CN103550787B - 一种微小rna拮抗剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种微小RNA拮抗剂及其应用。本发明根据具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或几个核苷酸的序列的微小RNA具有调控脑缺血后炎症因子表达的功能，提供了一种微小RNA拮抗剂，其为经修饰的微小RNA反向互补序列。采用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的微小RNA表达可明显抑制经LPS刺激的小胶质细胞BV2中炎症因子iNOS的表达或经IFN-γ和LPS刺激的原代星形胶质细胞或星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种微小RNA拮抗剂及其应用。
背景技术
脑中风是世界人群中排名第三的死因，并且是造成成年人残疾的首要病因。据统计，美国每年有50～75万人发病；在中国，脑中风发病人数达250万/年，死亡人数达160万/年。脑中风已超过心肌梗塞，成为国人死亡的首要病因。脑中风不仅致死率高，而且高达75%的卒中患者还会留下神经行为功能损伤和认知障碍等后遗症，造成社会和家庭的沉重经济负担。脑中风主要分为两种类型，70%以上为缺血性脑中风，其是指各种血栓在不同脑区引起脑血管堵塞，从而造成缺血性脑损伤，其中最常见的为大脑中动脉堵塞；另外不到30%是由脑血管破裂导致的脑出血，最终也造成脑供血不足及缺血性脑损伤。脑缺血也是心脏骤停导致的后果之一。
脑缺血可引起脑内一系列细胞和分子应答机制，这些机制交织在一起最终决定了脑神经细胞的死亡和存活。目前发现，脑缺血导致的神经元死亡或损伤的机制主要有：过量兴奋性氨基酸（如谷氨酸）释放导致的神经元损伤机制、大量自由基导致的损伤机制以及脑缺血引起的脑内过度炎症应答而导致的神经炎症损伤机制。这些病理损伤机制对脑中风治疗药物的研制和开发具有重要意义。
miRNA是近年来发现于真核生物细胞中的一类长约22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，可通过与靶mRNA的3’-UTR互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用。
目前，越来越多的研究证实，miRNA在脑缺血后的表达水平发生显著变化，提示其参与了脑缺血损伤作用，并参与脑缺血损伤后的保护和修复机制的调控。有研究表明，大鼠脑缺血再灌注24小时后血浆中miR-19b、miR-290、miR-292-5p的表达明显升高，这些miRNAs很可能成为脑卒中的实验室诊断标志物。另有文献报道，抑制小鼠miR-497表达，可以明显减少小鼠脑缺血后大脑皮层的梗死体积，减轻脑缺血损伤。在星型胶质细胞中miR-181通过调控Bcl-2和Mcl-1在细胞脑缺血模型中导致线粒体功能紊乱：miR-181的上调加剧脑缺血损伤。“miR-3473b”具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，于2010年首次在小鼠的尿液和生殖系统中被发现，目前，尚无关于miR-3473b任何系统功能的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种微小RNA拮抗剂及其作为神经炎症抑制剂的应用。
本发明提供了一种微小RNA在调控脑缺血后炎症因子表达中的应用；该微小RNA具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列，或在SEQIDNO：1所示核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或几个核苷酸的序列。
作为优选，用于调控脑缺血后炎症因子表达的微小RNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
该微小RNA为人工合成，或来自动物样本，包括组织或细胞。
细胞实验证实，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在小鼠原代培养星型胶质细胞缺糖缺氧模型组中表达明显高于正常组。下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA能明显抑制IFN-γ和LPS诱导的星型胶质细胞炎症因子表达；且具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在LPS刺激的BV2细胞中的表达明显高于正常细胞；下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA可以抑制BV2细胞炎症因子iNOSmRNA的表达
