CN111643486A - 治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及制备方法 - Google Patents

治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及其制备方法。该缓释凝胶贴剂使用时贴敷于患者督脉大椎穴，石杉碱甲通过大椎穴部位皮肤吸收并分布进入脑组织从而发挥脑靶向治疗作用，并减少药物进入血液循环系统而避免了不良反应的发生；同时，本发明贴剂属于新型水凝胶给药系统，制剂基质柔软舒适与皮肤亲和力高，对皮肤安全无刺激无过敏，药物作用时间长而减少给药次数。因此，本发明解决了AD患者由于记忆力减弱、智力降低常常忘记吃药，或多吃药、吃错药而引起的疗效不佳或引发不良反应的问题，为AD患者的治疗提供了一种疗效可靠、使用便捷、安全无毒的新型药物制剂，因此，具有重要的临床价值和广阔的市场前景。

Description

治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，还涉及该石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病又称老年痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性痴呆如记忆、认知能力和生活自理能力渐行性下降为主要特征的神经退行性疾病，患者在患病后7～10年间死亡。据世界卫生组织(WHO)最新数据统计，2017年全球约有4700万痴呆患者，每年新增病例990万。《世界阿尔茨海默病报告2018》报道，2014年中国老龄人口超过2.12亿，随着人口老龄化的加剧，至2050年AD患者预计将达到1.52亿；我国由于人口老龄化，也将成为AD患者最多的国家。2015年全球用于AD患者治疗总费用高达8180亿美元，在我国，AD患者平均每年的花费为13万元，因此，AD患者已经给家庭、社会和医疗带来了沉重的负担。因此，开发用于AD治疗的新型药物制剂具有重要的临床价值和社会意义。
目前，AD的发病机制复杂，病因学尚未阐明。经典的乙酰胆碱能学说认为，乙酰胆碱与人的记忆、学习及其它精神活动密切相关，AD主要是因为患者脑内乙酰胆碱水平下降，导致神经突触传递障碍所致；以抗氧化、改善脑代谢活性为作用靶点的药物因针对性不强、疗效不确切而并未成为抗AD的常用药物；以β-淀粉样蛋白、tau蛋白为靶点的新药开发则是近些年来的研究热点，然而，近几年来针对这两个靶点的新药研究在临床试验中均未表现出预期效果，如2014～2016年，以tau蛋白为靶点的候选药物Bapineuzumab与LMTX在临床试验均未能表现出对AD临床症状的改善而宣告失败。2015～2016年，以β-淀粉样蛋白为靶点的Gantenerumab、Solanezumab在临床试验中也均未表现出预期疗效。尽管对于AD的发病机制有多种学说并存，但经典的乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物在临床上仍处于主体地位。其中，石杉碱甲(Huperzine A，HA)是一种主要的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可通过对神经递质水平(乙酰胆碱酯)的调节、减弱谷氨酸介导的兴奋性细胞毒性、抗神经细胞凋亡的作用与缺氧性损伤的保护作用、调节APP蛋白的代谢、抗氧化的作用与对神经生长因子信号的调节等多靶点、多途径对AD产生有确切的疗效，因此是临床的一线用药。目前，HA临床应用大多为注射剂、片剂和胶囊，其中口服片剂和胶囊最多。口服HA不具有肝毒性，临床应用相对较为安全，但长期应用易出现其胃肠道等不良反应如恶心、呕吐，导致部分患者无法连续用药；另外，AD患者由于记忆力减弱、智力降低常常忘记吃药，或多吃药、吃错药，这在一定程度上又进一步限制了HA的临床应用。
透皮给药系统(Transdermal drug delivery system，TDDS)可以避免肝脏首过效应，避免药物对胃肠道的不良刺激；药物的吸收不受胃肠道因素影响；还可以减少给药次数，且使用方便，患者依从性较高。因此，透皮给药系统特别适合于AD患者的治疗。凝胶贴剂是一种基于水溶性高分子材料的新型透皮给药载体，具有使用方便、载药量大、药物透皮吸收效率高、无过敏无刺激、不拔毛无痛感、膏体柔软无异物感与药物作用时间长等独特优点，但是，目前尚未见到HA缓释凝胶贴剂的研究报道。
