、心绞痛、心律失常、心肌梗死(例如急性心肌梗死)或猝死。

Description

莫诺苷的医药用途

技术领域

本申请涉及中草药领域。具体地，本申请涉及莫诺苷的医药用途。尤其地，本申请涉及莫诺苷在制备治疗与心肌缺血相关疾病的药物中的用途。

背景技术

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是由于流向心肌区域的冠状动脉受到破坏，由于持久而严重的心肌供血不足所致的部分心肌急性坏死(王辉.浅析青年急性心肌梗死患者病因及临床特点[J].中国实用医药，2013，8(31)：107-107.)。心肌梗死发病率高，死亡率高，严重威胁着人们的生命安全和生活质量(white HD，chew DP.Acute myocardialinfarction[J].Lancet，2008，372：570-584；Dominguez-Rodriguez A,Abreu-Gonzalez P,Reiter RJ.Cardioprotection and pharmacological therapies in acute myocardialinfarction：Challenges in the current era[J].World J Cardiol,2014,6:100-106)。持久的缺血会引起细胞中一些分子结构的改变，从而引起终末心肌细胞受损或死亡，影响心脏功能。当前，急性心肌梗死的治疗主要是依赖于再灌注治疗，即利用药物(如溶栓剂)或介入等手段使阻塞的血管再开放进行治疗。然而，心肌在缺血后恢复血流时组织可能会损伤加重，甚至死亡，该现象即缺血再灌注损伤，这也成为影响再灌注治疗获得最佳疗效的主要障碍(Xiong J,Xue FS,Yuan YJ,et a1.Cholinergic anti-inflammatory pathway:apossible approach to protect against myocardial ischemia reperfusioninjury.Chin Med J(Engl),2010,123:2720-2726.)。因此，对缺血心肌进行保护，抑制缺血心肌细胞的死亡是控制缺血心肌引起损伤的最好治疗方法。

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一种糖酵解酶，它在活体组织中的活性很高，但是在正常血清中的活性很低，几乎检测不出。当组织细胞受损时，细胞膜通透性改变，LDH会大量释放到血液中，进入全身循环，此时血清中LDH活性会显著增高。心肌细胞中LDH活性是血清中的数百倍，急性心肌梗塞后，受损心肌细胞中的LDH会大量释放，血清LDH活性会显著升高，而且LDH上升在血液中存在时间较长，其半寿期长达160小时，这使得LDH成为检测心肌损伤的有效工具(Heron M.Deaths:leading causes for 2008[J].NatlVital Stat Rep.2012,60:1-94)。

心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)是肌钙蛋白的一种，它的作用是调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性从而调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。当心肌细胞损伤后，cTnT会从细胞释放到血液中，血液中的浓度会在4-6小时后升高，而且cTnT能在血液中长时间维持较高的浓度(约6-10天)。最主要的是，cTnT具有很高的灵敏度和心肌细胞特异性，所以cTnT是目前衡量心肌损伤程度最理想的标志物之一(Zhou R,He LF,Li YJ,etal.Cardioprotective effect of water and ethanol extract of Salviamiltiorrhiza in an experimental model of myocardial infarction[J].2012,139(2):440-6)。

心肌缺血会导致组织产生大量的自由基。各种生物膜是细胞结构与功能的基础，它们含有大量的多不饱和脂肪酸，这会成为氧化应激过程中产生的自由基攻击生物膜的靶点。生物膜被攻击引发脂质过氧化作用，产生大量的脂质过氧化物，丙二醛(malonicdialdehyde，MDA)是其中最典型的产物之一。而且脂质过氧化作用会通过链式反应扩大氧自由基的作用，造成恶性循环，使更多的生物膜被分解，这些分解产物中有害的部分会导致细胞代谢和功能障碍，甚至引起死亡。所以，MDA的含量通常可以作为机体脂质过氧化作用程度的一个指示性物质，也能间接的反应机体受损的程度(Mo X,Zhao N,Du X,et al.Theprotective effect of peony extract on acute myocardial infarction in rats[J].Phytomedicine.2011,18(6):451-7)。但机体本身也存在很多自由基抑制剂，其中研究的最多的是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，它是机体内氧自由基的头号杀手，能将机体中有害的超氧阴离子自由基清除(Wang W,Wang L,Yang H,et al.Protectiveeffects of Yindanxinnaotong capsule in a rat model ofmyocardial ischemia/reperfusion injury[J].J Tradit Chin Med.2014,34(6):699-709)。因此，促进SOD的产生可以对细胞起到保护作用。