动物实验证实：以对侧脑及假手术组小鼠相应脑区分离纯化的eGFP+星型胶质细胞为对照，对转基因小鼠缺血脑内分离纯化的eGFP+星型胶质细胞进行miRNA表达谱分析，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在缺血组织中表达明显升高。随后用动物脑缺血模型验证，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在缺血侧组织中表达明显高于对侧和假手术组。因此证明，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在脑缺血组织中被明显诱导表达，说明该微小RNA可起到调控神经疾病后的炎症应答的作用，下调其表达可抑制脑缺血后炎症因子的表达。
本发明还提供了一种微小RNA拮抗剂，其为经修饰的微小RNA反向互补序列；
该微小RNA具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或在SEQIDNO：1所示核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或几个核苷酸的序列；
修饰为：胆固醇修饰、硫代骨架修饰或甲氧修饰。
优选的，本发明提供的微小RNA拮抗剂为经修饰的SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列；
SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如SEQIDNO:2所示；
修饰为：在SEQIDNO:2所示的核苷酸序列3’端胆固醇修饰，5’端1～2位的核苷酸经硫代骨架修饰，3’端1～4位的核苷酸经硫代骨架修饰、全链核苷酸甲氧修饰。
如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具体为：
5’-GGGCUGGAGAGAUGGCUCAG-3’。
如SEQIDNO:1所示的核苷酸的反向互补序列，即SEQIDNO:2所示的核苷酸序列具体为：5’-CUGAGCCAUCUCUCCAGCCC-3’。
3’端的胆固醇修饰为具体为：使一个胆固醇分子附着在SEQIDNO:2所示核苷酸3’端。
硫代骨架修饰具体为：用一个硫原子取代中磷酸二酯键的非桥氧原子，即用P-S键替代P-O键。
全链核苷酸甲氧修饰是指在对SEQIDNO:2所示的序列中的各核苷酸的呋喃环中2’位上的-OH被甲氧基取代，已经过硫代骨架修饰的核苷酸也修饰甲基。
因此，本发明提供的微小RNA拮抗剂其结构具体为：5’-CsUsGAGCCAUCUCUCCAGsCsCsCs-Chlo-3’，其中，s表示硫代骨架修饰，Chlo表示胆固醇修饰。并对其中每一位核苷酸呋喃环中的2’位修饰甲氧基。
本发明还提供了本发明提供的微小RNA拮抗剂作为神经炎症抑制剂的应用。
研究表明脑缺血后脑内炎症相关细胞（星型胶质细胞）过度激活是缺血性脑损伤的重要病理机制之一。本发明利用目前公认的激活星型胶质细胞炎症应答的模式分子—干扰素γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）过度激活星型胶质细胞C6和原代星型胶质细胞，结果发现，利用本发明提供的微小RNA拮抗剂可以明显抑制原代星形胶质细胞或星型胶质细胞C6细胞炎症因子TNF-α和IL-1βmRNA的表达。
并且，小胶质细胞的过度炎症激活加剧缺血性脑损伤。利用本发明提供的微小RNA拮抗剂转染入BV2细胞，24小时后LPS刺激，结果发现，和正常细胞相比，LPS刺激BV2细胞6小时后，促炎症因子iNOSmRNA表达明显增多，而本发明提供的微小RNA拮抗剂可以抑制BV2细胞炎症因子iNOSmRNA的表达。
作为优选，本发明提供的微小RNA能够抑制的神经炎症为星型胶质细胞炎症或小胶质细胞炎症。
优选的，星型胶质细胞炎症为原代星形胶质细胞的炎症或星型胶质细胞系C6的炎症。
本发明提供的微小RNA拮抗剂在制备治疗脑缺血和/或缺血性脑损伤的药物中的应用。
作为优选，药物的剂型为注射剂。
本发明提供了一种微小RNA在调控脑缺血后炎症因子表达中的应用；该微小RNA具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列，或在SEQIDNO：1所示核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或几个核苷酸的序列。本发明还提供了一种微小RNA拮抗剂，其为经修饰的微小RNA反向互补序列；该微小RNA具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，或在SEQIDNO：1所示核苷酸序列中取代、缺失或添加一个或几个核苷酸的序列；修饰为：胆固醇修饰、硫代骨架修饰或甲氧修饰。本发明通过细胞实验和动物实验发现，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在脑缺血组织中被明显诱导表达，下调该微小RNA可显著抑制脑内星型胶质细胞和小胶质细胞的炎症应答。实验结果表明：采用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA表达可明显抑制经LPS刺激的小胶质细胞BV2中炎症因子iNOS的表达或经IFN-γ和LPS刺激的原代星形胶质细胞或星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。
附图说明
