CN103054921A - 从北柴胡中提取的有效组分及其抗抑郁活性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了北柴胡有效组分CHB的制备和药物用途，具体涉及其在治疗抑郁症产品中的应用。北柴胡有效组分CHB对于各种原因引起的抑郁症具有较好的治疗作用。北柴胡有效组分CHB对皮质酮损伤的U251细胞有一定的保护作用。北柴胡有效组分CHB能明显缩短小鼠悬尾不动时间和游泳不动时间，改善由利血平而造成的小鼠体温的降低，各剂量组与模型组相比，统计学上有显著差异，有剂量依赖性，体现较好的抗抑郁作用。

Description

从北柴胡中提取的有效组分及其抗抑郁活性的应用

技术领域

本发明涉及中药领域，具体说，涉及从北柴胡中提取有效组分CHB及该组分抗抑郁生物活性的应用。

背景技术

随着现代城市生活节奏不断地加快，人们压力越来越大，抑郁症的发病率也在逐年递增。抑郁症以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征，是一种慢性的反复发作的脑疾病，影响到全球20%的人群。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第四大疾患，预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。现有的抗抑郁西药主要是：三环类抗抑郁药（TCA）、单胺氧化酶抑制剂（MAOI）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRS）。由于化学合成抗抑郁药在长期服用后会出现严重的毒副作用，也存在着抗抑郁谱窄、易复发等缺点，所以作用温和、副作用少的传统中药及其方剂越来越受到人们的关注。

抑郁症以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征，包括焦躁情绪、快感缺失、睡眠障碍、负罪感和反复自杀念头等。抑郁症不仅给患者带来精神上的损失，也给患者造成沉重的经济负担，约15%的抑郁患者死于自杀。目前，抑郁症的发病率已呈现出逐年增长的趋势。据调查，每十位男性中就有一位可能患有抑郁症，而女性则每五位中就有一位患有抑郁症。美国每年因抑郁症造成的经济损失达到437亿美元。世界卫生组织、世界银行和哈佛大学的一项联合研究表明，抑郁症已经成为中国疾病负担的第二大疾病。

柴胡为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，按形状不同分别称为“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡具有镇静、止痛、降温、镇咳、抗炎抗菌、保肝利胆、降血压、抗病毒、抗肿瘤以及调节免疫系统活性等药理作用。但是现有技术中没有公开北柴胡治疗抑郁症的用途。

应激是当机体所处的外界环境突然发生变化时，机体通过对它的认知和评价而做出的一系列心里生理反应。应激导致下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）轴功能的失调，行为和心理应激可以引起血清糖皮质激素的升高。增高的糖皮质激素通过激活糖皮质激素受体降低海马神经元新生，造成海马神经元萎缩、体积减小，而海马神经元的损害将打断正常应激反应时海马对HPA轴的抑制作用而造成恶性循环。因此本实验采用到了国际上用于抗抑郁药物初筛的两个最常见的动物模型：小鼠悬尾(tail suspension test，TST)和强迫游泳（forced swim test，FST）。两种模型的作用原理均是通过对动物施以无法逃避的应急刺激造成动物的行为绝望而模拟人类的抑郁症症状，又称为行为绝望抑郁动物模型。FST是由Porsolt于1977年首先提出，TST是受FST的启发而创建的。两个模型的特点是：操作简单、快速、敏感，而且特异性较高，动物行为表现与抑郁症有某些相似之处，因此成为抗抑郁药物临床前筛选及疗效评价的重要指标。

目前公认的抑郁症发病机制是单胺类神经递质假说，该假说认为抑郁症是由单胺类递质功能降低引起的，基于单胺类递质的药物至今仍是抑郁症治疗的一线药物。这些抗抑郁药通过抑制突触外单胺类递质的重吸收或抑制它们的降解来提高突触外单胺递质的浓度达到抗抑郁的效果。有发现，长期服用利血平会出现抑郁症状，其诱发抑郁的机制与之引起的脑内单胺类神经递质的耗竭有关。腹腔注射利血平建立动物模型不仅模拟了抑郁症患者的临床行为表现，更模拟了抑郁症患者脑内单胺类递质系统功能降低的病理机制，因而在新药研发中被广泛应用。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种治疗治疗抑郁症的物质，即北柴胡的有效组分。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种北柴胡的有效组分。