Bax是线粒体性细胞凋亡通路的关键蛋白(Wei MC1,Zong WX,Cheng EH,etal.Proapoptotic BAX and BAK:a requisite gateway to mitochondrial dysfunctionand death[J].Science.2001,292(5517):727–30)，在凋亡信号刺激下，bax形成低聚物，并从细胞质基质转移到到线粒体膜上(Jürgensmeier JM,Xie Z,Deveraux Q,et al.Baxdirectly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria[J].Proc.Natl.Acad.Sci.1998,95(9):4997–5002.)，通过与线粒体膜上的孔隙蛋白相互作用，增加线粒体膜的通透性，导致细胞色素C从线粒体释放，激活caspase通路引起细胞凋亡(Narita M,Shimizu S,Ito T,et al.Bax interacts with the permeabilitytransition pore to induce permeability transition and cytochrome c release inisolated mitochondria[J].Proc.Natl.Acad.Sci.1998,95(25):14681–14686；Marzo I,Brenner C,Zamzami N,et al.Bax and adenine nucleotide translocator cooperatein the mitochondrial control of apoptosis[J].Science.1998,281(5385):2027-31)。Caspase-8是caspase凋亡通路的上游蛋白，是caspase凋亡通路的启动者，其与配体蛋白FADD结合后水解激活，激活的起始caspase对执行者caspase进行切割并使之激活，被激活的执行者caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。caspase-3是细胞凋亡通路的一个关键执行者，是导致许多关键蛋白水解的原因(Fernandes-AlnemriT.etal.CPP32,a novel human apoptotic protein with homology to Caenorhabditiselegans cell death protein Ced-3and mammalian interleukin-1beta-convertingenzyme[J].J.Biol.Chem.1994,269(49):30761-4)。Bcl-2是细胞内少数抑制细胞凋亡通路的关键性蛋白，其通过抑制线粒体释放细胞色素C，从而广泛的抑制各种有害刺激引起的细胞凋亡(MurphyKM.,et al.Bcl-2inhibits Bax translocation from cytosol tomitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells[J].Cell DeathDiffer.2000,7(1):102-11)。

莫诺苷(morroniside)是从中药山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et.Zucc.)提取的化合物，其结构如下：研究显示，其具有神经保护作用(Yang CC.,etal.Morroniside-Induced PP2A Activation Antagonizes Tau Hyperphosphorylation in a CellularModel of Neurodegeneration[J].J Alzheimers Dis.2016,51(1):33-44；Wang W.,etal.Morroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogenperoxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol.2009,613(1-3):19-23)。

发明内容

在本申请中，发明人通过大量研究发现，莫诺苷对于缺血后心肌具有较好的保护作用，可用于预防或治疗与心肌缺血相关的疾病，例如冠心病、心肌损伤(例如心肌缺血再灌注损伤)、心绞痛、心律失常、心肌梗死(例如急性心肌梗死)或猝死。

因此，在一个方面，本申请涉及莫诺苷用于提高组织中SOD活性的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于提高有此需要的受试者的组织中SOD的活性。

在本申请的某些优选实施方案中，所述组织为心肌组织。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌组织为缺血心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及莫诺苷用于降低组织中MDA含量的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于降低有此需要的受试者的组织中MDA的含量。

在本申请的某些优选实施方案中，所述组织为心肌组织。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌组织为缺血心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及莫诺苷用于抑制细胞凋亡的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制细胞的凋亡。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及莫诺苷用于抑制caspase细胞凋亡通路的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制caspase细胞凋亡通路。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及莫诺苷用于抑制细胞凋亡因子表达的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制细胞凋亡因子的表达。

在本申请的某些优选实施方案中，所述凋亡因子选自bcl-2、bax、caspase-8和caspase-3。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及莫诺苷在制备预防或治疗与心肌缺血相关的疾病的药物中的用途。