图1示小鼠脑缺血损伤后具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA表达量测定结果，其中，柱1示假手术组皮层组织中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA相对表达量，柱2示缺血再灌注6h后，对侧皮层组织中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA相对表达量，柱3示缺血再灌注6h后，缺血侧皮层组织中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA相对表达量，柱4示缺血再灌注24h后，对侧皮层组织中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA相对表达量，柱5示缺血再灌注24h后，缺血侧皮层组织中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA相对表达量；
图2示小鼠原代星型胶质细胞造缺糖缺氧OGD模型后具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA表达量测定结果，其中，柱1示正常星形胶质细胞中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的相对表达量，柱2示缺糖缺氧造模后复氧6h后星形胶质细胞中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的相对表达量，柱3示缺糖缺氧造模后复氧24h后星形胶质细胞中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的相对表达量；
图3示本发明提供的微小RNA抑制剂对IFN-γ和LPS刺激后的星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α的表达量测定结果，其中，柱1示正常星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α的相对表达量，柱2示经IFN-γ和LPS刺激后的星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α的相对表达量，柱3示经IFN-γ和LPS刺激并转染入本发明提供的微小RNA抑制剂后的星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α的相对表达量，柱4示经IFN-γ和LPS刺激并转染入对照微小RNA抑制剂后的星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α的相对表达量；
图4示本发明提供的微小RNA抑制剂对IFN-γ和LPS刺激后的星型胶质细胞系C6中炎症因子IL-1β的表达量测定结果，其中，柱1示正常星型胶质细胞系C6中炎症因子IL-1β的相对表达量，柱2示经IFN-γ和LPS刺激后的星型胶质细胞系C6中炎症因子IL-1β的相对表达量，柱3示经IFN-γ和LPS刺激并转染入本发明提供的微小RNA抑制剂后的星型胶质细胞系C6中炎症因子IL-1β的相对表达量，柱4示经IFN-γ和LPS刺激并转染入对照微小RNA抑制剂后的星型胶质细胞系C6中炎症因子IL-1β的相对表达量；
图5示本发明提供的微小RNA抑制剂对IFN-γ和LPS刺激后的原代星型胶质细胞中炎症因子TNF-α的表达量测定结果，其中，柱1示正常原代星型胶质细胞中炎症因子TNF-α的相对表达量，柱2示经IFN-γ和LPS刺激后的原代星型胶质细胞中炎症因子TNF-α的相对表达量，柱3示经IFN-γ和LPS刺激并转染入本发明提供的微小RNA抑制剂后的原代星型胶质细胞中炎症因子TNF-α的相对表达量；
图6示本发明提供的微小RNA抑制剂对IFN-γ和LPS刺激后的原代星型胶质细胞中炎症因子IL-1β的表达量测定结果，其中，柱1示正常原代星型胶质细胞中炎症因子IL-1β的相对表达量，柱2示经IFN-γ和LPS刺激后的原代星型胶质细胞中炎症因子IL-1β的相对表达量，柱3示经IFN-γ和LPS刺激并转染入本发明提供的微小RNA抑制剂后的原代星型胶质细胞中炎症因子IL-1β的相对表达量；
图7经LPS刺激后小胶质细胞系BV2中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的表达量测定结果，其中，柱1示正常小胶质细胞系BV2中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的相对表达量，柱2示经LPS刺激后的小胶质细胞系BV2中具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的微小RNA的相对表达量；
