CN111514150A - Tppo在抑制fpp导致的细胞死亡及相应再灌注损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

在发现法尼基焦磷酸(FPP)可以导致肥大细胞和神经细胞的急性细胞死亡并激活褪黑素相关受体家族2(TRPM2)的基础上，本发明提供了三苯基氧膦(TPPO)在针对法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2激活相关疾病，特别是脑缺血再灌注损伤中的用途；本发明还提供了相应药物组合物以及使用三苯基氧膦抑制褪黑素相关受体家族2激活的非治疗性方法。本发明为治疗再灌注损伤类疾病提供了保护作用显著的新治疗靶点和药物。

Description

TPPO在抑制FPP导致的细胞死亡及相应再灌注损伤中的应用

技术领域

本发明属于心脑血管疾病领域。

背景技术

缺血再灌注损伤，是指局部组织因血液循环障碍，缺血、缺氧以及随后血流恢复中的一系列改变而发生的软化坏死。脑缺血/再灌注损伤造成了70％左右的脑梗。脑梗是全球的第二大死亡原因。中国每年160万人因脑梗死亡，死亡率为1.57‰，我国每12秒就有一人发生脑梗，每21秒就有一人死于脑梗。高死亡率使得脑梗在中国超过心脏病成为第一大致死原因。脑梗的发病在北方人中的比例高于南方人，在男性中的发病率高于女性，老年人中高于年轻人。随着城市化和老龄化的进展，脑梗发病率以8.3％的增长率逐年增加，并呈现出低收入群体中快速增长、性别和地域差异明显以及年轻化趋势。据推测，2030年我国脑血管病事件发生率将比2010年升高约50％。脑梗的治疗给个人和社会以及公立医疗支出也带来沉重的经济负担。2004年，针对脑梗的平均医疗支出为6356元，是农村地区人均年收入的两倍；公立医院在脑梗治疗方面的支出于2003年达到11.7亿人民币，2009年该支出达到81.9亿元，年增长率117％。至2011年，脑梗的医疗支出已达到400亿元，体量巨大。

缺血性脑损伤的主要风险因素包括：高血压、高血脂、肥胖、糖尿病、抽烟等。目前其临床治疗方式主要为通过静脉注射阿替普酶(纤维蛋白溶酶原激活药，alteplase)溶解栓塞，该治疗在脑缺血发生后四个半小时之内有效。而如果病人之前有出血型脑梗或者脑出血等病史，则不能使用阿替普酶疗法，因为该疗法易引起更严重的出血。若阿替普酶疗法无效，则需在24小时之内将阻塞机械性去除。脑缺血损伤的长效疗法只有阿司匹林和一些其他的抗凝剂。除了从解除栓塞和抗凝的角度治疗脑缺血损伤，鉴于有关脑缺血损伤的生物医学基础研究结果表明，脑缺血过程中有大量细胞发生自噬、凋亡和坏死，细胞死亡主要原因为在脑缺血和再灌注过程中产生大量活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)和钙超载现象(calcium overload)，科学家和医生进行了多项针对消除脑缺血损伤过程中产生的ROS的临床实验，包括抗氧化剂维生素C、NAC(N-acetyl-l-cysteine)和硫辛酸等等。目前，这些临床实验都以失败告终。在ROS已经产生的条件下试图消除它引起的细胞损伤目前没有太好的效果。因此，迫切需要其它的靶点和通路来减轻脑缺血过程中产生的细胞损伤。

FPP是甲羟戊酸代谢通路的一种重要中间代谢产物，甲羟戊酸代谢通路广泛存在于各种真核原核生物中，目前的研究结果认为该通路的主要作用为合成胆固醇用于细胞膜的组成、合成泛醌在线粒体中参与呼吸链的电子传递、合成的FPP和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)可以用于小G蛋白的异戊烯化修饰，从而帮助这些蛋白定位到膜上等等。甲羟戊酸代谢途径在不同的生理病理状态下受到不同的调控。目前研究发现，在缺氧和高糖条件下，甲羟戊酸代谢通路会被激活，代谢产物和中间代谢产物会积累。大脑中利用的胆固醇占人体总胆固醇的25％，且主要依赖于脑中的合成，因此大脑中的甲羟戊酸通路是具有高度活性的。在脑缺血/再灌注的病理环境下，依据之前的研究结果推测，甲羟戊酸途径会进一步加强。因此，增强的甲羟戊酸途径和中间代谢产物的积累在脑缺血损伤过程中起何种作用值得研究并且很可能成为新的治疗靶点。