在本申请的某些优选实施方案中，所述与心肌缺血相关的疾病选自冠心病、心肌损伤(例如心肌缺血再灌注损伤)、心绞痛、心律失常、心肌梗死(例如急性心肌梗死)和猝死。

在另一个方面，本申请涉及一种抑制细胞凋亡的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及一种抑制caspase细胞凋亡通路的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在另一个方面，本申请涉及一种抑制细胞凋亡因子表达的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷。

在本申请的某些优选实施方案中，所述凋亡因子选自bcl-2、bax、caspase-8和caspase-3。

在本申请的某些优选实施方案中，所述细胞为心肌细胞。

在本申请的某些优选实施方案中，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的动物疾病模型、细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“与心肌缺血相关的疾病”主要指与心脏血液灌注减少有关的心脏功能异常的疾病。例如“冠心病(CHD)”，全称为冠状动脉粥样硬化性心脏病，也称缺血性心脏病(IHD)，是指冠状动脉发生粥样硬化导致管腔狭窄或闭塞，从而心肌缺氧或坏死而引起的心脏病。

例如“心肌缺血损伤(Ischemic injury)”，是指心肌血液供应中断后，会出现心肌细胞酸中毒、细胞器超微结构改变和功能障碍，导致不可逆性损伤甚至死亡。而在缺血区重建后，心肌细胞出现更严重的损伤，可导致血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死等病情恶化的现象，即为心肌缺血再灌注损伤。

例如“心绞痛”，是指冠状动脉供血不足，心肌急剧的暂时缺血与缺氧所引起的以发作性胸痛为主要表现的一组临床综合征。

例如“心肌梗死”，是指由于流向心肌区域的冠状动脉受到破坏，由于持久而严重的心肌供血不足所致的部分心肌急性坏死。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，优选人。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指，足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病的发生的量；治疗有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度，患者自己的免疫系统的总体状态，患者的一般情况例如年龄、体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

发明的有益效果

本申请通过建立大鼠心肌缺血模型，以心肌酶、氧化应激、心肌细胞凋亡为观察指标，发现莫诺苷对缺血心肌具有较好的保护作用，为临床与心肌缺血相关疾病的治疗开辟新的途径。

附图说明

图1显示了采用冠状动脉结扎法建立大鼠心肌缺血模型的结扎位置示意图。

图2显示了大鼠心电图，其中图2(a)为正常大鼠心电图；图2(b)为心肌缺血模型大鼠心电图。

图3显示了莫诺苷给药3d对心肌缺血模型大鼠血清LDH活性的影响。

图4显示了莫诺苷给药3d对心肌缺血模型大鼠血清cTnT含量的影响。

图5显示了莫诺苷给药3d对心肌缺血模型大鼠心肌组织SOD活性的影响。

图6显示了莫诺苷给药3d对心肌缺血模型大鼠心肌组织MDA含量的影响。

图7显示了莫诺苷给药3d，心肌缺血模型大鼠心肌组织TTC染色检测心肌梗死面积的结果，其中，各测试组由下到上为沿垂直大鼠心脏长轴方向从心尖到结扎部位获取的心脏切片。

图8显示了莫诺苷给药3d，心肌缺血模型大鼠心肌组织梗死面积统计结果。

图9显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中的bcl-2的免疫印迹分析结果；其中，泳道从左向右依次是：假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组和阳性对照组。

图10显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中bcl-2的表达水平，以GAPDH为参照(bcl-2/GAPDH)。

图11显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中的bax的免疫印迹分析结果；其中，泳道从左向右依次是：假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组和阳性对照组。

图12显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中bax的表达水平，以GAPDH为参照(bax/GAPDH)。

图13显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中的caspase-8的免疫印迹分析结果；其中，泳道从左向右依次是：假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组和阳性对照组。

图14显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中caspase-8的表达水平，以GAPDH为参照(caspase-8/GAPDH)。

图15显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中的caspase-3的免疫印迹分析结果；其中从左向右依次是：假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组和阳性对照组。

图16显示了分别给予心肌缺血模型大鼠蒸馏水、莫诺苷(45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg)、美托洛尔(10mg/kg)3d，各组大鼠心肌组织中caspase-3的表达水平，以GAPDH为参照(caspase-3/GAPDH)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1莫诺苷的制备