图8本发明提供的微小RNA抑制剂对LPS刺激后的小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOS的表达量测定结果，其中，柱1示柱1示小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOS的相对表达量，柱2示经LPS刺激后的小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOS的相对表达量，柱3示经LPS刺激并转染入对照微小RNA抑制剂后的小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOS的相对表达量，柱4示经LPS刺激并转染入本发明提供的微小RNA抑制剂后的小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOS的相对表达量。
具体实施方式
本发明提供了一种微小RNA拮抗剂及其作为神经炎症抑制剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中：
DMEM培养基购自美国Hyclone公司；
胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；
无血清的DF12培养液购自美国Hyclone公司；
二甲基亚砜（DMSO）购自美国SIGMA公司；
青霉素、链霉素购自上海生工；
脂多糖购自美国SIGMA公司；
干扰素γ购自R&D公司；
脂质体2000、微小RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自美国）Invitrogen公司；
本发明提供的微小RNA抑制剂由上海吉玛制药技术有限公司合成；
异氟烷购自山东科源制药公司；
C57小鼠购自上海斯莱克公司
小胶质细胞BV2购自美国模式菌种收集中心(ATCC)；
CO2培养箱，逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；
倒置显微镜购自日本Olympus公司；
立体手术显微镜购自深圳瑞奥德公司；
激光多普勒脑血流测定仪PeriFluxsystem5000购自PERIMADAB公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA对脑缺血后炎症因子表达的调控
1、大脑中动脉栓塞模型（MCAO）制作
取C57小鼠异氟烷气体麻醉后仰卧，并固定于手术台温毯上，将激光多普勒探头（laser-Dopplerprobe）置于头侧面（背外侧头顶皮层后囟2mm，前囟旁3mm处），实时检测脑皮层血流量。做颈部正中切口，暴露右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈外动脉距其始端约1mm处做一小切口，将制备好的线栓自切口处插入颈外动脉，再经颈内动脉至大脑中动脉始端，栓塞大脑中动脉，造成局灶性脑缺血。小鼠缺血1h后，拔出栓子，恢复脑组织供血(血流再灌注6小时和24h后，处死动物)。假手术组小鼠只进行手术操作，不进行线栓阻断脑血流。术后于安静清洁环境中分笼饲养。
2、具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在小鼠脑缺血损伤模型（MCAO）的皮层组织中的表达
采用实时荧光定量PCR技术测定了3套小鼠脑缺血损伤模型（MCAO）的皮层组织中具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达，具体为：
用mirVanaTMmiRNAKit(Ambion)提取RNA；ABIHighCapacitycDNAArchiveKit（AppliedBiosystems）逆转录获得cDNA。
使用Taqman探针法，实时定量检具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA和内参sno202表达。使用SYGR法检测炎症因子TNF-α、IL-1β和内参18s的mRNA表达。
sno202探针购自探针够自Invitrogen公司，货号:4427975,AssayID:001232。
具有SEQIDNO:1所示的微小RNA的探针购自Invitrogen公司，货号：4427975，AssayID:465212
内参18smRNA及炎症因子的引物序列如表1所示：
表1内参18smRNA及炎症因子的引物序列如表1所示
反应条件:50℃2min
所有反应用ABIPrism7500SequenceDetectionSystem（AppliedBiosystems）检测。结果如图1所示。
统计结果显示，缺血再灌注6小时和24小时，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在缺血侧组织中表达显著高于对侧以及假手术组（P＜0.05）。
实施例2具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在原代星型胶质细胞缺糖缺氧（OGD）模型中的表达
1、原代星型胶质细胞培养