本发明第二方面提供了北柴胡的有效组分的制备方法。

本发明第三方面提供了北柴胡的有效组分的药物组合物。

本发明第四方面提供了北柴胡的有效组分的治疗抑郁症的用途。

本发明的北柴胡的有效组分，通过如下的制备方法获得：

1)北柴胡根用80-90%乙醇提取，提取液合并后浓缩挥至无醇味，

2）向提取物中加入60-90%乙醇搅拌至溶解，将提取物的醇溶用石油醚进行萃取至石油醚层颜色较浅，将石油醚层弃去；

3）剩余醇溶液用大孔吸附树脂拌匀，并加热挥干，将吸附样品的大孔树脂装入一个下部预先填装了大孔吸附树脂的色谱柱上；

4）首先用10-30%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液弃去；

5）再用50-70%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液收集，

6）减压回收乙醇得浸膏，并将浸膏干燥、粉碎得柴胡有效组分。

为提高提取的效率，步骤1）中所述的北柴胡根优选经过干燥、粉碎。

步骤1）中提取温度优选是乙醇回流的温度。

步骤1）中80-90%乙醇的用量以北柴胡根计优选每公斤10-14升，更优选每公斤12升。

步骤2）中萃取步骤优选使用分液漏斗中进行。

步骤3）的优选的大孔吸附树脂选自D101大孔吸附树脂、AB-8树脂、DM-130树脂、HPD-100树脂。

本发明的最优选的的北柴胡的有效组分，通过如下的制备方法获得：

1）干燥的北柴胡根经粉碎后用85%乙醇(以北柴胡根计优选每公斤12倍体积)回流提取，提取液合并后浓缩挥至无醇味，

2）向提取物中加入适量60%乙醇，搅拌溶解后将提取物的醇溶液置于分液漏斗中，用等体积石油醚进行萃取至石油醚层颜色较浅，将石油醚层弃去；

3）剩余醇溶液用D101大孔吸附树脂拌匀，并在水浴锅上挥干，将吸附样品的大孔树脂装入一个下部预先填装了少量D101大孔吸附树脂的玻璃色谱柱上；

4）首先用20%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液弃去；

5）再用60%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液收集；

6）减压回收乙醇得浸膏，并将浸膏真空干燥、粉碎得柴胡有效组分粉末。

本发明北柴胡有效组分CHB对皮质酮造成的U251细胞损伤有一定的保护作用，在药理学抑郁模型有显著的抗抑郁活性。北柴胡有效组分CHB均能缩短小鼠悬尾不动时间和强迫游泳的不动时间，并改善由利血平造成的小鼠体温降低，各剂量组与模型组相比，统计学上有显著性差异，呈剂量依赖性，体现显著的抗抑郁作用。

所述的柴胡的有效组分在制备治疗抑郁症产品中的应用。所述的抑郁症是指由于各种原因引起的抑郁及抑郁伴随的神经、精神症状。

本发明首次公开北柴胡有效组分CHB用于治疗西医范畴的以抑郁症状为主的精神疾病和中医范畴的情志性方面的应用。

本发明首次公开了北柴胡有效组分CHB治疗抑郁症的药用作用，因此，将柴胡有效组分单独或与其他组分或辅料配合制成药剂，只要该药剂用于治疗抑郁症及相关神经精神症状，均属于本发明的保护范围。

本发明提供的药物组合物，包括有效剂量的的柴胡有效组分和药学可接受的载体和/或辅料。本发明的北柴胡有效组分CHB是一种药物活性成分。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明柴胡有效组分与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明柴胡有效组分在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量%。

本发明柴胡有效组分或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括o/w型、w/o型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明柴胡有效组分可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明柴胡有效组分制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明柴胡有效组分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明柴胡有效组分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明柴胡有效组分片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明柴胡有效组分的胶囊剂。

为将本发明柴胡有效组分制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明柴胡有效组分药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明柴胡有效组分的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的柴胡有效组分或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的柴胡有效组分与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的北柴胡有效组分CHB在制成任何一种剂型时，均具有治疗抑郁症的作用。任何药剂，如果其组分中含有北柴胡有效组分CHB或者仅以北柴胡有效组分CHB单独成分制备成药，在其包装或说明书等标识上或者其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗抑郁症的作用，也属于本发明的保护范围之内。

本发明的产品包括药品和保健品。本发明的北柴胡有效组分CHB是来源于天然种草药物伞形科植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根。因此，也可以将北柴胡有效组分CHB制成保健食品或保健药品。将北柴胡有效组分CHB制成的保健食品或保健药品，如果在其包装或包装说明书等标识上注明或提示具有治疗抑郁症的作用，也属于本发明的保护范围之内。