冰片，味辛，气香，长于走串，亦有开窍醒神之功效。《本草纲目》称其能“通诸窍、散郁火”，而《本草衍义》总结出的其作用特点“独行则势弱，佐使则有功”可谓精辟之至。后世冰片多作为中医方剂配伍之“佐使”药，以引药直达病所，王光清称之为有“率领群药”的作用。这种药物的配伍原则实质是化学成分的比例变化，所以这种指导思想(理念)也适用于成分配伍。因为无论是中药饮片还是提取的或合成的单体化合物都是由化学元素组成的化合物分子，都是以人体为应用对象，用于防病治病，这是物质同一性与生物活性同一性的基础。研究发现冰片可明显改善局灶性脑缺血下大鼠的脑代谢，维持脑缺血状态下神经细胞的正常形态和功能，延缓、减轻其坏死。冰片对脑缺血的保护作用与其显著的抗组织氧自由基及改善能量代谢障碍作用密切相关，现代研究表明冰片不但可以促进许多药物透过血-脑屏障(BBB)提高药物在脑组织的浓度而提高治疗效果，还能促进活细胞、脂质体透过血脑屏障；同时还可以改变一些神经递质。冰片通过升高下丘脑5-羟色胺(5-HT)的含量，介导BBB开放；P-糖蛋白(P-gp)在细胞膜上成极化分布，能定向地外排某些特定的物质，冰片能明显抑制细胞膜上P-gp的活性，使BBB的通透性增强；当冰片透过血脑屏障后，亲和力大的冰片与P-gp结合后被泵出细胞外，并且抑制了5-HT与P-gp结合，亲和力小的5-HT与P-gp结合的少，在细胞内蓄积，含量增加，进一步介导BBB开放。同时冰片有促进生理、病理情况下脑血管内皮细胞生成一氧化氮(NO)的作用、可使正常及脑损伤大鼠脑组织总Ca2+含量增加，内源性NO与Ca2+参与BBB通透性的调节，NO合成提高及Ca2+含量增加，增加BBB通透性；NO可调节微血管的通透性，是影响BBB通透性的一个重要的物质因素。冰片诱导BBB开放为生理性开放，其促血脑屏障开放不会引起脑的病理性损害，冰片对脑及BBB有一定的保护作用。因此，冰片是一个理想的促进药物HA透皮吸收与透过BBB进入大脑的促渗剂。
经络“内属于脏腑，外络于肢节”，是运行气血、沟通上下、贯穿内外的通道，从而将人体连成一个有机的整体。《灵枢》记载了十二经脉与五脏六腑的络属关系。从循行分布上看，督脉与脑直接相关：《难经》记载：“督脉者·起于下极之腧，并于脊里，上至风府，入属于脑”。《素问》记载督脉的分支“上额交巅上，入络脑”。“入络脑”与“入属于脑”说明督脉归属于脑，与脑关系密切。督脉穴位主治头部病症，如百会、大椎、人中、风府等穴在文献记载中有显著的治疗脑部疾病的作用；其中大椎穴为最重要的穴位，如《新编针灸经》记载：“大椎为极重要之刺激点，对全身作用极大，对各种神经症状有缓解作用”。督脉下起丹田，为元气所发，络属于脑，与五脏六腑均有联系，故可将肾之精、心之神以及其他脏腑之精微上输于脑，以充实脑髓、奉养元神，表明督脉是脏腑精微上输于脑的重要通道，是治疗脑部疾病的重要给药部位。
综上所述，石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的开发具有科学的理论依据和重要的社会意义、临床应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，解决了在临床上HA口服制剂治疗AD过程易出现的如恶心、呕吐、腹痛、胃肠道不适等不良反应而导致部分患者无法连续用药的弊端。
本发明的第二个目的是提供上述凝胶贴剂的制备方法。
本发明所采用的第一种技术方案是：治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，按照质量百分比，由以下组分组成：
石杉碱甲为0.0083～0.0091％，冰片为2.7546～4.3929％，聚丙烯酸钠NP-800为0.6121～1.0138％，聚丙烯酸钠NP-700为0.9182～1.3517％，二氧化钛为2.4485～3.3792％，甘羟铝为0.1530～0.2365％，EDTA-2Na为0.0918～0.1690％，甘油为33.6673～40.5505％，PVP-K90或PVP-K120为3.6728～4.7309％，酒石酸为0.1530～0.2365％，纯化水为39.7886～47.3089％，防腐剂为0.1836～0.2703％，95％乙醇为6.1213～6.7584％，各组分的质量百分比之和为100％。
本发明所采用第一种技术方案的特点还在于，
防腐剂为羟苯乙酯与羟苯丁酯的混合物，羟苯乙酯与羟苯丁酯的质量比为4：1。
本发明所采用的第二种技术方案是：治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，包括以下各步骤：
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0083～0.0091％的石杉碱甲，2.7546～4.3929％的冰片，0.6121～1.0138％的聚丙烯酸钠NP-800，0.9182～1.3517％的聚丙烯酸钠NP-700，2.4485～3.3792％的二氧化钛，0.1530～0.2365％的甘羟铝，0.0918～0.1690％的EDTA-2Na，33.6673～40.5505％的甘油，3.6728～4.7309％的PVP-K90或PVP-K120，0.1530～0.2365％的酒石酸，39.7886～47.3089％的纯化水，0.1836～0.2703％的防腐剂，6.1213～6.7584％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