选用新生一天的C57小鼠，75%乙醇消毒后置于无菌培养皿中，在超净台下用眼科镊夹住鼠颈部、眼科剪将头皮组织分层剪开并翻向外侧，显露两侧大脑半球，用弯眼科镊撕去蛛网膜及软脑膜，在无血管区夹取少许两侧大脑皮层组织，放入无血清的DF12培养液中，尽量将其剪碎并转移至15ml离心管，无血清的DF12培养液洗3次。在37℃条件下加入适量0.05%的胰蛋白酶液消化10min，并用吹管轻轻吹打20下以内。再加入少许含20%胎牛血清无血清的DF12培养液培养基以终止消化，离心(1000r/min)3min；弃上清，重新加入上述培养基，轻轻吹打，制成初细胞悬液，过70μ细胞筛，并将细胞悬液接种至塑料培养瓶中，接种密度约2×105/mL。将培养瓶置于CO2培养箱中培养，次日换液，去除未贴壁的活力差或死亡细胞，继续培养7d，每3天换液，每次换液稍加振摇。待细胞铺满瓶底后将培养瓶固定于恒温摇床(37℃，200rpm)3～4h，弃悬液并以PBS液漂洗，经质量分数为0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁生长的星形胶质细胞，种至6孔板培养。
2、原代星型胶质细胞造缺糖缺氧（OGD）模型的构建
原代星型胶质细胞培养10天后，接种于6孔板，造OGD模型，模拟体内缺血状态。将细胞正常的培养基换为缺糖的OGD培养基，并放入缺氧培养箱（OGDchamber），充入CO2与N2的混合气体（其中CO2的体积分数为5%，2psi）10分钟，然后关阀门，从而使细胞处于无氧、37℃条件下，培养4小时。然后换回正常培养基，继续在CO2与N2的混合气体（其中CO2的体积分数为5%，2psi）37℃培养箱中培养6小时或24小时。
其中，缺糖的OGD培养基中各组分的摩尔-体积浓度为：NaCl120mmol/L，Tris-HCl25mmol/L，KCl5.4mmol/L，CaCl21.8mmol/L，pH值为7.4。
3、具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在原代星型胶质细胞缺糖缺氧（OGD）模型中的表达
取构建的原代培养的星型胶质细胞缺糖缺氧（OGD）模型，分别于复氧6小时和24小时收集细胞，并取正常的星型胶质细胞、以未经复氧的星型胶质细胞缺糖缺氧（OGD）模型作为对照。提取总RNA，采用实时荧光定量PCR技术测定具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达。实验方法与探针序列如本发明实施例1所述，实验结果如图2所示。
结果显示，具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在OGD复氧6小时和24小时细胞中的表达显著高于正常细胞。
实施例3下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达可明显抑制脑内星型胶质细胞中炎症因子的表达
采用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达，该抑制剂由上海吉玛制药技术有限公司采用人工合成的方法制得。本发明提供的微小RNA抑制剂具体为：在SEQIDNO:2所示的核苷酸序列3’端胆固醇修饰，5’端1～2位核苷酸和3’端1～4位核苷酸硫代骨架修饰、全链核苷酸甲氧修饰。
1、星型胶质细胞系C6的培养
将冻存细胞由液氮罐中取出后迅速置于37℃温水中轻轻摇晃解冻，1000转离心3min，弃上清，细胞在含10%FBS的DMEM中培养，细胞在培养皿中覆盖率达60%～70%时进行传代。传代的细胞覆盖率达60%-70%后，1000转离心3min获取细胞，台盼蓝染色，用血球计数仪于显微镜下计数。将计数后的细胞稀释成15～20万个/mL，进行铺板。
然后，利用目前公认的激活星型胶质细胞炎症应答的模式分子—干扰素γ（IFN-γ）和脂多糖（LPS）过度激活制备星型胶质细胞系C6。具体为本发明提供的微小RNA抑制剂转染入细胞24h后，同时加入50U/mlIFN-γ和100ng/mL的LPS，刺激6小时后，收集细胞，提取RNA。
2、下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达
取本发明实施例2制备的原代星型胶质细胞和本实施例制备的星型胶质细胞系C6在高糖DMEM培养基中37℃，5％CO2条件下培养。细胞转染前通过胰酶消化收集细胞，接种于6孔培养板中，待细胞生长密度到90～95%左右，用脂质体2000将本发明提供的微小RNA抑制剂转染入细胞。同时设未经转染本发明提供的微小RNA抑制剂的原代星型胶质细胞和星型胶质细胞系C6作为对照组。脂质体转染参照Lipofectamine2000，货号:11668-019说明书提供的方法完成（Invitrogen，CA，USA）。
其中，高糖DMEM培养基中各组分的含量为：质量分数为10%的FBS，摩尔体积浓度为2mmol/L的谷氨酰胺，质量分数为100kU/L青霉素及质量分数为100mg/L链霉素。
采用本发明实施例1提供的方法对原代星型胶质细胞和星型胶质细胞系C6炎症因子TNF-α、IL-1β的mRNA表达情况进行检测。试验以未经刺激的正常星型胶质细胞，及以经IFN-γ和LPS刺激后并转染入对照微小RNA抑制剂的细胞作为对照。检测结果如图3～6所示。