附图说明

图1.柴胡有效组分的HPLC分析图谱（注：经与对照品对照，27.194min的色谱信号归属为柴胡皂苷b₂）

具体实施方式

实施例1：北柴胡有效组分的分离

1.材料：

1.1动物：KM小鼠，♂，体重18-22g，维通利华动物实验中心提供，合格证编号：SCXK-2006-0008。

1.2药品与试剂：盐酸氟西汀（Fluoxetine，Prozac百忧解），礼来苏州制药有限公司，批号：0724A，将其研成粉末用水配成3.5mg/kg混悬液。

1.3仪器与材料：HPLC，小鼠悬尾测试仪TU-1，中国医学科学院药物研究所提供。CONTRONIX小鼠肛温测定仪，购自北京业之恒科技有限公司。

2.方法

2.1 组分提取

12Kg干燥的北柴胡根经粉碎后用85%的乙醇(约140L)回流提取3次，提取时间分别为：2h;2h;1h。将提取液合并后浓缩挥至无醇味得浸膏溶液5L，用60%的乙醇将上述浸膏溶液稀释至8L。将8L溶液分成两份，分别置于两个10L的分液漏斗中用石油醚萃取3次(3L×2×3)，至第三次萃取时石油醚层基本无色，将萃取所得石油醚层弃去。将石油醚萃取后的醇溶液用D101大孔吸附树脂(5L)拌匀，并在水浴锅上挥干，将吸附样品的大孔树脂装入一个下部预先填装了少量的D101大孔吸附树脂的玻璃色谱柱。首先用20%的乙醇(40L)洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液弃去。再用60%的乙醇(44L)洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液收集，减压回收乙醇得浸膏，并将浸膏真空干燥、粉碎得柴胡有效组分粉末240g。

2.2 结构鉴定

将上述柴胡有效组分进行HPLC分析，分析条件为：色谱柱：KromasilC18(250mm×4.6mm，Ф5μm)。柱温：25℃。流动相：乙腈(A)和纯净水(B),梯度洗脱，0～20min：30～40%A；20～35min：40～50%A；35～45min：50～60%A；45～55min：60～80%A；55～65min:80～100%A。流速：1.0mL/min。检测波长为254nm。进样量：20μL。HPLC图谱如附图1所示：

saikosaponin h(柴胡皂苷h)R₁=glc[(4→1)-rha](6→1)glc,R₂=β-OH,R₃=H.

saikosaponin b₂(柴胡皂苷b₂)R₁=fuc(3→1)-glc,R₂=α-OH,R₃=OH.

2″-O-β-D-glucopyranosylsaikosaponin b₂(2″-O-葡萄糖柴胡皂苷b₂)R₁=fuc(3→1)-glc(2→1)-glc,R₂=α-OH,R₃=OH.

6″-O-acetyl-saikosaponin b₂(6″-O-乙酰化柴胡皂苷b₂)R₁=fuc(3→1)-glc-6″-O-Ac,R₂=α-OH,R₃=OH.

药理实验

实验例1：北柴胡有效组分CHB对皮质酮损伤的U251细胞的损伤作用

胶质瘤细胞株U251，用含10%灭活的FBS的RPMI1640培养基（加Hepes 0.2%，NaHCO₃ 0.3576%）于37℃，5%CO₂条件下培养，3d传代，取对数生长期细胞进行实验。完全培养基调整细胞数浓度为1×10⁸L^-1后接种于96孔板中，100μL/孔，37℃、5%CO₂条件下培养过夜，次日分组：空白组加完全培养基，模型组加含皮质酮终浓度为200μmolL^-1的完全培养基，实验组加含CHB组分（终浓度分别为10，1mg L^-1）及皮质酮（终浓度为200μmol L^-1）的完全培养基，各组3个复孔。37℃，5%CO₂条件下培养48h，然后用MTT法检测细胞存活率，酶标仪570nm波长读取各孔吸光值。用于定量反应活细胞多少。以SPSS13.0统计软件处理，数据以“x±s”表示，两个样本平均数比较采用t检验分析。

由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能，DMSO使结晶物溶解，在570nm波长处测定其光吸收值（A570nm），可间接反映活细胞数量，实验结果见表2。显示U251细胞经终浓度为200μmol L^-1皮质酮处理24小时后，A570nm值显著低于正常对照组，表明细胞受到损伤或部分细胞已经死亡。给予10mg·mL^-1组分保护后，A570nm值较之于谷氨酸处理组显著升高，表明U251细胞损伤明显减弱，活细胞增多。证明组分对皮质酮造成的U251细胞损伤有一定的保护作用。

表2柴胡组分CHB对U251细胞皮质酮模型损伤的影响（n=3）

与模型组比较，*P<0.05

北柴胡有效组分对小鼠的抗抑郁作用

实验例2 小鼠悬尾实验

2.1药物的配制 称取柴胡组分，配成100mg/kg、200mg/kg，阳性药配制成3.5mg/kg混悬液。

2.2小鼠适应3天后根据体重分层随机分组，分别为对照组、阳性组、低剂量组和高剂量组。每组15只，连续灌胃给药7天，末次给药1h后将小鼠尾巴固定在回形针上，放入悬尾测试仪箱子内，使其呈倒挂状态，适应2min后，开始记录4min内的不动时间。判断标准：小鼠悬挂期间，没有任何活动时，定为不动状态。