将山茱萸(产地浙江)粉粹，加10倍重量水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，减压浓缩，加乙醇沉淀，静置，滤过，加压回收乙醇，SP70大孔树脂吸附，收取30％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，真空干燥，得到山茱萸环烯醚萜苷；用硅胶(60-80目)拌样，干燥、硅胶(200-300目)柱层析，用氯仿/甲醇(氯仿：甲醇＝1:0-3:1)洗脱，薄层色谱检测，相同部分合并，回收溶剂；将莫诺苷在甲醇溶液中反复重结晶，得到莫诺苷纯化合物，经高效液相色谱检测含量大于98.5％。

实施例2莫诺苷对心肌缺血模型大鼠的保护作用

1材料与方法

1.1药物

单体化合物莫诺苷，由实施例1制备得到，临用前用蒸馏水溶解成所需浓度的药液供实验用。

美托洛尔：购自宣武医院西药房，生产厂家阿斯利康药业(中国)有限公司。临用前用蒸馏水溶解成10mg/kg浓度的药液供实验用。

1.2实验动物

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠108只，7-8周龄，质量为260-280g。购自斯贝福实验动物科技有限公司，合格证编号：SCKK(京)2011-0004。常规饲养，环境温度24±1℃，湿度55±5％，术前12h禁食不禁水。

1.3主要实验仪器

小动物呼吸机(哈佛仪器公司，美国)；手术显微镜(蔡司公司，德国)；多导生理信号记录仪(BIOPAC公司，美国)；扫描仪(惠普公司，美国)；超声波细胞破碎粉碎机(宁波市新芝科技研究所，中国)；台式微量冷冻离心机(Beckman Coulter公司，美国)；全波长酶标仪(Thermo Fisher公司，美国)；Powerpac Basic电泳仪(Bio-Rad公司，美国)；化学发光凝胶成像系统(Alpha公司，美国)。

1.4主要试剂

丙二醛测试盒(南京建成，中国)；超氧化物歧化酶测试盒(南京建成，中国)；乳酸脱氢酶测试盒(南京建成，中国)；大鼠心肌肌钙蛋白T测试盒(南京建成，中国)；RIPA裂解液(碧云天生物技术研究所，中国)；BCA法蛋白定量试剂盒(普利莱基因技术有限公司，中国)，兔源性bax抗体(Cell Signaling Technology，美国)；兔源性bcl-2抗体(Cell SignalingTechnology，美国)；兔源性caspase-3抗体(Abcam，美国)；兔源性caspase-8抗体(CellSignaling Technology，美国)；兔源性GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，美国)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(中杉金桥生物技术有限公司，中国)；ECL WesternBlotting Kit(THERMO-PIERCE公司，美国)。

1.5实验方法

1.5.1心肌缺血模型制备

本实验参照冠状动脉结扎法(Nagaoka K1,Matoba T1,Mao Y1,et al.A NewTherapeutic Modality for Acute Myocardial Infarction:NanoparticleMediatedDelivery of Pitavastatin Induces Cardioprotection from Ischemia-ReperfusionInjury via Activation of PI3K/Akt Pathwayand Anti-Inflammation in a Rat Model[J].PLoS One.2015,10(7):e0132451.；Aysel Guven Bagla,Ertugrul Ercan,HalilFatih Asgun,et al.Experimental acute myocardial infarction in rats:HIF-1,caspase-3,erythropoietin and erythropoietin receptor expression and thecardioprotectiveeffects of two different erythropoietin doses[J].ActaHistochemica.2013,115:658–668)制备心肌缺血模型。10％水合氯醛3.5ml/kg进行腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧位固定在鼠板上，手术灯聚焦在颈部行气管插管。然后调整成侧卧位，连接呼吸机，呼吸频率50次/分钟，呼吸比2:1，潮气量2.5ml/100g。在腋下到肋骨末端之间备皮，安尔碘消毒。从皮肤表面跳动最明显处，横向切口约2cm～3cm，充分暴露胸大肌与前锯肌，钝性分离胸大肌与前锯肌，从第四肋间剪开小口，然后用止血钳小心钝性分离扩大切口，直至切口恰好可以放置开胸器，撑开开胸器，充分暴露心脏，但注意不要肆意扩大肋间切口，以防止创伤太大，关胸难度增大。用眼科镊小心撕开心包，持针器左手持针，从左心耳根部与肺动脉圆锥交界处往下4mm左右入针，进针深度1.5mm左右，平行左心耳右边缘跨度3mm～5mm出针(如图1所示)，活扣结扎。注意结扎位置，太靠上，梗死面积太大，死亡率高；太靠下，则梗死面积太小或不太明显。结扎后，肉眼观察结扎部位以下心室壁变苍白，可以初步判断造模成功。8字缝合法缝合肋间，留1根留置管，然后逐层关闭缝合胸腔，在彻底关闭前用10ml注射器膨肺，胸腔关闭后，通过留置管排净胸腔空气和积液。间歇式断开呼吸机，直至大鼠恢复自主呼吸。将大鼠转移至术后保养箱。假手术组大鼠，只穿线，不结扎，其它步骤一样。