所述防腐剂为羟苯乙酯与羟苯丁酯的混合物，羟苯乙酯与羟苯丁酯的质量比为4:1；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K90或PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，搅拌混合15～20min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂。
本发明所采用第二种技术方案的特点还在于，
石杉碱甲是采用以下工程菌通过发酵生物合成而制备的，所用工程菌包括：总状毛霉NSH-D菌株Mucor racemosus NSH-D，GenBank登录号KX060585.1；易脆毛霉NSY-1菌株Mucor fragilis NSY-1，GenBank登录号KX060586.1；轮状镰刀菌NSH-5菌株Fusariumverticillioides NSH-5，GenBank登录号KX853851.1；尖孢镰刀菌NSG-1菌株Fusariumverticillioides NSG-1，GenBank登录号KX853850.1；哈茨木霉NSW-V菌株Trichodermaharzianum NSW-V，GenBank登录号KX034080.1其中的任何一种或多种经过培养发酵、超声破碎细胞、萃取、浓缩、纯化、干燥步骤精制而成。
步骤3中搅拌操作真空度为不低于-0.05MPa条件下进行。
步骤5中搅拌混合操作在真空度为不低于-0.05MPa条件下进行。
步骤7中交联固化的条件为：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天。
本发明的有益效果是：
1、本发明基于中医药经络穴位理论，结合石杉碱甲的作用机理和AD患者的用药特点而研发的一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，通过将缓释凝胶贴剂贴敷于AD患者的督脉大椎穴部位，石杉碱甲在水凝胶贴剂作用下高效透过皮肤吸收并在冰片作用下通过督脉进入脑部，从而发挥对AD的治疗作用。同时，避免了口服或注射给药存在的由于药物进入体循环而在全身分布而存在的不良反应如恶心、呕吐、腹痛、胃肠道不适等而导致部分患者无法连续用药的弊端，也避免了注射给药存在的注射疼痛、皮肤刺激、心理恐慌与使用不便的弊端。
2、本发明为穴位缓释凝胶贴剂，具有使用方便、载药量大、药物透皮吸收效率高、无过敏无刺激、不拔毛无痛感、膏体柔软无异物感、药物作用时间长与生物利用度高等优点，更避免了AD患者由于记忆力减弱、智力降低常常忘记吃药，或多吃药、吃错药而引起的疗效不佳或引发不良反应的弊端，因而特别适合于AD患者，且患者依从性较高，可坚持配合治疗从而提高疗效。
3、本发明为穴位缓释凝胶贴剂，具有透皮给药、穴位吸收与脑靶向作用的独特优势，符合AD患者的用药特点，填补了领域空白，对于口服给药与注射给药而言具有较大的市场竞争力，可为我国制药企业参与国际AD药物市场的竞争提供了重要支撑。
附图说明
图1为本发明HA不同给药方案的血-药浓度图；
图2为本发明HA不同给药方案的脑-药浓度图；
图3为本发明HA不同给药方案的对于脑组织AchE活性的影响图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，按照质量百分比，由以下质量百分比的组分组成：
石杉碱甲为0.0083～0.0091％，冰片为2.7546～4.3929％，聚丙烯酸钠NP-800为0.6121～1.0138％，聚丙烯酸钠NP-700为0.9182～1.3517％，二氧化钛为2.4485～3.3792％，甘羟铝为0.1530～0.2365％，EDTA-2Na为0.0918～0.1690％，甘油为33.6673～40.5505％，PVP-K90或PVP-K120为3.6728～4.7309％，酒石酸为0.1530～0.2365％，纯化水为39.7886～47.3089％，防腐剂为0.1836～0.2703％，95％乙醇为6.1213～6.7584％，以上各组分的质量百分比之和为100％。
上述防腐剂为羟苯乙酯与羟苯丁酯的混合物，羟苯乙酯与羟苯丁酯的质量比为4:1。