发明内容

发明人在对甲羟戊酸代谢通路与脑缺血/再灌注损伤关联的研究中首次发现：1.法尼基焦磷酸(FPP)可以导致肥大细胞和神经细胞的急性细胞死亡；2.FPP可以激活褪黑素相关受体家族2(TRPM2)；3.FPP/TRPM2信号轴在脑缺血/再灌注损伤中的应用；4.三苯基氧膦(Triphenylphosphine oxide,TPPO)抑制FPP激活TRPM2及其在抑制脑缺血/再灌注损伤中的应用。

基于上述发现：

一方面，本申请提供了三苯基氧膦在制备治疗再灌注损伤的药物中的用途。

进一步地，所述再灌注损伤为脑缺血再灌注损伤。

进一步地，所述再灌注损伤为法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2导致的脑缺血再灌注损伤。

进一步地，所述再灌注损伤为急性期脑缺血再灌注损伤。

进一步地，上述用途中的药物为注射剂型。

另一方面，本申请提供了三苯基氧膦在制备法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2激活相关疾病中的用途。

进一步地，所述相关疾病中包含肥大细胞或神经细胞的急性细胞死亡。

进一步地，上述用途中的药物为注射剂型。

另一方面，本申请提供了抑制褪黑素相关受体家族2激活的非治疗性方法，包括使用三苯基氧膦。

进一步地，所述褪黑素相关受体家族2激活由法尼基焦磷酸导致。

另一方面，本申请提供了用于治疗再灌注损伤的药物，其中包含三苯基氧膦。

进一步地，所述再灌注损伤为脑缺血再灌注损伤。

本发明中的非治疗性方法可以用于疾病研究、药物研究、生理研究等科研方面。

本发明的再灌注损伤和法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2激活相关疾病包括但不限于脑缺血再灌注损伤、心肌缺血再灌注损伤、离体器官保存和移植中的损伤、急性肾小管坏死、坏死性肠炎等。上述疾病可以为各个具体时期如急性期、恢复期的疾病。

除三苯基氧膦外，本发明的药物中还可以包括各种其他已知和研究中的抗再灌注损伤药物，包括但不限于各种自由基清除剂、抗氧化剂、膜稳定剂等，如维生素C、维生素E、SOD酶，辅酶Q10、去铁胺等。

本发明中的药物可以制备为各种剂型，包括但不限于各种注射和口服剂型，如片剂、胶囊剂、口服液、针剂、粉针剂等，特别优选注射剂型。

本发明中的药物可以根据需要和药剂领域常识使用各种药学上可接受的各种辅料/赋形剂，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH调节剂、矫味剂等，特别优选可用于注射剂型的各种辅料/赋形剂。

附图说明

图1显示肥大细胞p815预加入10μg/mL的碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染料后，在Tyrode’s buffer中用相应浓度的FPP处理，并在酶标仪下检测加入FPP前后的PI荧光强度变化来指征细胞死亡。图显示平均值±标准误，灰色线代表标准误，黑色箭头表示FPP加入的时间。

图2显示体外培养的大鼠海马神经元在培养10天左右以后，用Hoechst染料和PI染料染色后用FPP处理1小时，比较不同FPP处理组细胞死亡比例。死亡比例定义为PI阳性细胞数量/Hoechst阳性细胞数量。条形代表平均值±标准误。

图3显示P815细胞在生理盐水中先加FPP处理10min，而后加入2mM氯化钙，检测在此过程中PI荧光强度变化。图显示平均值±标准误，灰色线代表标准误，黑色箭头分别表示FPP和氯化钙加入的时间。

图4显示TRPM2敲除的p815细胞和对照细胞分别依次用FPP和氯化钙处理，检测在此过程中PI荧光强度变化。图显示平均值±标准误，灰色线代表标准误，黑色箭头分别表示FPP和氯化钙加入的时间。

图5显示P815细胞在生理盐水中先加100μM TPPO预处理半小时，而后FPP处理10min，接下来加入2mM氯化钙，检测在此过程中PI荧光强度变化。图显示平均值±标准误，灰色线代表标准误，黑色箭头分别表示FPP和氯化钙加入的时间。

图6显示体外培养的大鼠海马神经元在培养10天左右以后，用Hoechst染料和PI染料染色后用FPP处理1小时，比较是否有TPPO处理组细胞死亡比例。死亡比例定义为PI阳性细胞数量/Hoechst阳性细胞数量。条形代表平均值±标准误。