1.5.2心电图检测

造模后，用多导生理信号记录仪采集大鼠II导联心电图(Ma X1,Zhang K,Li H,etal.Extracts from Astragalus membranaceus limit myocardial cell death andimprove cardiac function in a rat model of myocardial ischemia[J].JEthnopharmacol.2013,149(3):720-8.)，具体方法是：大鼠右上肢和双下肢内侧备皮，用生理盐水润湿表皮，负极探针插入右上肢内侧皮下，正极探针插入左下肢内侧皮下，接地极探针插入右下肢内侧皮下，注意不要插入肌肉中和插破血管。一个完整的正常大鼠心电图如图2(a)所示，从左至右依次为，P波，QRS波群，T波；造模成功后的大鼠心电图，表现为S-T波段抬高，如图2(b)所示。淘汰心电图S-T波段抬高不明显的大鼠，根据差额补充法补充各组因为淘汰和术中死亡所损失的数量。

1.5.3动物分组及给药

108只大鼠随机分为6组，即假手术组(sham组)，模型组(model组)，莫诺苷组(morroniside组)(分45mg/kg小剂量组，90mg/kg中剂量组和180mg/kg大剂量组)及美托洛尔阳性药组(metoprolol组)。莫诺苷及美托洛尔溶于蒸馏水，造模后3h，莫诺苷组按照莫诺苷45mg/kg、90mg/kg、180mg/kg的剂量，美托洛尔组按照美托洛尔10mg/kg的剂量每天灌胃给药1次，连续3d。假手术组和模型组给予等体积(1.5ml)蒸馏水。

1.5.4大鼠动脉血清生化指标检测

10％水合氯醛4ml/kg进行腹腔注射麻醉。仰卧位固定于鼠板上。剪开腹腔，眼科镊向一侧小心扒开肠系组织，用止血钳夹住腹主动脉远心端，5ml注射器针头斜口朝上斜插入动脉，平行推进后抽血。抽血完毕，用另一个止血钳夹住腹主动脉近心端，退出注射器，将血液沿内壁缓慢注入负压促凝采血管，上下晃动数次，4℃冰箱静置。待血液中血清析出后4℃，3000r/min离心30min，离心完成后，取出血清分装，放-80℃冰箱储存待用。检测前，将血清从-80℃冰箱取出，放冰上解冻，仔细阅读各试剂盒说明书，按步骤操作，用酶标仪检测的反应终液吸光度，根据公式计算所测物质活性或含量。

(1)莫诺苷给药3d对心肌缺血大鼠血清LDH活性的影响

莫诺苷给药3天后，各组大鼠血清LDH活性检测结果如图3所示。与假手术组相比，模型组血清LDH活性显著升高(P<0.001)，这表明冠脉结扎手术给大鼠带来明显的心肌损伤，心肌组织中的LDH大量释放到血液中，导致血清中LDH活性大幅升高；与模型组相比，莫诺苷小、中和大剂量给药组大鼠血清LDH活性显著下降(P<0.001)，且与给药剂量呈一定的依赖关系。

(2)莫诺苷给药3d对心肌缺血大鼠血清cTNT含量的影响

莫诺苷给药3天后，各组大鼠血清cTnT含量的检测结果如图4所示。与假手术组相比，模型组血清cTnT含量显著升高(P<0.001)，这表明冠脉结扎手术给大鼠带来明显的心肌损伤，心肌细胞中的cTnT释放到血液中，导致血清中cTnT含量升高；与模型组相比，莫诺苷小、中和大剂量给药组大鼠血清cTnT含量都有下降，且与给药剂量呈一定的依赖关系，其中莫诺苷中剂量组和大剂量组的血清cTnT含量显著下降(P<0.05；P<0.01)。