本发明治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0083～0.0091％的石杉碱甲，2.7546～4.3929％的冰片，0.6121～1.0138％的聚丙烯酸钠NP-800，0.9182～1.3517％的聚丙烯酸钠NP-700，2.4485～3.3792％的二氧化钛，0.1530～0.2365％的甘羟铝，0.0918～0.1690％的EDTA-2Na，33.6673～40.5505％的甘油，3.6728～4.7309％的PVP-K90或PVP-K120，.1530～0.2365％的酒石酸，39.7886～47.3089％的纯化水，0.1836～0.2703％的防腐剂(羟苯乙酯与羟苯丁酯4:1)，6.1213～6.7584％的95％乙醇，以上各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，然后在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K90或PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得的乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌混合15～20min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，得到半成品贴剂，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天(条件：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天)，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，阴凉处存放。
上述一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，石杉碱甲是采用以下工程菌通过发酵生物合成而制备的，所用工程菌包括：总状毛霉NSH-D菌株Mucorracemosus NSH-D(GenBank登录号KX060585.1)，易脆毛霉NSY-1菌株Mucor fragilis NSY-1(GenBank登录号KX060586.1)，轮状镰刀菌NSH-5菌株Fusarium verticillioides NSH-5(GenBank登录号KX853851.1)，尖孢镰刀Fusarium verticillioides NSG-1(GenBank登录号KX853850.1)，哈茨木霉NSW-V菌株Trichoderma harzianum NSW-V(GenBank登录号KX034080.1)，其中的任何一种或多种经过培养发酵、超声破碎细胞、萃取、浓缩、纯化、干燥步骤精制而成。
以下从原理方面说明本发明的关键点所在：
1、AD的主要病变部位在于脑组织，因此，只有将石杉碱甲递送至至脑部才可发挥良好的抗AD并降低由于全身分布而带来的不良反应。然而，脑组织由于存在着血-脑屏障(BBB)而阻碍药物进入脑组织，进而影响了药物的疗效。本发明基于中医药“督脉入脑”与“冰片芳香开窍”理论，通过督脉大椎穴给药与冰片的引经作用而极大地提高石杉碱甲在脑组织的浓度而提高治疗效果，因此，比口服给药与注射给药具有更高的脑靶向作用和抗AD治疗效果。
2、由于AD患者记忆力减弱、智力降低常常忘记吃药，或多吃药、吃错药而引起疗效不佳或引发潜在不良反应。本发明为石杉碱甲穴位的缓释凝胶贴剂，通过将缓释凝胶贴剂贴敷于AD患者的督脉大椎穴部位而发挥治疗作用，这样就有效避免了AD患者由于记忆力减弱、智力降低常常忘记吃药，或多吃药、吃错药而引起的疗效不佳或引发不良反应的弊端，因而特别适合于AD患者。
3.本发明所述的石杉碱甲在冰片引经的佐使作用下，均可对AD产生确切的治疗作用，例如公知的软膏剂、糊剂、橡胶膏、贴膏剂或黑膏药的制备方法。但是本发明所述的制备方法采用了与皮肤生物相容性好的药用级水溶性高分子材料、保湿剂甘油、纯化水、填充剂等制备而成，形成的凝胶贴剂具有空间网状骨架结构，从而使水分、甘油和石杉碱甲填充于这种空间网状骨架结构中，且石杉碱甲以游离的分子状态存在，从而使石杉碱甲在皮肤内外两侧形成较高的浓度梯度而利于药物的透皮吸收；同时，冰片也具有良好的促进药物透皮吸收的作用。本发明的缓释凝胶贴剂具有载药量大、药物透皮吸收效率高与作用时间长、对皮肤无刺激无过敏、基质柔软无异物感、黏性适中不拔毛无痛感等优点，且使用简单方便，极大地方便了AD患者的用药需求。
实施例1
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0083％的石杉碱甲，2.7546％的冰片，0.6121％的聚丙烯酸钠NP-800，1.3517％的聚丙烯酸钠NP-700，2.4485％的二氧化钛，0.1530％的甘羟铝，0.0918％的EDTA-2Na，35.1404％的甘油，3.6728％的PVP-K120，0.1530％的酒石酸，47.3089％的纯化水，0.1836％的防腐剂(羟苯乙酯与羟苯丁酯4:1)，6.1213％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，然后在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌混合15min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天(条件：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天)，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，阴凉处存放。