图7显示HEK-293细胞中过表达TRPM2后在全细胞水平进行膜片钳实验，实验过程中，将电压从-100mV增加到+100mV，检测电流变化。TPPO处理浓度为50μM。图显示的加FPP之前、之后和洗脱掉FPP以后的电流值变化，标出的平均值±标准误。

图8显示重组人TRPM2克隆表达纯化以后在Biacore S200仪器中铺到CM5的传感器芯片中，而后注射不同浓度的FPP检测二者亲和力。

图9显示将H中所得得亲和力数据根据Langmuir model进行拟合，计算出拟合的亲和力值。

图10显示C57/B6小鼠的左颈动脉进行大脑中动脉阻塞，对侧仅分离血管进行假手术处理，阻塞1.5小时以后取出阻塞线栓再灌注，24h后取脑组织测FPP浓度的结果。

图11显示脑中动脉阻塞手术前30min向两组小鼠分别颅内注射3mg TPPO或者溶剂β-环糊精，随后进行同于图J中的脑中动脉阻塞和再灌注处理，而后进行脑切片2,3,5-三苯基四氮唑氯化物(TTC)染色检测脑梗死区域大小。柱状图显示的平均值±标准误。ns，不显着，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。条形代表平均值±标准误。数据是至少两个独立实验的代表性数据。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下例实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明的具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照试剂盒及仪器制造商所建议的条件。

实施例1FPP诱导肥大细胞和神经细胞的死亡

材料来源：FPP来自于化学合成，肥大细胞系p815来源于ATCC，Tyrode’s buffer(137mM NaCl,2.7mM KCl,1.0mM MgCl 2,1.8mM CaCl 2,20mM HEPES,and 5.6mM glucose,pH7.4)，SLH(saline+HEPES+L-glutamine)，黑色96孔板(Corning,#3925)，酶标仪(VARIOSKAN FLASH)，斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠购自维通利华公司，培养基为glia-conditioned neurobasal media(Gibco)补充2％B-27(Gibco),2mM谷氨酸盐(Gibco)and 1％链霉素/青霉素(Gibco)。

实验方法：

FPP导致细胞死亡检测：根据实验设计，在细胞计数后取适量细胞，用PBS洗一次，反应液Tyrode’s buffer或者SLH洗一次，而后以10E5细胞每80μL的密度重悬在反应液中，加入10μg/mL碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，将细胞分到黑色96孔板中，每孔80μL。在酶标仪下读取处理前PI荧光值，读取条件为激发光531nm，发射光632nm，读取间隔为30sec，读取20次。而后加入20μL FPP，用排枪混匀，置于酶标仪中在同样激发光和发射光条件下读数，间隔30s读取120次。对于CaCl2单独加的反应体系，则在加入FPP后间隔30sec读取20次PI荧光值，而后加入终浓度2mM CaCl2，混匀后间隔30sec读取120次。得到的荧光读数结果用加入FPP之前的结果进行归一化，然后用Graphpad作图

神经元体外培养：在胚胎期18天时分离出斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley)大鼠的海马神经元，用0.025％的胰蛋白酶在37度消化30min后，用含血清培养基终止消化，将神经元培养在经过多聚赖氨酸处理过的玻片上，培养密度为12孔板中120，000/孔。分离后第三天加入氟尿嘧啶脱氧核苷(fluorodeoxyuridine，FDU)抑制神经胶质细胞的生长，至第10天用于实验。

发明人研究了甲羟戊酸代谢通路中间产物FPP对肥大细胞和神经细胞的效果，发现：(1)外源加入FPP可以导致肥大细胞的急性细胞死亡，并具有很好的浓度梯度效应(见图1)；

(2)用FPP处理体外培养的原代神经元也可以诱导急性细胞死亡(见图2)；

进一步研究显示：

(3)如果外在缓冲液中无钙离子，FPP则不能诱导细胞死亡，而如果补充钙离子，FPP的急性细胞毒性效应恢复(见图3)；

实施例2对FPP诱导肥大细胞和神经细胞的死亡原理的研究

材料来源：lenti-puro/psPAX2/pMD2.G等质粒来源于addgene，HEK293细胞来自ATCC，ACSF缓冲液(HEPES(pH7.4,1M)25mM,NaCl(5M)125mM,KCl(1M)2.5mM,Glucose(1M)30mM,MgCl2(1M)1mM)，puromycin(corning公司)，TPPO(sigma公司)，Hoechst(ThermoFisher公司)，野生型C57/B6小鼠(北京大学动物中心提供)。