(3)莫诺苷给药3d对心肌缺血大鼠脂质过氧化作用的影响

莫诺苷给药3天后，各组大鼠心肌组织中SOD活性的检测结果如图5所示。与假手术组相比，模型组心肌组织中SOD活性显著降低(P<0.05)，这表明冠脉结扎手术给大鼠带来明显的心肌损伤，降低了组织中SOD的活性；与模型组相比，莫诺苷小、中、大剂量给药组大鼠组织中SOD的活性都有增强，且与给药剂量呈一定的依赖关系，莫诺苷中剂量组和大剂量组的SOD的活性显著增强(P<0.05和P<0.01)。

(4)莫诺苷给药3d对心肌缺血大鼠心肌组织MDA含量的影响

莫诺苷给药3天后，各组大鼠心肌组织中MDA含量检测结果如图6所示。与假手术组相比，模型组心肌组织中MDA含量显著增加(P<0.001)，这表明冠脉结扎手术给大鼠带来明显的心肌损伤，增加了组织脂质过氧化作用；与模型组相比，莫诺苷小、中和大剂量给药组大鼠组织中MDA含量都有减少，且与给药剂量呈一定的依赖关系，但其中只有莫诺苷大剂量组的MDA含量显著下降(P<0.05)。

1.5.5心脏梗死体积检测

TTC染色检测心肌梗死体积的方法参照Chen TL,Zhu GL,He XL,et al.Short-term pretreatment with atorvastatin attenuatesleft ventricular dysfunction,reduces infarct size andapoptosis in acute myocardial infarction rats[J].IntJ Clin Exp Med.2014,7(12):4799-808.。用0.01mol/L的PBS配制2％TTC溶液，电子pH计调pH为7.4～7.8。大鼠造模3天后，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，注射器吸取1ml饱和氯化钾，迅速剪开胸腔，从心尖注入左心室，这时心脏会停留在收缩期。剪下心脏，除去附着的脂肪组织，4℃生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，用保鲜膜包裹放入大鼠切片模具，-20℃速冻20min。沿垂直心脏长轴方向从心尖到结扎部位，将心脏切成5～6片薄片，每片厚度约2mm。将切片放入玻璃皿中，加入提前37℃预热的TTC溶液至可以完全覆盖切片，用载玻片压住，防止切片遇热变形，避光反应10min～15min，反应过程中翻面一次，直至可以清楚的区分梗死区与非梗死区。反应完毕，放入4％多聚甲醛中固定1h。待全部染完，用蒸馏水冲洗脑片，滤纸吸干。扫描仪扫描后用图像分析软件Image J计算梗死体积百分比。

莫诺苷给药3天后，TTC染色结果如图7所示，假手术组心脏切片全部染成砖红色，没有出现梗死灶，其余各组的梗死面积统计结果如图8所示。与假手术组相比，模型组心脏切片出现明显白色梗死灶，表明冠脉结扎手术给大鼠带来明显的心肌梗死损伤；与模型组相比，莫诺苷小、中和大剂量给药组心肌梗死面积都有不同程度的减少，且与给药剂量呈一定的依赖关系，其中莫诺苷大剂量给药组的心肌梗死体积比模型组显著性减小(P<0.05)40％左右。结果表明，在大鼠心肌缺血缺血再灌注3h后连续给药3天，莫诺苷大剂量组能显著降低大鼠心肌梗死体积。

1.5.6Western Blot技术检测莫诺苷对大鼠心肌缺血后凋亡因子表达的影响

于造模后3天将大鼠用10％水合氯醛4ml/kg腹腔麻醉，剪开胸腔，快速剪下心脏，这时趁心脏还有搏动，将其放入4℃生理盐水中，剪下梗死灶及周边区，冲洗干净，用滤纸吸干，包入锡箔纸中，放入液氮中冻存片刻后，于-80℃保存。取出冻存于-80℃的心肌组织于5ml EP管中称重，加入预冷的裂解液9μl/1mg新鲜组织、PMSF1μl/100μlRIPA，冰上充分超声粉碎。4℃静止30min，4℃12000r/min离心30min，取上清测定蛋白浓度，总蛋白与5X上样缓冲液1:4稀释，95℃变性10min。采用12％SDS-PAGE分离胶，浓缩胶用5％SDS-PAGE。电泳：浓缩胶电压60V，40min，分离胶电压90V，90min，分离蛋白。电泳后用0.45μmNC膜进行转膜；条带在5％的脱脂奶粉中封闭2h；分别用兔源性Bcl-2抗体(1:1000)、兔源性bax抗体(1:1000)、兔源性caspase-3抗体(1:1000)、兔源性caspase-8抗体(1:1000)及兔源性GAPDH抗体，4℃冰箱孵育过夜。TBST缓冲液洗涤3次，每次10min。接下来与相应的辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗涤3次，每次10min；用ECL显色1min，滤去显色液，凝胶成像仪拍片。用Quanity One软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.5.7数据分析