实施例2
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0091％的石杉碱甲，4.3929％的冰片，1.0138％的聚丙烯酸钠NP-800，0.9182％的聚丙烯酸钠NP-700，3.3792％的二氧化钛，0.2365％的甘羟铝，0.1690％的EDTA-2Na，38.0966％的甘油，4.7309％的PVP-K90，0.2365％的酒石酸，39.7886％的纯化水，0.2703％的防腐剂(羟苯乙酯与羟苯丁酯4:1)，6.7584％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，然后在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K90，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌混合20min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天(条件：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天)，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，阴凉处存放。
实施例3
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0087％的石杉碱甲，3.5738％的冰片，0.8129％的聚丙烯酸钠NP-800，1.2355％的聚丙烯酸钠NP-700，2.9139的二氧化钛，0.1948％的甘羟铝，0.1305％的EDTA-2Na，37.1089％的甘油，4.2019％的PVP-K120，0.1948％的酒石酸，42.9575％的纯化水，0.2269％的防腐剂(羟苯乙酯与羟苯丁酯4:1)，6.4399％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，然后在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌混合18min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天(条件：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天)，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，阴凉处存放。
实施例4
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0084％的石杉碱甲，3.6988％的冰片，0.9247％的聚丙烯酸钠NP-800，0.9247％的聚丙烯酸钠NP-700，3.0823％的二氧化钛，0.1849％的甘羟铝，0.1541％的EDTA-2Na，36.9884％的甘油，4.3153％的PVP-K120，0.1849％的酒石酸，43.1531％％的纯化水，0.2157％的防腐剂(羟苯乙酯与羟苯丁酯4:1)，6.1647％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，然后在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，在真空度为不低于-0.05MPa条件下，搅拌混合20min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天(条件：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天)，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明一种治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，阴凉处存放。
以下从相关实验结果进一步说明本发明所产生的有益效果：
(一)药动学实验
1、实验动物和分组：