2.3统计学处理，以SPSS13.0统计软件处理，数据以“x±s”表示，组间比较采用One-way ANOVA进行统计，然后进一步采用LSD检验进行两两比较。

2.4对小鼠选为不动时间的影响

北柴胡有效组分CHB对小鼠悬尾不动时间的影响实验结果见表3。小鼠在悬尾模型中出现的不动状态反映了动物的绝望行为。给予北柴胡有效组分100mg/kg、200mg/kg，两个剂量均能显著缩短小鼠不动时间，显示出抗抑郁作用。

表3 CHB对小鼠悬尾不动时间的影响（x±s，n=13）（TST）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

实验例3 小鼠强迫游泳实验

3.1药物的配制 称取柴胡组分，配成100mg/kg、200mg/kg，阳性药配制成3.5mg/kg混悬液。

3.2小鼠适应3天后根据体重分层随机分组，分别为对照组、阳性组、低剂量组和高剂量组。每组15只，连续灌胃给药7天，于末次给药1h后将小鼠置于水深10cm，水温(25±2)℃的圆桶中，观察6min，比较各组在后4min内的不动时间。不动状态为：小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的状态。

3.3对小鼠强迫游泳不动时间的影响

北柴胡有效组分CHB对强迫游泳小鼠不动时间的影响，实验结果见表4。小鼠在强迫游泳模型中出现的不动状态反映了动物的绝望行为，可模拟人类的抑郁状态。给予北柴胡有效组分100mg/kg、200mg/kg，两个剂量均能显著缩短强迫游泳小鼠不动时间，显示出抗抑郁作用。

表4 CHB对小鼠强迫游泳不动时间的影响（x±s，n=13）(FST)

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实验例4 利血平拮抗实验

4.1药物的配制 称取柴胡组分，配成100mg/kg、200mg/kg，阳性药配制成3.5mg/kg混悬液。

4.2小鼠适应3天后根据体重分层随机分组，分别为对照组、阳性组、低剂量组和高剂量组。每组15只，连续灌胃给药7天，末次给药1h后，腹腔注射利血平4mg/kg，4h后，用肛门温度计蘸取少量凡士林轻轻插入动物肛门1～2cm处，停留15s测定动物体温，比较各组体温值。

4.3对利血平致体温下降的影响

北柴胡有效组分CHB能有效对利血平只小鼠体温下降的影响，结果见表5。利血平是一种囊泡再摄取抑制剂，使递质留在囊泡外，被单胺氧化酶降解，从而耗竭体内单胺类递质，引起动物体温降低。连续给予CHB，100，200mg/kg剂量组均能明显改善利血平诱导的体温下降。

表5 CHB对利血平拮抗小鼠体温的影响（x±s，n=15）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Claims (10)

1.一种北柴胡的有效组分，其特征在于，通过如下的制备方法获得：

1)北柴胡根用80-90%乙醇提取，提取液合并后浓缩挥至无醇味，

2）向提取物中加入60-90%乙醇搅拌至溶解，将提取物的醇溶用石油醚进行萃取至石油醚层颜色较浅，将石油醚层弃去；

3）剩余醇溶液用大孔吸附树脂拌匀，并加热挥干，将吸附样品的大孔树脂装入一个下部预先填装了大孔吸附树脂的色谱柱上；

4）首先用10-30%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液弃去；

5）再用50-70%的乙醇洗脱大孔树脂柱至洗脱液色浅，将该部分洗脱液收集，

6）减压回收乙醇得浸膏，并将浸膏干燥、粉碎得柴胡有效组分。

2.根据要求1的北柴胡的有效组分，其特征在于，步骤1）中所述的北柴胡根经过干燥、粉碎。

3.根据要求1的北柴胡的有效组分，其特征在于，步骤1）中提取温度是乙醇回流的温度，

4.根据要求1的北柴胡的有效组分，其特征在于，步骤1）中80-90%乙醇的用量以北柴胡根计每公斤10-14升。

5.根据要求1的北柴胡的有效组分，其特征在于，步骤2）中萃取步骤是在分液漏斗中进行。

6.根据要求1的北柴胡的有效组分，其特征在于，步骤3）的大孔吸附树脂选自D101大孔吸附树脂、AB-8树脂、DM-130树脂、HPD-100树脂。

7.权利要求1-6中任一项所述的柴胡的有效组分在制备治疗抑郁症产品中的应用。

8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述的抑郁症是指由于各种原因引起的抑郁及抑郁伴随的神经、精神症状。

9.根据权利要求7-8中任一项的应用，其特征在于，所述产品包括药品和保健品。

10.一种药物组合物，包括有效剂量的权利要求1-6中任一项的柴胡有效组分和药学可接受的载体和/或辅料。