实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计，结果以Mean±SEM表示。用单因素方差分析(one-way analysis of variance，ANOVA)进行组间样本均数比较，P<0.05表示具有统计学意义。

莫诺苷给药3天后，检测bcl-2的表达，结果如图9、图10所示。发现与假手术组相比，模型组大鼠bcl-2的表达显著降低(P<0.001)；与模型组相比，莫诺苷小、中、大剂量组有显著性增高(P<0.05、P<0.001、P<0.001)。

莫诺苷给药3天后，检测bax的表达，结果如图11、图12所示。发现与假手术组相比，模型组大鼠bax的表达显著升高(P<0.001)；与模型组相比，莫诺苷小、中、大剂量组有显著性降低(P<0.001)。

莫诺苷给药3天后，检测caspase-8的表达，结果如图13、图14所示。发现与假手术组相比，模型组大鼠caspase-8的表达显著升高(P<0.001)；与模型组相比，莫诺苷大剂量组有显著性降低(P<0.01)。

莫诺苷给药3天后，检测caspase-3的表达，结果如图15、图16所示。发现与假手术组相比，模型组中大鼠caspase-3的表达显著升高(P<0.001)；与模型组相比，莫诺苷中剂量组、大剂量组有显著性降低(P<0.001)。

结论：本申请采用大鼠心肌缺血模型，首次将莫诺苷用于研究治疗心肌缺血类疾病。心肌缺血之后，莫诺苷可以增强SOD的活性，提高缺血组织的抗氧化能力，削弱脂质过氧化作用，减轻缺血造成的细胞和组织损伤，减小梗死面积。大鼠心肌缺血之后，细胞凋亡信号caspase通路和bcl-2/bax通路被激活，莫诺苷可增强心肌细胞中细胞凋亡抑制蛋白bcl-2的表达和降低促进凋亡的bax、caspase-3、caspase-8蛋白的表达，减少心肌细胞的死亡丢失，起到抗细胞凋亡的心肌保护作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解：根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.莫诺苷用于提高组织中SOD活性的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于提高有此需要的受试者的组织中SOD的活性；

优选地，所述组织为心肌组织；

优选地，所述心肌组织为缺血心肌组织。

2.莫诺苷用于降低组织中MDA含量的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于降低有此需要的受试者的组织中MDA的含量；

优选地，所述组织为心肌组织；

优选地，所述心肌组织为缺血心肌组织。

3.莫诺苷用于抑制细胞凋亡的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制细胞的凋亡；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

4.莫诺苷用于抑制caspase细胞凋亡通路的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制caspase细胞凋亡通路；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

5.莫诺苷用于抑制细胞凋亡因子表达的用途，或者莫诺苷用于制备药物的用途，其中所述药物用于抑制细胞凋亡因子的表达；

优选地，所述凋亡因子选自bcl-2、bax、caspase-8和caspase-3；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

6.莫诺苷在制备预防或治疗与心肌缺血相关的疾病的药物中的用途。

7.权利要求6的用途，其中所述与心肌缺血相关的疾病选自冠心病、心肌损伤(例如心肌缺血再灌注损伤)、心绞痛、心律失常、心肌梗死(例如急性心肌梗死)和猝死。

8.一种抑制细胞凋亡的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

9.一种抑制caspase细胞凋亡通路的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。

10.一种抑制细胞凋亡因子表达的方法，其包括向有此需要的细胞施用有效量的莫诺苷；

优选地，所述凋亡因子选自bcl-2、bax、caspase-8和caspase-3；

优选地，所述细胞为心肌细胞；

优选地，所述心肌细胞来源于缺血后心肌组织。