将成年健康SD大鼠随机分为口服给药组(Group-1)、督脉穴位贴敷给药组(Group-2)和腹部贴敷给药组(Group-3)，每组24只。各组按照以下方案给药：①口服给药组(Group-1)，按2mg/kg的剂量灌胃给予石杉碱甲片剂；②督脉穴位贴敷给药组(Group-2)，鼠的大椎穴穴位位于背部正中线第7颈椎和第1胸椎之间，实验前24h将穴位部位的毛剔除干净，将本发明石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂贴敷于大椎穴部位；③腹部贴敷给药组(Group-3)，实验前24h将SD大鼠腹部的毛剔除干净，然后贴敷本发明石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂。
2、样品处理与测定：
各组给药完后，于1.0，3.0，5.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0h各组分别眼眶取血，然后处死动物，剥取脑组织。将血液样品，于10000r/min离心10min，准确移取血浆400μl；加入1.0mol/ml NaOH溶液50μl，涡旋30s。加入1.5ml提取液(醋酸乙酯-正己烷＝1∶1)，涡旋振荡3min；3000r/min离心10min，吸取上清液，移入另一离心管；再加入1.5ml提取液，重复提取1次，吸取上清液与第1次提取液合并。然后将置于40℃恒温水浴蒸干，用100μl流动相溶解，取40μl进样，测定。
脑组织，用生理盐水冲洗至无血迹，称重；按照3mg/ml加入一定量的生理盐水匀浆，涡旋振荡3min；3000r/min离心10min，准确移取上清液400μl，其余操作与血浆样品处理方法相同。
3、实验结果：
三种不同给药方案如口服给药组(Group-1)、督脉穴位贴敷给药组(Group-2)和腹部贴敷给药组(Group-3)，实验动物的血药浓度如图1所示，脑药浓度如图2所示，图1和图2表明督脉穴位贴敷给药能够减少药物进入体循环而促进药物进入脑组织，从而发挥良好的脑靶向作用。由图1可知，Group-2与Group-3比较，二者均为透皮给药，因此药物达峰时间落后于口服给药(Group-1)，但Group-2的峰浓度和药时曲线下面积AUC明显低于Group-3(t-test，P＜0.05)，表明督脉大椎穴可减少药物透皮吸收后进入血液。由图2可知，Group-2组使HA在脑组织中的峰浓度和脑药时曲线下面积AUC远高于Group-1和Group-2(t-test，P＜0.05)，而且Group-2在脑组织中的达峰时间低于血药浓度达峰时间，表明督脉穴位可以将通过穴位进入体内的药物分子首先运输于脑而具有良好的脑靶向作用；此外，Group-2在脑组织中维持药物浓度的时间也高于口服给药，因此督脉穴位贴敷给药HA对于AD患者的治疗十分有利。实验也证明了经络穴位“联系脏腑内外”与“督脉通于脑”理论的正确性，表明了督脉穴位如大椎穴是非常理想的治疗脑病的给药部位。
(二)药效学实验
1、实验动物和分组：
将成年健康SD大鼠随机分为对照组(Control)、和督脉穴位贴敷给药组(Group-2)，每组24只(雌雄各半)。各组按照以下方案给药：①对照组(Control)，正常饲养不做任何处理；②口服给药组(Group-1)，每天给药一次，连续给药28天；③督脉穴位贴敷给药组(Group-2)，将穴位部位的毛剔除干净，将本发明石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂贴敷于大椎穴部位，每天给药一次，连续给药28天。
2、测定分析：
2.1测定原理
AchE水解乙酰胆碱生成胆碱和乙酸，胆碱与巯基显色剂反应生成黄色化合物对三硝基苯(TNB)，测定其吸光度(OD)即可计算出AchE活性。
2.2测定步骤：
①按照乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)活性测定试剂盒的操作说明进行配制各试剂。
②取小鼠脑组织，用生理盐水冲洗至无血迹，准确称重；加入生理盐水制备成10％的生理盐水匀浆，离心(3000r/min)10min；取上清液按1：9加入生理盐水稀释成1％匀浆液，待测，备用。
③测定分为测定管、对照管、标准管和空白管，各管具体操作如下：
测定管中依次加入0.05ml样品，0.5ml底物缓冲液，0.5ml显色液，混合均匀，于37℃准确反应6min；之后加入0.03ml抑制剂，0.1ml透明剂，0.05ml稳定剂，混合均匀，静置15min，在412nm波长下测定吸光度OD值。
对照管依次加入0.5ml底物缓冲液，0.5ml显色液，混合均匀，于37℃准确反应6min；之后加入0.03ml抑制剂，0.1ml透明剂，0.05ml稳定剂，0.05ml样品；混合均匀，静置15min，在412nm波长下测定吸光度OD值。
标准管依次加入1.0μmol/l的标准液0.05ml，0.5ml底物缓冲液，0.5ml显色液，混合均匀，于37℃准确反应6min；之后加入0.03ml抑制剂，0.1ml透明剂，0.05ml稳定剂，混合均匀，静置15min，在412nm波长下测定吸光度OD值。