其中，对照微小RNA抑制剂序列如SEQIDNO:11所示，具体为：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’，其修饰方式为，在其3’端胆固醇修饰，5’端1～2位的核苷酸经硫代骨架修饰，3’端1～4位的核苷酸经硫代骨架修饰、并对其中每一位核苷酸呋喃环中的2’位修饰甲氧基。即，对照微小RNA抑制剂的结构为：5’-UsUsGUACUACACAAAAGUAsCsUsGs-Chlo-3’。
结果表明：利用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达可以抑制原代星型胶质细胞和星型胶质细胞系C6中TNF-α和IL-1β的mRNA的表达。
实施例4具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA在LPS刺激的小胶质细胞BV2中的表达
利用目前公认的激活小胶质细胞炎症应答的模式分子脂多糖（LPS）刺激BV2小胶质细胞，6小时后收集细胞，获得LPS刺激的小胶质BV2细胞。提取总RNA，采用实时荧光定量PCR技术测定具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达，统计结果显示，LPS刺激的小胶质BV2细胞在LPS刺激的BV2细胞中的表达明显高于正常细胞，结果如图7所示。
实施例5下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达可明显抑制小胶质细胞BV2中炎症因子的表达
采用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有如SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达，该抑制剂由上海吉玛制药技术有限公司采用人工合成的方法制得。本发明提供的微小RNA抑制剂具体为：在SEQIDNO:2所示的核苷酸序列3’端胆固醇修饰，5’端2个核苷酸和3’端4个核苷酸硫代骨架修饰、全链核苷酸甲氧修饰。
采用实施例3中提供的方法将本发明提供的微小RNA抑制剂转染入小胶质细胞系BV2的24h后，同时加入100ng/mL的LPS，刺激6小时后，收集细胞，提取RNA。采用本发明实施例1提供的方法对小胶质细胞系BV2中炎症因子iNOSmRNA表达情况进行检测。试验以未经刺激的正常小胶质细胞系BV2，及以LPS刺激并转染入对照微小RNA抑制剂后的小胶质细胞系BV2作为对照。检测结果如图8所示。
其中，对照微小RNA抑制剂序列如SEQIDNO:11所示，具体为：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’，其修饰方式为，在其3’端胆固醇修饰，5’端1～2位的核苷酸经硫代骨架修饰，3’端1～4位的核苷酸经硫代骨架修饰、并对其中每一位核苷酸呋喃环中的2’位修饰甲氧基。即，对照微小RNA抑制剂的结构为：5’-UsUsGUACUACACAAAAGUAsCsUsGs-Chlo-3’。
结果显示：利用本发明提供的微小RNA抑制剂下调具有SEQIDNO：1所示核苷酸序列的微小RNA的表达可以抑制小胶质细胞BV2中炎症因子iNOSmRNA的表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种微小RNA在制备调控脑缺血后炎症因子表达药物中的应用；
所述微小RNA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
所述微小RNA表达抑制经LPS刺激的小胶质细胞BV2中炎症因子iNOS的表达或经IFN-γ和LPS刺激的原代星型胶质细胞或星型胶质细胞系C6中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。
2.微小RNA拮抗剂在制备神经炎症抑制剂中的应用，所述微小RNA拮抗剂为经修饰的SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列；
所述SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如SEQIDNO:2所示；
所述修饰为：在SEQIDNO:2所示的核苷酸序列3’端胆固醇修饰，5’端1～2位的核苷酸经硫代骨架修饰，3’端1～4位的核苷酸经硫代骨架修饰、全链核苷酸甲氧修饰；
所述神经炎症为星型胶质细胞炎症或小胶质细胞炎症。
3.微小RNA拮抗剂在制备治疗脑缺血和/或缺血性脑损伤的药物中的应用，所述微小RNA拮抗剂为经修饰的SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列；
所述SEQIDNO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如SEQIDNO:2所示；
所述修饰为：在SEQIDNO:2所示的核苷酸序列3’端胆固醇修饰，5’端1～2位的核苷酸经硫代骨架修饰，3’端1～4位的核苷酸经硫代骨架修饰、全链核苷酸甲氧修饰。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。
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