实验方法：

TRPM2敲除方法：将含有敲除TRPM2的sgRNA的lenti-puro质粒和包装质粒psPAX2以及pMD2.G通过脂质体转染转入HEK293细胞中，获取慢病毒毒液，而后侵染p815细胞。48h以后，对于转染pSpCas9-2a-GFP的细胞用流式分选获取阳性细胞；对于转染lenti-puro的质粒加入6μg/mL的puromycin进行抗性筛选2天。

TPPO抑制神经细胞死亡检测方法：首先将神经元在含有5μg/mL Hoechst的培养基中37度条件下染色30min，然后将细胞用ACSF缓冲液清洗两次，TPPO预处理30分钟后，加入含有5μg/mL PI的ACSF和合适浓度FPP，而后加入CaCl2，室温孵育1h后在激光共聚焦显微镜下成像

膜片钳实验方法：在HEK293细胞中过表达鼠的TRPM2，得到稳定表达细胞系，用于膜片钳实验；在HEKA EPC10软件中的全细胞模式(whole cell configuration)下，室温条件下进行下面实验。数据以20kHz的频率采样；首先将电极内液灌入玻璃电极，其电阻为3-8MΩ；实验过程中给与电压刺激，持续250ms，从-100mV升高到+100mV，细胞外液为Ringer’sbuffer，140mM NaCl,2.8mM KCl,2mM MgCl 2,10mM glucose and 10mM HEPES(pH 7.2,渗透压298-308mOsm)，细胞内液为145mM Cs-methanesulfonate(CsSO 3CH 3),8mM NaCl,1mMEGTA and 10mM HEPES(用CsOH调pH至7.2,渗透压295-305mOsm)。实验进行时，将12μg/mLFPP灌流加入浴槽以检测FPP是否激活TRPM2，加TPPO组TPPO浓度为50μM，实验前预孵育细胞15min。

表面等离子体共振实验方法：将纯化出的TRPM2蛋白铺到CM5感受器芯片(GEhealthcare公司)上，通过进样器将不同浓度的FPP或者其它试剂溶解在缓冲液中并注入，缓冲液成分为20mM HEPES(pH 7.4),150mM NaCl,0.05％Tween 20。该实验在Biacore S200(GE healthcare公司)仪器上完成。亲和力拟合是根据Langmuir model模型进行，结果在Originlab上进行处理和作图。

小鼠脑缺血/再灌注损伤造模方法：取10-12周，体重22-26g雄性小鼠，向小鼠体内注射1％戊巴比妥钠，浓度为70mg/kg，待小鼠进入深度麻醉后，颈中部切口，分离出左侧颈总动脉，将阻塞用线栓沿劲总动脉插入直至到能感受到略微阻力，即为阻塞大脑中动脉。线栓阻塞保持90min，期间将小鼠置于保温箱中保暖，90min后取出阻塞线栓并结扎小鼠血管断端，将伤口缝合，再灌注24h后，处死小鼠，取出大脑，于脑模中切成1mm厚的脑切片。将切片在1％TTC染色液中室温下浸泡30min，有脑出血的小鼠结果从所有结果中排除；染色结果在相机下成像，而后用ImageJ量出阻塞面积，并进行分析比较。

组织FPP含量检测方法：先进行小鼠大脑中动脉缺血/再灌注模型的造模，，再灌注24h后取出鼠脑，出去嗅球和脑干，左右半球分开，得到有脑缺血/再灌注的脑组织和对照脑组织，组织在1mL异丙醇：100mM NH4HCO3 pH 7.8(体积比1:1)溶液中充分匀浆，取300μL做接下来的实验，每份样品中，加入450μL异丙醇：碳酸氢铵(pH7.8)，震荡混匀，每份样品中加入750μL乙腈冰上孵育10min去蛋白，14000g4℃离心10min，用自动旋干仪悬干，利用清华大学药学平台的三重四极杆质谱测定FPP浓度。

(4)针对FPP导致急性细胞死亡的钙离子依赖特性，我们进一步筛选可能参与此过程的离子通道，发现非选择性阳离子通道TRPM2的缺失会降低FPP的细胞毒性(见图4)；