空白管依次加入0.05ml的蒸馏水，0.5ml底物缓冲液，0.5ml显色液，混合均匀，于37℃准确反应6min；之后加入0.03ml抑制剂，0.1ml透明剂，0.05ml稳定剂，混合均匀，静置15min，在412nm波长下测定吸光度OD值。
④脑组织匀浆中AchE活力(U/mgprot)是指每mg脑组织蛋白在37℃保温6min，水解反应体系中1.0μmol基质为1个活力单位。活力按照下列公式(1)计算：
Figure BDA0002492212660000211
3、实验结果：
由图3可知，督脉大椎穴贴敷给药(Group-2)比口服给药(Group-1)能够显著抑制脑组织中AchE的活性，因此可增加Ach在脑组织的剂量。这与药动学(图2)的结果一致，表明相同条件下，通过督脉穴位给药能够增强药物-HA的脑靶向治疗作用从而增强药效，同时使药物在脑部起效迅速。
(三)安全性评价
1、皮肤刺激性实验
1.1实验方法：
取6只大耳白兔，试验前背部局部脱毛处理及破损皮肤准备。采取同体自身对比法，近头端为完整皮肤区，近尾端为破损皮肤区，左侧贴敷本发明石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，右侧贴敷空白凝胶贴剂为对照。分别将载药HA凝胶贴剂和空白凝胶贴剂直接贴敷于实验区上，共贴敷15天，每天一次，贴敷时间首次24h，之后为23h，第二天用温水清洁给药部位，1小时后再次贴敷。首次给药前及每天清洁后1h，末次给药清除药物后24h、48h、72h观察涂敷部位有无红斑和水肿等情况并进行评分，根据评分结果评价本发明石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的皮肤刺激强度。
1.2实验结果：
在给药过程及观察期内，动物一般状况、体重增长良好。对于完整皮肤区域，石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂和空白凝胶贴剂组均未见红斑和水肿，载药HA凝胶贴剂组仅在第14天有一只动物出现轻度红斑，停药后24小时消退，空白凝胶贴剂组和载药HA凝胶贴剂组平均分值分别为0和0.05，根据皮肤刺激强度评价标准评价为无刺激性。对于破损皮肤区域，载药HA凝胶贴剂和空白凝胶贴剂组多数动物于首次贴敷后即出现轻度红斑，可能为破损伤口愈合的自然表现，试验4天后逐渐消退，至第8天破损区域完全愈合，在给药过程及观察期内，破损皮肤石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂和空白凝胶贴剂的平均分值均小于0.49，刺激强度为无刺激性。
1.3结论：
石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及空白凝胶贴剂对大耳白兔完整皮肤和破损皮肤经皮连续给药15天，皮肤刺激强度均为无刺激性。
2、皮肤过敏性实验
2.1实验方法：
取检疫合格的豚鼠40只，采用随机均衡法分为阴性对照组、阳性对照组、石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂组和空白凝胶贴剂组，每组10只，雌雄各半。第0、7、14日于动物背部一侧去毛区分别致敏3次，末次致敏后第14日于动物背部另一侧脱毛区进行激发，激发后1h、24h、48h及72h观察每只动物的皮肤及全身反应并进行评分，评价皮肤过敏反应程度。
2.2实验结果：
在给药过程及观察期内，阴性对照组、石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂组和空白凝胶贴剂组均未见红斑、水肿或其它异常情况，阳性对照组动物首次致敏后部分动物出现给药区边缘皲裂，第2和第3次致敏后阳性对照组动物均可观察到轻至重度红斑、皮肤皲裂、结痂及增厚现象，激发前均恢复。激发阶段，去除药物后1h、24h、48h、72h观察各组动物，阳性对照组于去除药物后1h所有动物出现轻度、中度红斑及水肿，随观察时间延长过敏反应减轻，48h时2只动物水肿处起皮脱落，72h时所有动物全部恢复，阳性率为100％。阴性对照组、石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂组和空白凝胶贴剂组均未见红斑、水肿等皮肤过敏反应，且各组动物未见哮喘、站立不稳或休克等全身性过敏反应。
2.3结论：
石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂及空白凝胶贴剂对豚鼠经皮致敏及激发后，未见发生皮肤过敏性反应，表明本发明贴剂对于皮肤安全无毒。

Claims (7)

1.治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，其特征在于，按照质量百分比，由以下组分组成：
石杉碱甲为0.0083～0.0091％，冰片为2.7546～4.3929％，聚丙烯酸钠NP-800为0.6121～1.0138％，聚丙烯酸钠NP-700为0.9182～1.3517％，二氧化钛为2.4485～3.3792％，甘羟铝为0.1530～0.2365％，EDTA-2Na为0.0918～0.1690％，甘油为33.6673～40.5505％，PVP-K90或PVP-K120为3.6728～4.7309％，酒石酸为0.1530～0.2365％，纯化水为39.7886～47.3089％，防腐剂为0.1836～0.2703％，95％乙醇为6.1213～6.7584％，各组分的质量百分比之和为100％。
2.根据权利要求1所述的治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂，其特征在于，所述防腐剂为羟苯乙酯与羟苯丁酯的混合物，羟苯乙酯与羟苯丁酯的质量比为4：1。
3.治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，其特征在于，包括以下各步骤：
步骤1：根据制剂所需，按照质量百分比，称取0.0083～0.0091％的石杉碱甲，2.7546～4.3929％的冰片，0.6121～1.0138％的聚丙烯酸钠NP-800，0.9182～1.3517％的聚丙烯酸钠NP-700，2.4485～3.3792％的二氧化钛，0.1530～0.2365％的甘羟铝，0.0918～0.1690％的EDTA-2Na，33.6673～40.5505％的甘油，3.6728～4.7309％的PVP-K90或PVP-K120，0.1530～0.2365％的酒石酸，39.7886～47.3089％的纯化水，0.1836～0.2703％的防腐剂，6.1213～6.7584％的95％乙醇，各组分的质量百分比之和为100％；
所述防腐剂为羟苯乙酯与羟苯丁酯的混合物，羟苯乙酯与羟苯丁酯的质量比为4:1；
步骤2：将步骤1称取的聚丙烯酸钠NP-800、聚丙烯酸钠NP-700、二氧化钛、甘羟铝与EDTA-2Na在密闭洁净干燥的塑料袋内振摇混合，得到固相，备用；
步骤3：将步骤1称取的甘油加入真空搅拌器中，再加入步骤2所得固相，搅拌10min，得到甘油相，备用；
步骤4：将步骤1称取的酒石酸，加入到纯化水中，搅拌至酒石酸溶解后再加入PVP-K90或PVP-K120，然后不断搅拌至PVP充分溶解，得到水相，备用；
步骤5：将步骤1称取的石杉碱甲、冰片与防腐剂，加入到95％乙醇中，搅拌至充分溶解，得到乙醇相，备用；
步骤6：将步骤5所得乙醇相，步骤4所得水相，依次加入到步骤3所得的甘油相中，搅拌混合15～20min，得到凝胶膏体，备用；
步骤7：将步骤6所得凝胶膏体转移到涂布切割机上，以医用无纺布为背衬层、双塑双硅纸为覆盖膜，进行膏体的涂布、覆膜与裁切，将所得半成品贴剂以无纺布层朝上、覆盖膜层朝下置于静置间进行交联固化7天，经质检合格后，采用高阻隔性铝塑复合膜袋包装，即得到本发明治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂。
4.根据权利要求3所述的治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，其特征在于，所述石杉碱甲是采用以下工程菌通过发酵生物合成而制备的，所用工程菌包括：总状毛霉NSH-D菌株Mucor racemosus NSH-D，GenBank登录号KX060585.1；易脆毛霉NSY-1菌株Mucor fragilis NSY-1，GenBank登录号KX060586.1；轮状镰刀菌NSH-5菌株Fusariumverticillioides NSH-5，GenBank登录号KX853851.1；尖孢镰刀菌NSG-1菌株Fusariumverticillioides NSG-1，GenBank登录号KX853850.1；哈茨木霉NSW-V菌株Trichodermaharzianum NSW-V，GenBank登录号KX034080.1其中的任何一种或多种经过培养发酵、超声破碎细胞、萃取、浓缩、纯化、干燥步骤精制而成。
5.根据权利要求3所述的治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，其特征在于，所述步骤3中搅拌操作在真空度不低于-0.05MPa条件下进行。
6.根据权利要求3所述的治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，其特征在于，所述步骤5中搅拌混合操作在真空度不低于-0.05MPa条件下进行。
7.根据权利要求3所述的治疗老年痴呆的石杉碱甲穴位缓释凝胶贴剂的制备方法，其特征在于，所述步骤7中交联固化的条件为：温度35～38℃、湿度40％～45％放置3天，然后温度30℃～33℃、湿度55％～60％放置4天。
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