(5)TRPM通道抑制剂TPPO可以抑制FPP导致的肥大细胞和神经元急性死亡(见图5、6)；

(6)电生理实验证明了FPP可以直接打开TRPM2离子通道，并且这种FPP介导的TRPM2的开放可以被TPPO所抑制(见图7)；

(7)体外蛋白纯化和表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)实验进一步显示，FPP能够直接和TRPM2结合并激活该通道，并且二者亲和力为～0.21μM，高于TRPM2和它的已知经典配体腺苷二磷酸-核糖体(adenosine diphosphate-ribose，ADPR)的亲和力(见图8、9)；

基于以上新发现，结合甲羟戊酸代谢通路在大脑中的高活性，我们检测了大脑中动脉闭塞模型小鼠大脑中FPP的积累，结果显示：

(8)出现大脑中动脉闭塞的脑半球FPP浓度显著高于未进行大脑中动脉闭塞手术的脑半球(见图10)，说明在脑缺血和再灌注过程中，不仅产生了大量的ROS和钙内流，同时还有显著性的FPP积累，而此FPP积累很可能也介导了脑缺血/再灌注损伤的病理形成。

综上，可以预期TPPO可以抑制FPP激活TRPM2通道并且抑制FPP导致的急性细胞死亡。

实施例3TPPO抑制小鼠脑中动脉阻塞/再灌注损伤的应用

材料来源：野生型C57/B6小鼠(北京大学动物中心提供)，TPPO(sigma公司)，β-环糊精(sigma公司)，TTC(sigma公司)，1％戊巴比妥钠(清华大学实验动物中心提供)。

实验方法：

TPPO颅内注射：由于TPPO在水中溶解度不高，现将TPPO以1mg/mL的终浓度、1：25的质量比，溶解在β-环糊精中，而后低温超声3-4小时以帮助溶解。MCAO手术前30min，向小鼠体内以70mg/kg的浓度腹腔注射戊巴比妥钠，将小鼠放置于脑立体定位仪上，待小鼠深入昏迷以后用牙科钻在小鼠颅骨上打洞，而后注射3μLTPPO或者对应的β-环糊精溶剂对照。具体注射位点为：左纹状体(根据小鼠脑定位坐标为前/后，+0.5mm；内/外，-2.0mm；背/腹，-2.5mm)。注射速度为0.3uL/min，注射结束后留针5min，而后缝合完成手术。

小鼠脑中动脉阻塞/再灌注损伤造模及检测：TPPO注射完成后，，在小鼠颈部剪除一个切口，分离出左侧颈总动脉，用线栓阻塞小鼠大脑中动脉直至感觉不到阻力，将小鼠在37℃的保温箱中放置90min，而后松开结扎线，取出线栓，缝合伤口。经过24h的再灌注后，处死小鼠，取出脑，切成1mm厚度的切片，在1％的TTC染液中染色30min。此过程中，如果发现有脑出血的结果将排除在外。将染色结果进行成像并用ImageJ统计计算成像面积。

根据图11的结果，我们可以看到，TPPO处理组的小鼠脑缺血/再灌注损伤面积小于对照组，即说明TPPO对脑缺血/再灌注损伤有保护作用。

本申请参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本申请作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所述排除没有在本申请中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。

仅使用常规实验，本领域技术人员会认识到或者能够确定对本申请所述的具体实施方案的许多等价形式。本申请所述的本发明实施方案的范围不意在限制为上述说明书，而是如随附的权利要求所列出的那样。本领域技术人员会理解，可实现本说明书的各种变化和修饰，而不背离如权利要求所定义的本发明的主旨或范围。

Claims (12)

1.三苯基氧膦在制备治疗再灌注损伤的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述再灌注损伤为脑缺血再灌注损伤。

3.根据权利要求2的用途，其中所述再灌注损伤为法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2导致的脑缺血再灌注损伤。

4.根据权利要求2或3的用途，其中所述再灌注损伤为急性期脑缺血再灌注损伤。

5.根据权利要求1-3任一项的用途，其中，药物为注射剂型。

6.三苯基氧膦在制备法尼基焦磷酸激活褪黑素相关受体家族2激活相关疾病中的用途。

7.根据权利要求6的用途，其中所述相关疾病中包含肥大细胞或神经细胞的急性细胞死亡。

8.根据权利要求6或7的用途，其中上述用途中的药物为注射剂型。

9.抑制褪黑素相关受体家族2激活的非治疗性方法，包括使用三苯基氧膦。

10.根据权利要求9的方法，其中所述褪黑素相关受体家族2激活由法尼基焦磷酸导致。

11.用于治疗再灌注损伤的药物，其中包含三苯基氧膦。

12.根据权利要求11的药物，其中所述再灌注损伤为脑缺血再灌注损伤。

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